睾丸生殖细胞（共7篇）
睾丸生殖细胞 篇1
患者男,19岁,6个月前自觉右侧睾丸结节,大小约为1cm,无疼痛、发热等不适,未予处理,4个月前运动时碰伤睾丸,随后右侧睾丸逐渐增大,伴疼痛,无发热。专科检查,右侧睾丸增大,质硬,有压痛。实验室检查:绒毛膜促性腺激素(β-HCG)50 096 m IU/ml,甲胎蛋白(AFP)755.34 ng/ml,癌胚抗原(CEA),糖类抗原(CA199),神经原特异性烯醇化酶(NSE)正常。
磁共振成像(MRI)平扫T1WI显示右侧睾丸体积增大,正常睾丸实质未见显示,其内见团块状混杂信号,大小约为6.5cm×6.7 cm×6.4 cm,其内见斑片状高信号(图1),T2WI-FS显示肿块呈高低混杂信号,肿块中心、周边见多发类圆形长T2信号囊变坏死区及小分隔,呈“蜂窝状”,以周边多发为著,对比T1WI部分斑片高信号减低,被抑制(图2),弥散加权成像显示(DWI)肿块部分弥散受限,呈较高信号(图3),矢状位T2WI显示肿块边缘清晰,见短T2的低信号包膜(图4),常规及动态增强显示肿块边缘、实性部分呈斑片状渐进性不均匀强化,部分分隔和肿块内囊壁可见强化(图5~6),双侧腹股沟区可见多发淋巴结影,直径约为0.9~1.2 cm。诊断:右侧睾丸恶性肿瘤,考虑生殖细胞肿瘤。
手术所见右侧睾丸肿物,大小约7 cm×6 cm,边界清晰。大体病理:切面灰白色,质硬,未侵及右侧精索。睾丸组织内见片巢状分布的异型细胞,细胞体积大、合体状、胞质中等或丰富、核深染,核仁明显,核分裂像易见,提示为绒毛膜癌区域,另有部分胞质透亮的细胞呈腺泡状或微囊状排列,提示为卵黄囊瘤区域,并见分化尚成熟的腺上皮、鳞状上皮及神经组织等,提示畸胎瘤区域,肿瘤侵犯白膜伴大片出血、坏死,可见较多脉管内瘤栓,未见明确神经束侵犯;附睾、精索均未见肿瘤。免疫组织化学:AFP部分(+),β-HCG(+),CD30部分(+),SALL4(+),PLAP部分(+),OCT-4部分(+),CD117(-),CK(-)。病理诊断:混合性恶性生殖肿瘤,成分含有绒毛膜癌(约65%),卵黄囊瘤(约20%)、畸胎瘤(约15%)(图7~8)。
讨论睾丸混合性生殖细胞瘤(mixed germ cell tumors,MGCTs)是一种来源于原始生殖细胞的少见恶性肿瘤,占非精原生殖细胞瘤的32%~60%,多包含一种以上生殖肿瘤成分,以2种生殖细胞成分构成为多见,其中以胚胎性癌和畸胎瘤混合多见。好发于20~35岁青年男性患者,以北美和新西兰发病率高。临床表现无特异性,多以睾丸逐渐性增大的肿块就诊,合并出血坏死时可伴有疼痛。
睾丸恶性肿瘤的MRI表现与其病理改变有关[1],绒毛膜癌,多见明显出血坏死,而出血多表现为稍短T1、稍长T2信号,坏死多表现为长T1、长T2信号,文献报道颅内绒毛膜癌肿瘤卒中是其特征性表现之一[2],而绒毛膜癌单独发生于睾丸少见,由于其病理基础相同,MRI表现具有相似性,肿瘤内见出血信号,增强扫描肿瘤实性部分呈斑片状明显强化,而出血部分未见强化,则可能有一定的提示意义。卵黄囊瘤多表现为囊实性肿块,其中囊性以中心多见,但本例位于中心及周边,并可见小分隔,呈“蜂窝状”改变,增强扫描实性部分呈斑片状、片絮状不均匀性强化,并呈渐进性强化,这与文献报道卵黄囊瘤的影像表现相符合[3],囊性病灶部分囊壁及分隔可强化,中央未见强化,有文献甚至认为肿块内伴有明显液化是非精原细胞性生殖细胞肿瘤的重要影像特征[4]。而畸胎瘤则容易诊断,若发现肿块内含有脂肪和钙化等成分则可明确诊断,在MRI上脂肪的信号较具特征,呈稍短T1、稍长T2信号,T2WI-FS脂肪信号明减低,因此对于临床怀疑畸胎瘤的患者,必须辅以脂肪抑制序列。
MGCTs信号混杂主要由病理基础决定,本例是由绒毛膜癌、卵黄囊瘤、畸胎瘤3种成分构成,,其中绒毛膜癌成分占最大比例,此种组合少见,由于这3种肿瘤恶性程度均较高,生长速度较快,肿块易发生缺血坏死,故在MRI的T1WI和T2WI均表现为混杂信号为主,同时对比T1WI表现为高信号的部分,在T2WI-FS被抑制,提示含有脂肪,对照病理,该信号为畸胎瘤成分。
图1 T1WI显示右侧睾丸增大,内见混杂信号肿块,并可见斑片状高信号
图3 DWI显示肿块部分弥散受限
图4矢状位T2WI显示肿块边缘清晰,见短T2的包膜
图5增强显示肿块边缘及实性部分呈渐进性不均匀强化,肿块内囊性部分无强化(a:横断位;b:冠状位)
图6绒毛膜癌:睾丸组织内见片巢状分布的异型细胞,细胞体积大、合体状、胞质中等或丰富、核深染,核仁明显,核分裂像易见(HE染色×400)
图7畸胎瘤:成熟的腺上皮、鳞状上皮及神经组织(HE染色×200)
图8卵黄囊瘤:胞质透亮的细胞呈腺泡状或微囊状排列(HE染色×200)
本病需与睾丸间质性细胞瘤、恶性淋巴瘤相鉴别。睾丸间质细胞瘤多发生在睾丸外周部位,边界清晰,其特征是肿瘤周围有正常睾丸组织,增强扫描病灶明显强化。而恶性淋巴瘤好发于50岁以上老年男性,双侧多见,肿块呈弥漫性生长,T1WI呈等低信号,T2WI以低信号为主,增强后轻度强化,精索、附睾常常受累。
MGCTs病理成分复杂,术前诊断困难,但密切结合临床,如血HCG、AFP明显升高,结合MRI特点,术前可做出一些提示性诊断,最终确诊需依赖病理和免疫组织化学。
参考文献
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鸡睾丸生精上皮细胞冷冻保存研究 篇2
1 材料与方法
1.1 试验材料
广西土鸡(Guangxi native broilers)鸡苗,购自湖州广东温氏畜牧有限公司,常规饲养。
1.2 主要试剂
高糖DMEM培养基、胎牛血清,购于Gibco试剂公司;AKP试剂盒,购于华美生物工程有限公司;神经胶质细胞衍生的营养因子(GDNF),购于CytoLab Ltd.; Hoechst 33342、碘化丙锭、胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶(0.25%)、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、碱性成纤维细胞因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、干细胞生长因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF),均购于美国Sigma(St.Louis,MO,USA)试剂公司。
