流感病毒B型（共4篇）
流感病毒B型 篇1
禽流行性感冒是由A型流感病毒引起的从呼吸系统病变到全身败血症的一种高度急性传染病, 对养禽业造成了巨大的损失。
1 禽流感病毒感染和致病的分子机制
1.1 吸附、穿膜和脱壳
病毒粒子血凝素突起识别和结合宿主细胞表面含唾液酸的特异性受体, 使病毒与宿主细胞接触并吸附到细胞膜上, 然后被吞入, 形成胞饮泡, 胞饮泡与溶酶体融合使胞内p H降到5, 病毒粒子血凝素蛋白构型改变使位于轻链HA2N端的融合序列暴露, 引起病毒囊膜与细胞膜融合, 使病毒粒子内部的核衣壳释放到胞浆内。
1.2 基因组的转录与复制
病毒脱去囊膜后其核酸片段进入宿主细胞核。首先, 病毒RNA聚合酶结合到宿主m RNA的5′端, 通过聚合酶组分2的核酸内切酶活性切下11个核苷酸, 这一序列带有帽状结构, 可直接作为引物。引物加上后, 聚合酶组分1以病毒RNA为模板催化合成起始, 并使链延伸。接上去的第一个核苷酸是G, 它与病毒RNA聚合酶的3′端第二个核苷酸互补, 病毒转录酶不转录3′端的第一个核苷酸 (U) 。当链延伸到14个核苷酸长度时, 引物被释放下来, 但3′端的A仍保留在m RNA上, 病毒m RNA的5′端仍为AGC。当链延伸到近5′端的poly (U) 时, 以此为模板合成poly (A) 尾后终止链的延伸。因此, 病毒m RNA是病毒RNA的不完全转录物。6个单顺反子m RNA在核内合成后, 很快转移到细胞浆翻译病毒蛋白。
1.3 病毒蛋白的合成
m RNA在核内合成后转移到细胞浆, 在核糖体上翻译成为病毒血凝素、神经氨酸酶、核蛋白、聚合酶组分1、聚合酶组分2和聚合酶组分PA。NS和M基因的m RNA分别进行剪接, 各产生两个m RNA, 翻译成非结构蛋白NS1、NS2, 和基质蛋白M1、M2。血凝素HA和神经氨酸酶NA在粗面内质网内进行糖基化, 在高尔基体中修饰后运输到细胞膜。
1.4 病毒粒子的装配
首先, HA和NA插入到细胞膜, 然后M1移向细胞浆膜的内侧面, 非连续地贴补使之增厚。NP在细胞浆合成后首先以游离状态存在, 但很快进入细胞核并与新合成的v RNA结合形成核衣壳。8个基因节段和内部病毒蛋白 (NP、PB1、PB2、PA、M2) 一起组装, 并移送到有HA、NA和M2插入的细胞膜位置, 准备出芽。
1.5 病毒的出芽和释放
这个过程可持续数小时而不溶解感染的细胞, 目前机制尚不清楚。M1合成后到达细胞膜并与HA、NA或M2的胞浆区之间相互作用可能是出芽的信号。NA去除病毒囊膜上的唾液酸, 避免子代病毒在细胞膜上的吸附聚集, 从而促进病毒粒子的释放。病毒成熟的最后一步是靠宿主的蛋白酶将HA裂解为HA1和HA2, 使病毒粒子具有感染性并进入新一轮的复制, 这个裂解过程可能在胞外完成。
2 禽流感的诊断
因为禽流感亚型众多, 毒力差别很大, 临床症状也千差万别, 高致病性禽流感除了具有大流行的特点外, 很难与其它传染病区分, 因此单靠临床诊断常常难以定性。AIV的确切诊断有赖于病毒的分离和鉴定。
2.1 病毒的分离
病毒通常在消化道内复制, 所以一般从活禽或死禽的气管和泄殖腔中分离病毒。消化道和呼吸道的组织、分泌物、排泄物也都适合于分离病毒。在高致病性AIV造成全身感染的条件下, 由于严重的病毒血症, 实际上每一器官都能分离到病毒。
