Beclin1蛋白（精选4篇）
Beclin1蛋白 篇1
摘要：目的 观察搜风祛痰法中药复方稳斑汤对Apo E基因敲除小鼠动脉粥样硬化(AS)不稳定斑块自噬相关蛋白beclin1和LC3的影响。方法 建立Apo E基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块模型,并设立空白组、模型组、西药组及稳斑汤低、中、高剂量组。实验周期1个月,麻醉处死小鼠取主动脉组织HE染色后在光学显微镜下进行病理学观察,然后采用Western blot法检测beclin1及LC3的蛋白表达水平。结果 beclin-1蛋白表达结果显示:与空白对照组比较,模型对照组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与模型对照组比较,中药中剂量组、中药高剂量组、西药组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白表达水平显著升高(P<0.01);中药高剂量组与西药组无统计学意义(P>0.05)。LC3蛋白表达结果显示:与空白对照组比较,模型对照组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与模型对照组比较,中药各剂量组及西药组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平显著升高(P<0.01);中药高剂量组与西药组无统计学意义。结论 搜风祛痰法中药复方稳斑汤对于beclin1与LC3的蛋白表达密切相关,即搜风祛痰法中药复方稳斑汤可能通过影响beclin1与LC3的蛋白表达,从而影响动脉粥样硬化斑块的稳定性。
关键词：动脉粥样硬化,搜风祛痰中药复方,稳斑汤,ApoE基因敲除小鼠,不稳定斑块,自噬相关蛋白,beclin1,LC3
动脉粥样硬化( AS) 是由于动脉血管内膜出现了黄色的胆固醇、类脂肪,逐渐血栓形成,纤维组织增生及钙质沉着,日久出现动脉管壁钙化。AS疾病普遍存在内皮功能障碍,成为导致或加重AS的重要因素之一[1]。在由AS所导致的疾病或与之相关的疾病中,对疾病的预后和死亡率有着非常重要的关系。AS斑块普遍认为分成: 内皮细胞损伤、脂质条纹形成及纤维斑块和复合斑块三步。AS斑块的发生发展受遗传和环境多种因素影响[2]。细胞利用溶酶体途径实现过多或衰亡的细胞器及损伤蛋白的降解即为自噬[3]。作为自噬相关蛋白的Beclin1 和LC3 均是参与自噬体形成的重要基因,Beclin1 是自噬特异性基因,而微管相关蛋白1 轻链31( LC3) 是自噬标志性基因,是自噬特异的诊断指标之一[4]。本实验以Apo E基因敲除小鼠为研究对象,给予中药复方稳斑汤,观察自噬基因beclin1 和LC3 的蛋白表达情况,推断二者对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。
1 材料与方法
1.1实验动物
(6~8)周龄Apo E基因缺陷鼠(系C57BU6 J,北京大学实验动物中心美国Jackson实验室引进并培育成功)70只,SPF级,体质量18 g~20 g。
1.2药物
稳斑汤药物组成:全蝎10 g,蜈蚣2条,地龙15 g,陈皮15 g,法半夏15 g,白术15 g,水蛭15 g。由辽宁中医药大学附属医院中药局提供,加工制成含生药2 g/m L的中药浓缩液备用。
1.3试剂和仪器
Beclin-1,LC3一抗及相对应二抗购自北京博奥森生物科技有限公司;总蛋白提取试剂盒北京天恩泽生物科技有限公司;蛋白marber(北京索莱宝生物科技有限公司);ECL发光试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)。
1.4模型制备
高脂饲料(含0.15%胆固醇)喂养13周后,随机处死4只。取主动脉根部,HE染色观察AS硬化程度,确定造模成功。
1.5分组及给药
取60只Apo E基因敲除小鼠,随机抽取12只,建立模型组。随机抽取4组治疗组,每组12支建立稳斑汤低剂量组、稳斑汤中剂量组、稳斑汤高剂量组及西药组。按成人服用量,换算小鼠(小鼠的体质量折算系数9.0折算)用量。稳斑汤低剂量组61.75 g/(kg·d),稳斑汤中剂量组123.5 g/(kg·d),稳斑汤高剂量组247 g/(kg·d),西药组予阿托伐他汀0.27 g/(kg·d),模型组给予生理盐水0.3 m L/d。按体质量系数比折算成小鼠用量灌胃给药,每日1次。各组干预时间为1周。另随机取正常C57BL/6J小鼠12只正常饲料喂养13周,设为空白组。处死全部小鼠,无菌条件下取出主动脉冻存于-80℃冰箱中备用。