完全培养基:在含10%胎牛血清、2%鸡血清的高糖DMEM培养液中添加1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、10 ng/mL bFGF、10 ng/mL hIGF、10 U/mL LIF、5 ng/mL SCF、5.5×10-5 mol/L β-巯基乙醇、10 ng/mL GDNF。
1.3 石蜡切片
取4对睾丸用Bouin氏液固定,2 d后进行常规石蜡切片(切片厚度为5 μm)和H.E.染色,用光学显微镜(Motic BA400)观察,拍照。
1.4 生精上皮细胞悬液的制备
取20～30日龄公鸡用75%酒精消毒腹部,获取两侧睾丸,置于含双抗的PBS中浸洗3次;在体视显微镜下仔细剥离白膜和血管,剪碎,加入适量无钙离子、镁离子的PBS吹打数次,移入离心管中静置5 min;弃上清液,用10倍于组织块体积的胶原酶(1 mg/mL)消化,37 ℃作用30 min,期间每隔5 min混匀1次;第1次酶解后500 r/min离心2 min,弃上清液,之后用胰蛋白酶-EDTA(0.25%)消化5 min;收集细胞悬液,加含血清的培养基终止消化,用300目不锈钢网筛过滤,过滤液以1 200 r/min离心5 min;弃上清液,重新悬浮细胞,取少量细胞进行活率检测,剩余细胞用于冷冻保存研究。
1.5 细胞活率的检测
在1 mL细胞悬液或培养液中加入Hoechst 33342 6 μL、碘化丙锭8 μL,轻轻混匀后 37 ℃避光孵育15 min,荧光显微镜下观察,死细胞呈红色,活细胞呈蓝色[4]。
1.6 冷冻-复苏程序
生精上皮细胞沉淀加入4 ℃预冷的防冻液,悬浮后调整细胞浓度至5×106个/mL,分装于冻存管中;将冻存管置于4 ℃冰箱中平衡1 h,然后将冻存管装进隔热盒中,置-80 ℃冰箱中过夜,第2天转移到液氮中贮存。在液氮中贮存2周后,将冻存管取出迅速放入37 ℃水浴锅中,不时摇动,在1 min内使其完全融化,然后在超净台内无菌取出细胞,逐滴加入适量DMEM洗涤1次。
1.7 防冻液的筛选
1.7.1 不同浓度DMSO对生精上皮细胞冷冻保存效果的比较
在DMEM中加入20%胎牛血清和不同浓度的DMSO(2.5%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%),以复苏后细胞活率为指标确定DMSO的最佳浓度。
1.7.2 不同浓度蔗糖对生精上皮细胞冷冻保存效果的比较
以含20%胎牛血清和10% DMSO的DMEM为基础防冻液,以复苏后细胞活率为指标,比较不同浓度(0,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mol/L)的蔗糖对生精上皮细胞冷冻保存效果的影响。
1.8 复苏后的培养与鉴定
1.8.1 复苏后的原代培养
用含20%胎牛血清、10% DMSO、不含蔗糖的DMEM为防冻液冻存,复苏后的生精上皮细胞洗涤后用完全培养基调整细胞浓度为6×105个/mL,然后接种于24孔培养板上,于37 ℃、5% CO2培养箱中混合培养,24 h后换液以除去死细胞;每24 h观察1次,每48 h换掉2/3的液体。
1.8.2 AKP染色、鉴定
体外原代培养4～5 d 获得的SSCs集落进行AKP活性检测。孔板用PBS清洗3次后加入固定液固定15 min;再用PBS清洗3次去除固定液,加入新鲜配制的BCIP/NBT染色液,避光染色20 min;PBS清洗后,倒置显微镜下观察、拍照。
1.9 统计分析
试验重复4次,数据用平均值±标准差表示,组间资料应用单因素方差(One-way ANOVA)分析, P<0.05视为有显著性差异。各项统计均用SPSS 10.0软件在计算机上完成。
2 结果
2.1 石蜡切片观察结果
出壳后20～30 d的公鸡睾丸曲细精管结构典型,SSCs已经形成,但只有1层单层细胞,未见分化的生精细胞。SSCs和支持细胞都排列在曲细精管的基底膜上,两者形态差异明显:SSCs细胞核较大,呈圆形;而支持细胞核较小,呈细长梭形(见图1)。
注:粗箭头所示为SSCs,细箭头所示为支持细胞。
2.2 生精上皮细胞悬液的制备和活率检测
经两步酶消化,平均每个20～30日龄公鸡睾丸大约能够得到2×106～6×106个生精上皮细胞。细胞悬液经Hoechst 33342/碘化丙锭双重荧光染色,细胞活性清晰可辨,死细胞呈红色,活细胞呈蓝色,平均活率高达95%以上。
2.3 防冻液的筛选
不同浓度DMSO对生精上皮细胞冷冻保存效果的影响见图2。由图2可见,DMSO的最佳浓度为10.0%,与其他各组差异显著(P<0.05)。不同浓度蔗糖对生精上皮细胞冷冻保存效果的影响见图3。由图3可见,添加蔗糖对生精上皮细胞冻存有害,随着蔗糖浓度的增加,细胞活率随之下降。
注:图中字母不同表示差异显著(P<0.05)。
注:图中字母不同表示差异显著(P<0.05)。
2.4 复苏后的培养与鉴定
生精上皮细胞冻存复苏后平均活率为(67.08±4.54)%。用完全培养基稀释后混合培养,刚接种时细胞为圆形,以均一的单细胞状态存在;1 h后支持细胞开始贴壁;2～3 h后绝大部分生精上皮细胞都已贴壁;24 h后支持细胞铺展呈长梭形或成纤维细胞状,面积较大,两侧有多个突起;SSCs为圆形,贴附在支持细胞上,单个或两个成串存在。混合培养4～5 d后,可见典型的SSCs葡萄串状集落(见图4),集落AKP染色呈深褐色,为阳性;而支持细胞单层不着色,为AKP阴性(见图5)。
3 讨论
SSCs属于成体干细胞,由性原细胞(gonocyte)发育分化而来。试验通过石蜡切片观察证实,公鸡在20～30日龄SSCs已经形成,且未发生分化,此时应是鸡SSCs取材的理想时期。Jung J G等[2]发现,4周龄莱航鸡睾丸细胞中诸多干细胞标志阳性细胞占0.33%～0.44%,显著高于24周龄的0.029%～0.072%。这也说明以幼龄动物为供体可获得纯度较高的SSCs。当然,并非供体日龄越小越好。李碧春等[5]发现,在孵化第16～19天鸡胚睾丸曲精细管的管腔中分布着精原细胞(即性原细胞),可见在鸡胚阶段SSCs尚未形成。
通过Hoechst 33342/碘化丙锭双重荧光染色可以准确地检测细胞活率[4]。DMSO是细胞冻存中最常用的渗透性防冻剂。试验通过检测细胞活率这一指标,发现对于鸡生精上皮细胞冷冻保存,DMSO的最佳浓度为10%,过高过低都会显著降低细胞活率。这与李碧春等[3]关于鸡胚精原细胞体外冷冻保存的报道一致。Izadyar F等[6]也用10%的DMSO成功地冻存了牛的A型精原细胞(包含SSCs)。但Izadyar F等[6]认为添加蔗糖对冻存牛A型精原细胞有利,蔗糖浓度为0.07 mol/L效果最好。本试验却发现添加蔗糖对冻存鸡生精上皮细胞有害,添加浓度越高对细胞的毒性越大。这可能是因为鸡生精上皮细胞对高渗透压敏感,在防冻液中添加蔗糖也就提高了溶液的渗透压,从而对细胞产生了高渗打击。