临床上分离病毒的方法常用棉拭子取气管和泄殖腔内的分泌物, 再将棉拭子放在含有抗生素的平衡盐溶液中, 以抑制细菌生长。鸡胚接种是目前分离病毒的常用方法。也可收集器官并放在灭菌的小瓶中, 在对器官进行取样时, 应尽量把不同脏器的样品分别收集, 因为从内脏器官分离到流感病毒通常意味着全身感染, 这常与致病性高致病性禽流感有关。
2.2 病毒的鉴定
用鸡红细胞检测鸡胚尿囊液的血凝活性是鉴定禽流感的方法之一, 有常量和微量两种技术。
HA表面抗原亚型的鉴定可在血凝抑制试验 (HI) 中用一组目前已知的16种 (H1~H16) 不同血凝素的抗血清来鉴定HA的亚型。抗HA血清最好用纯化的HA蛋白制备, 或用单克隆抗体, 这样可以避免由于抗NA抗体所产生的空间干扰。但是, 用已知亚型的抗HA抗体不能检测含有新的HA亚型的流感病毒。血凝阳性的病毒尿囊液还应当与新城疫病毒感染所引起的血凝活性区别。
NA亚型通常用制备的9种已知神经氨酸酶的抗血清做神经氨酸酶抑制试验 (NI) 来鉴定。现已经研制出微量NI技术, 这有助于对大量分离物的分析, 并且易于操作。
对于AIV的毒力鉴定, OIE认为, 用1:10倍稀释具有感染性的鸡胚尿囊液, 静脉注射8羽4~8周龄的易感鸡, 每羽0.2ml, 若10d内致死6~8羽, 则这样的流感病毒为高致病性AIV。
2.3 血清学诊断方法
用血清学方法检测感染鸡抗体的存在, 一般在病毒感染7~10d后就可以检测到抗体。常用的检测抗体的技术包括HI试验、琼脂双扩散试验 (AGIP) 、病毒中和试验、神经氨酸酶抑制试验 (NI) 、单辐射溶血试验 (SRD) 、放射免疫试验 (RIA) 和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 。
Ⅲ型副流感病毒肺炎临床分析 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料2014年1-12月本院儿科病房收治肺炎1 563例诊断均符合第7 版《实用儿科学》肺炎诊断标准[2], 其中诊断为PIV3 肺炎49 例, 男31 例, 女18 例, 均为急性起病。
1.2 方法入院当天通过咽拭子采集呼吸道分泌物标本, 采用直接免疫荧光法 (试剂盒:美国Chemicon公司;荧光显微镜:德国莱卡公司。) 检测呼吸道七种常见病毒:副流感病毒Ⅰ~Ⅲ型、RSV、腺病毒、流感病毒A和B型, 经病毒学检查确诊49例PIV3阳性患儿作为观察对象, 观察记录患儿发病季节、年龄、症状、体征、实验室检查 (包括血常规、肝肾功能、电解质、支原体抗体、心肌酶谱、超敏C反应蛋白、降钙素原、血培养) 、胸片、潮气呼吸肺功能以及治疗及预后。
2 结果
2.1 分布情况PIV3感染与年龄的关系:<6 个月18 例 (36.73%) , 6 个月~1 岁12 例 (24.49%) , 1~2 岁12 例 (24.49%) , 2~3 岁6 例 (12.24%) , >3 岁1 例 (2.04%) 。PIV3感染与季节的关系:春季 (3~5月) 20例 (40.82%) , 夏季 (6~8 月) 19 例 (38.78%) , 秋季 (9~11 月) 6 例 (12.24%) , 冬季 (12~2月) 4例 (8.16%) 。