1.6观察指标
①主动脉组织病理学观察。每组随机取10只小鼠,麻醉处死,无菌条件下在每只小鼠的主动脉根部取4个相同的切面。切面分别为:升主动脉近端横截面,切面形态呈圆形;主动脉瓣附着部位,并有冠状动脉开口:主动脉瓣起始横截面;主动脉瓣完全出现并汇合在一起。取材后用生理盐水冲洗,10%甲醛中性溶液固定。常规石蜡包埋,均匀间断切片,厚5μm。①HE染色:普通光镜下观察主动脉根部组织及斑块的形态结构。②将组织从冰箱中取出,融化,按照组织净重与裂解液1∶10加入蛋白提取试剂,并用玻璃匀浆器在冰上进行匀浆,匀浆后静置于冰上20min,10 000 r/min进行离心,离心15 min,分离上清液即为总蛋白备用。采用考马斯亮蓝法对各组总蛋白进行蛋白定量,每孔上样20μg总蛋白进行电泳,半干转印法将蛋白转至PVDF膜,一抗(1∶200)4℃孵育过夜、二抗(1∶2 000)室温孵育1 h,ECL发光,胶片曝光,扫描胶片,分别测定目的蛋白和内参β-actin条带灰度值,并用目的蛋白灰度值/内参灰度值的比值表示该目的蛋白表达水平,进行统计分析。
1.7统计学处理
计量资料以均数±标准差(±s)表示。使用SPSS15.0数据处理软件分析。组间比较用t检验,多组均数比较用方差分析,不同指标间用直线相关分析。
2 结果
2.1腹主动脉组织HE染色结果
根据以往实验得出Apo E基因敲除小鼠腹主动脉组织HE染色在光镜下观察结果,空白对照组动脉内膜附有一层内皮细胞,内皮细胞层呈现皱褶状排列,但排列均匀,表面光滑,未见泡沫细胞及炎性细胞;模型对照组:血管腔内可见明显的粥样硬化斑块出现,斑块表面附有纤维帽,纤维帽主要由平滑肌细胞、弹力纤维和胶原组织构成,斑块中央可见大量的脂质聚集,斑块内可见大量泡沫细胞,偶见炎性细胞浸润,未出现斑块的动脉内膜区域严重破损;稳斑汤低剂量组:血管腔内可见粥样硬化斑块,斑块面积明显小于模型对照组,斑块内脂质含量较模型组少,斑块内可见少量泡沫细胞及炎性细胞,未出现斑块的动脉内膜区域形态较为完整,偶见内膜残缺;稳斑汤中剂量组、稳斑汤高剂量组、西药组:动脉内膜大部分较为光滑,偶见内膜不全,内膜不全区域可见明显的脂质条纹块形成,偶见泡沫细胞聚集,有少量纤维成分交联。
2.2各组小鼠腹主动脉组织中beclin1的表达水平(见表1、见图1)
与空白对照组比较,模型对照组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与模型对照组比较,中药中剂量、中药高剂量、西药组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与西药组比较,中药高剂量组小鼠腹主动脉组织中beclin1蛋白表达水平无显著变化(P>0.05)。
注:1为空白对照组;2为模型对照组;3为低剂量组;4为中剂量组;5为高剂量组;6为西药组。
2.3各组小鼠腹主动脉组织中的LC3蛋白表达水平(见表2、图2)
与空白对照组比较,模型对照组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与模型对照组比较,中药各剂量组及西药组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与西药组比较,中药高剂量组小鼠腹主动脉组织中LC3蛋白表达水平无统计学意义。
注:1为空白对照组;2为模型对照组;3为低剂量组;4为中剂量组;5为高剂量组;6为西药组。
3 讨论
冠状动脉粥样硬化是冠心病的病理基础。Ross等[5]指出AS是一种炎性疾病,自噬相关蛋白在AS的发生发展过程中具有重要作用。自噬蛋白可影响感染性疾病及炎症性疾病的病理过程,而且在非细菌感染相关的组织损伤所诱发的炎症反应中也能发挥抗炎效应[6]。自噬还能够抑制动脉粥样硬化的发生和发展。已有的研究结果较一致认为自噬对粥样硬化具有保护作用[7]。通过自噬清除细胞内的损伤成分,保护细胞抵御各种应激,防止细胞发生凋亡和坏死。