试验采用含20%胎牛血清的DMEM为基础培养液、10% DMSO为防冻液进行冻存,复苏后生精上皮细胞原代混合培养可形成典型的SSCs集落,集落呈碱性磷酸酶阳性,说明以10% DMSO为防冻剂的冷冻体系适合鸡睾丸生精上皮细胞冷冻保存,并且能够保存SSCs的增殖能力和干细胞潜能,为鸡SSCs移植、转基因等应用研究打下了基础。关于鸡SSCs冷冻保存方法的优化以及冻存后长期传代培养和鉴定还需要进一步研究。
参考文献
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睾丸生殖细胞 篇3
关键词：支持细胞,体外培养,小鼠,分离,纯化
支持细胞(sertoli cell,SC)也称足细胞,是由早期发育的胚胎生殖嵴细胞分化而成,与精原细胞一起构成睾丸曲细精管。睾丸支持细胞是柱状的大型细胞,其基底部接在曲细精管基底膜上,另一端突向曲细精管腔形成树枝状的突起[1,2]。在光镜下观察时,支持细胞呈不规则的三角形或多边形,核仁明显。电镜下观察时,支持细胞呈不规则三角形或多边形,侧面和腔面有许多不规则凹陷。胞质内有许多微丝和微管,相邻睾丸支持细胞侧面近基部的胞膜形成紧密连接。在精子的形成过程中,卵泡刺激素(FSH)与支持细胞膜上的FSH受体结合,激活腺嘌呤核苷酸环化酶,产生磷酸腺苷(cAMP),后者再激活磷酸化酶,使m RNA活化,产生雄激素结合蛋白(ABP),ABP与睾酮结合,维持曲细精管内睾酮的浓度,造成生精细胞分化成熟的环境。
多年来,支持细胞的功能被认为是生精细胞的支架,为生精细胞提供必需的营养物质,可分泌缪勒管抑制物(MIS)、ABP以及多种生长因子(如TGF-α、TGF-β、b-FGF、EGF-α、EGF-β、IGF-1等),也对精原细胞的体外分化培养起着至关重要的作用[3,4]。因此,支持细胞体外培养是进行生殖细胞培养研究的基础,目前已有多种支持细胞体外培养方法,并已建立永生支持细胞株。
另外,由于支持细胞表达并分泌自杀相关因子配体(FasL),从而被用于睾丸以外的部位,为移植的细胞提供免疫豁免的环境,为糖尿病和帕金森病的治疗开辟了广阔的前景;此外,支持细胞在体外可促进神经元以及胰岛细胞的存活及功能的发挥。近期还有人报道了支持细胞用于体细胞克隆的可能性。所有这些均说明支持细胞的功能非常广泛,应用前景广大,其具体的作用机制以及更广泛的应用有待于人们去进一步开发。
1 材料
F12/DMEM培养基,Gibco公司生产;胎牛血清(FBS)、胶原酶Ⅳ、胰蛋白酶和透明质酸酶、油红O、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES),Sigma公司生产;青霉素、链霉素,哈药集团制药总厂生产;谷氨酰胺,Merk公司生产。
生物安全柜,HFD公司生产;CO2培养箱,Termo公司生产;低温高速离心机,Eppendorf公司生产;倒置显微镜,Nikon公司生产;电子分析天平,沈阳龙腾电子有限公司生产;超低温冰箱,NBS公司生产;超纯水制备机,PALL公司生产;低温冰箱,SANYO公司生产;4℃冰箱,海尔集团生产;磁力搅拌器,杭州仪表电机厂生产;数显恒温水浴锅、培养皿、解剖用眼科剪刀、眼科直头镊子、眼科弯头镊子、显微镊子、200目钢筛、离心管(2 m L、15 m L、50 m L)和移液枪及枪头,江苏常熟医疗机械厂生产。
16～22日龄睾丸发育良好的雄性昆明小白鼠10只,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。
2 方法
2.1 小鼠睾丸细胞悬液的制备及支持细胞的分离
取16～22日龄雄性昆明小白鼠10只,采用颈椎脱臼法处死,在无菌条件下,切开阴囊取出睾丸,去除睾丸白膜和血管,暴露生精小管,用D-Hank’s液反复冲洗;用吸管轻轻吹打以吹散精曲小管,再用小剪刀将生精小管剪成1～4 mm长的碎块;加入10倍于组织体积的1 mg/m L胶原酶溶液,于37℃、5%CO2条件下孵育15 min(期间晃动数次);1 000 r/min离心5 min;弃去上清液,加入0.25%胰蛋白酶和1.5 mg/m L的透明质酸酶溶液作用15 min;加入适量的血清终止消化,用200目钢筛过滤悬液,收集滤液,以1 000 r/min离心5 min;弃去上清液,用D-Hank’s液洗涤2～3遍,然后用F12/DMEM洗涤2次。
2.2 支持细胞的纯化
将分离的细胞悬液用Tris-HCl溶液(0.05 mol/L,pH值为7.4)低渗处理(3～5 min)以除去混杂的其他睾丸细胞;利用睾丸支持细胞贴壁而生殖细胞不贴壁的性质,培养24 h弃去悬浮于培养液中的杂细胞。纯化后,活细胞含量和支持细胞的纯度可进一步提高。
2.3 支持细胞的培养及其生长曲线的绘制
将分离得到的细胞在倒置显微镜下用细胞计数板进行计数,并采用台盼蓝染色判断睾丸支持细胞的活性,重新加入含10%胎牛血清的F12/DMEM培养液调整细胞密度为(3～3.5)×106/m L,培养24 h;弃去培养液,进行细胞计数;加少量20 mmol/L Tris-HCl液,低渗处理细胞3～5 min;再用Hank平衡盐溶液(HB-SS)冲洗2次,去除大部分生精细胞,加入含10%胎牛血清的F12/DMEM培养液,重新调整细胞密度,置于37℃、5%CO2、100%湿度条件下培养[5]。
取传至第3代刚好铺满瓶底、生长旺盛的睾丸支持细胞,用D-Hank’s液清洗后,用0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化2～3 min;用培养液中和,吹打成单个细胞,调整细胞浓度为3×104/m L,接种在24孔细胞培养板中,每孔接种1 m L,于37℃、5%CO2、100%湿度条件下培养,每24 h消化收集细胞,用血细胞计数板计细胞数,每次计3孔,每孔计2次,取平均值,连续计数8 d,每天1次。绘制细胞生长曲线。
2.4 支持细胞的形态、结构和生长增殖情况
2.4.1 H.E.染色
用0.25%的胰酶对汇合度达到80%的原代支持细胞进行消化并洗涤,然后将其接种在培养皿中,且放入经多聚赖氨酸包被的盖玻片,继续在培养箱中培养以制作细胞爬片;将贴有支持细胞的爬片用37℃、无Ca2+、Mg2+离子的PBS漂洗3次,每次20～60 s;浸入95%的乙醇中固定15 min;用上述PBS洗2次,每次1 min;将盖玻片浸入苏木精染液中5～10 min;用去离子水洗涤,浸入稀盐酸乙醇溶液中数秒钟;用去离子水洗涤,浸入淡氨水中3～5 min;用自来水洗涤干净,浸入伊红染液中5～10 min;用去离子水洗涤,通过70%、80%、90%乙醇各1次,95%乙醇2次,100%乙醇3次,每次1 min;通过二甲苯3次,每次1 min;用中性树胶封片,观察细胞和细胞核形态。
