细菌学鉴定（共12篇）
细菌学鉴定 篇1
死因鉴定是司法鉴定的基础工作, 是法医学鉴定需解决的关键问题, 重要性仅次于死亡时间。但需注意的是, 死亡24h之内, 尸体尚未发生腐败, 但死亡24h后, 尸体便逐年开始腐败, 出现各种晚期尸体现象, 出现各种细菌滋生、繁殖, 尸体组织形态逐渐崩解、内源性化学物质不断降解, 难以建立相应的死后细菌学检查体系。目前尚无一个确切、完整、系统的“法医微生物学”概念与理论, 但法医学、微生物交叉融合内容已较丰富。
一、材料与方法
( 一) 实验动物与材料
取健康SD大鼠30 只, 雌雄不限, 体重150 - 200g, 随机分为10 组, 其中10 只采用颈椎脱臼法处死纳入A组, 10 只制作缺氧缺血模型20min确认死亡纳入B组, 10 只注射金黄色葡萄球菌纳入C组, 不给于治疗, 待死亡。分别在死后3、6、9 日, 取大鼠尸体, 按照无菌操作要求, 取后肢深部肌肉, 准确称量成若干份, 每份100mg, 编号放入灭菌EP管, -70℃ 冻存待测。 设备采用TD - 20 /20Luminometer、ATP、APyrase等与相关检测试剂盒。另取30 只SD大鼠, 同法处死, 分别在死后第1 - 10 日, 采样取后肢深部肌肉、肝脏、脾脏、肾脏组织。
( 二) 方法
1. 检测组织中微生物ATP
取样本0. 10g 2ml无菌均浆器中, 加入0. 9ml 4℃ 无菌生理盐水, 均浆, 收集5ml放入无菌EP管中, 1ml无菌生理盐水振洗, 3 次, 混匀3000r/min离心5min。取离心后样品上层清洗50μl检测管内, 加入50μ Triton X - 100 与腺苷三磷酸双磷酸酶混合液, 37℃ 赋予10min, 沸水水浴1min, 加入100μl Bac Tier - Glo TM检测液, 孵育5min, 检测发光值, 以无菌生理盐水作为空白, 计算ATP标准曲线。
2. 菌种培养鉴定
获得均浆, 接种, 以分区划线法接种于培养皿中, 每份样品接种2 份, 分别在37℃ 有氧条件和37℃ 无氧条件下培养24h。采用接种环刮培养菌落, 涂抹在栽载玻片中央, 酒精灯烤制细菌涂片, 采用Granm染色法染色, 油镜下观察细菌形态。
( 三) 统计学处理
收集数据建立WPS xls数据表, 以SPSS18. 0 软件进行数学统计, 计量资料以均数 ± 标准差表示, 组间比较采用t检验或非参数检验, 计数资料以数 ( n) 或率 ( % ) 表示, 比较采用x2检验, 以P < 0. 05 表示差异具有统计学意义。
二、结果
( 一) 微生物ATP
以ATP浓度对数值作为横坐标, 以相对发光单位的对数值作为横坐标, 呈一元线性方程Y = 0. 815X + 9. 015, R2= 0. 998, P < 0. 01。 A组: 死后第3 日、6 日、9 日, - Log ( [ATP]) 分别为 ( 10. 63 ± 0. 14) % 、 ( 7. 81 ± 0. 11) % 、 ( 8. 17± 0. 12) % , B组则为 ( 7. 82 ± 0. 15 ) % 、 ( 6. 17 ± 0. 12 ) % 、 ( 7. 52 ± 0. 20) % , C组则为 ( 12. 7 ± 1. 27) % 、 ( 10. 6 ± 6.42) % 、 ( 11. 8 ± 6. 20) % , 差异具有统计学意义 ( P < 0. 05) 。
( 二) 菌种培养鉴定
普通培养, A组与B组1 - 3 日, 肌肉、肝脏、脾脏、肾脏均无细菌生长, C组脾脏、肾脏细菌培养阳性。均厌氧培养后, A组3 - 10 日组织均有细菌长出, 主要为G - 小杆菌, 死后7 - 10 日出现G + 大杆菌, B组3 - 5 日组织有细菌长出, 6 - 10 日见G - 小杆菌, C组组织见金黄色葡萄糖球菌, 3 - 5日出现杆菌。
三、讨论
从本次研究结果来看, 不同死因大鼠在不同时间段得到的不同后肢深部组织微生物ATP含量存在显著差异, 不同死因大鼠在不同时间段得到的不同组织细菌培养阳性出现时间、优势菌结果存在一定差异, 反映死因、死亡时间对微生物的繁殖存在显著影响, 不仅影响微生物含量还影响微生物含量。但需注意的是, 受死亡环境、尸体所在环境、尸体大小等因素影响, 不同类型尸体腐败速度、细菌类型定然存在差异, 该法是否可作为野外死亡人的死因鉴定尚存在异议, 但在发现较早、医院死亡及时冷冻的尸体死因鉴定中有一定价值。
摘要：目的:评价死后细菌学检测在死因鉴定中的作用。方法:取健康SD大鼠30只, 10只采用颈椎脱臼法处死纳入A组, 10只制作缺氧缺血模型20min确认死亡纳入B组, 10只注射金黄色葡萄球菌纳入C组, 不给于治疗, 待死亡, 分别在死后3、6、9日, 取后肢深部肌肉, 采用化学发光法检测ATP水平, 另取30只SD大鼠, 同法处死, 分别在死后第1-10日, 采样取后肢深部肌肉、肝脏、脾脏、肾脏组织, 进行细菌学培养镜检。结果:以ATP浓度对数值作为横坐标, 以相对发光单位的对数值作为横坐标, 呈一元线性方程Y=0.815X+9.015, R2=0.998, P<0.01;A组、B组、C组死后第3日、6日、9日ATP组间与组内比较差异具有统计学意义 (P<0.05) ;普通培养、厌氧培养, A组、B组、C组肌肉、肝脏、脾脏、肾脏细菌培养阳性出现时间、优势菌类型差存在差异。结论:死后细菌学检测可用于死因鉴定中, ATP、细菌培养与鉴定等都可作为死因判断依据, 但检测结果受观察时间等因素影响, 同时是否适用于野外大型动物死亡尚无明确定论。
关键词：死因,细菌学检查,司法鉴定
参考文献
[1]赵子琴.法医病理学[M].北京:人民卫生出版社, 2009.
细菌学鉴定 篇2
常见细菌系统鉴定手册在蓝岭香柏网上书店销售，读者在蓝岭香柏网还可了解到常见细菌系统鉴定手册作者、价格、内容介绍等信息。欢迎购买常见细菌系统鉴定手册，蓝岭香柏...阅读完整评论内容
常见细菌系统鉴定手册-科学出版社- 梦迪知识堂- 食品伙伴个性空间食品...
编者评论 -
常见细菌系统鉴定手册东秀珠蔡妙英等编著科学出版社目录序使用说明绪论第一部分常见 细菌属的特征描述第一章光合细菌第二章产芽孢细菌第三章好氧或兼性厌氧发酵型革兰氏...阅读完整评论内容
10株产菊粉酶细菌的筛选及鉴定 篇3
关键词： 菊粉酶；细菌；筛选；鉴定
中图分类号： Q939 9 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）08-0360-03
菊粉酶（inulinase）是糖基水解酶 32 家族（glycosyl hydrolases family 32）的一员，又称β-2，1-D-果聚糖酶，它能特异地作用于β-2，1-D-果聚糖果糖苷键 [1-4]。根据其作用于底物的方式不同，又可分为内切菊粉酶（endoinulinase，EC 3 2 1 7） 和外切菊粉酶（exoinulinase，EC 3 2 1 80），目前该酶被广泛用于菊芋制备低聚果糖的工业生产，这主要是因为菊芋富含菊糖，而菊糖是由D-呋喃果糖分子经β-2，1糖苷键聚合而成的聚合度较高的直链多糖，在菊粉酶的作用下，它可以从内部和末端水解自身的β-2，1糖苷键，从而降解为低聚果糖 [5-8]。而微生物由于来源广泛，种类多，它已经成为菊粉酶筛选的良好来源，但是迄今为止，在工业上还是很缺乏具有高产酶活性的功能菌株。因此，如何筛选获得具有高产菊粉酶活性的目的菌株已经成为众多研究者的关注焦点 [9-15]。这其中又以产菊粉酶真菌的研究居多，而对于细菌的研究较少。因此，本研究以内蒙古包头当地菊芋种植的根际土壤为材料，定向筛选产菊粉酶细菌，以期为菊芋制备低聚果糖提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1 1 材料与试剂
菊芋根部土壤来源于包头市东河区沙尔沁镇。菊粉、琼脂、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨，购自上海蓝季科技发展有限公司。3，5-二硝基水杨酸，购自上海远帆助剂厂。冰醋酸、酒石酸钾钠、KCl、NaNO3、K2HPO4、（NH4）H2PO、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O，购自天津市风船化学试剂有限公司。上述药品均为分析纯。
DNS 试剂：取3，5-二硝基水杨酸3 15 g，加水500 mL，水浴至45 ℃，逐步加入100 mL 0 2 g/mL氢氧化钠，然后加入酒石酸钾钠91 g、苯酚2 5 g、无水亚硝酸钠 2 5 g，搅拌使之溶解，冷却后定容至1 000 mL，贮存于棕色瓶中，放置 1 周后使用。
醋酸缓冲液（0 1 mol/L，pH值4 6）：准确称取醋酸钠 0 803 6 g，加少量蒸馏水溶解，再加入冰醋酸 0 59 mL，调节pH 值至4 6，加蒸馏水定容至200 mL。
1 2 培养基配制
富集培养基：酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水 1 000 mL。初筛培养基：菊粉30 g，KCl 0 5 g，NaNO3 3 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，FeSO4 0 01 g，K2HPO4 1 g，蒸馏水 1 000 mL，琼脂15 g。复筛培养基（同发酵培养基）：菊粉20 g，蛋白胨10 g，（NH4）2HPO4 0 5 g，MgSO4·7H2O 0 5 g，NaNO3 5 g，蒸馏水1000 mL，琼脂15 g（发酵培养基无）。 斜面保藏培养基：马铃薯 20 g，蔗糖（葡萄糖）20 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂15～20 g，pH值自然。
1 3 菌株筛选
富集培养：取菊芋根际土5 g，放入100 mL无菌水中，170 r/min振荡1 h得悬浮液，将1 mL摇匀的悬浮液加入含有50 mL富集培养液的三角瓶中，37 ℃下170 r/min 振荡培养48 h。
初筛：将经过富集培养的菌液用无菌水稀释为10 -1、10 -2、10 -3、10 -4等4个不同的浓度，分别吸取0 5 mL不同浓度土壤悬液于初筛培养基上，涂布均匀后，把培养皿倒置放入恒温培养箱中，28 ℃培养2～3 d，并观察菌种的生长情况，利用“透明圈法”对目的菌落进行分离纯化，最后对所得的菌株进行斜面培养保藏。
复筛：利用纯化与酶活性测定相结合的方法复筛产菊粉酶细菌，先将纯化的目的菌株接种于复筛培养基上，28 ℃恒温培养2～3 d；然后选取生长较快的菌株接入含有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、170 r/min恒温水浴摇床培养72 h；发酵液3 500 r/min离心15 min，得到的上清液即为粗酶液；最后用DNS法测定粗酶液酶活性，从中获得产酶活性较高的菌株。
1 4 酶活性的测定
1 4 1 果糖标准曲线的绘制 试验方案见表1，将各试管沸水浴7 min，显色后快速冷却，之后用蒸馏水定容至10 mL，充分混匀后在550 nm下测吸光度，以果糖浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制果糖标准曲线，结果如图1所示。
1 4 2 酶活性的测定 菊粉酶活性单位定义 [16]：反应体系中1 min转化底物产生 1 μmol 还原糖所需的酶量即为1个活性单位（U/mL）。酶活性测定参照文献[17]，略有改动。向0 5 mL粗酶液中加入2 5 mL 1%菊糖（醋酸缓冲液配制），37 ℃ 反应20 min，沸水灭活10 min，加入DNS 2 mL，沸水浴中7 min显色，快速冷却后加5 mL蒸馏水定容到10 mL，以去离子水为空白对照，用可见分光光度计测吸光度。设3次重复，取平均值。
nlc202309011511
1 4 3 酶活性的计算 按下面的公示来计算单位酶活性 [15]：酶活性=D·n·1 000/（k·t）。式中：n为稀释倍数；k为曲线斜率；t为反应时间（s）。
1 5 产菊粉酶细菌的16S rRNA分子鉴定和系统发育分析