2.2 临床表现49 例患儿均为急性起病, 咳嗽49 例 (100.00%) ;发热28例 (57.14%) , 体温37.5~39.7℃, 低中度发热22例, 占发热总人数的78.57%, 热程1~9d不等, 平均热程约4.3d;喘息15 例 (30.61%) , 喘息平均持续时间6d;肺部粗湿啰音36 例 (73.47%) , 细湿啰音13 例 (26.53%) , 有喘鸣音15 例 (30.61%) , 无喘鸣音34 例 (69.39%) ;肺外表现:腹泻5 例, 中耳炎1 例, 急性喉炎1例, 病毒疹1例, 热性惊厥1例, 咽峡炎1例;合并基础疾病:先天性心脏病1例、中度贫血1例。
2.3 实验室检查血常规WBC<4×109/L 1例, (4~10) ×109/L 34例, (10~15) ×109/L 12例, >15×109/L 2例。中性粒细胞数 (ANC, 按年龄标准) 正常39 例 (79.59%) , ANC减少10 例 (20.41%) 。超敏C反应蛋白正常41 例 (83.67%) , 增高8 例 (16.33%) 。 降钙素原正常43 例 (87.76%) , 增高6 例 (12.24%) 。肝功能轻度异常2 例, 心肌酶谱CK-MB轻度升高9例, 血培养及肺炎支原体抗体均阴性。出院前复查相关异常指标均恢复正常。
2.4 影像学检查49例均行肺部X线检查, 均可见小片状阴影, 病变受累主要部位:两侧33 例 (67.35%) 、左侧1 例 (2.04%) 、右侧15例 (30.61%) 。仅1例行肺部CT检查提示两肺小叶性病变。所有患儿均无胸腔积液、气胸表现。
2.5 潮气呼吸肺功能检查正常32例 (65.31%) , 阻塞性病变10例 (20.41%) , 限制性病变3 例 (6.12%) , 混合性病变4例 (8.16%) 。
2.6 治疗与转归本组患儿予喜炎平静脉滴注、干扰素雾化、利巴韦林气雾剂抗病毒治疗, 喘息者予布地奈德、特布他林雾化治疗, 合并细菌感染者予青霉素类或头孢类抗生素治疗, 仅1例患儿持续高热不退予丙种球蛋白支持治疗, 49例患儿均治愈出院, 住院天数5~14d, 平均住院6.92d, 出院1周后随访所有肺功能异常患儿复查肺功能均正常。
3 讨论
PIV3属于副黏病毒属, 是负单链RNA病毒, 存在于呼吸道分泌物中, 通过人与人直接接触和飞沬经呼吸道传播, 主要感染婴幼儿和免疫力低下的成人, 引起肺炎和支气管炎, 其感染仅次于呼吸道合胞病毒。根据血清流行病学研究, 美国50%的1~6岁儿童已感染过PIV3, 而60%~80%的感染儿童均在2~4岁内[3]。
本文结果显示PIV3肺炎一年中各个月份均可发病, 但49例中春夏季发病39例, 占总阳性病例的79.59%, 提示春夏季节为感染高发季节, 跟赵艳丰等[4]报道南京地区、苏迎迎等[5]报道潍坊地区、孙诗炜等[6]报道苏州地区一致。发病年龄<1岁30例, 占总阳性病例的61.22%, 提示婴儿发病率高, 跟曹淑彦等[7]报道一致, 考虑可能由于婴儿免疫系统发育不完善, 机体应答能力相对较弱, 对病毒抵抗力低所致。1~2岁12例 (24.49%) , 2~3岁6例 (12.24%) , >3岁1例 (2.04%) , 提示随着患儿年龄增长, 小儿机体免疫功能不断增强, 故PIV3感染率明显下降。
国内有研究PIV3 肺炎患儿CD4+/CD8+比值升高, 导致免疫功能紊乱, 与哮喘患儿细胞免疫功能类似[8]。本组病例中发生喘息患儿15例 (30.61%) , 提示PIV3肺炎患儿中有近1/3发生喘息, 且喘息患儿潮气呼吸肺功能检查发生阻塞性病变有10例 (20.41%) , 提示PIV3肺炎合并喘息患儿易发生小气道阻塞, 考虑跟病毒侵犯气管、支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮及间质细胞引起细胞变性、坏死、增生和黏膜糜烂有关。这部分患儿是否有PIV3感染后气道高反应性, 是否会反复喘息发作及与哮喘发生是否有关联, 需进一步远期随访。
