激光共聚焦（共9篇）
激光共聚焦 篇1
激光扫描共聚焦显微镜 (Confocal
Laser Scanning Microscope, CLSM) , 简
称共聚焦显微镜, 是目前生物医学领域中最先进的荧光成像和细胞分析工具之一, 其应用领域日趋广泛。作为一种用于图像采集和分析的大型精密仪器, 它主要由以下几部分组成:激光光源、扫描器 (内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器) 、荧光显微镜 (装有微量步进电动机) 系统、光学装置、计算机存储与处理及控制系统。其各部分设计应用了先进的激光技术、光学显微镜技术、计算机控制及图像处理技术、精密的机械技术。整个系统由共聚焦显微镜专用的计算机软件统一精确控制, 从而保证各部分工作协调。LSM510共聚焦显微镜使用及管理方法如下。
1 基本操作步骤
蔡司LSM510聚焦显微镜基本操作步骤主要有:
(1) 打开稳压电源。
(2) 打开组电源。
(3) 打开计算机, 启动Windows, 启动LSM510软件。
(4) 选择所用染料种类。
(5) 根据染料的激发波长, 选用相应激光管。
(6) 用明场、DIC或普通荧光观察标本, 找到观察对象。
(7) 光路转换至扫描观察模式。
(8) 设置扫描分辨率、目镜倍数和扫描放大倍数等, 快速预览, 调整激光管电压、光电倍增功率、降噪等至最佳状态。
(9) 获取图像并保存, 实验结果拷贝。
(10) 关激光管电源, 退出LSM510软件, 让风扇继续工作散热, 风扇自动停止时, 方可关电源开关。
(11) 关闭计算机, 填写使用记录, 保持仪器及室内清洁。
2 需准备的器皿及要求
(1) 载玻片、盖玻片:盖玻片的厚度应在0.13~0.17 mm, 载玻片厚度在1.0~1.2 mm, 厚度要均匀、光洁、无干扰荧光。在盖玻片上培养贴壁细胞或粘贴组织切片, 完成药物反应、样品固定和荧光标记等工作。样品处理后, 将盖玻片扣于载玻片上, 上机观察测定。对于悬浮细胞, 要在试管中完成样品处理后再上机之前, 将其滴于载玻片上加盖玻片, 上机测定。
(2) petri dish (又称glass bottom dishes, 或coverslip bottomdishes) 。petri皿的结构是在35 mm塑料平皿的底部打出1个直径1 cm左右的圆孔, 并在平皿底部的外侧粘上1片厚度为0.17 mm盖玻片密封圆孔。使用时, 将内环直径36 mmpetri皿支架放到显微镜的载物台, 再将载有样品的35 mmpetri皿放到该petri皿支架, 即可用显微镜观察或用共聚焦显微镜扫描样品。
(3) 封片剂:生物样品经过固定后, 可以用封片剂进行封片, 以防样品干燥及盖玻片脱落。常用的封片剂有甘油+PBS (9∶1或1∶1) 。而对于活细胞, 则可使其悬浮于相应的溶液中, 直接滴片和封片, 立即观察, 不加上述封片剂。
3 使用注意事项
使用共聚焦显微镜, 必须注意以下几点:
(1) 严格按照使用规程操作, 不得任意改变操作程序, 激光共聚焦显微镜系统中的激光发射管使用寿命有限且价格昂贵。所以, 在操作使用过程中切记, 在开关的启动顺序以及在扫描过程中努力做到保护好激光管。
(2) 注意不要暴露在中等功率和高功率的激光辐射中, 特别要注意不得注视激光束, 甚至不要观看样品;不得在系统附近储存或使用易燃易爆物的固体、液体或气体;可以引燃的材料如布或纸张不得放入光路中。
(3) 开机或改变激光功率后, 约需20 min激光光源才能够达到稳定, 关闭系统时, 先关闭计算机, 等氩离子激光器风扇关闭时, 方可关闭系统开关。