Beclin-1 基因是第一个被研究的自噬基因,对自噬体的形成至关重要[8,9]; 微管相关蛋白LC3 是哺乳动物细胞中酵母自噬相关基因8 ( ATG8) 的同源物,LC3 的表达含量与自噬泡含量数的多少呈正相关,因此,LC3 被认为是自噬体的标志分子,可作为检测机体自噬程度的基因检测物,近来研究发现,ox-LDL能够诱导血管内皮细胞自噬,导致微管相关蛋白LC3 和Beclin-1 表达增加,在过量胆固醇存在的情况下,LC3Ⅱ蛋白含量明显升高,大量自噬泡聚集,自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤( 3-MA) 明显抑制由胆固醇负荷所诱导的自噬,促进动脉粥样硬化的发生[10,11]。本研究结果表明,与空白对照组比较,模型对照组小鼠腹主动脉组织中beclin1 蛋白、LC3 蛋白表达水平显著降低,该结果与以往研究结果一致,说明动脉粥样硬化发生时,可引起beclin1 蛋白、LC3 蛋白表达水平的降低。而中药各剂量组与西药组均能不同程度的提高beclin-1 蛋白、LC3 蛋白的表达,进而提高自噬相关蛋白的活性。这说明上调自噬相关基因beclin-1 蛋白和LC3 蛋白的表达,可以增强机体的抗氧化作用,进一步减少血管内脂质的浸润,阻止氧化应激反应的进展从而预防动脉粥样硬化的形成及发展。本实验观察到搜风祛痰中药复方稳斑汤干预后Apo E基因敲除小鼠体内自噬相关基因beclin-1 蛋白和LC3 蛋白的表达有所增加,血管内粥样斑块的脂质浸润明显减少,斑块更趋稳定。
从古到今,众医家认为胸痹是由于气亏,痰浊,瘀血,气滞,寒凝而引起心脉痹阻不畅而至。而这些是从病理机制而言,所以胸痹存在痰湿、阴虚及血瘀等临床分型。这些分型只不过是在胸痹发展过程中的不同病理阶段或是所表现的侧重点不同。本研究主要从痰、瘀、热三方面兼夹转化的病理基础为点,探讨治疗方法。中医学认为心气不足,推动无力,心阴失养,阳微而阴弦,痰瘀阻络脉道不利,而更主要的是三者杂合,交结为患,日久不化,酿成浊脂,浸于脉管。所谓“阳微”,是指胸阳不足,所谓“阴弦”,是痰饮阻滞。《医学心悟》曰“其人脏腑素有郁热,则风乘火势,火借风威,热风悱郁不得宣泄,而为热风矣”。本实验选用本院经验方复方稳斑汤,方用全蝎、蜈蚣、地龙共为君药,以达熄风止痉、解毒散结,通络止痛平喘之功。以陈皮、半夏、白术为臣,既能燥湿化痰又可宽胸理气、消痞散结;水蛭破血逐瘀,为佐药。共奏搜风祛瘀,通络散结之功效。
干预beclin-1 与LC3 的蛋白表达将成为防治AS的新靶点。本实验结果表明搜风祛痰中药复方稳斑汤与西药阿托伐他汀钙片治疗AS的效果具有相同作用,搜风祛痰中药复方稳斑汤可以提高beclin-1 与LC3的蛋白表达,这可能是搜风祛痰中药复方稳斑汤增强粥样动脉硬化斑块稳定性的机制之一。
Beclin1蛋白 篇2
1 Beclin1的研究概况
自1998年Liang等[3]在致死性Sinbis病毒性脑炎的大鼠中发现一种相对分子量为60KD的螺旋结构蛋白质, 其能与bcl-2基因产物相互作用, 抑制Sinbis病毒的复制同时诱导病毒的凋亡, 并将编码这种蛋白质的基因命名为Beclin 1以来, 越来越多的研究开始着眼于Beclin1基因。Beclin1定位于人染色体17q21, 编码450个氨基酸、60KD卷曲螺旋状蛋白。其蛋白结构域分四部分:Bcl-2结合结构域 (Bcl-2BD) , 其对于Beclin1与Bcl蛋白家族抗凋亡成员Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w在体内与体外的结合是必须的;中央卷曲螺旋区 (CCD) 能与紫外线辐射抵抗的相关蛋白 (UVRAG) 结合, 促进自噬的发生;进化保守区 (ECD) 能与Class III PI3/Vps34结合, 将信号向下游传导, 启动自噬功能[4,5];核输出结构域。
2 Beclin1对自噬的调节作用
Beclin1通过与辅助因子 (Atg14L, UVRAG, Bif-1, Rubicon, A m b r a 1, H M G B 1, n P I S T, V M P 1, S L A M, I P 3 R, P I N K和survivin) 的相互作用调节Vps-34, 促进Beclin1-Vps34-Vps15核心复合物的形成, 诱导自噬的发生[5]。自噬得以诱导之后, Beclin1-Vps34-Vps15核心复合物启动膜泡的成核反应, 并使其他自噬蛋白如Atg21、Atg24结合到膜上形成前自噬体, 再通过膜泡扩张将底物包绕形成自噬体[6]。
