禽流感病毒H5N1（共7篇）
禽流感病毒H5N1 篇1
目前已经证实感染人的禽流感病毒亚型为H 5 N 1、H 9 N 2、H7N7、H9N2、H7N3等,其中感染H5N1的患者病情严重,病死率高。本研究将该重组H5N1HA蛋白作用于离体培养的人肺腺癌上皮细胞株,观察其对细胞释放炎症细胞因子的影响,旨在研究禽流感病毒HA启动急性损伤的可能免疫病理应答机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料
D M E M培养基
人肺腺癌上皮细胞株A549
胎牛血清
胰蛋白酶
细胞培养瓶和培养板
TRIZOL试剂
Multiplex Bead Assay液相蛋白芯片系统(IL-8、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、IL-6)
BCA蛋白测定试剂盒
PVD F膜
1.2 主要仪器
二氧化碳恒温细胞培养箱(Incubator);超净台;细胞计数板;倒置相差显微镜;酶标仪;台式高速离心机;垂直电泳仪;酶标仪;PTC-200P C R扩增仪。
注:*HA组与对照组比较P<0.05
1.3 实验方法
RT-PCR检测及抑制实验。
1.3.1 细胞分组
(1)将A549细胞接种于6孔培养板,长满后加入分为4组:空白对照组、H A蛋白(2 0μg/m L)刺激组、H A蛋白(40μg/mL)刺激组、HA蛋白(80μg/mL)刺激组,刺激1h后提取总RNA。(2)将A549细胞接种于6孔培养板,长满后每孔加入HA蛋白(40μg/mL),分别加入刺激物后0、15min、30min、1h、2h、4h提取RNA。(3)抑制实验:A549细胞接种于6孔板中,长满后分别分为3组:空白对照组、HA蛋白(40μg/mL)刺激组、HA蛋白(40μg/mL)+JAK3抑制剂组,刺激1h,提取各组RNA。
1.3.2 细胞RNA的提取
(1)匀浆:用冰PBS液洗2遍,吸干,向培养板中加入0.5mL TRIZOL试剂裂解细胞,用枪反复吸打数次直至呈匀浆状。(2)两相分离:匀浆后样品于室温孵育5min,以便核酸蛋白复合体完全解离。尽量收集所有液体。每1mL的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿,盖紧管盖,手动剧烈振荡管体15s后,室温孵育2~3min。4℃12000×g离心15min。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层核上层的无色的水相。
(3)RNA沉淀:将水相转移到新Eppendorf管中,水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA,加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1mL TRIZOL试剂的此时加0.5mL的异丙醇。混匀后室温孵育10min后,于4℃12000g离心10min。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。(4)R N A清洗:移去上清液,每1mLTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1mL的75%乙醇,清洗R N A沉淀。振荡后,4℃7 5 0 0×g离心5 m i n。(5)重新溶解R NA沉淀。(6)RNA的定性:取2μL总的RNA样本点样在含0.5μg/μL溴化乙锭(EB)的1%琼脂糖凝胶上电泳,电泳缓冲液为0.5×TBE,电压为50V,电泳时间为30min。电泳后在紫外灯下观察,可见28S、18S、5S3条带,28S与18S的亮度之比为2:1。
2 结果
2.1 RT-PCR结果
不同浓度的HA蛋白刺激A549细胞1h后均有IRF-1和IP-10基因水平的表达增加,呈量效关系。HA蛋白(40ug/ml)刺激A549细胞IRF-1及IP-10基因表达的水平随时间延长呈增强的趋势。
2.2 JAK3抑制实验
HA蛋白+JAK3抑制剂组,RT-PCR检测IRF-1和IP-10基因表达明显低于HA蛋白刺激组。Western blot检测HA蛋白+JAK3抑制组,JAK3及NF-κB磷酸化明显受减弱。作用12h后细胞培养上清中IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1alpha、MIP-1beta及RANTES表达水平明显低于同浓度HA蛋白刺激组(表1),差异具有显著性意义(P<0.05)。