(4) 扫描后的图像储存在计算机内, 可作进一步处理。由于计算机的硬盘有限, 应及时储存到用户软盘上, 但要警惕任何病毒浸染激光共聚焦显微系统。使用前要严格把关, 检查软盘是否携带病毒。
4 日常管理
蔡司LSM510共聚焦显微镜是一种集激光技术、显微镜技术、光度技术、计算机及图像处理技术、精密的机械技术等多种高技术于一身的大型仪器。其价格昂贵, 在使用过程中要特别注意做好保养和管理工作。通常要做到以下几点:
(1) 严格按照操作规则使用, 避免因使用不当造成损坏。
(2) 为保持良好工作状态, 延长使用寿命, 工作环境应保持清洁、干燥、远离辐射源。每次使用后, 要做好清洁工作, 及时清洁目镜、物镜等容易污染的光学部件。
(3) 系统应设立专门房间, 安装在防震台上, 工作间内要安装空调, 抽湿及防尘装置。无论仪器是否工作, 最好使其环境始终保持在22℃±1℃的恒温。
(4) 注意保护仪器的光纤, 防止被挤压, 仪器常用的零配件及专用工具由专门人员负责保管。
(5) 仪器工作间必须常年保持清洁、卫生, 操作人员必须穿拖鞋、工作服。
(6) 使用者必须培训合格后, 在管理人员的指导下, 方可上机操作。
收稿日期:2007-07-20
激光共聚焦 篇2
共聚焦显微拉曼光谱的应用和进展
介绍了共聚焦显微拉曼光谱的原理和优点,总结了国内外运用该技术在肿瘤检测、公安与法学、文物考古等多个领域的.最新应用和进展,并对其前景进行了展望.
作 者：许永建 罗荣辉 郭茂田 吴俊富 李明玉 XU Yong-jian LUO Rong-hui GUO Mao-tian WU Jun-fu LI Ming-yu 作者单位：郑州大学物理工程学院,河南郑州,450001刊 名：激光杂志 ISTIC PKU英文刊名：LASER JOURNAL年，卷(期)：28(2)分类号：O433.4关键词：显微拉曼光谱 检测 应用 进展
激光共聚焦 篇3
事情发展至此，似乎已经有了一个“完美结局”。然而，对于广大已经做过或即将去做激光近视矫正手术的人而言，因该事件所造成的心理恐慌却未能被完全消除。激光近视眼手术到底安不安全？蔡瑞芳教授所说的“术后十年出现视力明显下降”的问题是否存在？术后眩光、夜间视力减退及干眼症等并发症的发生率高不高？听听专家的观点。
疑问一：术后十年，视力会明显下降？
专家观点：术后远期视力下降与近视本身有关
准分子激光近视矫正手术迄今已有20多年的历史了。我国自1993年开展至今，并没有发现“术后十余年出现不明原因视力明显下降”的情况，部分患者在术后远期出现明显视力下降，多与近视，尤其是高度近视本身的并发症有关。
值得一提的是，近视激光矫正手术只是去除近视度数，提高视力，并不能改变近视眼患者眼球本身存在的问题。比如，高度近视患者的常见并发症包括视网膜脱离、青光眼、白内障等。其中，视网膜脱离最常见，也最严重，可导致视力严重下降，若不及时治疗，还会导致失明。
疑问二：激光近视矫正手术有严重并发症？
专家观点：只要术前“考虑周全”，并发症大多可避免。
总体而言，与准分子激光近视矫正手术相关的并发症主要有5个——干眼症、眩光、近视回退、角膜瓣相关并发症和继发圆锥角膜。不过，只要医生能在术前“考虑周全”，合理把握手术适应证，把不适合做手术的人“劝退”，同时根据具体情况，适当微调手术方式，就能显著减少术后并发症的发生。
1. 干眼症
对策：严重干眼症者不宜手术。
干眼症是准分子激光近视矫正术后比较常见的并发症，主要是由于激光切削损伤角膜神经所致，多数为轻度，且随着角膜伤口的修复，干眼症状会逐渐减轻并消退。术前存在严重干眼症者，应慎做手术。
2.眩光
对策：瞳孔过大的高度近视患者不宜手术。