利用菌落PCR技术扩增所得目的菌株的16S rRNA序列，引物选用27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）， 具体方法参考文献[18]。然后利用Blast程序寻找GenBank中与各目的序列同源性最高的序列作为参考，最后用ClustalX 1 81软件进行序列多重比对，利用MEGA 4软件以Neighbor-Joining法进行系统发育分析 （采样量1 000次），构建系统发育树 [18]。
2 结果与分析
2 1 产菊粉酶菌株产酶活性测定
由图2可见，10株产菊粉酶细菌的产酶活性随时间的延长呈规律性变化，除菌株A1、A4外，其他菌株的产酶活性都是第1天最高，此后呈下降趋势；而菌株A1、A4的产酶活性以第2天最高，此后开始下降。
酶活性的产菊粉酶细菌，并对其中部分菌株加以鉴定。测序结果表明，产菊粉酶细菌多为厚壁菌门，此外也包含放线菌门和变形菌门，且来自厚壁菌门和放线菌门的细菌可能具有较好的产菊粉酶活性，如彼尔姆短杆菌（A1）和芽孢杆菌（A7）要高于多黏类芽孢杆菌（A6、A8），而变形菌门的细菌产菊粉酶活性则较差。
张扬等曾筛选到一株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），而且该菌的产酶活性在培养2天后达到最高 [4]，这与本研究中的菌株A4产酶性能一致，因此A4也可能是巨大芽孢杆菌。Pandey等发现产菊粉酶的细菌包括假单胞菌属（Pseudomonas）、节杆菌属（Arthrobacter）、黄杆菌属 （Staphylococcus）和埃希菌属（Escherichia）等许多类型 [19]，而本研究则发现，除上述细菌外，短杆菌属（Brevibacterium sp ）、多黏类芽孢杆菌（P polymyxa）和嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）也具有产菊粉酶能力，只不过这3类细菌产菊粉酶能力较弱。因此，本研究后续将关注利用紫外诱变、化学突变技术以及重离子诱变技术来获取高产菊粉酶活性菌。
参考文献：
[1] Pons T，Olmea O，Chinea G，et al Structural model for family 32 of glycosyl-hydrolase enzymes[J] Proteins，1998，33（3）：383-395
[2]宫 颖，于基成，刘 秋，等 微生物源菊粉酶的研究进展[J] 食品安全质量检测学报，2014，5（7）：2146-2150
[3]冯 珊，朱宏阳，黄声岚 菊粉酶及其应用研究进展[J] 海峡药学，2013，25（12）：8-10
[4]顾夕梅，陈晓佩，奚晓桐，等 菊粉酶及其制备低聚果糖研究进展[J] 广东化工，2014，41（7）：95-96
[5]Li Y，Liu G L，Chi Z M Ethanol production from inulin and unsterilized meal of Jerusalem artichoke tubers by Saccharomyces sp W0 expressing the endo-inulinase gene from Arthrobacter sp [J] Bioresource Technology，2013，147（21）： 254-259
[6]李 娟，曹泽虹，李 超，等 响应面法优化黑曲霉深层发酵产内切型菊粉酶工艺[J] 食品科学，2014，35（9）：207-212
[7]熊伍平，王成华，陆 雁，等 一个外切菊粉酶基因的克隆表达及酶学性质[J] 生物加工过程，2013，11（3）：40-45
[8]王 静，金征宇，江 波，等 Aspergillus ficuum内切菊粉酶的酶解条件优化及酶解动力学研究[J] 食品科学，2009，30（21）：161-165 [9]韩 睿 青海产菊粉酶菌株的筛选及分子鉴定[J] 农业科学与技术：英文版，2015，25（2）：224-227
[10] 张 瑞，朱启忠，张 扬 产菊粉酶芽孢杆菌发酵条件优化[J] 资源开发与市场，2013，29（7）：676-678
[11]赵 洁，朱启忠，耿 松，等 产菊粉酶菌株的筛选及发酵条件研究[J] 中国酿造，2012，31（9）：107-110
[12]黄玉玲，王桂峰，隆小华，等 产菊粉酶菌株的筛选及产酶条件优化[J] 食品工业科技，2012，33（21）：160-163
[13]张泽生，王 翠，张荣萍，等 产菊粉酶微生物的筛选及发酵工艺的研究[J] 现代食品科技，2010，26（5）：498-501，497
[14]罗登林，袁海丽，曾小宇，等 响应面法优化Aspergillus niger X-6发酵生产菊粉酶工艺的研究[J] 食品科学，2010，31（23）：138-141[15] 王 翠 产菊粉酶菌株的筛选及菊粉酶性质的研究[D] 天津：天津科技大学，2010：8-10
[16]王建华，刘艳艳，姚 斌，等 高产菊粉酶酵母筛选、发酵和酶学性质研究[J] 生物工程学报，2000，16（1）：60-64
[17]王 琳 产菊粉酶菌株的筛选及其酶学特性的研究[D] 南京：南京农业大学，2007：6-11
[18]宁洎英 两种常用农药对叶际微生物群落结构的影响及叶面农药残留的原位降解研究[D] 北京：中国科学院研究生院，2010：26-28
[19] Pandey A，Soccol C R，Selvakumar P，et al Recent developments in microbial inulinases Its production，properties，and industrial applications[J] Applied Biochemistry and Biotechnology，1999，81（1）： 35-52
细菌数值鉴定法及鉴定系统的发展 篇4
1 细菌数值鉴定理论的建立和发展
1962年Beers和Lockhart提出用概率值[3]来表示某试验在指定细菌分类群中的阳性率,从而将统计学用于细菌鉴定学中。1968年Dybowski和Frankin首次用条件概率法[4]对肠杆菌科细菌进行鉴定,所提出的相对相似百分比PRL(Percentage Relative Likelihood)和模式分数MLF(Modal Likelihood Fraction)两个数值鉴定参数,为后续的研究奠定了基础。1970年Lapage S.P.、Basomb S.、Willcox W.R.和Curtis M.A.用相似的概率法对279株新分离的革兰氏阴性杆菌进行鉴定[5],70%~80%的菌株被正确鉴定,细菌概率鉴定法的价值得到认可。1973年Lapage小组系统地研究和发展了细菌概率鉴定法,并建立了科学的细菌数值鉴定数理模型,Lapage细菌数值鉴定理论[6,7]正式形成。同年Bascomb等[8]用此模型编制了鉴定程式对1079株革兰氏阴性需氧参考菌株进行了鉴定,其中90.8%的发酵菌和82.1%的非发酵菌得到正确的鉴定。API制造商法国生物梅埃公司在Lapage理论的基础上又提出了参数T值(T Index)和鉴定可信度评价标准[9],进一步完善了此理论。
2 细菌数值鉴定理论解析
2.1 Lapage理论
细菌数值鉴定法以贝叶斯定理(Bayer's Theory)和Lapage理论为基础,利用由细菌条目(Taxa)、鉴定试验(Tests)、概率(Probabilities)三大要素构成的矩阵为数据源,计算鉴定分值(ID,Identification Scores)、模式比值(Fm,Model Frequencies)、T值(T,T index)和R值,并将细菌条目ID值按降序排列,参照鉴定信度评价标准来选择最为可能的鉴定结果。ID≥99.9%,T≥0.75为极好的鉴定;99.8%≤ID≤99.0%,T≥0.75为很好的鉴定;90.9%≤ID≤98.9%,T≥0.25为好的鉴定;80.0%≤ID≤89.9%,T≥0为可接受的鉴定;ID<80.0%为低分辨率,可通过ID累加法或补充试验完成鉴定。
ID值即鉴定百分率,是每个细菌条目生化反应的出现概率值与库中所有细菌条目生化反应出现概率值总和的比值,表示每种细菌出现的可能性。T值代表个体(待鉴定菌)与总体(某细菌条目包含的各生物型)的近似值,它越接近1,表明鉴定价值越大。R值是ID值按降序排列后相邻两条目的ID之比,代表首选条目与次选条目的差距,R越大,表明两者之间的差距越大,越有鉴定价值。
2.2 矩阵的构建对鉴定率的影响
矩阵的三大要素构建是否合理对细菌鉴定率的高低起到了关键的作用。Lapage小组在研究中得出以下结论:(1)理想的矩阵中细菌条目是越广泛越好,但这是不切实际的。因为在扩大其数量的同时,若要保持原有的鉴定率,必须提高试验的数量,同时鉴定成本也会增加,所以应该按矩阵需要服务的范围,如:是为鉴定医学致病菌,还是为鉴定动植物致病菌等目的来选择细菌条目。(2)试验的选择不仅要考虑其可靠性、易操作性,还要尽量选择鉴别率高的。Lapage小组提供了一个可行的试验选择程序。(3)矩阵中的概率值必须来自于参考实验室、权威期刊及书籍,以保证数据的科学准确。
3 细菌数值鉴定系统的发展
3.1 细菌数值鉴定系统的组成
细菌数值鉴定系统是数值鉴定理论与计算机技术、自动化技术相结合的产物,它由试验单元、分析单元和读数仪组成。试验单元是指试验中用到的多项生化反应条或反应板;分析单元是指数值编码索引手册和数值编码分析软件,它完成对数值编码的分析;读数仪可代替人眼,对生化反应结果进行自动判读。
3.2 计算机和自动化技术的进步推动了分析单元和读数仪的发展
从20世纪70年代至今,它经历了用数值编码索引手册进行编码分析的手工阶段;用数值编码软件进行编码分析的半自动阶段;用自动读数仪代替人工读码的全自动阶段;用专家系统辅助分析、修订鉴定结果的智能化阶段四个发展过程。Steel K.J.在1965年提到“计算机辅助鉴定技术将帮助我们迎接细菌快速鉴定的挑战[10]”。1977年Holmes B.、Willcox W.R.、Lapage S.P.和Malnick H.在API20E鉴定可靠性的研究中得出结论,计算机辅助鉴定明显优于编码手工鉴定[11],这充分证明了计算机技术在细菌鉴定工作中的价值。它与自动化技术的进步共同推动了分析单元和读数仪的发展,大大提高了细菌数值鉴定系统自动化和智能化的水平。
3.3 试验单元的发展扩大了细菌鉴定谱,提高了细菌鉴定速度
试验单元包含的生化反应是与分析单元中矩阵试验相对应的。细菌鉴定系统制造商一直热衷于选择更为理想的试验及合理的增加试验数目来扩大单个试验单元的菌种鉴定范围。以法国生物梅里埃公司为例,从1970年至今,用于各试验单元的生化反应总和达到近千种。从API鉴定条到ATB ID试条,再到VITEK鉴定卡,每试验单元包含的生化反应数目由20项增到60多项。现在VITEK GN鉴定卡能鉴定API20E及API20NE包含的菌种数。国内的相关学者也积极致力于试验单元的研究,哈尔滨的徐迪诚[12,13,14,15],安徽的马筱玲、陈学民[16,17,18],武汉的张银旺、付有荣[19]等专家开发的鉴定条/板已覆盖了肠杆菌科、非发酵菌、弧菌科、葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属及厌氧菌等临床致病菌,鉴定能力大大提高。
新技术也不断应用于试验单元,使细菌鉴定的速度提高了4~8倍。例如美国德灵公司开发的RNID3鉴定板(Rapid Gram Negative Identification System Type3 Panel)将荧光技术用于其中,同时结合先进的读数仪Microscan Walkaway最快可在鉴定板孵育2.5h后得到鉴定结果[20]。
3.4 国内外细菌数值鉴定系统发展的比较
国外在此方面的研究起步较早,先进的Vitek 2[21]、Microscan Walkaway和BD Phoenix[22]等微生物数值鉴定系统现已具有很高的专业化、自动化和智能化的水平。国内的研究从20世纪90年代后开始,起步相对较晚,代表产品有杭州天和HW-138细菌鉴定分析仪[23]、山东鑫科XK-3401自动微生物鉴定及药敏分析系统[24]、湖南天地人TDR-200C自动细菌鉴定/药敏分析系统[25,26,27]、安徽恒星HX-21细菌鉴定药敏分析仪[28]、珠海迪尔Bact-IST微生物分析仪[29],它们在以上各方面的性能明显低于国外的水平。首先,国产微生物分析仪所使用的鉴定板/条种类较少,鉴定谱比国外产品窄;其次,国内读数仪均使用比浊和比色技术,鉴定速度相对较慢;特别是专家系统缺少用户自定义功能,软件的自动化和智能化水平相对较低。