2.4.2 油红O染色
将贴有支持细胞的爬片用10%的中性甲醛固定12～15 h;再用70%乙醇洗涤数次后,加入0.5%的油红O,室温下染色10 min;弃去染液,经过70%乙醇洗涤后,用去离子水洗涤干净,苏木素复染2 min;用中性树胶封片,观察细胞和细胞核形态。
3 结果与分析
3.1 台盼蓝染色活率鉴定
细胞活率=[1-染色细胞数/细胞总数]×100%=1-13/181=92.81%。混合细胞台盼蓝染色结果见180页彩图1。
3.2 支持细胞的生长曲线(见图2)
由图2可以看出,睾丸支持细胞在培养至第2天时进入对数生长期,细胞增殖旺盛,至第6天时进入平台期,增殖速度开始减慢,但培养至第7天仍没见到凋亡的细胞。
3.3 支持细胞生长状况的观察
支持细胞贴壁性良好,接种后游离时间很短,一般4 h以后细胞开始发生极化,伸出突起,胞质拉长。体外培养10 h后完全贴壁,随即进入增殖期。培养24 h后弃去培养基,并经过Tris-HCl低渗处理后,可见胞体较大,呈长柱状贴壁生长,有的出现2个或多个突起,折光性较强。培养48 h后,可见睾丸支持细胞体积增大,呈不规则形,胞核清晰可见,位于胞体的中央或稍偏位。随着培养时间的延长,睾丸支持细胞的折光性降低,增殖减慢,细胞的连接非常紧密。各个培养阶段的支持细胞见180页彩图3～6。
3.4 H.E.染色
睾丸支持细胞呈长柱状或不规则的多边形,有3～4个突起,胞质铺展很大,被染成红色。细胞核为1个或多个,呈圆形或卵圆形,被染成淡蓝色或蓝紫色(见180页彩图7)。
3.5 油红O染色
睾丸支持细胞经油红O染色后,显微镜下观察可见胞质中有大小不一的圆形或卵圆形的空泡状结构,被染成红色或桔红色,这些空泡状结构是脂质小滴,存在于细胞的两极或核的周围(见180页彩图8)。
4 讨论与结论
4.1 对小鼠日龄的选择
由于睾丸支持细胞在睾丸中所占比例很低,因此分离的纯度常受到生精细胞及间质细胞的影响。胚胎鼠睾丸中生精细胞较少或不存在,但睾丸支持细胞产量亦较低;成年鼠睾丸中含有大量的生精细胞,所得睾丸支持细胞纯度较低。故试验选取16～22日龄的幼鼠,其睾丸均未下降到腹腔,曲细精管的生精上皮内主要有支持细胞和精原细胞两类细胞。这样既保证了产量,也提高了细胞的纯度。
4.2 睾丸支持细胞悬液的制备方法
适当的分离程序及消化分离方法对制备良好单细胞悬液非常重要。16～22日龄小白鼠的睾丸主要由支持细胞与各级生精细胞组成生精上皮,其中支持细胞基部位于由多层细胞及非细胞成分组成的固有膜上,故采用胶原酶和胰蛋白酶进行联合消化[6,7]。取出睾丸之后,先用显微镊子仔细去除脂肪垫及睾丸白膜,然后将睾丸组织剪碎,反复离心冲洗以去除血细胞,进行胰胶原酶消化时,将睾丸间质消散后,静置沉淀或低速离心,去除掉大部分间质组织及管周肌样细胞;再进行胰蛋白酶和透明质酸酶消化,去除基底膜部分并使曲细精管内细胞充分散开,释放出睾丸支持细胞和精原细胞,消化后的细胞组织液用200目滤网过滤,进一步去除筋膜,以去除大部分成纤维细胞,提高睾丸支持细胞的纯度。国外相关的文献报道和笔者的试验结果表明,这种多步骤消化过程能有效地分离到纯度较高的曲细精管段并获得较高产量的单细胞悬液,减少酶对细胞的损伤,同时确保去除大部分间质成分、管周肌样细胞。
4.3 细胞悬液的低渗处理
通过对前人方法的改进,试验在分离细胞过程中将分离的细胞悬液用0.05 mol/L的Tris-HCl低渗处理,以去除混杂的部分精原细胞和间质细胞,然后利用培养时睾丸支持细胞贴壁而生殖细胞不贴壁的特性,培养至24小时弃去悬浮于培养液中的杂细胞。通过该方法纯化后,平均每个睾丸可获得2×106个细胞,活细胞占总数的95%以上,睾丸支持细胞的纯度可达90%。与以往学者在39℃条件下培养48 h以去除精原细胞、纯化睾丸支持细胞的方法相比,明显降低了高温对细胞的损害,提高了睾丸支持细胞的纯度和活率。
4.4 睾丸支持细胞的形态、结构和生长、增殖
睾丸支持细胞分离培养至第3天时体积增大,膜状铺在培养皿底壁上,相互间连接呈网状。随着培养时间的延长(培养5～6 d后),睾丸支持细胞融合成片,折光性减弱。但睾丸支持细胞在体外培养时活性很强,培养至2周时,细胞仍存活良好,经H.E.染色、光镜下观察可见睾丸支持细胞呈宽大的柱状或不规则状,有多个粗大的突起,细胞核呈圆形或卵圆形,核膜上有小凹。睾丸支持细胞经油红O染色后,显微镜下观察可见胞质中散在有圆形、卵圆形、大小不一的空泡状结构。这些空泡状结构是脂质小滴,被染成红色或桔红色,聚集于睾丸支持细胞的两极或散布于核的四周。鉴定结果表明,含有红色或橘红色空泡状结构的细胞为睾丸支持细胞。
4.5 睾丸间质细胞与支持细胞的相互作用
间质细胞能够在促黄体生成素(LH)的作用下合成和分泌雄激素,而支持细胞能够在FSH的作用下使间质细胞产生的雄激素发生芳香化反应;雄激素又可促进支持细胞产生ABP并影响其他代谢功能。支持细胞的分泌产物可以通过旁分泌途径调节间质细胞的功能。研究表明,间质细胞的主要功能是合成和分泌雄激素,即一类含19个碳原子的类固醇激素,主要有睾酮、雄烯二酮等。支持细胞对生殖细胞具有支持和营养作用,同时还可形成睾丸内微环境、构成血睾屏障、吞噬细胞残体、调节精子的发生、产生类固醇类物质及分泌100余种不同的蛋白质以调节生殖功能。研究已证实支持细胞维持着睾丸组织的免疫豁免。总之,支持细胞通过分泌雄激素和一些含氮类细胞因子间接或直接地作用于间质细胞,在支持细胞与间质细胞之间形成短环式结构,以优化间质细胞的雄激素生成过程。间质细胞产生的睾酮对支持细胞的分泌功能起促进作用;间质细胞还产生非类固醇性调节物质对支持细胞的分泌功能具有抑制或者促进作用[8]。
参考文献
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[3]MERONI S,CANEPA D,PELLIZZARI E,et al.Regulation of gam-ma-glutamyl transpeptidase activity by Ca(2+)-and protein ki-nase C-dependent pathways in sertoli cells[J].Int J Androl,1997,20(4):189-194.