Bcl-2是一种凋亡抑制蛋白, 其通过与Beclin1的Bcl-2结合结构域的相互作用来抑制细胞自噬。正常情况下, Bcl-2为非磷酸化状态, 与Beclin1紧密结合, 减弱了Beclin1与Vps34的相互作用, 使其他自噬相关蛋白难以结合到自噬体膜上, 抑制了自噬的发生。当应激时, Bcl-2被激活的激酶JNK1磷酸化, 与Beclin1分离, Beclin1启动细胞自噬[7]。
3 Beclin1与肿瘤的关系
3.1 Beclin1诱导肿瘤细胞自噬
自噬可以清除受损细胞器以避免有害自由基及突变的发生, 从而避免更大的损伤, Beclin1的突变、减少或缺失均会使细胞的自噬、凋亡减少, 导致肿瘤发生率增加, 促进了肿瘤的发展, 这也在一系列研究中得到了证实。Beclin1基因的敲除促进了人类A549肺癌细胞的生长, 抑制了其凋亡[8]。而在体外实验中, 将Beclin1导入存在内源性Beclin1缺失的人乳腺癌细胞株MCF-7中, 自噬可被诱发, 从而抑制细胞增殖和肿瘤形成[9]。使用三苯氧胺处理MCF-7细胞后可引起典型自噬特征的细胞死亡, 其作用是通过神经酰胺刺激Beclin1的表达, 从而激活自噬作用来实现的[10]。这一点被应用于肿瘤的治疗当中, 化疗药物他莫昔芬、神经酰胺都是通过上调Beclin1来促进自噬的发生。
3.2 Beclin1诱导肿瘤细胞凋亡
Beclin1可与抗凋亡蛋白Bcl-2结合, 当应激发生时则与其分离产生了促凋亡作用。同时有研究表明最强的凋亡抑制因子survivin在胃癌、癌前病变、胃炎中的表达逐渐降低, 而Beclin1在胃癌、癌前病变、胃炎中的表达逐渐升高, 二者的表达强度有一定的相关性, 表明Beclin1在肿瘤的发生发展中可能与survivin起着相反的作用, 即诱导细胞的凋亡, 抑制肿瘤的形成。但也有对Beclin1致细胞凋亡作用的研究表明Beclin1与凋亡的关系并不明显, 在Beclin1+/-杂合缺失的鼠模型的研究中发现其对DNA损伤的反应以及停止血浆供给后的凋亡反应都是正常的[11]。
3.3 Beclin1抑制肿瘤细胞增殖
早期研究表明在过度表达Beclin 1的乳腺癌MCF-7细胞中, 细胞增殖、克隆形成及体内成瘤都受到了抑制。也有文献[12]报道了在局部晚期结肠癌患者中, Beclin1高表达的肿瘤细胞增殖细胞核抗原PCNA低表达, Beclin1低表达的肿瘤细胞PCNA高表达。说明Beclin1可降低局部晚期结肠癌死亡风险的机制之一是抑制肿瘤细胞周期的进行及细胞的增殖分化。
3.4 Beclin1抑制肿瘤坏死及炎症扩散
当肿瘤快速生长缺乏营养时, 肿瘤易发生坏死, 研究表明肿瘤坏死易导致局部巨噬细胞等炎性细胞浸润并分泌细胞因子和化学因子。肿瘤相关炎性反应可能促进肿瘤血管生成及肿瘤细胞的增殖。因此, 抑制肿瘤坏死及局部炎性反应可能是抑制肿瘤进展的途径之一。
Degenhardt等学者[13]构建了Beclin 1+/-同时高表达抗凋亡基因Bcl-2的永生化小鼠肾上皮细胞。由于同时抑制了凋亡及自噬, 代谢应激能导致该细胞大量的坏死。而野生型Beclin 1+/+同时高表达Bcl-2的细胞则能显著抵抗代谢应激反应。将两种细胞种植到小鼠体内后Beclin1+/-Bcl-2细胞成瘤速度明显快于Beclin 1+/+Bcl-2细胞, 并伴随瘤组织中央大量的坏死及炎性反应。因此, Beclin 1介导的自噬作用是预防肿瘤坏死及炎性反应, 抑制肿瘤发生与发展的重要手段。
3.5 Beclin1预防细胞基因组突变
自噬可以限制DNA损伤, 维持基因组完整性。Mat hew等[14]在Beclin1+/-永生化小鼠乳腺上皮的研究中证明自噬活性降低可导致细胞DNA损伤、基因扩增、染色体非整倍性等, 基因组的不稳定性大大增加了细胞的突变率, 促进了肿瘤的发生。因此, Beclin1抑制肿瘤的作用不仅仅是促进肿瘤细胞的死亡, 还可能包括维持细胞稳态, 保护细胞限制DNA损伤。
3.6 Beclin1促进肿瘤的发生发展
Beclin1在乳腺癌[15]、宫颈癌[16]中的表达下降;但在胃癌[17]、肝癌[18]中却呈现为高表达状态, 表明自噬可能促进了这些肿瘤的发展。原因可能是当快速生长的肿瘤细胞缺乏营养时, 如肿瘤晚期, 位于中央的肿瘤细胞缺乏足够的血供, 自噬被诱发, 通过降解胞内蛋白质及细胞器为肿瘤细胞的生长提供营养及能量[19]。这一点可被肝癌的自噬研究佐证:在营养缺乏的条件下, Beclin1的表达上调, 从而诱导肿瘤细胞的自噬[20]。因此, 在肿瘤发生的晚期阶段, 自噬可能利于肿瘤细胞在低血管化的环境中生长。