本文中49例患儿血常规示ANC减少10例 (20.41%) , 提示大约1/5的患儿合并ANC减少, 说明PIV3是引起中性粒细胞减少症的病毒之一。病毒感染导致中性粒细胞减少的原因可能是病毒的直接作用或者诱导粒细胞产生自身抗体导致粒细胞破坏, 也可能由于粒细胞在血管壁上附着增多[9]。
总而言之, PIV3是儿童急性呼吸道感染的重要病原之一, 春夏季为高发季节, 婴儿为高发人群。临床表现以发热、咳嗽、喘息为主要症状, 所有患儿均有咳嗽症状, 一半以上患儿有发热, 多为低中度发热, 近1/3的患儿伴喘息, 胸片以双肺受累多见, 肺外症状少见, 极少数有一过性肝功能、心肌酶谱轻度异常, 但较快恢复正常。约1/5的患儿合并ANC减少, 血培养均阴性提示无1 例继发严重感染, 且所有患儿ANC在短期内恢复正常, 提示PIV3引起的ANC减少为一过性的。超敏C反应蛋白、降钙素原检查提示15% 左右的患儿PIV3感染的基础上合并细菌感染, 需抗菌药物治疗, 避免了临床抗生素的滥用。PIV3肺炎目前尚未找到特效的抗病毒治疗方法, 有效的副流感病毒疫苗正在研发中, 还未进入临床试验[10], 治疗以对症治疗为主, 加强呼吸道护理, 注意喂养及支持疗法, 重症病例较少, 并发症少, 短期随访预后较好。
摘要：目的:分析Ⅲ型副流感病毒PIV3肺炎的临床特点, 提高对该病的诊治水平。方法:采用回顾性调查方法, 对2014年1-12月收治的49例PIV3肺炎患儿发病季节、年龄、临床表现、实验室检查、胸片、肺功能检查、治疗及预后进行分析。结果:春夏季39例 (79.59%) , 发病年龄<1岁30例 (61.22%) , 临床症状主要为咳嗽、发热、喘息、肺部粗湿啰音, 喘息患儿易合并肺功能异常, 胸片以双肺受累多见, 少部分患儿有一过性中性粒细胞减少, 49例均治愈出院, 出院1周随访肺功能均恢复正常。结论:春夏是PIV3肺炎的高发季节, 婴儿为高发人群, 临床症状主要为咳嗽、发热、喘息, 并发症少, 以抗病毒及对症治疗为主, 极少数合并细菌感染者需抗生素治疗, 预后良好。
关键词：Ⅲ型副流感病毒,肺炎
参考文献
[1]尹俭俭, 李秀景, 郑丛龙.副流感病毒的研究进展〔J〕.中国微生态学杂志, 2013, 25 (4) :478.
[2]胡亚美, 江载芳.诸福棠实用儿科学〔M〕.第7版.北京:人民卫生出版社, 2002:1174-1185.
[3]Peltola V, Heikkinen T, Ruuskanen O.Clinical courses of croup caused by influenza and parainfluenza viruses〔J〕.Pediatr Infect Dis J, 2002, 21 (1) :76-78.
[4]赵艳丰, 雷忠英, 王琳, 等.南京地区住院儿童副流感病毒感染监测〔J〕.临床儿科杂志, 2013, 31 (1) :52-54.
[5]苏迎迎, 孙中厚, 王华, 等.潍坊地区急性呼吸道感染患儿副流感病毒检测及分析〔J〕.儿科药学杂志, 2013, 19 (6) :4-6.