3 讨论
AIV表面HA蛋白在决定A型流感病毒毒力、病毒的宿主特异性方面起着至关重要的作用。AIV通过HA与呼吸道上皮细胞表面含唾液酸的糖蛋白或糖脂特异性识别、结合而侵袭呼吸道上皮细胞[1]。在人类与AIV特异性结合的唾液酸α2,3半乳糖受体(SA2,3Gal)主要分布于下呼吸道,如肺泡上皮细胞,AIV作用的呼吸道靶细胞是II型肺泡上皮细胞及巨噬细胞[2]。
目前,AIV通过何种机制诱导趋化因子高水平表达尚不清楚。我们通过免疫印记检测HA蛋白对JAK-STAT及NF-κB信号转导通路的影响,发现HA蛋白作用于A549细胞后,能诱导STAT1、JAK2、JAK3、NF-κB磷酸化,IRF-1和IP-10基因表达增加;而加入JAK3抑制剂能同时抑制JAK-STAT及NF-κB信号转导通路,降低HA蛋白诱导I R F-1和I P-1 0基因表达[3],显著下调IL-6、M C P-1、RANTES、MIP-1α、MIP-1β及IL-8等炎症因子产生及释放。这说明AIV HA蛋白通过活化JAK-STAT及NF-κB信号通路引起免疫病理损伤。
摘要：目的 通过揭示HA蛋白引起急性免疫损伤的信号转导分子机制及关键分子靶点,为创新药物的开发奠定基础。方法 RT-PCR检测及抑制实验。结果 不同浓度的HA蛋白刺激A549细胞1h后均有IRF-1和IP-10基因水平的表达增加,呈量效关系。结论 JAK3分子是HA蛋白触发早期免疫炎症反应的关键信号分子。
关键词：H5N1,病毒蛋白,免疫
参考文献
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禽流感病毒H5N1 篇2
据日本共同社消息, 日本东京都医学综合研究所等研究小组日前开发出一种针对强毒性H5N1型禽流感病毒的新型检测方法, 检测灵敏度是以往方法的50倍以上。该装置仅为手掌大小。日本北海道大学和熊本大学也参与了该项研究。这一检测方式将有助于防治禽流感。
据悉, 只需提取被检测者鼻腔和喉部的黏膜, 将其滴在检测装置上, 15分钟左右就可诊断出结果。研究小组对孕检和流感检测中已被使用的“免疫层析法”进行了改良。新型检测机器可使H5N1相关抗体与微量荧光色素相结合, 并对该色素进行高灵敏度检测。之前的方法只能检测出部分H5型病毒, 研究小组此次开发出了新抗体。经确认, 新检测方式可以检测出各类H5型病毒。
禽流感病毒H5N1 篇3
禽流行性感冒(简称禽流感,AI)是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的以禽类为主的传染性疾病。根据病原体类型的不同,禽流感分为高致病性(HPAI)和低致病性(MPAI)禽流感,其中高致病性毒株主要有H5和H7两个血清亚型。本研究所用的毒株 (GSGD/1/96)是我国分离鉴定的第1株高致病性禽流感病毒株[4]。笔者在miRNA组学测序的基础上,分析了差异显著两组间的miRNA,其中miRNA-17a*在3月龄SPF鸭感染与非感染病毒状态下的免疫器官中的表达存在极显著差异。为了探讨该miRNA在感染和非感染病毒状态下SPF鸭不同组织中的表达规律,本研究对3月龄的SPF鸭采用滴鼻法感染H5N1亚型禽流感病毒,检测miRNA-17a*在感染与非感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭的各组织中的表达情况,以期为在感染H5N1亚型禽流感病毒状态下,miRNA-17a*在水禽中的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验动物和样品处理
3月龄SPF鸭和H5N1亚型禽流感病毒株(GSGD/1/96),均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。将20只SPF鸭随机分成2组,即试验组和对照组,每组10只,分别隔离饲养在负压隔离器中。试验组SPF鸭采用滴鼻法人工感染1×106EID50/0.1 mL的H5N1亚型禽流感病毒,感染病毒后每2 d采血1次,并分离血清检测SPF鸭感染H5N1亚型禽流感病毒后抗体水平的变化,当抗体水平稳定至平台期时,对试验组和对照组SPF鸭进行屠宰,采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、气管和肌肉组织,立即置于液氮中, -80 ℃冰箱中保存,备用。