4 Beclin1与急性白血病的关系
有研究[21]表明, Beclin1在急性髓系白血病中低表达, 并且随着白血病危险度级别的增加Beclin1的表达水平降低更为明显;在急性淋巴细胞白血病高危组和低危组中Beclin1的相对表达量均高于正常对照组, 虽然随着白血病危险度级别的增加其表达水平明显降低, 但是仍高于正常对照组的表达水平。Beclin1m RNA在正常对照组、急性髓系白血病组和急性淋巴细胞白血病组的表达水平存在正相关关系。
5 结论与展望
目前Beclin1已被认为是一种抑癌基因, 但由于Beclin1对肿瘤存在双重调节作用, 诱发自噬不一定会导致肿瘤细胞的死亡, 反而有可能促进肿瘤细胞的增殖, 所以目前在研究尚未成熟的情况下不能盲目地将诱导、抑制自噬应用于肿瘤治疗上, 以免造成严重的后果。可以期待今后研究成熟之后利用肿瘤发展不同阶段的特点, 抑制具有保护细胞效应的自噬反应, 促进杀伤细胞的自噬以发挥抗癌作用。
Beclin1蛋白 篇3
本研究旨在饮食限制以及维生素D(VD)干预的情况下 ,观察老龄大鼠中自噬相关基因Beclin1的表达和自噬小体的比例,研究饮食限制联合维生素D对细胞自噬的影响,探索饮食限制与维生素D是否通过不同的信号转导途径来诱导细胞自噬的发生。
1 材料与方法
1.1实验动物和主要试剂山西医科大学动物实验中心购进40只18月的老龄大鼠,JEM-100CX II型透射电镜(日本日立HITACHI公司H-600),超薄切片机 (瑞典LKB公司LKB-Ⅴ),活性VD(纯度为99%)购自Sigma公司,Beclin 1兔抗大鼠单克隆抗体、EnVision抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒均购自武汉博士德公司。
1.2动物处理40只18月老龄大鼠经洗脱期后随机分为4组,对照组、饮食限制组(DR组)、维生素D组(VD组)、维生素D联合饮食限制组 (DR联合VD组),喂养6个月,每周测大鼠体重,灌胃VD3μg/kg。
1.3投射电镜检测自噬小体经过常规取材、双重固定、脱水、浸透、包埋、切片(厚度为50 nm),醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后,透射电镜观察、拍照、记录。
1.4免疫组化观察肾皮质细胞Beclin1蛋白的表达采用免疫组化法检测,组织蜡块切片,烤片后脱蜡和水化,高压抗原修复,依次滴加过氧化物酶阻断液(37 ℃ 封闭40 min)、体积分数10% 非免疫血清(37 ℃ 孵育40 min)、第一抗体(稀释度均为1∶50,4 ℃过夜),生物素标记的第二抗体(37 ℃孵育20 min)及链酶亲和素-生物素-辣根过氧 化物酶工 作液 (37 ℃ 孵育20 min),DAB显色,苏木素复染,脱水透明,中性树胶封片。用已知阳性切片作阳性对照,用PBS代替一抗作阴性对照。
1.5统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,各组细胞自噬泡比值和Beclin1的表达采用单因素方差分析, 两组之间 的进一步 比较采用t检验 ,检验水准α= 0.05。
2结果
2.1电镜观察自噬体为单层或双层膜包裹着的处于不同降解阶段的胞浆成分或废弃的细胞器经消化降解后形成的板层样结构。透射电镜下正常组肝脏细胞内脂滴较多,线粒体嵴结构清晰,自噬体少见。限食组肝脏细胞内线粒体丰富,肿胀明显,自噬体数量较多。 维生素D组肝脏细胞线粒体丰富,线粒体体积增大, 自噬体数量较多。维生素D组联合饮食限制组线粒体明显肿胀,出现大量自噬体。详见图1、表1。
2.2免疫组化显示Beclin1蛋白表达增高与对照组相比 ,DR组 、VD组 、DR联合VD组肾皮质 细胞中Beclin1的表达明 显增高 ,差异有统 计学意义 (P< 0.01),且DR联合VD组Beclin1蛋白的表达高于DR组、VD组(P <0.01)。详见表2。
3 讨 论
大量实验表明饮食限制可以引起细胞自噬,是除遗传操作以外强有力的延缓衰老方法,被称为衰老研究领域重大的发现[8]。近年来有实验发现活性维生素D也能够引起细胞自噬,成为自噬与衰老领域新的研究热点,但目前的研究尚不清楚二者是否通过相同的信号转导途径引起细胞自噬。