3.5 细菌数值鉴定系统的未来
从20世纪70年代至今,几乎所有的制造商均在开发各自独立的细菌数值鉴定系统,不同系统间无法兼容。美国BD公司细菌鉴定仪CRYSTAL首次应用兼容软件,使CRYSTAL不但能分析自己的鉴定板,而且能分析API鉴定条。虽然CRYSTAL未实现完全的通用性,但是它向细菌数值鉴定“家族”发出了一个信号——通用性分析软件的时代是否将要到来。
2008年法国生物梅里埃公司首次推出APIWeb版鉴定系统[30],网络化分析软件又成为细菌数值鉴定“家族”的新成员,它能给我们带来什么,它是否能迅猛发展,我们拭目以待。
摘要：细菌数值鉴定法是数理统计学与细菌鉴定学相结合产生的一种细菌概率鉴定方法。细菌数值鉴定系统是细菌数值鉴定理论与计算机技术、自动化技术相结合的产物。本文阐述了细菌数值鉴定法和细菌数值鉴定系统的建立和发展,展望未来随分析软件的网络化,通用性将成为细菌数值鉴定系统发展的新趋势。
全自动细菌鉴定 篇5
法国生物梅里埃公司最新一代应用经典生化方法进行细菌鉴定的全自动仪器，采用了国际金标准ApI的数据库并继承发展了VITEK第一代产品的自动化处理技术，集成了生物梅里埃几十年的技术和创新于一体，为当今最先进的细菌鉴定/药敏系统，全自动细菌鉴定。
技术参数：
一、鉴定原理：终点法、阈值法;比色、比浊动态分析法
二、菌液浓度控制：液晶数显比浊仪，测量细菌浓度范围0.0-7.5麦氏单位。多点测量，自动显示平均值。
三、自动加样：真空批量加样法，每批可同时处理10个试剂卡，每卡需菌悬液小于4ml
四、自动处理测试卡：自动扫描卡片条码、自动核查卡片与标本资料、自动密封卡片、自动上载试卡，自动孵育，自动每15分钟进行一次检测、自动卸载完成卡，自动报告结果。
五、操作软件：Windows Xp操作系统，简易易用图形界面，鉴定材料《全自动细菌鉴定》。
六、打印机：激光打印机，自动打印实验结果。
七、一次性试卡：64孔鉴定/药敏卡片，带有条形码可指示卡片的序列号和测试的种类。
八、鉴定细菌范围：可全自动鉴定菌种400种，包括：
革兰氏阴性杆菌(含大肠杆菌0157及非发酵菌);革兰氏阳性菌(含猪链球菌1型、2型和7种李斯特菌);酵母菌;需氧芽胞杆菌(含炭疽芽孢杆菌);奈瑟菌、嗜血杆菌、弯曲菌;厌氧菌
九、鉴定速度：95%常见细菌≤5小时;其中革兰氏阴性菌(GN)2～10小时，革兰氏阳性菌(Gp)2～8小时
十、药敏试验：满足革兰氏阴性及革兰氏阳性两大类细菌药敏试验，速度4—15小时，95%常见细菌药敏≤6小时;抗生素已含第4代头孢等
十一、工作容量：30个试验卡
十二、操作步骤：自动真空批量接种、自动扫描卡片条码、自动核查卡片与标本资料、自动密封卡片、自动上载试卡，自动孵育，自动检测、自动卸载废卡，自动报告结果
十三、认证：ISO9001认证:OK;CE或FDA认证:OK;进口医疗器械注册证：OK
主要特点：
1、自动化程度高，操作简单易用。
2、数据库齐全，鉴定准确。
内 容 概 述
关于全自动细菌鉴定等部分检验项目收费标准的复函
内 容 全 文
天津市卫生局：
你局《关于请批准部分新增检验项目收费标准的函》(津卫财函389号)收悉。经审核，对全自动细菌鉴定等4项检验项目收费标准予以核定，具体收费标准(见附件)，自2011年11月20日起执行。
细菌学鉴定 篇6
关键词：樱桃流胶病；内生细菌；拮抗；筛选；鉴定；芽孢杆菌
中图分类号： S436.629文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0172-03
樱桃流胶病（cherry gummosis）是普遍发生的樱桃病害之一，主要危害枝干，引起主干、枝条等流胶，轻者树势衰弱、果实产量及质量降低，重者主枝甚至整株枯死[1]。流胶病又分为生理性流胶病和侵染性流胶病[1-4]，后者病原为葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothoidea）[3]和丁香假单胞菌（Pesudomonas syringae）[4]。据吴小芹等报道，葡萄座腔菌能引起5个属针叶树和40个属阔叶树的溃疡、流胶、枝枯、果实腐烂，分布几乎遍及全球[5]。该菌引起的樱桃流胶病在山东、四川等地果园发病率在70%以上[1，6]，云南省的富民县、马关县、鲁甸县、石屏县、彝良县、紫溪镇等地均有千亩以上的规模化种植，具有潜在的暴发风险。目前，樱桃流胶病的化学防治主要采用铜制剂，但杀菌剂的频繁使用会导致致病菌产生抗药性。生物防治以其不污染环境、无生态毒性、对人畜安全等优点成为植物保护研究的热点之一[7-8]。据高玲玲等报道，棉花、小麦、玉米、油菜、辣椒、马铃薯、芭蕉、葡萄等经济作物内存在丰富的内生拮抗细菌[9]。内生细菌系统地分布于植物组织内，既能受到植物组织的保护，还可以从植物组织持续不断地吸收充足的碳源和氮源，比暴露于强烈的日光、紫外线、暴风雨、干旱等恶劣环境的附生细菌具有更稳定的生存环境，还具有固氮、促生、抗旱等生物学功能，具有良好的开发利用前景[9-10]。目前利用樱桃流胶病拮抗内生细菌的研究鲜见报道，本试验旨在探索樱桃内生细菌的分离方法并筛选拮抗菌株，为樱桃的优质高产提供潜在的生防菌株。
1材料与方法
1.1供试材料
樱桃流胶病病原菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）BOD02、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAA01，由红河学院云南省高校作物高效优质栽培重点实验室提供；培养基：马铃薯培养基（PDA）、LB培养基。
1.2内生细菌的分离
1.2.1样品采集从云南省蒙自县红河学院校园分别采集樱桃主干树皮、一年生枝条、树叶，置于无菌自封袋内带回实验室分离内生细菌。
1.2.2内生细菌的分离和纯化将树皮、枝条、叶组织修剪整齐，分别放入75%乙醇中消毒5 min，再转入含有效氯10%的NaClO中消毒5 min（树皮、枝条）或2 min（叶），无菌水浸洗2～3次，最后用无菌滤纸吸干表面水分；同时，以最后1遍浸洗消毒组织的无菌水涂布上述平板作为对照检验消毒效果。分别取5 g样品置无菌研钵中，加15 mL无菌水研磨，静置50 s，再吸取上清液依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4，取30 μL分别涂布LB，置于30 ℃恒温箱培养2～3 d；待长出菌落后，根据细菌形态、颜色、质地、大小对不同的菌落反复划线纯化[11]。
1.3内生细菌对樱桃流胶病病原菌的拮抗测定
1.3.1葡萄座腔菌和内生细菌的培养将葡萄座腔菌接种在PDA平板上，25 ℃恒温培养，待菌丝长满平板后转4 ℃冰箱保存备用；将纯化的内生细菌接种于LB液体培养基，28 ℃、160 r/min振荡培养24 h，离心12 min（6 000 r/min，4 ℃），取沉淀以无菌水悬浮并调整浓度为106 CFU/mL。
1.3.2拮抗测定用打孔器在菌落边缘取直径为5 mm 的病原菌菌饼，将菌丝面朝下接种于PDA平板的中央，28 ℃培养2 d后，在距病原菌30 mm 处对称摆放相同孔径的灭菌单层滤纸片，再吸取5 μL供试细菌悬浮液滴加在滤纸片上，每平板4株，3个重复，以浸润无菌水的滤纸片为对照，继续培养3～7 d，检查是否有抑菌圈形成，并测量对照病原菌菌落的扩展半径（R0）与对峙培养病原菌的扩展半径（Ri），以下列公式计算相对抑制率（I）。
I=（R0-Ri）/R0×100%。
1.4拮抗菌株的鉴定
对拮抗性菌株及解淀粉芽孢杆菌BAA01（主要作为革兰氏染色、芽孢染色的阳性对照）进行革兰氏染色、芽孢染色、硝酸盐还原反应、V-P试验、柠檬酸盐利用、淀粉水解、接触酶试验、H2S反应、酪蛋白水解、氧化酶反应，以及葡萄糖、D-果糖、乳糖、D-甘露醇、D-木糖产酸、NaCl耐受性、生长温度范围测试等形态学及生理生化特征分析，初步鉴定内生细菌[12]。
2结果与分析
2.1樱桃内生细菌的分离
利用涂布平板法，根据菌落的形态、颜色、质地、大小等形态学宏观特征划线纯化，分别从樱桃的树皮、枝条、叶分离内生细菌10、5、6株，共计21株。结果表明，樱桃不同组织内生细菌的种群密度由大到小依次为树皮（主干）>叶>枝（一年生），这种差异可能与樱桃组织的年龄相关。
2.2内生细菌对葡萄座腔菌的拮抗测定
采用对峙培养法利用PDA培养基筛选出对樱桃流胶病葡萄座腔菌具有一定拮抗作用的内生细菌8株，占测试内生细菌的38.10%。其中，4株分离自樱桃主干树皮，2株分离自樱桃一年生枝条，2株分离自樱桃叶片；分离自主干树皮的菌株C2-1、C2-2、C2-3及分离自树叶的C3-6有较强的抑菌作用（表1）。
2.3拮抗内生细菌的鉴定
以解淀粉芽孢杆菌BAA01作为参照菌株，对8株拮抗内生细菌进行形态学和生理生化鉴定，结果（表1）表明：C1-1、C2-1、C2-2、C2-3、C2-5、C3-5、C3-6等7株拮抗内生细菌，革兰氏染色、芽孢染色、硝酸盐还原反应、V-P试验、柠檬酸盐利用、淀粉水解、接触酶试验、H2S反应、酪蛋白水解、氧化酶反应，以及葡萄糖、D-果糖、乳糖、D-甘露醇、D-木糖产酸等均呈阳性，能耐受3%～7%的NaCl，不耐10 ℃的低温与50 ℃的高温；C1-3革兰氏染色、芽孢染色、硝酸盐还原反应、V-P试验、淀粉水解、接触酶试验、H2S反应、酪蛋白水解、氧化酶反应，以及葡萄糖、D-果糖、乳糖、D-甘露醇、D-木糖产酸等均呈阳性，柠檬酸盐利用呈阴性，能耐受3%～7%的NaCl，不耐10 ℃的低温与50 ℃的高温。根据上述鉴定结果，参考《常见细菌系统鉴定手册》[12]，可以初步确定上述菌株属于芽孢杆菌属。
3结论与讨论
研究表明，内生细菌广泛分布于植物体根、茎、叶等器官、组织的细胞或细胞间隙[9，11，13-15]。本研究结果表明，樱桃内生细菌及拮抗内生细菌的种群密度，主干树皮明显高于一年生枝条和叶片，这与植物内生菌具有组织分布差异性、组织年龄的物种多样性及种群密度较高的研究结果[16-17]是一致的。
据田甜等报道，从42份土样中分离到山核桃干腐病葡萄座腔菌的拮抗真菌3株、拮抗放线菌2株[18]；刘雪红等从1份盐碱土中分离到1株冬枣轮纹病葡萄座腔菌拮抗性芽孢杆菌[19]。上述研究均是从不含病原菌葡萄座腔菌的异地土壤筛选拮抗菌株，而本研究从樱桃的主干树皮、一年生枝条、叶片筛选到8株流胶病葡萄座腔菌拮抗菌株，表明接近病原菌的材料或许含有更丰富的拮抗性微生物。本研究中4株拮抗菌株的相对抑菌率在50%及以上（尤其是内生细菌C2-3达66.7%），表现出良好的潜在应用价值；8株拮抗菌株经生理生化鉴定为芽孢杆菌属。芽孢杆菌以抗逆性强等优点已有商品化菌剂应用于农业病虫害防治[9]，但生防菌的田间防效会因物理、化学、微生物种群等因素的影响而降低[20]，因而室内筛选的生防菌尚需盆栽试验进一步验证。表18株拮抗内生细菌对樱桃流胶病的相对抑菌率及生理生化特征
参考文献：
[1]孙杨，魏国芹，孙玉刚. 樱桃流胶病研究进展及防治方法[J]. 生物灾害科学，2013，36（2）：188-191.
[2]William C O，Martin J B. Ethephon induced gummosis in sour cherry（Prunus cerasus L.）[J]. Plant Physiology，1982，70：547-555.
[3]Elizabeth A. Botryosphaeria canker and dieback of trees and shrubs in the landscape[R]. Virginia Cooperative Extension，2005：450-726.
[4]de Vries D P. Field resistance to bacterial canker in some cherry seedling populations[J]. Euphytica，1965，14（1）：78-82.
[5]吴小芹，何月秋，刘忠华. 葡萄座腔菌属所致树木溃疡病发生与研究进展[J]. 南京林业大学学报：自然科学版，2001，25（1）：61-66.