[6]孙诗炜, 苏小慰, 陈正荣, 等.儿童急性呼吸道副流感病毒3型感染流行与气候因素的关系〔J〕.江苏医药, 2011, 37 (8) :932-934.
[7]曹淑彦, 陈小芳, 李孟荣, 等.急性呼吸道感染住院患儿副流感病毒的检测及分析〔J〕.临床儿科杂志, 2007, 25 (10) :841-843.
[8]赵显虹, 刘继贤, 李瑞, 等.副流感病毒3型感染肺炎患儿细胞免疫功能分析〔J〕.临床肺科杂志, 2011, 16 (5) :706-708.
[9]Schwartzberg LS.Neutropenia:etiology and pathogenesis〔J〕.Clin Cornerstone, 2006, 8 (Suppl 5) :S5-S11.
流感病毒B型 篇3
荧光定量RT-PCR检测方法的灵敏度高, 并且可以有效的防止检测过程中样品的污染, 极大的提高了检测的准确性。此外荧光定量RT-PCR检测方法灵活性也好, 可一次获得样品的多个遗传信息, 这就大大的缩短了检测时间, 为A型流感病毒患者的治疗创造了最佳治疗时间。本次研究选取2011年9月至2012年3月我院收治的10例A型流感病毒感染者, 随机分为两组, 对照组5例进行常规检测, 实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。两组临床资料进行分析, 情况如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本次研究病例10例, 其中女性6人, 男性4人, 年龄5~70岁。小孩4例和老人3例比重较大, 男女比例相当。10例患者中, 发烧咳嗽的有1例, 浑身酸痛流涕的有2例, 出汗咳嗽流涕的有1例, 发烧浑身酸痛的有2例, 发烧并且出汗的有1例, 浑身酸痛兼出汗的有1例, 发烧、浑身酸痛、出汗、咳嗽流涕的有2例。两组在性别、年龄、病情等一般资料上比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 方法
对照组5例进行常规检测, 采用血清学检测方法和病毒分离培养方法进行检测。实验组5例采用荧光定量RT-PCR方法进行检测。
1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0统计学软件, 计数资料行χ2检验, P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
实验组荧光定量RT-PCR方法检测时间短, 且具有特异高, 敏感性高的特点。这些特性对疾病治疗也有极大的帮助。对照组发现有3例病情加重, 其中1例并发淋巴系统疾病2例并发肺部细菌感染, 继发性肺炎主要症状表现为持续发烧、头痛、呕吐、恶心、嗜睡、食欲不振、吐浓痰、痰液黏稠且黄、少数痰中带血、病人面色发黄。并发淋巴系统疾病的患者表现为淋巴结中大、身体浮肿、淋巴管扩张扭曲、局部淋巴管管壁及其周围组织发生炎症细胞浸润、浸润的细胞中有大量噬酸性粒细胞。实验组有2例病人并发肺部细菌感染, 症状表现为发烧、恶心、呕吐、嗜睡惊厥等症状, 没有发现有淋巴系统病变的病例。经化验科检验, 肺部细菌感染的继发性肺炎主要是感染金黄色葡萄球菌、嗜血杆菌和肺炎链球菌。实验组治疗时间为1~3周, 对照组治疗时间为2~4周, 其中有1例病情严重的为6周左右。有1例因病情恶化转移到上级医院去接受治疗。值得提醒的是, 在研究过程中发现A型流感病毒容易感染其他住院病人。而这些病人都是些免疫能力相对比较低的病患。见表1。
注:*与对照组比较1) P<0.05。
3 讨论