自噬主要的生理功能是将胞质中的大分子物 质 (如蛋白质、RNA、过量储存的糖原等)和一些细胞内源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破损的细胞器)在单位膜包裹的囊泡中大量降解,实现再循环,以维持细胞自身的稳定。这个过程对于细胞成分更新、保持旺盛的生理状态是至关重要的[9]。自噬过程的信号 调控目前 有以下几 种:mTOR信号途径、 ClassⅠPI3K/PKB途径、Gi3蛋白和氨基酸等。随着年龄的增长,细胞自噬作用开始减弱,细胞适应外界环境和自身防御反应的能力降低,损伤的细胞结构及大量氧自由基等不能有效地被清除,细胞稳态发生变化, 加速细胞老化[10]。Beclin1是酵母菌atg/vps40基因在哺乳动物中的同源物,参与自噬泡的形成过程,是新近发现的哺乳动物调控自噬性细胞死亡途径的关键基因[8]。Beclin1基因在多种正常组织中均有表达,因此可以通过检测Beclin1蛋白的表达来间接反映自噬发生的强度。
电子显微镜是检测细胞自噬的金标准[11]。自噬体是内源性物质包括细胞内由于生理或病理原因而被损伤的细胞器,或过量储存的糖原等,被细胞自身的膜 (如内质网或高尔基复合体的膜)包裹形成。通过电镜可对细胞的自噬体进行定量。
活性维生素D与细胞的自噬有着相关性,本实验结果表示4组之间Beclin1蛋白表达差异有统计学意义,且维生素D联合饮食限制组Beclin1蛋白的表达高于维生素D组和饮食限制组。这些结果显示,维生素D、饮食限制二者联合可以诱导细胞自噬,且维生素D联合饮食限制诱导细胞自噬比单独的维生素D和单独饮食限制作用更强,支持维生素D与饮食限制二者联合具有叠加作用,但维生素D与饮食限制究竟通过什么信号途径需要进一步探讨。
Beclin1蛋白 篇4
Beclin1是一种与自噬相关的抑癌基因, 位于人染色体17q21上, 在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌中该部位均存在缺失。有研究提示Beclin1的表达缺失导致自噬活性的减弱从而促进肿瘤的发生, 故Beclin1在雌激素依赖性肿瘤子宫内膜癌的发生发展中起着重要的作用。因此, 本研究旨在构建Beclin1真核表达载体pc DNA3.1-Beclin1, 建立稳定表达Beclin1的细胞株, 探讨Beclin1在子宫内膜癌细胞增殖中的影响, 以期对子宫内膜癌基因治疗提供科学的依据, 对内膜癌的发生发展关系的研究能进一步深入奠定实验基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料
高效真核表达载体pc DNA3.1质粒购自Oligoengine公司;G418和Lipofectamine2000购自Invivogen公司;BglⅡ、Eco RI、HindⅢ、T4DNA链接酶、Taq DNA聚合酶和DL2000DNA分子量标记购自北京天根生物有限公司;琼脂凝胶回收试剂盒、质粒提取纯化试剂盒、RNA抽提及逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 试剂盒购自Fermentas公司, 兔抗人Beclin1多克隆抗体购自大连宝生物公司, 所有DNA序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;人子宫内膜癌细胞HEC-1-B购自中国医学科学院上海细胞库, 实验涉及各种酶类为NEB产品, 嘌呤霉素为sigma产品, 胎牛血清 (FBS) 购自杭州四季青生物制品公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计和子宫内膜细胞Beclin1基因扩增