[6]邵云华，李学良，张艳，等. 刘武生物有机肥防治樱桃流胶病试验[J]. 山东林业科技，2009，39（4）：54-56.
[7]Jeger M J，Jeffries R，Elad Y，et al. A generic theoretical model for biological control of foliar plant diseases[J]. Journal of Theoretical Biology，2009，256（2）：201-214.
[8]黄英菊，蒋继志，冯丽娜，等. 几种拮抗菌对致病疫霉抑制作用的比较研究[J]. 河北农业大学学报，2014，37（4）：80-85.
[9]高玲玲，陈小龙，蒋涛，等. 具有拮抗作用的水稻内生固氮菌的分离与鉴定[J]. 华中农业大学学报，2012，31（5）：553-557.
[10]Andrew J H. Biological control in the phyllosphere[J]. Phytopathology，1992，30：603-635.
[11]李志强，张莉，张颖，等. 绿豆立枯病根际生防细菌的筛选[J]. 河南大学学报：自然科学版，2009，39（1）：68-71.
[12]东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，2001：43-313.
[13]李俊州，王春梅，文才艺，等. 内生细菌EBS05对番茄抗中国番茄黄化曲叶病毒的诱导作用[J]. 江苏农业学报，2014，30（4）：746-751.
[14]袁建军. 一把伞南星拮抗性内生细菌筛选[J]. 江苏农业科学，2013，41（12）：373-374.
[15]康琳，魏金莉，胡蝶，等. 雪胆中抗MRSA内生细菌的多样性[J]. 江苏农业科学，2014，42（2）：303-305.
[16]Guo L D，Huang G R，Wang Y. Seasonal and tissue age influences on endophytic fungi of Pinus tabulaeformis（Pinaceae） in the Dongling Mountains[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2008，50（8）：997-1003.
[17]Mishra A，Gond S K，Kumar A，et al. Season and tissue type affect fungal endophyte communities of the Indian medicinal plant Tinospora cordifolia more strongly than geographic location[J]. Microbial Ecology，2012，64（2）：388-398.
[18]田甜，沈振明，徐秋芳，等. 土壤中山核桃干腐病抑制菌的筛选和鉴定[J]. 浙江农林大学学报，2012，29（1）：58-64.
[19]刘雪红，王宝琴. 冬枣轮纹病病原真菌的分离及其拮抗菌的初筛[J]. 华北农学报，2014，29（1）：227-231.
链霉素耐药细菌的分离及鉴定 篇7
细菌耐药性也称细菌抗药性, 是指细菌能抵御抗生素影响的能力。细菌耐药性按传统的分类方法分为固有耐药性和获得耐药性。固有耐药性也叫做天然耐药性, 是细菌对抗菌药的天然不敏感, 由于具有这种特点的细菌不具有药物的作用靶点而产生耐药性。获得耐药性是细菌在长期接触抗菌药物情况下发生变异, 从而获得耐药性。这种耐药性包括交叉耐药性、单向耐药性和多重耐药性。细菌获得耐药性发生的机制可分为遗传学机制和生化机制。
目前由于大量地使用链霉素, 导致链霉素在一些食品和生物体中有残留。含链霉素废水排入天然水体中, 是链霉素的存在于自然环境中的关键原因。链霉素的残留又是导致耐药细菌产生的重要原因, 所以必须对环境、农产品和食品中链霉素残留量进行检测, 避免链霉素通过食物链在某一生物体内积累。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 耗材
离心管 (1.5mL) 、PCR扩增管 (0.2mL) 、枪头 (10μL、200μL、1mL) 、1.5mL离心管盒、45mm过滤器、0.25μm滤膜等。
1.1.2 仪器和试剂
移夜枪、pH计、培养箱、H1650电泳仪及电泳槽 (北京六一仪器厂) 、高速离心离心机、PCR仪 (PTC100, MJ公司) 。
注:++生长良好, +生长, -不生长。
蛋白胨、酵母浸膏、链霉素 (Genview) 、16SrDNA引物 (F27、R1492, 上海英骏生物技术有限公司) 、Taq酶 (上海申能博彩) 等。
2 方法
2.1 预处理培养皿、试管、移液枪枪头、过滤器等的灭菌
LB培养的配制;链霉素 (1.6mg/mL) 的配制;抗生素平板的制备, 将灭好菌的装有50mLLB固体培养基的三角瓶放入60℃水浴锅中, 在水浴锅中保温半小时, 使培养基的温度不超过50℃, 然后取出三角瓶, 加入链霉素 (0.8mg/mL) 225μL, 摇匀, 于无菌台上倒平板, 每个平板所加的培养基约为15mL, 平板倒好冷却后, 立即放入避光环境下。37℃培养箱中放置过夜。
2.2 耐药性菌株的筛选
从R1河流及R2河流中取得水样, 取200μL水样涂布在含抗生素的平板上, 另将原水样稀释成10-1和10-2, 分别取100μL涂布在不含抗生素的平板上作对照, 平衡涂布3个平板, 置于37℃培养箱中培养24h。第二天观察并计录单菌落数, 同时计算细菌的耐药率。并从含抗生素平板上挑取菌落比较特殊的单菌落进行下一步的纯化鉴定。
2.3 耐药性细菌菌株的纯化及保藏
对所挑取的耐药性细菌菌株采用梯度稀释法进行纯化。用无菌的接种环将挑取的单菌落接到含有0.5mLLB液体培养基的1.5mL离心管中, 振荡混匀后, 作为原液, 然后进行10倍的稀释至10-4和10-5, 取这两个稀释度的悬浮液100μL涂布在固体培养基上, 置于37℃培养箱中培养24h。重复三次。培养得到单菌落, 对单菌落进行观察并记录菌落形态和大小, 并接种到3mLLB液体培养基的试管中, 37℃摇床中, 200rpm, 振荡培养24h。取无菌的1.5mL离心管于离心管盒中, 在管盖上标上抗生素、菌株编号和日期。用200μL移液枪吸取200μL50%甘油到1.5mL离心管中, 再加入800μL上述菌液到离心管中, 颠倒混匀, 于-20℃冰箱中保存。
2.4 耐药性细菌菌株的MIC测定
配制链霉素浓度梯度的LB液体培养基:0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL, 分别接种10μL上述纯化得到的细菌的菌液, 于37℃摇床中, 200rpm, 振荡培养24h, 第二天观察细菌生长情况, 以在试管内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
2.5 革兰氏染色
革兰氏染色及镜检涂片干燥、加热固定冷却结晶紫初染、碘液媒染酒精脱色番红复染、干燥镜检。
2.6 16SrDNA序列扩增及分析
(1) 将上述得到的纯种接种至LB液体培养基中培养过夜, 取100μL菌液至无菌1.5mL离心管中, 以10000rpm离心2min, 用枪吸去上清夜;加入100μL的无菌水, 振荡重悬菌体, 于100℃水浴锅中煮10min以破壁, 冷却至室温后以12000rpm离心2min, 吸取50μL上清夜至另一个无菌的离心管中作为16Sr DNA扩增的DNA模板。采用细菌16Sr DNA通用引物F27 (5'-AGA GTT T GA T C C TGG CTC AG-3') 及R1492 (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3') , 按以下反应体系进行P CR:
(2) 凝胶电泳:吸取PCR扩增产物5μL与1μL6×loadingbuffer混合, 上样至凝胶的小孔上 (负极) , 接上电源, 电泳60min, 电压为120V。电泳完后, 将凝胶取出放入溴化乙锭液中, 浸泡15min, 取出凝胶放入凝胶成像仪中进行凝胶成像。
2.7 16SrDNA的测序及序列分析
将扩增产物直接送到上海英骏测序公司进行测序, 测序结果使用phrap (V0.990329) 拼接, 去掉两端低质量序列 (质量低于40) , 将得到的16SrDNA序列用blastn (2.2.14) 比对NCBI的核酸数据库 (http://www.nc b i.n lm.n i h.go v/B LAS T/) 。
3 结果
3.1 耐链霉素细菌分离结果
从河流R1及R2采集水样进行耐链霉素细菌的分离, 参考美国标准委员会 (NCCL S) 2004年的标准, 介定耐链霉素细菌的最低抑制浓度为10μg/mL, 结果表明两河流水样都能筛选到耐链霉素的菌株, 其中R1水样的可培养细菌的耐药率为0.167%, 而R2的可培养细菌的耐药率为0.119%。此外R1河道的3次采样中, 各次空白对照的可培养的细菌数在105左右 (表1) , 3次平均值为1.32×105, R2的可培养的细菌数在104左右 (表1) , 3次平均值为2.1×104, 只有R1细菌数平均值的7/44。
3.2 筛选的细菌单菌落的形态
从含链霉素抗生素的LB固体培养基平板上随机挑取了一株细菌, 经过梯度稀释法纯化, 得到的纯种编号为Sm5, 其中Sm是链霉素的英文缩写, 其细菌单菌落特点见表2。
3.3 Sm5的MIC测定结果
对两株耐链霉素细菌进行链霉素最低抑制浓度 (MIC) 测定, 结果Sm5能够在链霉素浓度0~80μg/mL的LB液体培养基生长, 但在链霉素浓度160μg/mL的LB液体培养基不生长, 因此Sm5的最低抑制浓度MIC为160μg/mL。NCCLS对链霉素的MIC标准是10μg/mL, 该细菌的MIC是NCCLS标准的16倍, 该细菌为强耐药菌株。测定结果见表3。
M:DNA Marker;1:Amp2-1;2:Ery2-1;3:Tet2;4:Sm5;5:Cap1-1;Ck:空白对照
3.4 Sm5的革兰氏染色结果
Sm5经革兰氏染色后, 在40倍数码显微镜下观察细胞呈红色, 是革兰氏阴性细菌, 它的细胞呈长杆形, 长约1.0μm~2.0μm, 宽约0.3μm~0.5μm, 结果见图1。
3.5 Sm5的16S rDNA的扩增结果
采用细菌16S rDNA扩增的通用引物F27和R1492进行扩增, Sm5的条带见图2的泳道4, 能扩增出1.5kb左右的目的片段。
3.6 Sm5的16S rDNA的测序及序列分析
本次实验所得到的Sm5的16S rDNA的扩增目的产物直接送到上海英骏测序公司广州分公司进行纯化并测序, 得到的序列峰图杂峰很少, 去掉低质量及拼接, 所得到的Sm5 16S rDNA的序列长度为1415bp。把此序列在NCBI的核酸数据库 (http://w ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 进行blast比对分析, blast结果如表4。
选取比对最好的前20个序列, 从比对的结果来看, Sm5的16S rDNA序列与Pseu domonas plecoglossicida strain 2~3的序列具有99%相似性, 表明Sm5属于Pseudomo nas plecoglossicida。
4 结论
本实验对中山市区的R1河道及R2进行耐链霉素细菌调查, 按照美国国家临床实验室标准委员会 (NCCLS) 的标准 (10μg/mL) , 两处的耐药率分别为0.167%和0.119%。随机筛选得到一株细菌, 记为Sm5, 进行MIC检测发现, Sm5的MIC为160μg/mL, 是NC CLS标准的16倍, 该细菌耐链霉素强。
水稻纹枯病拮抗细菌分离与鉴定 篇8
该研究从水稻纹枯病患病稻株和病田土壤中分离筛选出一株有效拮抗细菌, 并对其进行初步鉴定, 为生物防治水稻纹枯病的应用提供基础和依据。
1 材料与方法
1.1 材料
水稻纹枯病病原菌分离自水稻纹枯病菌核。
马铃薯培养基 (PDA) :马铃薯200 g, 葡萄糖20.0 g, 琼脂20.0 g, 水1 000 mL, pH自然。肉汁蛋白胨培养基 (NA) :牛肉膏3.0 g, 蛋白胨10.0 g, NaCl 5.0 g, 琼脂20 g, 水1 000 mL, pH 7.0～7.2。液体培养时不加琼脂。几丁质培养基[4]:纯几丁质4 g, K2HPO40.7 g, KH2PO40.3 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, FeSO4·7H2O 0.01 g, ZnSO40.001 g, MnCl20.001 g, 琼脂20 g, 水1 000 mL, pH 7.0。各培养基均为121℃ 30 min灭菌。
1.2 方法