1.2 cDNA的获得
采用Trizol法提取试验组和对照组SPF鸭不同组织的总RNA,样品全部在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所P3实验室内处理,同时电泳检测总RNA的质量,应用紫外分光光度计检测总RNA的浓度。按照ReverTra Ace qPCR反转录试剂盒的要求,先将RNA样品于65 ℃加热5 min备用。调整各样品总RNA的浓度均为250 ng,使反转录体系中总RNA量一致,以减少定量中的误差。反转录体系:5×RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 0.5 μL、miRNA-specific stem-loop RT primer 0.5 μL、Total RNA 250 ng,添加Nuclease-free water至10 μL。反应条件:42 ℃ 15 min;98 ℃ 5 min。所得产物于-80 ℃保存,备用。
1.3 引物设计
试验所用miRNA-17a*序列为前期鸭高通量测序工作所得结果中获得序列,同时以5S rRNA作为内参对照。根据参考文献[5]中引物设计原则设计特异性反转录引物及荧光定量PCR上、下游引物(见表1),在长春华大中天生物技术有限公司合成。
1.4 荧光定量RT-PCR反应
根据SYBR Green荧光定量PCR试剂盒的要求,研究在感染与非感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭不同组织中miRNA-17a*的表达情况。反应体系:2×SYBR混合物12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、cDNA(按照1∶10比例稀释)2.5 μL、RNase free H2O 8 μL。反应条件:95 ℃ 1 min;94 ℃ 1 min,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,共40个循环。同时扩增5S rRNA作为内参对照,用2-△△CT法计算miRNA-17a*的表达量,以脾脏组织的表达量作为标准进行相对表达分析,应用SPSS软件对所得数据分析。
2 结果与分析
2.1 总RNA的提取(结果见图1)
M.DNA Marker;1～6.分别为心脏、肝脏、脾脏、 肾脏、肌肉、气管。
由图1可知,各组织提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测完整性较好,基本无降解。紫外分光光度计检测发现,OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间。说明样品无DNA或蛋白污染,能够满足试验的要求。
2.2 在非感染状态下SPF鸭不同组织中miRNA-17a*的相对表达(结果见图2)
由图2可知,在SPF鸭的不同组织中均能检测到miRNA-17a*表达,其中在肺脏中的相对表达量最高,其次为心脏、肌肉、脾脏、肾脏和气管,而在肝脏中miRNA-17a*的相对表达量最低。
2.3 在感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭不同组织中mi RNA-17a*的相对表达(结果见图3)
由图3可知,经荧光定量PCR分析,在SPF鸭感染H5N1亚型禽流感病毒后的不同组织中均能检测到miRNA-17a*表达,其中在肌肉中相对表达量明显高于其他组织,其次为心脏、脾脏、肾脏、肺脏和气管,而在肝脏中miRNA-17a*相对表达量最低。
2.4 在感染与非感染H5N1亚型禽流感病毒状态下SPF鸭不同组织中mi RNA-17a*相对表达情况的比较(结果见图4)
由图4可知,感染H5N1亚型禽流感病毒的SPF鸭气管中miRNA-17a*相对表达量是非感染SPF鸭气管中miRNA-17a*相对表达量的1.2倍,而在其他组织中,感染H5N1亚型禽流感病毒后miRNA-17a*相对表达量相对低于非感染SPF鸭。
3 讨论
MiRNA是近年来发现的一类对基因表达调控具有重要调节作用的小分子RNA。在细胞核内,在多种酶的作用下编码miRNA的基因经过转录、加工和转运过程剪切为成熟的miRNA[6]。近年来,关于miRNA在不同生物过程中的作用越来越受到人类的关注,有学者曾报道miRNA-17能够作用于靶基因PKD2的3′非翻译区,在转录后抑制该基因的表达,从而促进细胞的增殖[7],但是研究分析miRNA-17a*的作用还未见报道。