眩光主要表现为夜间视力下降，看灯光时周围有一圈光晕。眩光的发生主要与患者的瞳孔较大有关。一般地说，近视度数越深，术后出现眩光的可能性越大。而对于正常大小瞳孔的中低度近视眼患者而言，目前常用的激光切削模式一般不会产生明显的眩光症状。瞳孔偏大者，可以通过扩大激光切削范围等措施，有效降低眩光的发生率及程度。部分瞳孔很大的近视患者，尤其是高度近视患者，应慎行手术。
3.近视回退
对策：注意用眼卫生，定期去医院复查。
中低度近视患者在接受激光近视矫正以后，视力大多比较稳定，不易回退。少数中低度近视患者术后再次发生低度近视，主要与过度用眼，尤其是长时间持续用电脑等因素有关。
部分高度近视及角膜厚度偏薄的患者在术后可出现近视回退现象，且近视度数越深，近视回退的可能性越大。通常，与近视矫正手术相关的近视回退一般发生在术后1年以内，术后1年以上出现的近视度数加深，多与高度近视眼本身的病变有关。
4.LASIK手术角膜瓣相关并发症
对策：根据患者的近视度数以及所从事的职业，选择最合适的手术方式。
由于LASIK手术需要先制作一个角膜瓣，然后再进行激光切削。在制作角膜瓣的过程中，可能会因为角膜瓣异常而导致严重并发症。早期LASIK手术发生角膜瓣异常的概率较高。之后，随着微型角膜刀技术的不断改进，角膜瓣异常的发生率明显降低。近几年，随着飞秒激光技术的应用，制作角膜瓣的安全性显著提高。为完全避免制作角膜瓣可能造成的风险，1999年出现了准分子激光表层角膜切削技术（以LASEK手术为代表），无需制作角膜瓣，安全性较LASIK更高，尤其适合从事容易伤及眼睛职业的人（如足球、篮球运动员），以及角膜偏薄不适合做LASIK手术者。不过，LASEK术后恢复较LASIK慢，术后不适症状也较LASIK重。
5.继发圆锥角膜
对策：术前排除潜在的临床前期圆锥角膜。
圆锥角膜的发生率很低，一般在千分之一以下，只要在术前仔细检查，排除潜在的临床前期圆锥角膜，即可将术后继发圆锥角膜的风险降到最低。
一般地说，中低度近视者（近视小于600度），如果各项条件都符合激光手术的要求，手术安全性还是有保障的，效果也多是比较理想的。角膜厚度偏薄、暗环境下瞳孔比较大，或近视度数比较深者，手术医生会根据眼睛的具体条件设计手术方案，并告知术后可能出现的问题，如眩光、近视回退等。患者一定要在充分了解手术可能带来的问题的前提下，再决定是否接受激光手术。眼睛条件不符合手术要求者，医生会明确告知其不适合做手术。
疑问三：如何保证激光近视矫正手术的安全性？
专家观点：只要严格把握适应证、规范操作、认真随访，激光近视矫正手术是一项非常安全且疗效肯定的技术。
一般地说，只要能做到以下5点，就能保证激光近视手术的安全性和疗效：
1.术前检查。手术前，患者应去正规医院进行全面、专业的眼科检查，排除手术禁忌证。检查项目主要包括：近视度数、矫正视力、角膜厚度、像差、暗环境下的瞳孔大小、眼压、眼底等。
2.使用先进的准分子激光手术设备，以免因设备问题导致激光能量不稳定、切削偏心等不良反应。
3.手术医生要有资质，经验要丰富。
4.定期随访检查，尤其是手术后半年内。术后远期出现视力下降者，也要去医院进行检查，明确原因，并进行针对性治疗。
5.术后遵医嘱用药。术后，患者一定要按医嘱规范用药。激光近视矫正术后常用的一种眼药水是激素眼药水，有减轻术后反应、促进伤口愈合的作用，但也存在引起眼压升高的副作用。患者在使用激素眼药水期间，应定期去医院测量眼压，一旦发现眼压升高，应及时停用，以免眼压持续升高导致不可逆的激素性青光眼。
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“热门”近视疗法：哪些较“靠谱”？