A型流感病毒具有很强的侵袭力, 而且对药物的治疗具有抵抗力的突变或是变异, 可以对病人的健康造成威胁。对照组并发症较高, 可能是因为血清学检测特异性和敏感性不高, 检验的准确性低从而有误诊影响到对疾病的治疗或是错误治疗诱发病毒变异, 这些因素都可能加重疾病或是引起并发症;病毒分离培养方法至少需要21d才能得到检测结果, 检测时间过长, 有些患者所感染的病毒在检验过程中可能已经发生突变或者是变异, 从而影响到治疗的效果。A型流感病毒极易突变, 不正确的治疗以及治疗时间过长均易导致突变, 从而加重治疗的困难性。而且突变后的A型流感病毒株具有更强的毒力和攻击性。此外, 耐药性也是一个不可忽视的问题, 在确诊之前采用广谱抗病毒药物, 不仅易导致耐药还可能导致突变从而贻误病机。从感染A型流感病毒的人群分析, 老人和小孩所占比重相对较大, 老人免疫系统功能退化而小孩免疫系统尚未发育好, 这两大人群共同特点就是免疫力比较差。因此加强对老人和小孩的保护也很重要。感染A型流感病毒后, 人体的免疫力降低, 原本寄居于人体的正常菌群如金黄色葡萄球菌变成致病菌, 从而引发一系列的感染。早期识别以及采取长期隔离防范措施看来对预防受到感染的免疫功能受损患者发生 (医院性) 流感病毒爆发不失为是一种谨慎的作法[1]。然而, A型流感病毒感染早期症状并不明显, 只有50%左右的有明显的类似于呼吸道感染疾病的症状。这就加重了防治的难度。到医院就诊的都是症状明显、病情较严重的患者。这就需要医院有快速的检测结果和尽早的治疗。荧光定量RT-PCR检测方法正好弥补了血清学、病毒分离检测方法的不足, 对A型流感病毒的检测时间短, 异性高, 敏感性好, 为疾病A型流感病毒感染的尽早治疗创造了条件。荧光定量RT-PCR检测方法不仅对A型流感病毒的治疗有积极作用, 而且有利于隔离传染源, 切断传播途径, 保护易感者, 减轻人们的恐慌心里和心理压力。有利于提高治愈率, 缩短治病时间, 提高病人的生活质量。
摘要：目的:探析荧光定量RT-PCR检测方法对A型流感病毒检测的快速性、敏感性和特异性以指导临床治疗。方法:选择我院2011年9月至2012年3月收治的10例感染A型流感病毒病人, 随机分为对照组和实验组。对照组5例进行血清学、病毒分离培养等方法进行检测, 实验组5例进行荧光定量RT-PCR检测。结果:实验组的确诊率和治疗效果均高于对照组, 且所用的检测时间和治疗时间均短, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:荧光定量RT-PCR检测A型流感病毒准确率高, 对临床治疗有积极的指导作用。
关键词：荧光定量RT-PCR,A型流感病毒,检测方法
参考文献
流感病毒B型 篇4
1材料与方法
1.1病毒与试剂CPIV3 JS2013分离株由本实验室分离鉴定,将CPIV3 JS2013毒株接种MDBK细胞进行两次蚀斑纯化并连续传代增殖培养。
MDBK传代细胞购自中国兽医药品监察所;Transzol UP试剂、一步法RT-PCR试剂盒、Taq酶购自北京全式金生物技术有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Axygen公司;DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司。