禽流感病毒呈世界性分布,是危害养禽业健康发展的主要疫病,1997年,人们首次发现禽流感病毒能够感染人,使禽流感成为一种能够引起人类感染的新型传染病,对人类健康造成了巨大威胁。目前,人类除了从传统的编码蛋白基因及其相关通路角度研究禽流感病毒的分子作用机理,miRNA作为一类对mRNA转录后调控的非编码小RNA越来越受到关注[8]。
本研究选择前期鸭高通量测序工作中检测到的miRNA-17a*,研究其相对表达量,并分析感染H5N1亚型禽流感病毒后的SPF鸭与对照组SPF鸭相同组织间的相对表达差异。结果表明,在对照组SPF鸭的肺脏中miRNA-17a*的相对表达量较高,推测miRNA-17a*可能对禽类的呼吸系统具有一定的调节作用。感染H5N1亚型禽流感病毒后,miRNA-17a*在气管中的相对表达量与非感染SPF鸭气管的相对表达量相比升高,表明感染H5N1亚型禽流感病毒后miRNA-17a*及其对应的靶基因主要对禽类的呼吸系统产生影响,这与其在SPF鸭不同组织中的表达结果相一致,因此预测miRNA-17a*可能在水禽的呼吸系统中具有重要的调节作用,其调控的靶基因可能在水禽中起到抑制病毒复制的作用。但是这还需要进一步预测miRNA-17a*的靶基因,分析靶基因与miRNA-17a*的作用机理。
参考文献
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H5N1禽流感疫苗的研究进展 篇4
在亚洲、欧洲、非洲, 高致病性禽流感 (H5N1株) 不断的在家禽和迁徙鸟类中爆发, 最近人类在感染这种高致病禽流感 (HPAI) 病毒和因HPAI病毒的病死率都在增加, 暗示着流感大流行仍威胁着人类, 诸如神经氨酸酶抑制剂等抗病毒药对预防和治疗H5N1感染是有价值的。但供应有限和耐药性限制其发展。疫苗作为控制流感大流行的一种主要手段, 受到各个国家的重视。因此, 发展H5N1疫苗被认为是主要的策略, 保护人类避免一个可能的H5N1的流感大流行大体上建立的普通人流感疫苗的原则也被应用到大流行H5N1的流感疫苗的发展上。但是, 发展H5N1疫苗也存在一些实际和科学上的挑战[1,2,3]。包括野生型H5N1病毒的高致病性, H5型HA弱的免疫原性以及少的关于禽流感HAS的抗原位点信息和禽流感感染相关的免疫保护。 不像发展普通流感疫苗那样, 发展H5N1疫苗还有其他壁垒。不同的方法已被用作产生侯选的人H5N1疫苗。以下是正在发展的一些H5N1疫苗以及一些基因操作的疫苗, 见表1。血抑实验对抗禽流感的保护性免疫:发展一个有效疫苗在于对拮抗自然感染的保护性免疫反应的了解, 特别是那些直接拮抗病毒的构成。见表2。
1 灭活疫苗
根据纯化工艺可将灭活疫苗分为3 种:全病毒疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。裂解疫苗使用去污剂处理裂解病毒中的脂类成分, 保留病毒的结构蛋白;亚单位疫苗主要由已去除其他病毒成分的HA 和NA 组成。与全病毒疫苗相比, 后2种疫苗在儿童和成人中的全身反应较弱, 尤其适用于儿童。
通常的策略是对全病毒和亚病毒颗粒的灭活流感疫苗使用的疫苗株, 必须是和流行的H5N1病毒的抗原相似[9]。有2种基本的方法准备诸如H5N1这样流感大流行的疫苗株。 (1) 是不用基因修饰自然出现的疫苗株病毒, 这种病毒具有疫苗生产低致病性和鸡胚高增殖性的特点。 (2) 是从感染病毒患者身上分离的病毒经过修饰生产的疫苗, 这种侯选的人的H5N1疫苗株使用反向遗传技术减弱病毒毒力, 其中HA和NA来源于人感染的病毒, 其余的流感病毒的基因就是病毒的骨架在鸡胚增殖良好。见图1[10,11,12,13]。
通过修饰H5N1HA的裂解位点使毒力减弱, 却没有改变病毒的抗原性。世界卫生组织已通过使用从人分离H1N1鸡胚高产的PR8为骨架病毒。但是大多数疫苗生产厂家报道基于反向遗传的病毒抗原产量低于季节性流感疫苗, 为了减少疫苗生产所需要的抗原量, 切需要从鸡胚中提高基于反向遗传的H5N1病毒的产量, 这就必须进一步了解流感复制能力的分子机制。一些高产的PR8和H5N1 6+2重组的病毒, 包括基于反向遗传技术生产的疫苗株NIBRG-14、VN/04xPR8-rg和VNH5N1-PR8/CDC-rg[14,15]。
2 减毒活疫苗