1.2.1 拮抗细菌的分离
从水稻田采集患病稻株和土样, 水稻组织用无菌水漂洗3次, 切成2 cm左右长, 将水稻组织和土样每份称取5 g置于装有无菌水的45 mL锥形瓶中, 30℃ 120 r·min-1培养12 h, 无菌移液枪分别吸取10 mL菌液于90 mL的无菌水中得到1×10-2稀释度菌液, 吸取1×10-2菌液1 mL置于9 mL无菌水中, 如此稀释至1×10-7, 分别吸取1×10-5、1×10-6、1×10-7浓度菌液0.1 mL涂布于几丁质平板上, 32℃恒温培养箱中培养, 24～72 h后挑取培养特征相异的单个菌落平板划线进行3～4次的传代纯化, 斜面保存, 4℃贮藏备用。
1.2.2 拮抗细菌的筛选
将水稻纹枯病病原菌在PDA平板上活化, 用打孔器在菌落边缘打取菌块, 接种在平板中央, 28℃培养2 d后在距菌落中央2 cm处分别接种4株待测细菌, 28℃培养, 以不接种待测菌为对照。3 d后观察并测量抑菌圈大小[4]。
将抑菌效果较好的菌株做进一步复筛, 将各拮抗菌接于液体肉汁蛋白胨培养基中, 28℃培养2 d后, 把直径约为5 mm的纹枯病菌丝块分别在拮抗菌液 (浓度约为1×108cfu·mL-1) 中处理30 s, 置于PDA平板上, 每次处理重复3次, 无菌水对照, 28℃培养72 h, 测量菌落直径, 计算抑菌率。抑菌率/%=对照菌丝直径-处理菌丝直径/对照菌丝直径×100。
1.2.3 拮抗菌株的鉴定
按《伯杰氏细菌鉴定手册》和东秀珠等编著的《常见细菌系统鉴定手册》对拮抗细菌进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 水稻纹枯病拮抗细菌的分离与筛选结果
从患病稻株和土样中共分离得到细菌176株, 经过初筛和复筛共获得有拮抗效果的菌株14株, 其中SR32、SR79、RR93、SR110、RR137和SR155这6株细菌对水稻纹枯病表现出稳定的拮抗活性, 且生长较快, 通过抑菌率比较, SR32的抑菌率为73.6%, 明显高于其它菌株, 将其选择为水稻纹枯病的拮抗细菌菌株 (见表1, 表2) 。
2.2 拮抗细菌SR32的鉴定
2.2.1 SR32形态与菌落特征
菌株SR32在NA培养基上生长良好, 菌落呈圆形或近圆形, 白色, 不透明, 湿润, 边缘不整齐, 不产色素, 表面无光泽, 随着培养时间延长, 菌落变干, 有较粗且均匀的放射性皱纹, 显微镜下观察呈杆状, 菌体大小为 (1.3～1.5) μm× (0.6～0.8) μm, 有芽孢。
2.2.2 拮抗菌SR32生理生化特征
根据《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》所列的细菌菌株形态学和生理生化性状与菌株SR32的特征进行比较, 初步判断菌株SR32为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 。
注:“+”表示反应呈阳性;“-”表示反应呈阴性。
3 结论与讨论
从患病稻株和土样中共分离得到细菌176株, 经过筛选获得1株对水稻纹枯病病原菌抗性较强的细菌菌株, 编号为SR32, 其抑菌带为16.4 mm, 抑菌率73.6%, 明显高于其它菌株, 且生长较快, 将其选择为水稻纹枯病的拮抗细菌菌株, 根据菌株SR32的形态学和生理生化性状特征比较, 判断为枯草芽孢杆菌属 (Bacillus subtilis) 。
作物病害的生物防治越来越引起国内外学者的重视, 生物防治主要通过竞争作用、抗生作用、溶菌作用、重寄生以及促进植物生长等几个方面来达到抑制病原菌扩展的目的, 它具有无毒、广谱、无残留、持效期长、害虫和病菌难以产生抗药性等特点[5,6], 同时还可以提高植物抗病性、提高作物品质和改善土壤环境等多种优点。该研究获得了1株水稻纹枯病有效拮抗菌菌株SR32, 至于其生防作用机制、活性物质及大田防治效果需要进一步研究。
参考文献
[1]陈志谊, 许志刚, 陆凡, 等.拮抗菌B-916培养液对水稻纹枯病的抗生活性及其抗菌物质的研究[J].江苏农业科学, 2000, 16 (3) :148-152.
[2]何迎春, 高必达.立枯丝核菌的生物防治[J].中国生物防治, 2000, 16 (1) :31-34.
[3]郑爱萍, 李平, 王世全, 等.水稻纹枯病强接抗菌B34的分离与鉴定[J].植物病理学报, 2003, 33 (1) :81-85.
[4]左艳霞, 胡正嘉.1株抗水稻纹枯病放线菌的筛选[J].华中农业大学学报, 2006, 25 (1) :60-63.
[5]易龙, 肖崇刚, 马冠华, 等.防治烟草赤星病有益内生细菌的筛选及抑菌作用[J].微生物学报, 2004, 44 (1) :19-21.
细菌学鉴定 篇9
菊粉 (Inulin) 是由果糖经过β-2, 1果聚糖苷键连接的多聚果糖, 菊粉酶 (Inulinase) 是一种能水解β-2, 1-D-果聚糖糖苷键的一类水解酶, 能生产菊粉酶的微生物包括霉菌、酵母菌、细菌等[1]。微生物产生的菊粉酶能水解大量存在于菊芋等植物块茎中的菊粉, 用于生产果糖浆、低聚果糖、燃料酒精等, 具有十分重要的生产价值和广阔的利用前景[2]。国外从20世纪70年代就开始对菊粉酶的研究, 我国起步较晚[3]。本文报道了产菊粉酶细菌的筛选, 并对高酶活菌株做了菌种鉴定, 为进一步研究奠定了基础。
2 材料与方法
2.1 材料
分离样品:山东威海滨海盐碱地生长菊芋的根际土壤;市售水果。
培养基: (1) 初筛培养基主要是:菊粉10.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaN O31.5g/L、NH4H2PO4 2.0 g/L、KCl 0.5g/L、FeS O4·7H2O4 0.1g/L、K2HPO4 1.0g/L、琼脂20.0g/L, 初始pH 6.0。 (2) 发酵培养基是菊粉30.0g/L、蛋白胨7.0g/L、NaC l 5.0g/L、K2HPO4·3H2O 3.0g/L, 初始pH 6.0。
2.2 方法
菌种筛选: (1) 透明圈初筛法。取菊芋的根际土壤加入捣碎的菊芋, 常温透气一周左右使其长菌;称取10g分离样品置于内含100m L无菌水和玻璃珠的三角瓶内, 180 r/min, 30℃振荡30 min, 使细胞分散;将土壤悬液稀释为10-1、10-2、10-3三个浓度, 然后每个稀释梯度取0.2m L在以菊粉为唯一碳源的平板上进行涂布分离, 每个稀释度涂布两个平板, 置于30℃的恒温培养箱中培养2—4天, 挑取菌落周围透明圈稍大者进行划线分离, 直至分离到单菌落。 (2) 复筛。将筛选到的菌株由斜面接种到50m L (250m L三角瓶) 液体发酵培养基中, 在30℃、180 r/min培养24小时, 制成种子液;然后按3%的接种量将种子液添加到50m L (250m L三角瓶) 相应液体培养基中, 在30℃、180 r/min条件下进行产酶试验, 定时取样, 4000 r/min离心10min后测定发酵液中的酶活, 从中筛选酶活较高的菌株即可。
菊粉酶活的测定:将发酵液在4000 r/min, 20 min离心去除细菌菌体, 取1m L上清液加入到4m L的2%菊粉溶液 (p H5.0、0.lmol/L醋酸缓冲液配制) 中, 55℃水浴中保温10min;取反应液0.5m L加入1.5m L DNS混匀, 沸水浴中反应5min, 迅速冷却并稀释至25m L, 在540nm下测定其吸光度, 根据葡萄糖标准曲线计算样品中的还原糖含量[4]。定义每分钟产生1μmol还原糖需要的酶量为一个酶活单位 (U/m L) 。
选育细菌的鉴定: (1) 常规鉴定。将试验菌株活化3—4代, 镜检合格后根据细菌分类学研究标准的方法对供试菌株进行形态学观察, 包括细胞形态、有无鞭毛及细胞大小特征, 用光学显微镜观察, 并从平板上挑取单菌落按标准的方法进行革兰氏染色。 (2) 分子鉴定。采用16S r DNA序列分析法。按照SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒的说明书提取基因组。扩增16S r DNA的正向引物为7f (5′-CA-GAGTTTGATCCTGGCT-3′) , 反向引物1540r (5′-AG-GAGGTGATCCAGCCGCA-3′) 在25μL的PCR反应体系中含有:Template (基因组) 1μL、Primer up (10u M) 0.5μL、Primer down (10u M) 0.5μL、d NTP mix (10Mm each) 0.5μL、10×Taq reaction Buffer 2.5μL、Taq (5u/μL) 0.2μL。PCR反应参数为预变性94℃5min, 循环94℃30s、55℃35s、72℃1min, 35个循环, 延伸8min。PCR扩增产物由UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行琼脂糖切胶纯化后, 由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。 (3) 生理生化特征测定。以发酵液液体培养基为基础培养基, 分别配置成不同的盐度 (Na Cl, w/v) 及p H值梯度的培养基, 接种后振荡培养7天, 取培养液用分光光度计在600 nm波长下检测菌株的生长密度。实验设置的温度梯度为10℃、20℃、30℃、40℃、42℃、50℃。当实验温度为30℃时, 绝对盐度 (Na Cl) 梯度为1%、3%、5%、7%、0, p H值梯度为1.0、2.0、3.0、4.0、9.0、10.0。
16S r DNA序列比对及系统发育树构建:将测定的基因序列输入Genbank并运用Blast程序与数据库中已存在的细菌16S r DNA序列进行相似性比较分析;利用MEGA5.0软件绘制系统发育树, 确定其系统发生学地位。
3 结果与分析
3.1 菌株的分离、筛选
本试验以菊粉为惟一碳源, 筛选得产菊粉酶的菌株20株, 其中分离到三株产菊粉酶酶活较高的细菌F1、F2、F3, 将3株菌株分别转接入发酵培养基中, 在30℃、180 r/min的条件下培养2天, 发酵液经离心后获得菌株的粗酶液, 测定其菊粉酶酶活力, 其中F1产菊粉酶酶活力最高, 达1.73 U/m L, 然后选取该菌株进行研究。
3.2 F1菌株的鉴定
常规鉴定:形态观察发现, F1菌株在培养基上的菌落为圆形, 乳白色不透明, 菌落湿润、光滑, 边缘锯齿状。随着培养时间的延长, 菌落上有褶皱状突起, 颜色变为浅黄色;菌体直杆状, 革兰氏染色阳性, 符合芽孢杆菌属形态特征, 表明该菌株为芽孢杆菌 (Bacillus sp.) 。
分子鉴定: (1) PCR产物的检测。PCR实验以后进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明, 在1500 bp处有DNA条带, 证明PCR扩增成功, 见图1。 (2) 16S r DNA序列比对和结果分析。经克隆和测序分析后, 得到F1菌株的一段长度为1455bp的16S r DNA序列, 将序列提交到NCBI的Genbank进行Blast比对 (图2) 。序列分析表明, 该菌与Bacillus megaterium、Bacillus aryabhattai、Bacillus horikoshii的序列同源性都高达99%。
3.3 细菌生理生化实验结果
通过生理生化特征的研究表明, 菌株F1最佳绝对盐度 (NaC l) 为7.0%, 生长温度范围20—50℃, 最佳pH值为4.0, 这与芽孢杆菌属中菌株Bacillusmegaterium相符 (表1) , 初步鉴定为Bacillus megaterium。
注:+为阳性;-为阴性;ND为无数据。
4 讨论
在产菊粉酶菌种筛选方面, 国内外有关酵母菌和真菌的报道居多, 有关细菌的研究甚少[8,9,10]。本试验采用以菊粉为唯一碳源的平板划线分离法, 筛选得到产菊粉酶酶活较高的细菌菌株F1。通过对F1的形态观察、16SrD NA序列分析及生理生化实验的研究, 鉴定该菌为Bacillus megaterium;进一步优化Bacillus megaterium的产酶发酵条件、研究其酶学性质、酶的固定化条件并探讨其在工业上的实际应用具有重要意义。
摘要：从山东威海沿海滩涂菊芋生长的根际土壤中分离得到能产菊粉酶的菌株20株, 经过进一步摇瓶复筛, 获得了产菊粉酶活力较高的一株细菌F1, 其发酵液酶活达到1.73U/mL。通过形态学观察、16SrDNA序列分析及生理生化研究, 鉴定该菌为芽孢杆菌属的巨大芽孢杆菌 (bacillus megaterium) 。
关键词：菊粉酶,筛选,菌种鉴定
参考文献
[1]Gouda MK.Someproperties of Inulinase from Aspergillus Fum Igatus[J].Biological Sciences, 2002, 5 (5) ∶589-593.