近年来，我国近视的患病率逐年上升。对上海市中小学生调查显示，与2005年相比，2010年近视的患病率上升5%，且有低龄化的趋势，7～9岁学生近视患病率超过30%。可以说，近视已成为人们普遍关注的社会问题。目前，市面上有关近视防治的方法很多，有些方法疗效比较肯定，有些方法则既没有科学依据，也没有临床循证医学支持，存在误导。现就目前常见的近视防治方法做一分析。
框架眼镜
总体评价：为矫正近视最常见方法，但不能治疗近视。
虽然框架眼镜不能治疗近视，但对于裸眼视力比较差、上课看不清楚黑板或投影的孩子而言，则应该戴眼镜，因为不戴眼镜时，模糊的影像会促使近视度数加深。如果孩子的近视度数不深（200度以下），在做作业等近距离用眼时，可以不戴眼镜，上课需要看黑板时戴上眼镜。如果近视度数较深，眼镜宜常戴，切忌眯眼，因为眯眼有可能促使近视进展。
软性隐形眼镜
总体评价：没有控制近视进展的作用。
由于软性隐形眼镜没有控制近视进展的作用，且存在角膜感染的危险，故除特殊情况外，一般不主张青少年配戴。
硬性透气性隐形眼镜（RGP）
总体评价：有一定的阻止或减缓近视进展的作用。
硬性透气性隐形眼镜是一种高透氧的由较坚硬的材质制作的隐形眼镜，具有光学性能好、视觉效果佳及矫正角膜散光效果好等优点。临床研究发现：硬性透气性隐形眼镜除了具有软性隐形眼镜可矫正近视的作用外，还有一定的阻止或减缓近视进展的作用。目前认为，其控制近视进展作用的机制可能是通过获得清晰的视网膜成像，减少周边像差来达到。对于进展较快的近视，硬性透气性隐形眼镜是一种较好的选择，尤其是没有其他有效控制方法的高度近视者。
硬性透气性隐形眼镜RGP白天戴，睡觉时取下，使用年限一般为2年，每片价格800～1600元。
硬性透气性隐形眼镜对配戴年龄没有绝对要求，只要能配合就可以戴，年幼的孩子需要在家长的协助下配戴。有以下情况的孩子不适合配戴RGP：有眼部炎症（如结膜炎、角膜炎、睑缘炎）、眼睑异常、无法独立操作且家长也不能协助其进行操作、个人卫生习惯不良、学习或生活环境粉尘较多。
护理不规范是导致眼睛发炎的主要原因，为了安全、舒适地配戴硬性透气性隐形眼镜，配戴者应遵守正确的使用方法，如取下镜片后，一定要进行必要的清洗护；要用专门的护理液清洗，不可用自来水、热水或清洁液清洗；不要将镜片浸泡于生理盐水中，以防盐分渗入镜片的毛细孔中，从而降低镜片的透气性；戴上镜片后应避免揉眼；定期去医院检查，出现不适应随时去医院检查。
渐进多焦点眼镜
总体评价：仅伴有“内隐斜”的近视患者有一定的控制近视进展作用，且作用较有限，对伴“外隐斜”者有害无益。
美国、澳大利亚，以及我国部分学者对渐进多焦点眼镜控制近视进展作用进行了随机对照研究，发现其只对伴有“内隐斜”的近视患者有一定的控制近视进展作用，且作用也是比较有限的。
伴“内隐斜”的近视患者在看近时，眼睛的调节力过强，渐进多焦点眼镜通过减少看近时所需的调节力而起作用。而对于伴“外隐斜”的近视患者而言，戴渐进多焦点眼镜不仅不能控制近视进展，还会加重外隐斜。
目前，渐进多焦点眼镜主要还是应用在中老年人矫正老视上。配渐进多焦点眼镜前，除了要检查近视度数外，眼位的检查非常重要，应充分评估后，再确定是否适合配戴。国内很多地方存在学生不加选择地、过度验配渐进多焦点眼镜的情况，应引起关注。
角膜塑形镜
总体评价：长期配戴有一定的阻止或延缓近视进展的作用，但其降低近视度数的作用是短暂和可逆的，一旦停戴，将很快恢复到原来的近视度数。
角膜塑形镜又叫OK镜，是一种通过“反转几何设计”的硬性透气性隐形眼镜，通过重塑角膜表面，使中央角膜变平，降低角膜的屈光力来达到矫正近视的作用。临床研究发现，长期配戴角膜塑形镜有阻止或延缓近视进展的作用，其控制近视进展作用的机制可能与重塑角膜上皮形状和改善周边离焦作用有关。不过，角膜塑形镜降低近视度数的作用是短暂和可逆的，一旦停戴，将很快恢复到原来的近视度数，故需长期配戴。