预防流感的另一种方法是接种减毒活疫苗。在25～26℃下鸡胚中连续传代得到减毒毒株, 即冷适应株, 这种病毒只能在25℃左右复制, 不能在37℃下传代, 因此其感染只局限于上呼吸道, 临床上无明显的流感症状。利用弱毒株与当前的流行毒株进行基因重组, 得到带有弱毒株片段和流行株的HA 和NA 基因的重组病毒。重组病毒保持了25℃下生长特性, 并具有流行毒株的抗原性。多项人体和动物研究证实, 冷适应毒株生物学性质有很好的稳定性。弱毒流感疫苗与灭活疫苗的免疫后抗体阳转率都在50%～70% , 能够有效控制流感的流行, 并且群体免疫的意义更重大, 未免疫人群的感染率与免疫率呈负相关。利用弱毒疫苗组成3价疫苗免疫, 毒株间的相互影响并不明显。应用结果表明如FluMist, 弱毒疫苗的安全性是肯定的, 没有发现疫苗株导致流感的情况发生, 并且重组病毒的基因型稳定, 在免疫人群中分离的病毒仍保持原来的抗原成分[16]。
3 DNA疫苗
自从第一次报道DNA疫苗能诱导保护性免疫, 流感的DAN疫苗引起人们普遍的注意。根据抗原的不同可以将流感病毒的DNA 疫苗分为: (1) 是利用HA、NA 构建的DNA 疫苗, 以诱导体液免疫为主; (2) 是利用NP 和MI 等构建的疫苗, 以诱导细胞免疫为主。免疫途径包括肌内注射和基因枪2种。有研究滴鼻免疫的方式, 试图获得黏膜免疫, 但效果并不理想。DNA 疫苗的优点在于其制备工艺简单, 成本低, 能诱导产生细胞免疫, 其缺陷是有潜在整合到染色体的危险等。
4 病毒载体的疫苗
一些病毒的载体已经被发展成递送H5N1病毒DNA已达到疫苗作用的目的。2种复制缺陷的腺病毒载体表达全长H5的HA (HA来源于A/Hong Kong/156/97或A/Vietnam/1203/04株) [17,18]被在老鼠和家禽中测试。其他测试H5N1疫苗的病毒载体包括痘病毒和新城疫病毒。基于病毒载体的疫苗通过局部黏膜或其它途径递送, 能诱导强的体液和细胞免疫, 以及应对不断演化变异H5N1病毒的交叉保护。腺病毒载体不需要佐剂和鸡胚培养就能诱导强烈的免疫反应。虽然这种疫苗设计主要被用来免疫禽类, 但它也可被用作控制致死性禽流感大流行高危人群的使用。
5 改变NS1基因的活的流感疫苗
一个更合理的方法产生活病毒疫苗的方法是使用改变非结构蛋白 (NS1) 的流感病毒, NS1主要作用是对抗宿主干扰素的产生[19,20]。依靠反义遗传技术删除非结构蛋白 (NS1) 的流感病毒, 不能在干扰素生成的感受太细胞中复制, 此外, 缺乏NS1蛋白的病毒可以产生高水平的干扰素和其他细胞因子以增加对这种病毒的免疫性[21]。这就暗示对比通常活的或死的疫苗使用删除非结构蛋白 (NS1) 的流感病毒疫苗能提高免疫反应, 用低剂量的疫苗就能诱导强的保护性免疫。反义遗传技术使删除非结构蛋白 (NS1) 的流感病毒能作为对抗H5N1流感病毒的疫苗株 (图1) 。奥地利的维也纳正在对这种疫苗的安全性和免疫原性进行临床一期研究。
6 通用流感疫苗
一种理想的流感疫苗应该是无论在流感大流行期间还是过渡阶段对各种亚型的流感病毒都有效, 利用保守的M2 [22]制备的流感疫苗不能保护已感染的人, 但它可以减少病毒的传播, 在动物模型可以明显减少病死率[23,24,25]。
7 细胞培养的流感疫苗
目前, 市场上灭活流感疫苗是用鸡胚生产的, 所以高质量鸡胚必须及时充足的供应才能保证生产[26]。用细胞替代鸡胚具有很大的优势, 细胞生产的过程的将更快, 更容易质量控制以及更大规模的生产。病毒在无血清甚至无蛋白的培养基培养将明显减少微生物的感染以及对鸡胚卵清蛋白的过敏[27]。用细胞替代鸡胚在哺乳动物细胞培养的流感病毒和那些人的临床标本将更相似。在哺乳动物细胞培养的流感病毒制备的灭活疫苗比鸡胚制备能诱导更多的血清抗体, 提供更强的保护[28]。2种哺乳动物细胞被MDCK和VERO系在一些国家已授权可以生产灭活的流感疫苗。PER.C6也正在被考虑用作流感疫苗的生产[29]。荷兰用MDCK细胞生产的H5N1表面抗原流感大流行的疫苗和澳地利用VERO细胞生产的全病毒颗粒疫苗正在进行临床实验。
禽流感病毒H5N1 篇5
1 材料与方法
1.1 试验材料
(1) 注射器, 针头, 70%的酒精棉, 可调移液枪, 移液嘴, 血凝板等。
(2) 试验动物:来自同一个孵化鸭厂的樱桃谷肉鸭。
(3) 疫苗及剂型、生产厂家:重组禽流感病毒灭活疫苗 (H5N1亚型, Re-1株) , 哈尔滨维科生物技术开发公司。
1.2 试验方法
(1) 试验动物分组:
把饲养条件相同的三群樱桃谷肉鸭随机分为A (2 000羽) 、B (1 300羽) 、C (1 800羽) 三组作为免疫试验组。
(2) 接种方式:
8日龄皮下接种 (A) 组、15日龄肌肉接种 (B) 组、21日龄皮下和肌肉混和接种 (C) 组。
(3) 接种时间:
2006年12月。
(4) 采样时间 :
2006年12月～2007年1月。
(5) 检测试剂来源:
标准阴、阳性血清和抗原购自哈尔滨兽医研究所。
(6) 检测方法及判定:
依据高致病性禽流感防治技术规范中附件记载的血凝和血凝抑制试验介绍的方法进行检测和判定, 即:以完全抑制4个血凝单位 (HAU) 抗原的血清最高稀释倍数作为血凝抑制 (HI) 滴度。抗体滴度不小于1:16判定合格。
2 检测结果与讨论
(1) A组为8日龄皮下接种组, 分别于当日接种前、接种后10 d、20 d、30 d采样检测数据, 如表1。
从表1可看到A组接种疫苗后10 d采样检测的抗体合格率为5.26%, 平均抗体滴度1:4.32;接种疫苗后20 d采样检测的抗体合格率为85.71%, 平均抗体滴度1:31.62;疫苗接种后30 d采样检测的抗体合格率为100.00%, 平均抗体滴度1:44.67。从中可得出8日龄樱桃谷肉鸭皮下接种疫苗所产生的抗体可保护到出栏。
(2) B组为15日龄肌肉接种组, 分别于当日接种前、接种后10 d、20 d采样检测数据, 如表2。
从表2可看到B组接种疫苗后10 d采样检测的抗体合格率为100.00%, 平均抗体滴度1:30.67;接种疫苗后20 d采样检测的抗体合格率为80.95%, 平均抗体滴度1:25.71。从中可看出在疫苗接种后10 d采样检测的抗体滴度B组比A组高, 在疫苗接种后20 d采样检测的抗体滴度B组比A组低, 说明皮下接种疫苗抗体产生较慢, 而维持时间较长;肌肉接种疫苗抗体产生较快, 而维持时间较短。
(3) C组为21日龄肌肉和皮下混合接种组, 即该群有部分鸭肌肉接种, 有部分鸭皮下接种, 并分别于当日接种前、接种后10 d、后20 d采样检测数据, 如表3。
从表3可看到C组接种疫苗后10 d采样检测的抗体合格率为96.67%, 平均抗体滴度1:39.73;接种疫苗后20 d采样检测的抗体合格率为77.27%, 平均抗体滴度1:44.09。C 组与A、B组比较而言有如下特点:其抗体平均滴度在逐渐升高, 而合格率在逐渐下降, 这主要是其日龄优势, 使其能产生较高免疫抗体, 但因其为混种, 所以兼有两者抗体消长的趋势, 涨跌互现, 从接种疫苗后20 d采样检测的数据来看, 其抗体滴度的分布比A、B两组分散。
3 小 结
根据以上数据的整理归纳和分析, 笔者初步得出如下一些结论:
(1) 试验A、B、C组在免疫接种前当日各采集了10份樱桃谷小鸭的血样进行禽流感抗体检测, 结果没有检测出相应抗体, 那么在接种禽流感疫苗时可以不用考虑母源抗体的干扰, 在接种疫苗后所检测到的抗体是机体接受疫苗免疫后产生的。
(2) 樱桃谷肉鸭不同日龄接种禽流感疫苗所产生的抗体滴度有差异。其接种禽流感H5N1疫苗后, 产生的抗体随日龄的增长而提高。对于樱桃谷肉鸭来说:因其生长快 (饲养期仅40 d左右) , 以10日龄左右接种禽流感疫苗较好。但不要低于8日龄, 因为笔者在检测5、6日龄接种禽流感疫苗的鸭时, 其产生的抗体在相应的时间段抗体滴度很低, 能达到1:16以上的样品几乎为零。
(3) 禽流感疫苗接种樱桃谷肉鸭不同部位产生的抗体消长时间不同。肌肉注射产生抗体升高较快, 接种10 d左右70.00%以上的肉鸭可以获得保护, 在20 d左右开始下降, 抗体持续的时间较短。皮下注射产生抗体较升高较慢, 但20 d左右后可以达到70.00%以上的合格率, 抗体持续的时间较长。依此, 可作如下建议:如果肉鸭日龄偏大 (20日龄左右) 则可肌肉接种疫苗, 以便鸭群较快产生抗体抵御高致病性禽流感病毒的侵袭。如果肉鸭日龄偏小 (10日龄左右) 则以皮下接种较优。而未满8日龄的肉鸭免疫接种产生的抗体滴度很低, 所以不宜给8日龄以下樱桃谷鸭接种禽流感疫苗。
(4) 只要按要求接种了有效禽流感H5N1疫苗, 鸭便能产生抗体, 在接种后20 d左右采样检测其抗体滴度合格率基本上能达到农医发[2005]27号文要求的70%以上, 差异是:产生抗体滴度的高低不同而已, 不可能出现抗体滴度为零的情况。