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[5]许少华,郭筠秋.大鼠睾丸支持细胞的分离及培养方法[J].哈尔滨医科大学学报,2001,35(3):185-188.
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[7]李玉荣,白瑜,尹晓敏,等.大鼠睾丸支持细胞体外培养及FSH对其增殖的影响[J].河北农业大学学报,2008,31(3):73-76.
睾丸生殖细胞 篇4
关键词：不育症/中医病机,脾气虚,生精细胞,细胞凋亡,大鼠,男 (雄性)
脾气虚是引起男性不育的主要原因之一, 迄今为止, 脾气虚引起不育的病理机制尚未完全阐明。细胞凋亡存在于正常生精过程中, 但若生精细胞大量凋亡, 则会导致生精障碍[1]。本实验通过建立大鼠脾气虚的动物模型, 采用流式细胞仪 (FCM) 检测模型动物生精细胞凋亡状况, 从而探讨脾气虚引起不育的病理机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
选用体重 (200±20) g雄性Wistar大鼠40只, SPF级, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供, 动物合格证号:SCXK (鄂) 2004-0007。随机分为正常组、21天模型组、35天模型组及50天模型组, 每组10只。大鼠自由饮水和采食, 室温 (25±1) ℃, 光照明暗各12小时, 适应性喂养1周后进行实验。
1.2 药物及制备
大黄水煎液:生大黄由湖北中医药大学附属门诊部提供, 水煎制成含生药量0.2g/ml的混悬液。
1.3 动物模型的建立
采用苦寒泻下加劳倦过度法[2]。即每日上午以1.5 ml/100g体重灌胃大黄水煎液1次, 每日下午让大鼠负重游泳1次 (于大鼠尾根部缠绕重量为该大鼠体重10%的保险丝, 将其放入水深50cm、水温 (20±5) ℃的水槽中游泳, 至力竭为度 (大鼠鼻尖没入水面10秒)
1.4 标本的采集与处理
睾丸生精细胞单细胞悬液的制备:给药结束后次日, 处死大鼠, 取大鼠左侧睾丸组织, 按照文献[3]方法, 制备单细胞悬液。取睾丸组织约1g剪碎, 加入0.25%胰蛋白酶3 ml, 37℃水浴25分钟, 300目尼龙网过滤, 取滤液, 1 500 r/min离心10分钟, 弃上清, 然后加入PBS 3ml, 振荡, 1 500 r/min离心10分钟, 去上清, 再次加入PBS 3ml振荡后1 500 r/min离心10分钟, 去上清, 加入3ml 4℃70%乙醇封存于冰箱中。3天后离心出细胞液, 用PBS稀释细胞数致1×106个/ml, 常温下PI染色15~20分钟, 420目筛网过滤, 取1滴在荧光显微镜下观察, 若细胞核呈明亮的橙红色荧光, 即可上机分析。每份标本检测细胞数为20 000。实验数据采用细胞仪附带的软件进行分析。
1.5 观察指标检测
采用FACS 420型流式细胞仪 (美国BD公司) 对睾丸生精细胞单细胞悬液进行定量分析, 每份标本检测细胞数为20 000。在FCM分析的细胞分布直方图上, 正常睾丸组织由3类细胞群组成, 就其DNA含量分别排列在相应的峰道内。1C峰:单倍体DNA细胞群, 包括精子细胞和精子;2C峰:二倍体DNA细胞群, 主要包括G0期精原细胞、次级精母细胞;4C峰:四倍体DNA细胞群, 主要包括初级精母细胞、G2期精原细胞。若在1C峰前面出现一个显著的峰即为凋亡细胞峰[4]。
1.6 统计学分析
使用SPSS 10.0统计软件进行方差分析。
2 结果
2.1 各组大鼠睾丸生精细胞凋亡率测定
见表1, 图1。
与正常组比较#P<0.05, ##P<0.01;与21天模型组比较*P<0.05, **P<0.01;与35天模型组比较△P<0.05
2.2 各组大鼠各级生精细胞百分比的比较
见表2。
与正常组比较较#P<0.05, ##P<0.01;与21天模型组比较*P<0.05, **P<0.01;与35天模型组比较△P<0.05
3 讨论
脾气虚与男性不育的密切关系, 医学界很早就已认识到, 但是相关实验开展很少, 而且迄今为止, 仍未能清楚解释脾气虚导致不育的病理机制。细胞凋亡是多细胞有机体为了调控机体发育、维护内环境稳定, 由基因控制的细胞主动死亡过程[5]。在人体的正常生精过程中, 也存在着生精细胞的凋亡[6,7], 对于清除受损生精细胞、控制其数量具有重要意义[8]。有研究表明, 在生理情况下, 睾丸生殖细胞中的细胞凋亡主要是精原细胞和精母细胞凋亡, 很少发生在精子细胞中[9]。但若生精细胞的凋亡超过了正常范围, 则可导致睾丸生精功能障碍而致不育[10]。据此推论, 在脾气虚导致不育的病理环节中, 生精细胞过量凋亡可能起着关键性作用。
应用流式细胞术 (flow cytometry, FCM) 检测细胞凋亡是近年来发展的新手段, 具有快速、灵敏、精确、定量分析等特点[4]。流式细胞仪 (FCM) 分析, 已被研究者广泛应用, 在细胞经过标记的抗体染色后, 可以定性、定量及定位分析某一抗原在细胞内存在的情况, 而细胞经DNA染料染色后, 则可以分析细胞内的DNA含量, 从而可对细胞周期 (G0、G1、S、G2、M期细胞的比例) 以及细胞的倍体 (单倍体、二倍体、多倍体及非整倍体) 进行分析。睾丸曲细精管中的生精细胞由精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及精子共同组成;精原细胞是二倍体细胞 (2C) , 它经过DNA复制形成四倍体 (4C) 的初级精母细胞;初级精母细胞进行第一次成熟分裂后形成二倍体的次级精母细胞;次级精母细胞存在时间很短, 很快进入第二次成熟分裂形成单倍体 (1C) 精子细胞;精子细胞经过变形和核浓缩后成为精子。正常睾丸生精细胞流式分析DNA直方图一般由三个峰组成:①单倍体细胞峰由精子细胞及精子组成;②二倍体细胞峰由精原细胞、次级精母细胞和支持细胞组成;③四倍体细胞峰由初级精母细胞和处于G2M期精原细胞组成;此外, 在1C峰之前有时会出现一个凋亡峰, 它包括了凋亡的单倍体、二倍体及四倍体细胞[11,12];这四个峰按其DNA含量排列在相应的峰道数内。睾丸的生精功能可以通过流式细胞仪的两类指标进行分析, 其一是睾丸内各种细胞所占的百分数, 其二是各级生精细胞的凋亡。