[2]Fang Gong, Jun Sheng, ZhenmingChi, et al.Inulinase Production by aMarine Yeast Pichia Guilliermondii and Inulin Hydrolysisby the Crude inulinase[J].Jind Microbiolo Biotechnol, 2007, (34) ∶179-185.
[3]Allais J J, Hoyos-Lopez G, Kammoun S, et al.Isolation and Characterization of the Rmophilic Bacterial Strains with Inulinase Activity[J].Appl Environ Microbiol 1987, 53 (5) ∶942-945.
[4]仝瑛, 倪士峰, 刘建利, 等.DNS法测定菊芋中还原糖含量的研究[J].陕西中医, 2009, 30 (11) ∶1535-1537.
[5]刘波.芽孢杆菌文献研究[M].广州:广东旅游出版社, 2006∶1-1679.
[6]Shivaji S, Preeti Chaturvedi, Zareena Begum.JanibacterHoyleispNov Bacillus Isronensis Sp Nov and Bacillus Aryabhattaisp Nov Isolated from Cryotubes Used for Collecting Air from the Upper Atmosphere[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009, (59) ∶2977-2986.
[7]Yan LU, Ruizao YI.Bacillus Horikoshii, a Tetrodotoxin-producing Bacterium Isolated from the Liver of Puffer Fish[J].Annals of Microbiology, 2009, 59 (3) ∶453-458.
[8]王光远, 宋爱荣, 陈冠军.产菊粉酶酵母菌株的筛选及菌种鉴定[J].微生物学杂志, 2006, 26 (4) ∶39-41.
[9]王琳, 刘兆普, 赵耕毛, 等.产菊粉酶菌株的筛选及其产酶条件的优化[J].南京农业大学学报, 2007, 30 (2) ∶73-77.
引起犬子宫蓄脓细菌的分离鉴定 篇10
子宫蓄脓是由于继发或原发性原因, 子宫分泌增加、储纳恶露而导致子宫丧失正常生理功能, 且严重危害患病动物健康的疾病。细菌感染是子宫蓄脓的重要原因。抗菌药物是预防和治疗细菌性传染病的主要措施, 但是细菌对抗菌药物的耐药性程度和频率越来越高, 开发新的抗生素难度大, 耗资高, 周期长, 投入使用不久后又可能产生抗药性[8]。解决这一问题的关键是在临床诊疗过程中, 利用实验室进行细菌分离、鉴定, 以确定致病菌, 然后通过药敏试验对抗菌药物的临床治疗效果进行预测, 筛选出敏感药物, 进行针对性治疗, 以提高疗效和节省治疗费用。试验中的病例为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和疑似链球菌混合感染, 且各分离菌已对某些抗菌药物产生不同程度的耐药性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 主要仪器设备
冰箱、立式圆形压力蒸汽高皿压灭菌器、高压消毒器、干燥箱、培养、PGX型多段可编程光照培养箱、SW-CJ-1FD型单人单面超净工作台、镊子、接种环、酒精灯、锥形瓶 (100ml, 1000ml) , 载玻片、染色缸、染色架、涂抹棒等。
1.1.2 主要材料与试剂
子宫蓄脓犬的子宫脓液 (子宫内容物) 6份, 普通琼脂、营养琼脂、营养肉汤、血液琼脂、麦康凯琼脂、三铁糖培养基及按实验室常规方法自制的大肠杆菌生化鉴定试剂、金黄色葡萄球菌生化鉴定试剂及生化培养基。
1.1.3 药敏纸片
庆大霉素、恩诺沙星、林可霉素、头孢吡肟、菌必治、妥布霉素、链霉素、诺氟沙星 (氟哌酸) 、氨苄西林、四环素、氯霉素、头孢拉定、红霉素和头孢孟多, 均购于杭州天和微生物试剂有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 病料采集及保存
(1) 子宫蓄脓犬的确定。从2011年3~5月农大动物医院就诊犬中, 选择临床症状出现腹围增大、阴户肿胀或阴门流脓, 经B超腹部探查, 子宫内出现液性暗区的犬6头, 确定为子宫蓄脓犬。 (2) 病料的采集。选择临床症状符合子宫蓄脓的病例, 对其进行卵巢子宫切除术获得子宫及其内容物或直接用灭菌棉签通过阴道从子宫采集其内容物, 放入灭菌试管中送检。不能及时送检的, 暂时保存于冰箱之后送检。
1.2.2 细菌培养、生化鉴定和药敏试验
(1) 分离培养。在超净工作台中将采集的子宫内容物用划线法接种于营养琼脂、普通琼脂、血琼脂等培养基上, 置于37℃恒温培养箱培养24~48h, 观察细菌的生长情况。如为混合菌落, 则挑取不同菌落接种于培养基进行纯培养。获得单一茵落后, 革兰氏染色镜检, 并根据细菌特征做鉴别培养、生化鉴定试验和药敏试验。 (2) 鉴别培养。麦康凯和伊红美蓝琼脂培养基培养法:该方法是为了鉴别肠杆菌科细菌。大肠杆菌在麦康凯琼脂培养基上呈粉红色菌落为阳性, 伊红美蓝琼脂培养基上呈铁锈色菌落为阳性, 不生长为阴性。CAMP实验:在血平板上, 先接种1条金黄色葡萄球菌的划线, 与此垂直接种被检细菌, 培养24h后出现明显的β溶血现象证实为金黄色葡萄球菌球菌[9]。 (3) 细菌鉴定。染色镜检:试验采用的是细菌学广泛使用的鉴别染色法-革兰氏染色。首先将细菌在干燥的载玻片上涂匀并固定好, 滴加草酸铵结晶紫作用2min后水洗, 然后滴加革兰氏碘液媒染2min后水洗, 再以95%酒精脱色1min水洗, 继而滴加石碳酸复红复染30s后水洗, 最后等涂片干燥后拿于显微镜下观察, 染色效果好的片子取照。革兰氏染色颜色是蓝紫色的为阳性菌, 红色的为阴性菌。生化鉴定:参照《兽医微生物学实验指导》第二版的方法进行细菌的生化鉴定[10]。把用于镜检的另一半菌落接种于三糖铁培养基中, 在37℃恒温培养箱培养24h后, 观察变化。从三糖铁培养基中挑菌落到营养琼脂和血琼脂上进行纯培养, 用于进行生化试验及存种。左起:精氨酸、鼠李糖、乳糖、水杨素、甘露醇、蔗糖、七叶苷、半乳糖、果糖、山犁醇。
试管架另一侧的生化管左起:葡萄糖、懒氨酸、麦芽糖、阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、卫矛醇、甲基红试验、V-P试验、吲哚试验
总之, 细菌为革兰氏阴性杆菌, 营养琼脂上呈现乳白色、圆形、隆起的中等大小菌落, 血琼脂上菌落灰白色、圆形隆起、湿润、不溶血, 则转接种于麦康凯培养基, 37℃培养24h后, 如长出粉红色中等大小菌落, 则挑取菌落按常规法做氧化酶及葡萄糖发酵试验, 如为氧化酶阴性, 发酵葡萄糖, 则按肠杆菌科细菌接种于肠杆菌科细菌生化鉴定试剂盒, 37℃培养24h。根据反应结果, 查表确定细菌类型;如为革兰氏阴性杆菌, 氧化酶试验阳性, 葡萄糖发酵试验阴性, 则接种于非发酵革兰氏阴性杆菌生化鉴定试剂盒, 37℃培养24h。根据反应结果, 查表确定细菌类型;如镜检为革兰氏阳性球菌, 按常规方法做触酶试验。触酶试验阳性者, 加做葡萄糖发酵试验, 如为阳性, 则按葡萄球菌属接种于葡萄球菌属细菌生化鉴定试剂盒。根据反应结果, 查表确定细菌类型;如镜检为革兰氏阳性球菌, 触酶试验阴性, 按链球菌鉴定方法做进一步做甘露醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、七叶营、山梨醇、蕈糖、血清菊糖发酵试验, 精氨酸、马尿酸盐、明胶水解试验, 胆汁溶菌试验。根据反应结果, 确定细菌类型。
1.2.3 药敏试验
(1) 纸片的选用。按照纸片扩散法对所有分离株进行抗茵药物的敏感性试验。药物纸片包括氨苄西林、庆大霉素、阿米卡星、头孢唑啉、头孢拉定、头孢曲松、头孢哌酮、痢特灵、恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、四环素、氯霉素、强力霉素、阿奇霉素、青霉素、红霉素和氧氟沙星, 共19种。不同种属根据《抗菌药物敏感性试验的执行标准》推荐抗菌药物, 并结合临床抗菌药物使用情况, 选取不同的药敏纸片集。 (2) 操作方法。药物敏感试验按常规纸片法进行, 将分离出的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌接种于营养肉汤, 37℃培养24~36h, 取纯培养菌株用灭菌自制“L”形玻璃棒均匀涂布于普通营养琼脂平板, 用无菌镊子将各种抗菌药物圆纸片, 分别贴于培养基表面, 每个平板贴7张纸片, 各片距离要相等, 贴完后放入4℃冰箱感作1h, 再将平板倒置于恒温培养箱。37℃培养24~48h后, 量取抑菌环直径并做记录 (每种药做2个平行试验, 取平均值作为报告值) 。
2 结果与分析
2.1 细菌培养鉴定
6份子宫内容物的细菌培养中, 1份没有培养出细菌, 约总数的16%, 5份阳性, 阳性率约为83%, 其中单纯感染1份, 占阳性数的20% (1/5) , 混合感染5份, 占阳性数的80% (4/5) , 共培养出细菌36株, 分别为大肠埃希菌24株, 占1/3, 金黄色葡萄球菌9株, 占1/4, 疑似链球菌3株, 占1/12。
2.1.1 培养结果见图3、4。
2.1.2 镜检结果见图5、6、7。
2.1.3 鉴别试验结果
(1) CAMP试验结果。在细菌分离培养过程中, 其中有9株菌株菌落颜色呈金黄色最为明显, 所以拿来做CAMP实验[11]。 (2) 大肠杆菌在麦康凯培养基和伊红美蓝琼脂培养基。见图9、10。
2.2 生化鉴定结果
见表1。与判断标准比较后, 试验所选菌株与标准判断标准相符, 因此判断所选菌为大肠杆菌。
注:“+”产酸;“—”阴性;“⊕”产酸产气。+阳性, -阴性。
2.3 药敏试验结果
试验中犬子宫蓄脓症病菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和疑似链球菌混合感染。这3种病原菌对几种抗菌药物的抑菌圈直径, 据《现代诊断学手册》抑菌圈直径d>15mm为高度敏感;15mm>d>10mm为中度敏感;d<10mm为抗性, 的判定标准, 判断待测菌株对药物的敏感程度, 结果见表2、3。 (1) 大肠杆菌的药敏试验结果显示, 对大肠杆菌分离株高度敏感的抗菌药物依次为恩诺沙星;中度敏感药物为庆大霉素、头孢吡肟, 而链霉素、菌必治、妥不霉素、林可霉素耐药。结果表明只有恩诺沙星、庆大霉素、头孢吡肟对以上病例的病原菌有抑菌作用, 且抑菌圈不是较大, 说明大多数病原菌对以上几种药不敏感, 链霉素、菌必治、妥不霉素、林可霉素的效果相对不佳, 只对其中少数病例有抑菌作用, 说明很多细菌对抗生素类药物已经不敏感。 (3) 对金黄色葡萄球菌分离株高度敏感的药物依次为头孢孟多、诺氟沙星;中度敏感药物为庆大霉素, 而对林可霉素、红霉素、氯霉素、四环素耐药。
(mm)
注:抑菌圈;S:敏感;M:中度敏感;R:抗性
(mm)
4 讨论
4.1 与前人研究结果相同或相似部分
引起犬子宫蓄脓最常见的病原菌是大肠杆菌, 试验分离到大肠杆菌24株, 占分离菌总数的2/3, 与报道一致。张志强等[12]从48个病样中分离出了大肠杆菌 (56.25%) 和金黄色葡萄球菌 (16.67%) ;杨白亮等[13]从25个病样中同样也分离出了大肠杆菌 (58.6%) 和金黄色葡萄球菌 (17.2%) ;董龙等[14]从46个病样中分离到了大肠杆菌 (60.87%) 。这次试验中, 6个病样主要分离到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌, 与国内外报道的主要病原结果一致。
4.2 与前人研究结果不同部分
试验于昆明两处地方采回6份犬子宫蓄脓脓样做了细菌的分离鉴定, 其中云南农业大学宠物医院采回的子宫脓样, 由于注射了抗生素只是鉴定出大肠杆菌。西山区康大妈流浪狗收留所采回的子宫脓样鉴定出来的既有金黄色葡萄球菌又有大肠杆菌, 以大肠杆菌为主。由此推测该抗生素对球菌非常有效, 而对大肠杆菌欠佳, 这为今后犬子宫蓄脓的预防和治疗提供了科学的依据。
药敏试验结果表明, 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对各种抗生素的敏感性不尽相同, 与各研究学者的报道相差很大。只有恩诺沙星、庆大霉素、头孢吡肟对以上病例的大肠杆菌有抑菌作用, 且抑菌圈不是较大, 说明大多数病原菌对以上几种药不敏感。链霉素、菌必治、妥不霉素、林可霉素的效果相对不佳, 只对其中少数病例有抑菌作用, 说明很多细菌对抗生素类药物已经不敏感, 对临床上常用药基本耐受, 这可能与宠物主滥用抗菌素有关。对金黄色葡萄球菌分离株高度敏感的药物有2种, 占2/7;中度敏感药物只有庆大霉素, 而对4种药物耐药, 占4/7。这表明引起犬子宫蓄脓的细菌药物敏感性表现两极分化。因各菌对药物的敏感性变异比较大, 所以临床医生在治疗犬子宫蓄脓时应特别注意抗生素的选择, 在治疗的过程中应首选最为敏感的抗生素合用或交替使用, 以减少单个药物的使用剂量或使用时间, 减缓耐药菌株的产生。抗生素治疗可与其他治疗方法结合, 如局部子宫冲洗。
4.3 该研究需要说明的问题
引起昆明地区犬子宫蓄脓的病原菌, 除了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌之外可能还有其它菌, 由于试验经费和时间的限制, 试验过程中只是通过分离、鉴别和培养后将细菌分离, 且仅对相对应的大肠杆菌做了生化鉴定, 而严格来说每一种细菌做完分离和鉴别培养后还得做完整的生化鉴定, 这样的结果才更具有说服力。
不同地区、不同时间、不同的饲养环境下犬所感染的细菌也不尽相同。此次试验由于病例数量较少, 检出率还不能说明一个地区的整体问题。欲探明引起本地区犬子宫蓄脓症的优势菌, 尚需收集大量病例做进一步调查研究。
目前人们大多只是使用针对葡萄球菌、大肠杆菌这二种细菌的抗生素来防治犬的子宫蓄脓, 而对那些不常见的但是却可以引发犬子宫蓄脓的病原菌并未引起重视。如本次试验检测出的疑似链球菌, 很少有畜主和医生了解这种细菌可以引起犬子宫蓄脓。有学者已经证实了这种细菌也可以引发犬子宫蓄脓。
5 结论
试验于昆明两处地方采回6份犬子宫蓄脓样做了细菌的分离纯化培养、部分的生化鉴定和药敏试验, 共检测出36个菌株, 已经鉴定出来的有24株大肠杆菌, 9株疑似金黄色葡萄球菌和3株疑似链球菌等。药敏试验表明, 大肠杆菌的敏感药物为恩诺沙星等, 金黄色葡萄球菌的敏感药物为头孢孟多等。应联合应用喹诺酮类、头孢菌素类和氨基糖苷类药物治疗昆明地区的病例。
参考文献
[1]Hardy RM, Osborne CA.Canine pyometra:pathophysiology, diagnosis and treatment of uterine and extra—uterine lesions[J].JAAHA, 1974, 10:245-268.