在NCBI数据库中查找Beclin1的m RNA全序列, 基因编号NM003766;根据其c DNA全长序列, 参照国际流行标准, 利用Invivogen公司的在线软件进行设计, 选取编码区两侧的碱基合成相应的引物。上游引物序列 (上游) 5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATACAGT-3′, (下游) 5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGT-3′, 分别含有Eco RI、HindⅢ酶切点位, 目的片段为326 bp。按T/A克隆操作规范, 参照Trizol试剂盒说明书提取人子宫内膜癌细胞株HEC总RNA, 利用蛋白核酸分析仪测定RNA纯度及浓度, 通过1%琼脂糖电泳鉴定RNA完整性;取300 ng总RNA, 根据RT-PCR试剂盒说明进行逆转录合成Beclin1DNA;PCR反应条件为:94℃预变性5 min、55℃退火1.5 min、72℃延伸0.5min, 共30个循环, 最后72℃再延伸6 min终止。取PCR最终产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 切取326 bp目的片段凝胶, 利用试剂盒回收纯化目的片段。
1.2.2 构建Beclin1表达质粒
经Eco RI、HindⅢ双酶切后, 再将插入片段定向插入真核载体pc DNA3.1的相应位点;连接产物转化DH5α感受态细胞, 挑选单菌落, 利用T/A法重组克隆提取质粒, 用Eco RI、HindⅢ双切酶鉴定, 阳性克隆命名为pc DNA3.1-Beclin1。为检测目的基因是否正确插入载体以及有无基因突变的产生, 阳性克隆送上海生物有限公司测序, 将测序结果通过blast比对, 完全正确的质粒命名为pc DNA3.1-Beclin1.
1.2.3 质粒转染HEC细胞
设立实验组 (转染pc DNA3.1-Beclin1) 、空质粒对照组 (转染pc DNA3.1空载体) 、空白对照组 (脂质体组) , 体外传代培养HEC细胞, 采用含10%小牛血清的DMEM培养基, 将细胞稀释为3×105/m L接种于6孔板, 细胞密度到70%时, 利用脂质介导法转染pc DNA3.1-Beclin1重组质粒;转染后5 h换完全培养基继续培养24 h。Western blot法测定HEC中Beclin1的含量, 按试剂盒说明书操作, 利用图像分析系统对相应分子量目的条带进行定性分析。
1.2.4 MTT法检测转染细胞活性
在转染后24、48和72 h每孔加入MTT溶液 (5 mg.rn L-1用PBS配制, p H=7.4) 20μL, 继续孵育4 h, 终止培养, 小心吸弃孔内培养上清液, 每孔加入150μL二甲基亚砜 (DMSO) , 置摇床上低速振荡10 min, 使结晶物充分溶解;在酶联免疫检测仪490 nm波长处, 测量各孔的吸光值, 重复6次, 记录结果, 绘制细胞生长曲线。
1.3 统计学处理
用统计学软件SPSS 13.0对数据进行统计学分析, Western blot法测量结果采用重复测量方差分析 (ANOVA) ;计量资料用 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料采用x2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Beclin1基因扩增
T/A克隆PCR扩增, 从人子宫内膜癌HEC细胞提取, 经鉴定其纯度和完整性均较好, PCR扩增产物电泳得到约326 bp的特异条带, 与预期扩增片段大小相符, 见图1。
2.2 重组载体鉴定结果
将构建的pc DNA3.1-Beclin1重组质粒进行测序鉴定, 测序结果与设计一致, 见图2。
注:M:DNA分子量标记;1-2:pc DNA3.1-Beclin1
2.3 转染HEC细胞中pc DNA3.1-Beclin1表达测定
分别提取转染组、空载体组及对照组HEC细胞总蛋白, Western blot检测发现转染组条带明显增粗, 提示有外源的Beclin1高表达, 见图3。用荧光显微镜观察, 发现在转染数小时后即可见到部分细胞表达Beclin1, 在4 h之内表达Beclin1的HEC细胞数量逐渐增多, 在48 h达到高峰, 其pc DNA3.1-Beclin1转染细胞内出现大量明亮的绿色荧光, 阴性对照组 (空载体组) 荧光表达百分率约为4.8%, 转染组荧光表达百分率约为72.0%, 瞬时转染效率70.0%, 可以满足实验需要, 见图4。
2.4 MTT检测转染HEC细胞增殖状态
MTT结果显示, pc DNA3.1-Belin1转染组与阴性对照组 (脂质体组) 及pc DNA3.1空载体组间HEB细胞相比吸光度值差异均有统计学意义 (P<0.05) ;阴性对照组织 (脂质体组) 与空载体对照组HEC细胞相比, 吸光度值差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。描绘细胞曲线显示转染pc DNA3.1-Beclin1载体的子宫内膜癌HEC细胞生长有明显抑制, 实验组织HEC细胞增殖明显低于对照组。