本实验结果显示, 在模型组可见到在1C峰前出现一个明显的凋亡峰 (图1) , 这个峰由断裂的DNA形成, 代表凋亡细胞的数量。各模型组动物的睾丸生精细胞均出现大量凋亡, 35天、50天模型组更为明显。在生理情况下生精细胞凋亡主要发生在2C细胞群, 即精原细胞与精母细胞, 本实验显示生精细胞凋亡主要发生在1C细胞群 (精子细胞及精子) 和4C细胞群 (初级精母细胞及G2期精原细胞) , 虽然2C细胞群 (G0期精原细胞及次级精母细胞等) 亦有减少趋势, 但统计学分析没有显著性差异。
睾丸生殖细胞 篇5
1 资料与方法
1.1 材料
27例MFH组织及相应的癌旁正常纤维组织均取自哈尔滨医科大学附属第一医院2010年4月至2015年1月确诊为MFH并进行手术治疗的患者,肿瘤组织及癌旁正常纤维组织均经病理证实。其中男17例,女10例;年龄31~83岁,平均(58.7±13.5)岁。术中取材时先取正常纤维组织,再取肿瘤组织,并将组织切成方块,分装,放入液氮中保存,随后置于-80℃冰箱保存。TNM分期按照2010年AJCC标准,Ⅰ期5例,Ⅱ期7例,Ⅲ期11例,Ⅳ期4例。组织学亚型按照新版WHO软组织肿瘤分类(2002)进行:多形性MFH 14例、巨细胞性MFH 8例,炎性MFH 5例。
1.2 方法
a)总RNA的提取:将切取的MFH组织和癌旁组织迅速放入液氮中,快速转移至-80℃冰箱内存放。用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取组织总RNA,紫外分光光度计测定A260 nm/A280 nm值,1%琼脂糖凝胶电泳证实RNA完整性。b)c DNA合成:取组织提取RNA 1.0μg,用RT-PCR试剂盒DRR019A(TAKARA公司)合成c DNA,反应条件和反应体系参考试剂盒说明书。c)聚合酶链反应扩增目的基因:取分别来自MFH组织和相对应的癌旁正常纤维组织的c D-NA为模板进行PCR反应,以GAPDH为内参,对WT1,MPP11,PRAME,RHAMM,NY-CO-38,G250,NY-ESO-1,HTERT,BAGE的基因进行检测,引物设计参见文献[3]。9种CTA基因的引物序列、PCR反应退火温度、产物片段长度以及循环数见表1。对于所有的抗原,变性温度为94℃,延伸温度72℃。全部引物均经Gen Bank查询,为目前已知基因特异性引物序列。所有反应均经预变性,94℃5 min,扩增35个循环,72℃延伸5 min。d)DNA序列测定:随机抽取上述9种CTA的阳性PCR产物(各3例)进行DNA序列测定。DNA序列测定由上海基康生物技术公司完成。所得序列与基因库检索序列一致,证实所扩增产物为目的基因的片段。e)将在恶性纤维组织瘤中表达率最高的肿瘤睾丸抗原相关基因与临床相关指标(性别、年龄、组织学亚型、临床分期)进行统计学分析,寻求是否存在关联。
1.3 统计学处理
计数资料行χ2检验,全部数据由SPSS19.0统计软件完成,P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 CTA基因在MFH及相对应癌旁正常纤维组织中的表达
在2 7例MFH组织标本中,表达率最高的是WT 1(77.8%),其次是MPP11(74.1%),PRAME(63.0%),RHAMM(59.3%),NY-CO-38(51.9%),G250(44.4%),NY-ESO-1(44.4%),HTERT(40.7%),BAGE(14.8%),如图1所示。9种CTA基因在全部正常纤维组织中均无表达。肿瘤组织中至少有1种基因表达的频率是96.3%(26/27),3种或3种以上同时表达概率为85.2%(23/27)。
2.2 在MFH中CTA基因的表达与临床指标的关系
经统计学分析,CTA基因在MFH中表达率最高的WT1与临床相关指标(性别、年龄、组织学亚型、临床分期)无显著相关性(P>0.05),如表2所示。
3 讨论
MFH是一种较为常见的软组织肉瘤,恶性程度高,易发生转移和复发,预后差。在现阶段,由于病因未得到确定,对于MFH的早期诊断、病程监控、治疗都没有确切的办法。近年来,MFH患者生存率随着治疗方法的改进得到一定程度的提高。但即使采取以手术彻底切除加长期化疗的方法,患者的五年生存率仍低于70%[4,5]。这种肿瘤严重威胁着人类的生命健康,因此急需寻找新的方法来提高治疗效果。
近年来,随着肿瘤学、免疫学以及分子生物学等相关学科的发展,肿瘤免疫治疗的研究突飞猛进,成为继手术、放疗和化疗之后第四种抗肿瘤治疗手段。目前,在肿瘤治疗中免疫治疗只能作为辅助手段,原因有两个:其一是真正实用的肿瘤特异性抗原十分有限;其二是受多种因素影响,这些仅有的抗原免疫原性低,难以完成抗原的有效递呈,因而开展免疫治疗的关键所在是获得特异性肿瘤抗原[1]。作为免疫治疗其中之一,基因疫苗的治疗策略是利用人体免疫系统已存在的病原体免疫反应,将肿瘤特异性标记物的基因序列与病原体的基因序列融合制成基因疫苗,在人体内激活高水平的T淋巴细胞,从而诱导、维持有效的免疫应答反应,达到治疗目的。由于疫苗治疗具有特异性、在体内免疫效应维持时间长等优点,目前以CTA肽为主的疫苗已成为研究热点[1,6,7]。
1991年有学者通过改进T细胞表位克隆从黑色素瘤细胞中分离并鉴定了第一个肿瘤睾丸抗原MAGE-1,CTA逐渐被人们熟知。CTA基因在正常组织(睾丸和胎盘组织)和某些肿瘤细胞中表达[2]。除此之外,作为一类新的肿瘤特异性抗原,CTA还有如下主要特点:a)大多数CTA基因定位于X染色体;b)一般以多个家族成员的形式存在;c)CTA在各种来源不同的肿瘤组织中的表达一般具有异质性[8]。目前有关研究发现CTA基因及其编码产物CTA在细胞分化增殖、细胞凋亡、信号传导、基因转录、减数分裂等方面起作用[9,10,11,12]。此外,多项研究报告表明,作为肿瘤标记物,还可通过巢式RT-PCR技术检测外周血、脑脊液、腹水中CTA的mRNA的表达及含量,有助于发现少量肿瘤细胞的存在,从而用于肿瘤的早期诊断及转移复发的监测[8]。