摘要：通过把樱桃谷肉鸭分成A (8日龄, 皮下接种) 、B (15日龄, 肌肉接种) 、C (21日龄, 肌肉和皮下混种) 三组, 对不同日龄、不同免疫接种途径接种禽流感H5N1疫苗的樱桃谷肉鸭做田间试验, 笔者发现其抗体产生和消长与日龄和接种途径关系密切, 即日龄大的鸭产生的抗体滴度高, 皮下接种产生的抗体慢、但持续时间长, 肌肉接种产生的抗体快、但维持时间短, 不过在免疫接种后20d采样检测的抗体滴度合格率都能达到70%以上, 以此可以指导樱桃谷肉鸭养殖户根据实际情况接种禽流感疫苗。
禽流感病毒H5N1 篇6
1 临床资料
患者, 男, 46岁, 主因发热、咳嗽、咳痰2 d, 于2009年3月26日16:00就诊。患者意识清楚, 面色红润, 四肢稍感乏力, 体温39.2℃, 即给予降温、抗病毒、抗感染等对症治疗。次日, 患者因高热未退, 再次就诊于我院发热门诊, 体温39.5℃, 咳嗽、咳痰为粉红色痰, 病情较昨日加重, 立即摄胸部X线示:肺上、中叶斑片状高密度影, 局部肺纹理紊乱, 查问病史, 患者前几日曾食家禽, 初步诊断:“人禽流感”、“肺部感染”收住院治疗。
第3日, 患者出现胸闷、恶心, 呼气费力, 口唇及四肢末梢轻度紫绀, 立即给予吸氧、心电监测、抗炎、抗病毒等治疗, 报告院方, 立即组织院内感染专家, 通知省疾控中心采样。检测结果示H5N1核酸阳性, 诊断为“人感染甲型H5N1致病禽流感”、“肺炎”, 给予机械通气、抗感染、激素、免疫调节等对症治疗。7 d后患者体温正常, 呼吸道、消化道症状缓解, 心电图示正常, 肺部病灶大部分吸收, 10 d后患者步行出院, 随访至今, 生理状况稳定。
2 护理措施
2.1 紧急召开专题会议研究防控工作, 护理部制定护理防控应急预案, 成立以院长为总指挥的领导小组, 各负责人亲临现场, 抽调全院专业技术力量强的护理人员, 成立特别护理小组, 进入重症监护病房。
2.2 组织全院护理人员进行禽流感防控知识培训, 印发资料, 下放到科室, 人手一册。让大家明白:禽流感是囊膜病毒, 对去污剂等脂溶剂比较敏感, 福尔马林、氧化剂、稀酸能迅速破坏其传染性;禽流感病毒没有超常的稳定性, 可在加热、非等渗和干燥的条件下失活;要正确掌握七步洗手法、如何穿脱隔离衣、各种急救器材的消毒措施等, 随机考核医护人员, 并作为以后继续教育学分。
2.3 加强住院环境管理。合理布局、专人管理、快速反应、超前部署, 按照防治“非典”的经验做好禽流感的防控工作[2], 建立医务人员防护流程措施。
禽流感病房医务人员防护流程见图1.
患者用物首先用高强度紫外线消毒1 h, 然后用1∶1 000的“84”消毒液浸泡1 h, 然后单独清洗。用后的垃圾分别用生活垃圾袋及医用垃圾袋密封, 送焚烧炉焚烧。使用过的医疗器械如内镜、导管、吸痰设备等, 在清洗时要穿戴防护用品达到高水平灭菌, 通过水洗、酶洗、再清洗消毒, 同时做好清洗消毒登记工作, 室温保持在20~24℃, 湿度35%~55%.
2.4 做好患者的管理严密观察生命体征变化, 按照危机管理的原则[3], 发现异常立即报告。患者既往有糖尿病史, 担心糖尿病病情加重, 心理压力很大。因有插管患者不能进行语言交流, 我们便通过图片、书写等方式向其宣传有关糖尿病知识, 消除其恐惧心理, 积极与医生配合。为改善呼吸功能, 防止呼吸衰竭, 气管插管应固定牢固, 防止滑脱, 方法是:采取交叉双固定, 记录外露长度, 每班交接, 气管内给予滴生理盐水每2 h1次, 每次5 m L, 以湿化气道;每4 h更换1次卧位, 手掌握成空心状叩背, 每次10 min~20 min, 利于痰液稀释;定时吸痰, 脱机后, 拔除气管套管, 给予面罩加压雾化吸氧, 观察患者呼吸困难改善情况, 症状缓解后, 采取鼻导管给氧, 将氧流量控制在2~4 L/min, SpO2维持在95%以上, 观察呼吸及血气分析各项指标正常后停止吸氧。指导患者在床上进行缩唇呼吸, 练习腹式呼吸、吹气球等方法, 使肺膨胀;练习吞咽动作, 给予流食, 因患者有糖尿病史, 在饮食上给予均衡营养, 合理控制碳水化合物, 饮食宜清淡、低脂少油、少糖少盐。
由于基础护理到位, 住院10 d, 患者无皮肤损害、肢体功能障碍等不适。
3 体会
紧急启动应对突发公共卫生事件应急预案, 是此次治疗禽流感患者的关键。加强护士对急发、新发传染病知识的学习, 严密的管理、完善的护理制度、有条不紊的护理措施是抢救成功的重要保障。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部、国家中医药管理局.人禽流感诊疗方案 (2005年修订版) [S].2005.