[2]Smith F O.Canine pyometra[J].Thefiogeno1ogy, 2006, 66:610-612.
[3]沈磊磊, 虞耀土, 张忠杰等.细菌分离培养和药敏试验对兽医临床用药的指导意义[J].浙江畜牧兽医, 2008 (2) :30-31.
[4]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].第2版.北京:中国农业出版社, 2001:36-43.
[5]胡桂学, 兽医微生物学实验教程[M].北京:中国农业大学出版社, 2006:47-77.
[6]姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京:中国农业出版社, 2002:35-37.
[7]许丹宁, 侯振中, 樊卫东.奶牛隐性乳房炎的流行病学调查及病原菌的分离鉴定[J].现代畜牧兽医, 2005 (9) :40-41.
[8]张志强, 薛琴, 吕艳丽等.犬子宫积脓的需氧菌调查及药物敏感性试验[J].中国兽医杂志, 2005, 41 (3) :40-42.
[9]杨白亮, 姚迪.犬子宫蓄脓需氧菌的分离鉴定及药敏试验[J].中国兽医杂志, 2008, 44 (1) :74-76.
细菌学鉴定 篇11
关键词：同步硝化反硝化； 16S rDNA 序列； 好氧脱氮
中图分类号：X703.1 文献标志码：A 文章编号：16744764（2012）05013605
近年来，中国广泛开展了脱氮方面的研究，并且取得了阶段性的进展。在已经开发的废水脱氮方法中，生物脱氮法是目前公认的最为经济有效的方法之一。在硝化反硝化生物脱氮过程中，参与硝化的主要微生物硝化菌为自养菌，生长缓慢，世代时间长，需要较长的污泥龄，使得硝化成为城市污水处理厂的制约因素[1]。
不少研究和报道[24]已充分证明，反硝化可发生在有氧条件下，使得有关好氧硝化反硝化生物脱氮的研究日趋活跃。目前已知的好氧硝化反硝化菌有：粪产碱菌[5] （Alcaligenes faecalis），泛养硫球菌[6]（Thiosphaera pantotropha），现更名为脱氮副球菌[7] （Paracoccus denitrificans）和赤红红球菌[8]（Rhodococcus ruber）等，它们能同时利用氧和硝酸作为电子受体以获得高生长率。已有报道[9]Pseudomonas mendocina是典型的反硝化细菌， 具有较强的反硝化活性， 当硝酸盐浓度为88.5 mg/L 时， 反硝化速率最大， 为26.2 mg/（L·d），显现出较强的厌氧氨氧化能力。利用好氧同时硝化反硝化菌发展好氧脱氮技术具有以下优点：1）使硝化/反硝化反应在同1个反应器中进行，可以大大减少占地面积和建设资金；2）使用好氧反硝化细菌可以减少处理过程中加入调节系统pH的化学物质，降低成本；3）在处理过程中好氧反硝化菌更容易控制[10]。因此新型好氧反硝化微生物的筛选和好氧同时硝化反硝化生物脱氮技术已经成了生物脱氮领域新的研究和发展趋势。同时，污水处理中微生物的代谢情况与温度有关，随着温度降低微生物活性下降，当温度低于4 ℃时，微生物的生理活动几乎停止。北方冬季的低温条件会对微生物的生存造成很大影响，水温过低，会影响细菌的增殖速率和生理活性，同樣会使硝化反硝化作用停止。少数微生物会因为基因突变而产生抗寒性，因此可以通过人工选择的方式来培养耐低温优势菌种，使其在低温下仍有较强的脱氮能力[11]。〖=D（〗 张 巍：同步硝化反硝化细菌的鉴定与脱氮特性研究〖=〗
笔者依据好氧硝化反硝化脱氮的原理， 采用低温摇床富集、筛选具有硝化作用的反硝化脱氮菌， 利用传统与现代分子生物学相结合手段进行同步硝化反硝化短程脱氮菌分离并鉴定确定其分类地位。为富集高效硝化反硝化短程脱氮菌， 提高硝化反硝化脱氮过程的效率， 开发高效节能低耗的硝化反硝化短程脱氮工艺提供理论依据。1 材料和方法
1.1 实验材料
实验所用菌种来源于辽宁省昌图污水处理厂A/O装置中的好氧活性污泥。其他化学试剂均为市售分析纯。基因组DNA抽提试剂盒， 宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 分析仪器
分光光度计（ UNICO UVTU1901）；电子天平（LP502A）；pH 计（ 上海雷磁， pHs3c）， 离心机（TDZ5WS）；生化培养箱（SPX100BZ）；高压灭菌锅（HVE50 AUTOCLAVE）；电子显微镜（OLYMPUS CX41KF）；BIOLOG微生物鉴定系统 （美国 microLog）；恒温水浴摇床（英国 OLS200）。
1.3 分析方法
菌体浓度测定采用分光光度法测定[12]。CODCr 测定采用重铬酸钾法，NH4+-N采用纳氏分光光度计法[13]。
1.4 培养基
用于富集培养降解同步硝化反硝化细菌的培养基配方为： NaNO2 0.5 g、牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、pH 7.0[14]。
用于分离纯化同步硝化反硝化菌的培养基配方为：NaNO2 1.0 g、Na2CO3 1.0 g、NaH2PO4 0.25 g、CaCO3 1.0 g、K2HPO4 0.75 g、MnSO4 0.01 g、MgSO4·4H2O 0.03 g、H2O 1 000 mL、琼脂15 g。
1.5 菌株的富集与分离
将好氧污泥接种于4瓶250 mL 富集培养基中，每瓶污泥接种1.0 mL， 摇床培养， 摇床温度为15 ℃， 转速120 r ·min-1。4 d 后， 将富集好的菌液稀释后涂布于20 个装有分离培养基的平板上。将平板置于温度为15 ℃的培养箱中培养， 定期观察菌体的生长情况。用接种环将平板上生长良好的菌落挑出， 划线培养于分离培养基中， 翻接8～10次， 将菌株分离。将分离出的菌株， 划线于普通肉汁斜面， 4 ℃冰箱保藏。
1.6 菌株的生理生化鉴定
参照《菌种保藏手册》[15] 和《伯杰细菌鉴定手册》[16] ， 对SNDB5进行生理生化实验。
1.7 BIOLOG鉴定
BIOLOG鉴定系统由浊读仪、读数仪、数据库、软件、微孔鉴定板组成， 其实验方法参照文献[17]。
1.8 细菌的基因组DNA提取
采用宝生物工程（大连）有限公司的基因组DNA抽提试剂盒提取。
1.9 16S rDNA 扩增与测序
nlc202309032324
以SNDB5总DNA为模板， 以用DNASTAR软件分析设计的引物P1（188bp 左右有一段21bp片断： 5′CGCTAATACCGCAT ACGTCCT3′）和P2（1 128 bp 左右有1段20 bp片断： 5′CCATGCAGCACCTGTGTCTG3′） 进行扩增，反应液为50 μL， 含有ddH2O 40 μL， dNTP 1 μL， 10×buffer 5 μL， TaqE 1μL， 模板DNA 1μL， 50pmol·μL-1 引物2 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min， 94 ℃ 1 min， 53 ℃ 40 s， 72℃ 40 s， 35个循环， 最后72 ℃保温6 min。测序由宝生物工程（大连）有限公司完成， 将测序结果用Blast软件与Genbank中16S rDNA 序列进行同源性比较。
1.10 菌株SNDB5脱氮效能实验（以下实验均在好氧条件下进行）
将SNDB5以10%的接菌量分别接种到经高压灭菌的同步硝化反硝化培养基和NaNO2模拟废水中，在15 ℃下，120 r/min 进行摇瓶培养，实验装置如图1。每12 h监测同步硝化反硝化培养基中NO2--N、NO3--N、菌体生长吸光度（OD600）的变化；硝化培养基及NaNO2 模拟废水中NO3--N、NO2--N、菌体生长吸光度（OD600）的变化。
2 结果与讨论
2.1 菌株的分离与鉴定
2.1.1 菌株分离纯化 经过富集分离， 筛选出一株同步硝化反硝化脱氮效果好的菌株SNDB5， 其在肉汁琼脂平板上生长旺盛， 菌落较大， 呈乳白色。光滑，湿润，中间隆起，不透明，无核，边缘整齐。通过革兰氏染色，鉴定为革兰氏阴性菌，在显微镜下观察菌株，发现该菌均为杆状菌，大小为（1.5～1.8） μm× （0.4～ 0.6） μm （如图2所示）。
2.1.2 BIOLOG鉴定结果 使用Biolog自动菌种鉴定系统对该株菌进行鉴定， 该菌株鉴定种属为Pseudomonas mendocina（如图3所示）。
2.1.3 SNDB5菌株的16S rDNA基因序列、基因克隆分析 在以16S Forward、16S Internal 和16S Reverse 为引物进行DNA 测序时，发现测序结果均出现连续套峰，怀疑是菌种不纯所致，因此采取了克隆测序。
质粒CTD445XT12测序结果符合实验要求。登陆NCBI网站，将质粒进行序列比对，分别筛选出10余种与其相似的菌种，利用MEGA4软件，采取邻近法对质粒构建系统进化树。
将测得的CTD445XT12的16SrDNA 序列在GenBank中进行BLAST比对，所获得的同源序列均为Pseudomonas属的16SrDNA序列。
将CTD445XT12的16SrDNA序列与GenBank中相似的14种已知菌的序列进行多序列比对，运用MEGA4软件做出进化树，如图4所示。
由图3可知CTD445XT12与EU636659.1（Pseudomonas mendocina）同源性最近，相似性高达99%。
通过BIOLOG和分子生物学鉴定，结合菌株的形态学和生理学特性，可基本确定分离的菌株为Pseudomonas mendocina。菌株SNDB5与现已报道的好氧同步硝化反硝化菌均不相同。 目前已报道的Pseudomonas mendocina具有反硝化作用，而关于硝化作用尚无报道。
2.2 菌株SNDB5的硝化作用
以NaNO2 （浓度为0.1 %） 为惟一的氮源，培养基在121 ℃灭菌20 min后，取20 mL 放入120 mL 的培养瓶中，菌株活化后接種于该液体培养基中，菌株在以NaNO2为氮源的培养基上生长时，菌体生长曲线及溶液中NO3-浓度的变化曲线如图5示。由图4可知，菌体的硝化主要是在菌体的对数生长期发生的，而在菌体进入衰亡期后，溶液中的NO3-的浓度一直处于很低的浓度水平。碳酸钠在好氧硝化过程中起着非常重要的作用，它不但作为细菌Pseudomonas mendocina生长所需的碳源，也是菌株进行硝化过程中能量的来源，在C/N 比为2～3时，硝化速率达到最大[18]。本实验中C/N 约为16，可能尚未达到该菌株最佳C/N 比，需要进一步研究，以确定此时它的最大硝化速率。
以不同浓度NaNO2（25、50、100、150 mg/L）为惟一的氮源，培养基在121 ℃灭菌20 min后，取20 mL 放入120 mL 的培养瓶中，菌株活化后接种于该液体培养基中，菌株在以不同浓度NaNO2为氮源的培养基上生长时，溶液中NO2-浓度的变化曲线如图6示。由图6可知，菌株SNDB5在亚硝酸盐负荷为50 mg/L时，亚硝酸盐去除效率最高为66%。在亚硝酸盐负荷为25 mg/L时，亚硝酸盐去除率只有19%。当亚硝酸盐负荷大于50 mg/L时，亚硝酸盐去除率随之下降，在亚硝酸盐负荷为100 mg/L时，亚硝酸盐去除率为64%，亚硝酸盐负荷为150 mg/L时，亚硝酸盐去除率为48%。
随着亚硝酸盐负荷的提高，亚硝酸盐去除率降低，可以推断出随着水中的亚硝酸盐的浓度加大，菌株SNDB5的活性受到了抑制。3 结 语
1）分离的菌株SNDB5经鉴定为Pseudomonas mendocina，它与目前所报道的好氧硝化反硝化菌均不相同，表明了自然界中好氧硝化反硝化菌的生物多样性，对揭示好氧硝化反硝化菌群的生态学有重要的意义。
2）菌株SNDB5能分别适应不同的亚硝酸盐浓度，当亚硝酸盐负荷大于50 mg/L时，亚硝酸盐去除率随之下降，在亚硝酸盐负荷为100 mg/L时，亚硝酸盐去除率为64%，亚硝酸盐负荷为150 mg/L时，亚硝酸盐去除率为48%。 使得该菌株适应力较强，可能存在于含有高氮素浓度的活性污泥中，有应用于污水好氧硝化反硝化脱氮处理的潜力。随着亚硝酸盐负荷的提高，菌株SNDB5的活性受到了抑制。
nlc202309032324
3）低温条件下硝化反硝化脱氮菌的分离成功为后续高效工程菌的构建及工程应用研究提供了理论支撑和前提条件， 使低温地区污水处理厂在冬季运行时提高脱氮率成为可能。
参考文献：
[1]Blum D J W，Speece R E.A database of chemical toxicity to environmental bacteria and its use in interspecies comparisions and correlations[J].Research Journal of the Water Pollution Control Federation，1991，63（3）：198207.