目前,虽然大部分CTA功能尚未完全明确,与肿瘤的发病机制也未查明,但是CTA因具有免疫原性及表达局限性,而且CTA基因编码的200余个产物已被鉴定,为含有CTA的恶性肿瘤的免疫治疗提供了充分的选择,使其在肿瘤疫苗和肿瘤免疫治疗中极具发展潜力,成为一研究热点[1,13]。近年来,隆起性皮肤纤维肉瘤、尤文氏肉瘤、白血病等肿瘤相继发现了特异性标记物,而且,CTA的临床试验在黑色素瘤等肿瘤的治疗上已取得了令人鼓舞的进展[14,15],但MFH的特异性标记物却没有相关报道。
为了解CTA在MFH中的表达特点,我们检测了9种CTA基因在MFH组织的表达,发现这些CTA基因均有不同程度的表达,表达率最高的是WT1(77.8%),其次是MPP11(74.1%),PRAME(63.0%),RHAMM(59.3%),NY-CO-38(51.9%),肿瘤组织中至少有1种基因表达的频率是96.3%(26/27),3种或3种以上同时表达概率为85.2%(23/27);全部CTA基因在正常纤维组织中均无表达。本组实验还对表达率最高的WT1的表达和临床相关指标(性别、年龄、组织学亚型、临床分期)的关系进行了分析,结果显示无显著相关性,但本实验病例较少,是否存在关联有待进一步研究验证。结果提示上述5种CTA基因在MFH中呈现高度特异性表达,由于CTA在肿瘤中呈现异质性表达,这就为开展研究MFH的多价疫苗提供了实验依据,使得CTA作为肿瘤疫苗用于MFH的特异性免疫治疗成为可能,而且多价疫苗还可有效避免因肿瘤抗原表达的个体差异和抗原调变所致的免疫逃逸,进而扩大了免疫治疗适用范围,效果明显优于单一多肽疫苗。
CTA基因的研究把肿瘤发生、发展与生殖细胞的产生和成熟紧密联系在了一起,如上所述,CTA在众多肿瘤中均有不同频率的表达,而且多呈协同表达。Lee等[16]发现长期存活的睾丸癌患者有继发恶性纤维组织细胞瘤的可能,因CTA具有高度的表达限制性,提示CTA在恶性纤维组织细胞瘤中可能出现高表达,本次试验结果与多种CTA在恶性纤维组织细胞瘤中呈现高表达相符合,而且多种CTA之间存在协同表达现象。由于本次试验的局限性,CTA与恶性纤维组织细胞瘤之间的关联仍需要更多的研究来检验。
睾丸生殖细胞 篇6
1. 材料与方法
(1) 试验动物及睾丸样品睾丸样品取自于当地屠宰场屠宰的成年雄性绵羊。
(2) 主要试剂双抗购于Gibco公司;台盼蓝、胶原酶Ⅱ购于Sigma公司;Percoll购于Parmacia公司。
(3) 绵羊睾丸间质细胞的分离将采集的绵羊睾丸样品放入含有1%双抗的4℃的PBS缓冲液内, 半小时内带回实验室。将睾丸被膜用镊子撕开后, 用刀片将睾丸切成2 cm3左右的小块。将小块分成3份, 分别用于三种分离方法分离间质细胞, 每种方法设置3个重复样品。
酶消化结合细胞筛过滤 (方法1) :将睾丸小块放入50m L离心管, 离心管内预先装有含0.25 mg/m L胶原酶Ⅱ的PBS缓冲液。将离心管32℃恒温震荡20 min, 然后室温静置5 min。液体分层, 上层为富含间质细胞的悬液, 下层为富含曲精细管的沉淀。吸取上层液体, 100目细胞筛过滤, 收集富含间质细胞的滤液。
酶消化结合Percoll密度梯度离心 (方法2) :按方法1所述, 将睾丸经酶消化后, 吸取上层细胞悬液, 加入到Percoll离心液上, 离心液梯度为21%, 26%, 34%, 60%, 3 000 g离心30 min, 离心后吸取34%~60%梯度之间的细胞。将Percoll用PBS清洗后, 得到富含间质细胞的悬液。
机械分离结合细胞筛过滤 (方法3) :此方法与方法1类似, 根据间质细胞疏松存在于曲精细管周围间隙的特点, 在方法1中去除了胶原酶的添加。其余步骤同方法1。
(4) 绵羊睾丸间质细胞活率检测绵羊睾丸间质细胞活率检测使用台盼蓝排斥实验。染为蓝色的为死细胞, 未着色的为活细胞。将三种方法分离到的富含绵羊睾丸间质细胞的悬液与0.4%台盼蓝按体积比1∶1混合, 常温孵育2 min, 镜检。
(5) 统计方法统计分析软件为SPSS 17.0, 结果以平均数±标准误表示。组间差异分析采用F检验, 多重比较采用Duncan法。
2. 结果
经三种方法分离的间质细胞其悬液都较为浑浊, 说明细胞量都很大。经台盼蓝染色后镜检发现方法3所得细胞活率最高, 能够达到70%以上, 极显著高于方法1与方法2, P<0.01;第2种方法活率最低, 不足30%;第1种方法活率介于两者之间, 极显著高于方法2, P<0.01。结果如图1, 2所示。
3. 讨论
间质细胞是雄性动物体内分泌睾酮的最主要的细胞, 因此间质细胞的分离培养对于研究雄性动物的生殖非常重要。能否得到高活率的间质细胞关系着试验的成败, 因此, 分离高活率的睾丸间质细胞意义重大。
本试验研究结果表明, 简单的机械分离方法不仅能得到大量的间质细胞, 而且细胞的活率很高, 能达到70%以上, 极显著高于其余两种方法。我们认为是因为操作中减少了对间质细胞的处理及伤害造成的。许多研究中都加入了胶原酶对睾丸进行消化, 但是根据我们的经验在方法3中去掉了胶原酶, 减少了对间质细胞的伤害。因为间质细胞疏松的存在于睾丸曲精细管之间的间隙内, 仅通过震荡, 不需要消化也能分离出来。许多研究中所使用的第2种方法得到的间质细胞活率最低, 我们认为是因为细胞经过了较长时间的离心处理所致的。虽然Percoll处理能提高间质细胞的纯度, 但是牺牲了间质细胞的活率。另外通过差异贴壁法我们也能提高间质细胞的纯度, 因此, 下一步的研究应该围绕利用差异贴壁法提高方法3中间质细胞纯度来展开。
睾丸生殖细胞 篇7
CD147分子是一个新的细胞表面黏附分子,亦称细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinases inducer,EMMPRIN),与肿瘤侵袭力和转移密切相关[3]。本研究利用SP免疫组织化学法检测65例精原细胞癌,10例正常睾丸组织,10例胚胎睾丸组织中CD147的表达程度,探讨其临床意义。