1.2动物分组及病毒感染程序40只清洁级豚鼠用于本次的CPIV3 JS2013株人工感染试验。整个试验期间,所有豚鼠都被隔离培育在受控的笼子。豚鼠购回后,先隔离饲养7 d左右,使其适应新的环境,以排除应激的因素。之后将试验豚鼠随机分为两组,一组含有16只试验豚鼠作为感染组(CC),另外一组含有16只试验豚鼠作为空白对照组(NC)。感染组试验豚鼠通过滴鼻接毒TCID50为10-6.55/100 μL的CPIV3 JS2013株病毒液300 μL每只。阴性对照豚鼠通过滴鼻接种相同量的MDBK细胞培养液上清。 之后每日观察试验豚鼠的临床症状,尤其是试验豚鼠的身体状态和呼吸道疾病相关症状。在感染后第1、3、5、7、11、14、17、21天,通过安乐死每日处死2只感染组试验豚鼠和2只对照组试验豚鼠,摘取试验动物的脾、肺和气管组织,并对试验豚鼠进行心脏采血分离血清,所有获得的试验豚鼠的病料均置于-20 ℃保存备用。将所有取得的组织分成3份,分别进行病毒分离、RT-PCR检测和病理组织学检测。
1.3 RT-PCR检测与病毒分离采用Transzol UP试剂提取 鼻拭子 、 血清样品 总RNA, RT-PCR扩增CPIV3 M基因检测病毒血症和排毒情况,RT-PCR总体积20 μL,其中2×R-Mix Buffer 10 μL,上下游引物各0.5 μL(F 5’-AGTGATCTAGATGATGATCCA-3’, R 5’-GTTATTGATCCAATTGCTGT-3’),E-Mix 0.4 μL, RNA模版4 μL,无Rnase水补足至20 μL。扩增程序:45 ℃ 反转录40 min;94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 35个循环 ; 72 ℃ 10 min。反应结束后取PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳检测,并拍照记录。
按照报道的方法将阳性样品在MDBK细胞上进行病毒分离。
1.4病理学检测按病毒感染程序处死试验豚鼠后,将获取的感染组及空白组实验豚鼠各组织样品固定于4%中性福尔马林缓冲溶液中,48 h后进行石蜡包埋、切片等进行组织病理学检测。
1.5血凝抑制试验将按病毒感染程序分离得到的试验豚鼠血清按标准程序进行血凝抑制试验:在96孔微量血凝板的第一行每孔先加入25 μL生理盐水,然后加入待检试验豚鼠血清进行1:2连续倍比稀释,然后每孔加入25 μL 4单位抗原(根据第二章对JS2013株分离鉴定时所测的病毒血凝效价确定),在37 ℃恒温培养箱孵育30 min后,加入1%的豚鼠红细胞悬液25 μL,在37 ℃恒温培养箱孵育40 min后判定试验结果,HI抗体滴度为能完全抑制红细胞凝集的血清的最高稀释倍数(HI抗体滴度≤ 3log2判定为阴性,≥4log2判定为阳性)。
2结果与分析
2.1临床症状感染组试验豚鼠在攻毒后第2天开始有个别出现流鼻涕、打喷嚏和眼分泌物增多的症状,第4天开始普遍出现较为严重的呼吸道症状, 并出现腹式呼吸,症状一直持续到第14天,感染组豚鼠普遍出现精神倦怠、食欲减退和不喜走动的症状。空白组试验豚鼠则无明显临床症状。感染组试验豚鼠在接毒后第2~6天、第11天每天分别死亡1只,而空白组试验豚鼠并没有出现死亡,说明CPIV3 JS2013株对豚鼠有较强的致病性。
2.2病毒的RT-PCR检测与病毒分离将采集的临床样本处理后,抽提总RNA,RT-PCR扩增CPIV3 M基因。结果显示,攻毒后3 d可以检出病毒血症,持续到攻毒后第7天,攻毒后第3~14天,RT-PCR均可以从肺组织匀浆中检测到排毒(见表1)。空白组检测均为阴性。将检测为阳性的条带回收后送测序公司测序,结果显示扩增毒株为CPIV3 JS2013株。阳性样品经MDBK细胞分离能产生细胞病变,RT-PCR检测为CPIV3 JS2013株。
注:-:正常;+:排毒