[2]Ding A Z，Fu J M，Sheng G Y.Evidence of aerobic denitrification[J].Chinese Science Bulletin，2000，45（3）：27792782.
[3]Xie S G，Zhang X J，Wang Z S.Integrated study on biochemical mechanism in biofilter system[J].Acta Scientiae Circumstantiae，2002，22（5）：557561.
[4]Robertson L A，Kuenen J G.Aerobic denitrification： a controversy revived[J].Archives of Microbiology，1984，139：351354.
[5]Sckalk O J，Kuenen J G.Hydeoxylamine oxidation and subsequent nitrous oxide production by the heterotrophic ammonia oxidizer a lcaligenes faecalis[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1999，51（2）：255261.
[6]Robertson L A，van Niel E W J，Torremans R A M，et al.Simultaneous nitrification and denitrification in aerobic chemostst cultures of Thiosphaera pantotropha[J].Applied and Environmental Microbiology，1988，54：28122818.
[7]Lukow T，Diekmann H.Aerobic denitrification by a newly isolated heterotrophic bacterium strain TL1[J].Biotechnology Letters，1997，11（19）：11571159.
[8]張光亚，方柏山，闵航，等.好氧同时硝化反硝化菌的分离鉴定及系统发育分析[J].应用与环境生物学报，2005，11（2）：226228.
ZHANG Guangya，FANG Baishan，MIN Hang，et al.Identification and phylogenetic analysis of an isolated aerobic simultaneous nitrifierdenitrifier[J].Chinese Journal of Applied and Environmental Biology，2005，11（2）：226228.
[9]胡宝兰，郑平，徐向阳，等.一株反硝化细菌的鉴定及其厌氧氨氧化能力的证明[J].中国科学C辑：生命科学，2006，36（6）：493499.
HU Baolan，ZHENG Ping，XU Xiangyang，et al.Identification of a denitrifying bacterium and the anaerobic ammonia oxidation proof of ability[J].Science in China Series C：Life Sciences，2006，36（6）：493499.
[10]Artan N，Wilderer P， Orhon D，et al.The mechanism and design of sequencing batch reactor systems for nutrient removal the state of the art[J].Water Science and Technology，2001，43（3）：5360.
[11]Pochana K，Keller J.Study of factors affecting simultaneous nitrification and denitrification（SND）[J].Water Science and Technology，1999，39（6）：6168.
[12]周德庆.微生物学教程[M].北京：高等教育出版社，1993.
[13]国家环保总局.水和废水监测分析方法[M].北京：中国环境科学出版社，2002.
[14]Halling S B， Hjuler H.Simultaneous nitrification and denitrification with and upflow fixed bed reactor applying clinoptilolite as media[J].Water Treatment，1992，7：7788.
[15]中国科学院微生物研究所.菌种保藏手册[M].北京：科学出版社，1980：293294.
[16]Buchanan R E，Gibbons N E.Bergey’s manual of determinative bacteriology[M].8th ed.Baltimore：Williams and Wilikins Company，1974.
[17]李运，盛慧，赵荣华.Biolog微生物鉴定系统在菌种鉴定中的应用[J].酿酒科技，2005，7：8485.
LI Yun，SHENG Hui，ZHAO Ronghua.Utilization of biolog microbes identification system in the identification of microbial species[J].Liquormaking Science & Technology，2005，7：8485.
[18]Huang H K，Tseng S K.Nitrate reduction by Citrobacter diversus under aerobic environment[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2001，55：9094.
（编辑 王秀玲）doi：10.3969/j.issn.16744764.2012.05.023
细菌学鉴定 篇12
关键词：细菌,鉴定,数值鉴定
据中国两大细菌耐药监测网CHINET[1]和Mohnarin[2]的统计数据，从2005到2009年，平均每年每所三级甲等医院临床分离鉴定的致病菌株达到近2000株，耐药性菌株分离率呈增长趋势，可见临床细菌分离鉴定工作极为重要。1970年以来，细菌数值鉴定技术凭借着快速、鉴定率高、便于实现自动化、商品化、标准化等优点，现已成为临床细菌鉴定的主导方法。ATB、Vitek、Microscan、Sensitive、Phoenix、Bio Fosun等商品化细菌数值鉴定系统已在临床广泛应用。但因设备价格昂贵，且无法分析非本系统的鉴定板条，极大的限制了临床实验室对各系统间性能各异的鉴定板条的使用。为此，我们研制了通用型细菌数值鉴定软件 (SUNNY-2010ID) ，并对其性能进行了评测。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
参考菌株28株，来自于本室保存的中国药品生物制品鉴定所标准菌株、中国卫生部临床检验中心室间质评菌株、辽宁省临床检验中心室间质评菌株。临床菌株129株，2株淋病萘瑟菌、2株肺炎链球菌为临床直接分离株，其余来自于本室保存的2009年临床分离株。均经Autoscan4细菌鉴定药敏分析仪鉴定 (%ID≥80.0%) ，%ID<80.0%的菌株经常规方法进一步正确鉴定。
1.1.2 细菌鉴定条及仪器
API鉴定条及相应的编码索引手册、Vitek细菌浊度仪均购于法国生物梅里埃公司。
1.1.3 编程软件
Visual Foxpro6.0购于美国微软公司。
1.2 方法
1.2.1 SUNNY-2010ID软件的编制
利用VFP6.0编程语言分别编译细菌生化反应结果和数值编码录入模块、细菌条目/生化反应阳性率二维矩阵录入模块、数值鉴定概率计算器模块和鉴定可信度评价分析器模块。将API20E、API20NE、APIStrep、APIStaph、API20C AUX、APINH各细菌条目/生化反应阳性率表输入到软件中待评测。
1.2.2 性能检测
将待测菌株按全国临床检验操作规程进行复苏、纯培养后，取纯菌落严格按照API说明书进行操作，记录生化反应结果并转换为数值编码。分别用SUNNY-2010ID软件和API编码索引手册对测试菌株的数值编码进行检索鉴定，以测评本软件的准确性。将测试菌鉴定编码用SUNNY-10ID软件分别进行多次检索，观察软件的稳定性。
2 结果
157株测试菌分布在21个属36个种，由API20E、API20NE、APIStrep、APIStaph、API20C AUX、APINH 6种鉴定条完成了测试，SUNNY-2010ID软件和API编码索引手册对细菌编码的检索鉴定正确率分别为100% (157/157) 和98.7 (155/157) ，符合率为98.7% (155/157) ，经检验两种检索方法无显著性差异 (x2检验，p>0.05) ，结果见附表。
2 株菌检索不符合，API编码索引手册无码，但SUNNY-2010ID软件正确解码，分别为:大肠埃希菌 (编码5544572、%ID=99.28、T值=0.63、种水平好的鉴定) ;阴沟肠杆菌 (编码3315772、阴沟肠杆菌%ID=59.39、T值=0.25;坂崎肠杆菌种%ID=40.40、T值=0.22;属水平可接受的鉴定) 。
对157株测试菌的鉴定编码在不同时间分别进行3次重复检索，解码的重复率达100%。
3 讨论
从二十世纪七十年代至今，几乎所有的制造商均在开发各自独立的细菌数值鉴定系统，传统的技术路线为:给每种细菌的生化反应模式赋予一组编码，建立编码数据库或编码检索本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成编码，直接查阅编码检索本或编码数据库，得到细菌名称。因此，各鉴定系统间无法兼容。本研究抛开以上传统的以编码索引数据库为数据源的检索模式，找到了一条以出现概率计算法为核心而实现通用性的技术路线。即根据Bayers理论和Lapage理论[3,4]，以细菌条目/生化反应二维表为数据源，用研发的通用型出现概率计算器，对测试菌的生化反应结果或编码进行%ID (鉴定百分率) 、T值等参数的计算，然后利用通用型可信度评价器对参数进行评测，获得细菌名称。
*注:A代表API编码索引检索法, S代表SUNNY-2010ID软件检索法;+代表鉴定正确, -代表无法鉴定或鉴定错误。
各鉴定卡/板条使用的生化反应种类、数量及鉴定谱均不相同, 本软件将数据源表的生化反应字段数量扩大到96个, 可充分适应不同商品化鉴定卡/板条的要求。在参数计算中, 由于细菌生化反应阳性率值为小数, 出现概率为多个阳性率的乘积, 为防止计算值的溢出, 出现概率字段变量均采用双精度类型, 从而保证了相关参数的准确性。
SUNNY-2010ID软件在评测中使用了6种不同的鉴定条和相对应的细菌条目/生化反应阳性率表，测试菌谱覆盖了21个菌属，正确检索鉴定率达100%，并对2株API编码索引手册检索无编码的菌株正确解码，充分显示了本软件的通用性及准确性。
总之，SUNNY-2010ID软件是一个实用的细菌数值鉴定检索工具，不但可以作为中小型细菌室的主导设备，而且可以成为大型细菌室细菌鉴定系统的补充，具有较大的临床应用价值。
参考文献
[1]汪复, 朱德妹.2008中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志, 2009, 9 (5) :321-329.
[2]肖永红, 王进.2006-2007Mohnarin细菌耐药监测[J].中国医院感染学杂志, 2008, 18 (8) :1051-1056.
[3]Analytical Profile Index[M].3rd edition.France:Biomerieux S.A.all rights reserved, 1992:1-19.