1 材料和方法
1.1 材料
收集广州市第一人民医院、广州医学院附属第一医院、西安第四军医大学西京医院2000年5月～2003年5月手术切除的精原细胞癌标本65例,均经病理和临床证实为睾丸精原细胞癌,见图1。平均年龄25岁。另外取10例正常睾丸穿刺组织和10例正常胚胎睾丸组织(由西安第四军医大学细胞生物研究所提供)作为对照。
1.2 方法
1.2.1 试剂
HAb18G/CD147单克隆抗体由第四军医大学细胞生物研究中心建立,UltraSensitive TM SP超敏试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司生产。
1.2.2 方法
采用SP免疫组织化学染色法检测CD147,操作按说明书进行,用已知CD147阳性肝癌标本做阳性对照,PBS取代一抗作阴性对照。
1.3 免疫组织化学结果判断
CD147染色阳性表现棕黄色或棕褐色,主要定位于胞膜和胞浆。每张切片均由3位病理科医生分别随机观察具有代表性的10个高倍视野,根据胞膜和胞浆的染色程度及染色细胞百分率进行评分:基本不着色者为0分,着色淡者为1分,着色适中者为2分,着色深者为3分;着色细胞占计数细胞百分率<=5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,>51%为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分相乘为其最后得分,0-1分为阴性(-),2～3分为弱阳性(+),≥4分为强阳性(++)。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0软件包进行数据处理,CD147的表达和病理分级及其他的临床指标的关系用卡方或Fisher精确概率法检验(取P<0.05为显著差异)。
2 结果
2.1 CD147在组织中的表达情况
CD147染色阳性表现棕黄色或棕褐色,主要定位于胞膜和胞浆。10例正常睾丸组织和10例正常胚胎睾丸组织CD147表达均为阴性,见图1、表2;65例精原细胞癌组织有35例表达弱阳性(35/65,53.8%),18例表达强阳性(18/65,27.7%),见图3。
2.2 睾丸癌分化程度,临床分期及病理分型与CD147阳性表达的关系,见表1
CD147阳性表达在低分化与高分化间及临床TMN分期间差异均有显著意义(P<0.05)。未发现CD147阳性表达在年龄之间有差异。
2.3 CD147在精原细胞癌与正常、胚胎睾丸组织的表达关系,见表2
CD147在精原细胞癌与正常和胚胎组织中的表达差异有显著性(P<0.05)。
3 讨论
CD147分子由两个IgSF结构域构成[4],是属于Ig SF中高度糖基化的单次跨膜糖蛋白,分属内皮细胞组。CD147分子是一个新发现的细胞表面黏附分子,又称为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloprotein-ases inducer,EMM-PRIN),广泛存在于各种肿瘤细胞包膜表面,能够使得肿瘤周围间质细胞产生基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs),从而降解细胞外基底膜和间质成分,在肿瘤侵袭和转移密切相关[4,5]。肿瘤细胞表达的CD147分子也可作用于邻近的癌细胞,相互诱导促进MMPs释放降解基质,并水解肿瘤细胞表面的黏附成分而有助于癌细胞的迁移[6,7]。CD147还可以通过在RNA和蛋白水平影响血管内皮生长因子(VEGF)的表达,促进肿瘤血管的生成[6]。因此,CD147分子在肿瘤细胞的侵袭转移中起重要作用。根据肿瘤浸润的3步学说:黏附、降解、移动,CD147分子涉及了其中的每一步骤,因此其在肿瘤转移研究方面值得关注。目前已证实了CD147在乳腺癌、肝癌、喉鳞癌等多种恶性肿瘤中高度表达,它可作为肿瘤侵袭和转移能力强弱的判断指标[7]。但CD147在睾丸癌组织中的表达情况至今尚未有报道。
精原细胞癌细胞的发生,发展和转移是一个涉及多步骤的复杂过程,在此过程中,瘤细胞获得了多种能力,包括从原发的瘤细胞团上逃逸、浸润周围正常组织、侵入脉管系统并从脉管中溢出于靶组织中持续生长等。随着精原细胞癌的恶性程度临床分期的升高,精原细胞癌的复发率以及死亡率也随之升高[8]。而CD147作为瘤表面多功能分子,能调节肿瘤转移中的关键步骤[9]。有报道在多种恶性肿瘤中CD147对瘤组织的侵袭和转移中产生显著作用[10,11,12]。因此它也可能在睾丸癌的演进中扮演了重要角色[13]。
本研究的实验结果表明:CD147在正常睾丸组织和胚胎睾丸组织中为阴性,而65例睾丸癌组织弱阳性率达67.3%,强阳性率为24.8%。在肿瘤的临床分期与病理分化程度中,发现随着患者TNM分期越高、病理分型分化程度越低,CD147的阳性率及强阳性率也随之增加。这说明表达CD147者其肿瘤恶性程度、侵袭和转移能力较强。因此本研究证明,CD147的表达情况与肿瘤的恶性程度及侵犯、转移呈正相关关系。而对睾丸癌的病理分型却并无差异。因此,CD147有可能成为早期诊断睾丸癌,以及推断肿瘤细胞的远处转移的重要的实验室参考指标。同时,睾丸癌的患者也可以通过CD147的表达情况了解肿瘤的恶性程度,疗效判断及初步判断预后,对临床医生选择治疗方案具有指导作用。对CD147阻滞剂的进一步探索,或可成为抑制睾丸癌浸润、转移的一条新途径。
摘要：目的研究细胞外基质金属蛋白酶诱导分子(CD147)在精原细胞癌组织中的表达情况,探讨其临床意义。方法应用免疫组织化学S-P法检测65例精原细胞癌组织,10例正常睾丸组织,10例胚胎睾丸组织中CD147的表达情况,并对CD147表达与精原细胞癌各临床资料的关系进行统计学分析。结果胚胎睾丸组织,正常睾丸组织,及精原细胞癌CD147阳性率分别为:0%,0%,81.6%。CD147蛋白的表达与肿瘤的TNM分期和肿瘤分化程度呈正相关(P<0.05)。结论CD147检测有助于提高精原细胞癌的早期诊断率,有望成为反映肿瘤恶性程度及预后判断的标记物。