[2]王发强, 陈金宏.预防SARS实现院内零感染的几点探索[J].中华医院感染学杂志, 2003, 19 (3) :547-548.
禽流感病毒H5N1 篇7
为解决樱桃谷肉鸭的禽流感防疫问题, 笔者设想了超早期禽流感疫苗免疫方案。其原理是确保苗鸭有母源抗体, 使其在前10d能得到母源抗体的保护, 将疫苗注射时间提早至7日龄左右, 使雏鸭能在20日龄左右就能产生有效抗体, 尽量缩短整个生长周期的抗体空白期。为此, 特进行本试验, 现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于2008年4~5月在苍南县灵溪镇某樱桃谷肉鸭养殖场进行, 供试鸭为其存栏樱桃谷肉鸭5 000羽。禽流感疫苗由江苏南京梅里亚动物保健有限公司生产, 批号为20080413, 7日龄时每羽颈部皮下注射0.5mL。
1.2 试验方法
试验设3个处理组, 分别为:7日龄注射疫苗组 (A) , 12日龄注射疫苗组 (B) , 空白对照组 (CK) , 处理A组和处理B组各300羽, 余下为对照组 (CK) 。各组于1日龄、7日龄、12日龄、24日龄、32日龄随机抽20羽, 检测禽流感抗体。抗体检测采用血凝与血凝抑制法测定 (国标) , 具体由苍南县畜牧兽医局兽医实验室承担。
2 结果与分析
各组禽流感抗体滴度见表1。从表1可知, 各组第1天和第24天的滴度均相同。第7天各试验组经x2显著性检验, F=0.26
(log2)
3 结论与讨论
该批鸭存在母源抗体, 且均匀度好。笔者已经在苍南山区肉鸡防疫研究中揭示母源抗体的衰减规律服从线性关系, 从公式线性回归公式可以计算出母源抗体衰减至合格线4的日龄为9~10d。可见, 母代种鸭如果得到良好免疫, 可以确保前10个日龄的雏鸭对禽流感有免疫力。试验结果表明, 12日龄免疫比7日龄免疫的效果更好。可能是雏鸭太小了免疫应答器官发育不完全。此规律也与一些文献的报道相吻合。有抗体的个体在32日龄的抗体滴度基本上都大于或等于3, 其他则都为零。其原因可能是疫苗注射方法上不能保证每个个体都得到成功, 针头的深浅或者溢液造成免疫失败。据农户反映, 注射了疫苗的600羽鸭生长没有受到影响。
综上所述, 樱桃谷鸭超早期免疫有一定的意义。在10日龄左右注射禽流感疫苗, 估计在30日龄前可以产生合格的滴度。应进一步研究注射方法对抗体产生的影响。要加强对1日龄雏鸭的抗体检查, 确保有母源抗体。在12~30日龄是抗体的空档期, 应特别加强对禽流感病毒的防范工作。
参考文献
[1]占松鹤, 刘华.不同家禽红细胞悬液检测水禽禽流感抗体对比试验[J].畜牧与饲料科学, 2009 (5) :11-13.
[2]董海岚, 惠煜, 牛萍, 等.樱桃谷鸭禽流感抗体消长规律的试验[J].中国兽医杂志, 2009 (5) :41.
[3]刘宇卓, 魏和生, 黄福林, 等.一株鸭源49亚型禽流感病毒分离株生物学特性研究[J].江西农业学报, 2007 (9) :97-99.
[4]翁秋美, 林金远, 林丽红, 等.雏番鸭禽流感母源抗体水平对首免抗体的影响[J].福建畜牧兽医, 2008, 30 (5) :9-10.
[5]刘胜安, 王勇, 何建强, 等.不同免疫方式对白鸭禽流感免疫效果的研究[J].养禽与禽病防治, 2007 (9) :2-3.