2.3试验豚鼠解剖学病理变化感染组试验豚鼠肺脏解剖学病理变化主要集中在接毒后第2~11天, 肺组织表现为暗红色淤血、不规则的实变等。在接毒后的第3~7天感染组试验豚鼠几乎整个肺脏都呈现为实变和膨胀不全;接毒后的第7~14天可见肺脏膨胀逐减减轻;到第21天可见肺脏病变更不明显,说明感染组试验豚鼠在逐减恢复中(图1)。同时感染组试验豚鼠接毒后第2~7天,解剖可见脾脏与空白组试验豚鼠相比肿大明显(图1)。
2.4试验豚鼠组织病理学检测病理组织学检测结果表明感染组试验豚鼠肺脏主要组织病理学变化表现为肺泡间隔增宽、纤维性渗出、巨噬细胞浸润、 实变和代偿性肺气肿。在人工感染后第3天,感染组试验豚鼠肺脏都表现出了肺泡间隔增宽变化;人工感染后第5天,感染组试验豚鼠肺脏表现为局部纤维素渗出及充血;人工感染后第7天,感染组试验豚鼠肺脏表现为代偿性肺气肿;人工感染后第11天,感染组试验豚鼠肺脏可见间质性肺炎变化;空白组试验豚鼠肺脏未见病理变化(图2)。
2.5血凝抑制试验取本试验中感染组和空白组试验豚鼠第0、3、5、7、13、21天的血清进行血凝抑制试验。测得感染组试验豚鼠血凝抑制效价分别为1:20、1:23、1:24、1:26、1:25、1:24,而空白组试验豚鼠则 一直为1:20。 血凝抑制 试验的结 果说明JS2013株对豚鼠有较强的致病性。
3讨论
研究表明,PIV3可引起人和相关动物呼吸道疾病,HPIV1、HPIV3是导致人类上下呼吸道感染的重要病原体;BPIV3是引起牛呼吸道疾病的主要病原, 其引起的临床症状差异较大,可以是表现严重的呼吸道感染,也可以为无症状的亚临床感染。到目前为止,只有少数关于PIV3在羊群感染情况的报道, 多为血清学抗体检测,并未对其病原进行鉴定。本实验室2014年首次报道从发病山羊中分离到完全不同于BPIV3的山羊副流感病毒3型(CPIV3)。为了明确其对易感动物的致病性,本试验利用CPIV3分离株JS2013采取滴鼻接种的方式清洁级豚鼠,通过RT-PCR、血凝抑制试验、病理解剖学和病理组织学等一系列试验来研究该病原对豚鼠的致病性。
A: 空白组试验豚鼠肺脏无明显变化 B: 人工感染后第3天感染组试验豚鼠大部分肺脏表现为实变、淤血和肿大 C: 人工感染后第7天感染组试验豚鼠几乎全部肺脏表现为实变、淤血和肿大 D: 人工感染后第14天感染组试验豚鼠少部分肺脏表现为实变和肿大 E: 人工感染后第21天感染组试验豚鼠肺脏表现为肿大,症状减轻 F: 人工感染后第2~7天感染组试验豚鼠脾脏表现为膨大
A: 空白组豚鼠肺脏(×40) B: 接毒后第3天豚鼠肺脏表现为肺泡间隔增宽(×40) C:接毒后第5天豚鼠肺脏表现为局部纤维素渗出及充血(×40) D: 接毒后第7天豚鼠肺脏表现为代偿性肺气肿(×40) E: 接毒后第11天豚鼠肺脏表现为间质性肺炎(×40)
试验结果表明,攻毒后2 d感染组的试验豚鼠开始出现打喷嚏、流鼻涕、眼分泌物增多及腹式呼吸的临床症状,并有较高的致死率。攻毒后3 d可以检出病毒血症,持续到攻毒后第7天,攻毒后第3~14天,RT-PCR均可以从肺组织匀浆中检测到排毒。剖检观察感染组试验豚鼠,豚鼠肺出现实变和肿大的症状,病理组织学观察鉴定发现感染组试验豚鼠肺组织出现肺泡间隔增宽、肺泡融合、炎性细胞浸润等变化,但随着感染时间的增长,感染组试验豚鼠的肺部组织逐渐减轻。说明若豚鼠感染前期不死亡的话,则有一定几率可自愈。HI试验表明豚鼠感染此病毒后第3天开始出现血凝抑制抗体,血凝抑制效价为1:23;21 d后血凝抑制抗体仍保持较高的水平,血凝抑制效价1:24;感染组试验豚鼠感染此病毒的第3~21天,血凝抑制效价集中在1:24~ 1:26。