*与pc DNA3.1-Beclin1组比较, P<0.05
注:左侧为阴性对照组;右侧为实验组
3 讨论
Beclin1位于人类染色体17q21上, 大约有150 kb, 最初是由学者在致死性Sindbis病毒性脑炎的研究中被发现的, 被认为是一种双等位抑癌基因 (hapliinsufficient tumor suppressor) , 其杂合性缺失是细胞发生恶性转化的原因之一[3]。据研究, 自噬基因通过自噬作用、抑制基因空突变、促进细胞凋亡、抑制血管构建而抑制肿瘤的发生。据报道75%的人类卵巢癌、50%乳腺癌和40%的前列腺癌细胞存在Beclin1单等位基因缺失突变, 其表达量不同程度下降[4,5,6]。王赞宏等[7]通过研究发现, 自噬基因Beclin1抑制人宫颈癌He La细胞的生长, 降低其致瘤活性, 抑制肿瘤细胞的恶性增殖, 诱导自噬和凋亡, 抑制肿瘤的生长。
子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一, 发病率呈明显上升和年轻化趋势。有关子宫内膜癌的发病机制仍不完全清楚, 目前认为多基因、多阶段的癌基因或抑癌基因突变构成其发生和发展的分子基础。针对子宫内膜癌的Beclin1基因研究目前较为少见, 浙江医科大学附属妇产科医院赵剑虹等[8]通过免疫组化的研究方法发现, Beclin1蛋白在正常子宫内膜组织、良性增殖的子宫内膜、子宫内膜癌组织中表达率逐渐下降且呈显著差异性, Beclin1蛋白表达程度与子宫内膜癌细胞分化、组织学类型相关, 而与手术病理分期和肌层浸润深度无关。本课题组通过免疫组化实验证实:Beclin1蛋白在正常子宫内膜组织、良性增殖的子宫内膜、子宫内膜癌组织中表达率下降, 呈显著差异性, 与赵剑虹等[8]实验结果相一致。为更好的研究Beclin1蛋白表达程度只与子宫内膜癌发生发展的关系, 笔者设计研究方案, 用RT-PCR、T/A成功克隆扩增出Beclin1基因, 成功构建了Beclin1的真核表达载体pc DNA3.1-Beclin1, MTT法检测结果显示, 转染外源性Beclin1基因后, 实验组HEC细胞生长速率较其他两组明显减慢。Western blot法测定HEC中Beclin1的含量, 在酶联免疫检测仪测量并纪录结果、绘制细胞生长曲线显示, 当自噬基因Beclin1表达水平升高后, 凋亡的细胞明显上升;提示Beclin1基因可通过自噬调控, 进而影响子宫内膜癌的发生发展及临床预后, 以Bcelin1基因为治疗靶点, 可为子宫内膜癌的治疗提供广阔的视角。
综上所述, 结合本研究, Beclin1的表达程度与许多肿瘤的发生发展过程相关[9]。因此, 根据肿瘤发生的不同时期, 调节Beclin1的表达, 对于制定肿瘤的预防和治疗方案极为重要, 在子宫内膜癌的治疗中, 基于Beclin1的靶向治疗可成为一种新的探讨方向, 全面阐明Beclin1的功能、机制及其调控网络, 必将有助于理解子宫内膜癌的发生、发展规律, 并有效指导子宫内膜癌的临床诊治。
参考文献
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[3]Yue Z, Jin S, Yang C, et al.Beclin1, an autophagy gene essential for early embryonic development, is a haplo-insufficient tumor suppressor[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100 (25) :5077-5082.
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[7]王赞宏, 李莉, 彭芝兰, 等.自噬基因Beclin1对宫颈癌HeLa细胞生长影响的体内外研究[J].中华肿瘤学杂志, 2011, 33 (11) :804-809.
[8]赵剑虹, 万小云, 谢幸, 等.Beclin1、PTEN在子宫内膜癌组织中的表达[J].癌症杂志, 2006, 25 (6) :753-757.