角膜塑形镜多为晚上配戴，白天可保持正常的裸眼视力而不需戴近视眼镜。配戴角膜塑形镜有一定的适应证：年龄一般要求在7岁以上、角膜中央屈光度40D～46D、角膜散光在150度以下且近视度数在600度以下。
角膜塑形镜的材质和RGP一样，护理也基本相同。由于角膜塑形镜有重塑角膜表面作用，对角膜的损伤可能性较RGP更大，因此，除了要严格依照验配医生的要求进行配戴和护理外，定期进行检查是非常重要的。每副镜片费用约5000元，使用年限一般为2年。
防近视眼药水
总体评价：比较肯定的、可有效延缓近视进展的眼药水只有阿托品，但是存在明显的瞳孔散大、视物模糊和畏光等副作用，限制了其临床应用。
阿托品是一种非选择性的M受体拮抗剂，通过作用于视网膜外组织的M受体抑制近视进展。消旋山莨宕碱眼药水是一种与阿托品类似的M受体拮抗剂，作用效果明显低于阿托品，药理学上有一定的控制近视进展作用，但实际疗效仍有待临床研究来验证。托吡卡胺眼药水也是一种M受体拮抗剂，但对眼的作用主要是调节麻痹和瞳孔散大。近年来研究发现，调节在近视形成中不起主要作用，托吡卡胺只对调节痉挛引起的假性近视有效，对真性近视是无效的。其他眼药水一般都没有经过严格的临床对照研究验证，其临床疗效无法评估。
针灸、穴位按摩、气功疗法、耳穴贴压等中医疗法
总体评价：疗效有待更严格的对照研究证实。
中医理论认为，通过调节眼部经气，改善眼部血液循环，缓解睫状肌痉挛，可达到提高视力的目的。临床研究发现，多数中医疗法仅能增进视力，而不能降低近视屈光度。同时，由于绝大部分研究没有采用随机对照研究的方法，亦未采取科学的统计方法，故这些方法的疗效有待更严格的对照研究证实。许多“眼保仪”、“理疗仪”的设计也是基于中医相应理论，也有待更严格的对照研究来验证。
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护眼灯
总体评价：护眼灯“无频闪”可保护眼睛、防止近视的说法并无科学依据，正确使用台灯才是减缓视觉疲劳、防止近视的关键。
近视眼的发生发展与照明不当有明显关系，应重视良好照明。市场上常见的护眼灯一般是由荧光灯和高频电子镇流器组合而成，与普通节能灯的工作模式完全一致，只是单纯的“高频闪”，并没有消除频闪现象。生产厂家宣称的护眼灯“无频闪”可保护眼睛、防止近视的说法，严格来讲是没有科学依据的。实际上，正确使用台灯才是减缓视觉疲劳、防止近视的关键。比如，光源要位于左前方，光线不要直接射眼，室内照明可用日光灯，桌面照明可用白炽灯，照明的亮度不能太暗，也不能太亮。
激光近视矫正术
总体评价：适用于18周岁以上的成年人，可去除近视度数，但没有治疗近视的作用。
近视激光矫正术可以去除近视度数、提高裸眼视力，是目前矫治近视疗效最为肯定的方法。不过，激光手术去除的仅仅是近视度数，并不能改变近视眼的本质。由于未成年人的眼球发育还不成熟，近视度数不稳定，除非特殊情况，一般不适合进行激光手术矫正。
营养保健品
总体评价：尚需严格的科学研究证实其有效性。
适当食用蓝莓、胡萝卜等食物有益于身体健康，但是否有助于提高视力及防治近视，则没有严格的科学研究予以证实。此外，目前市面上绝大多数宣称对防治近视有作用的保健品，也都没有经过科学研究证实。
防近视桌椅
总体评价：有助于青少年保持正确坐姿，但主要还是靠“自觉”。
读写姿势是否端正对预防近视很重要。市面上销售的防近视座椅有一定的保持坐姿的作用，但长时间保持坐姿端正主要还是依靠青少年自觉。
专家忠告：
如果你的孩子已经患了近视，应避免近视度数进一步加深。对于目前还没有出现近视的孩子而言，应注意预防近视。如何预防近视及延缓近视加深？最重要的措施还是要注意用眼卫生，即要避免用眼过度，少看电视和电脑，改变不良的用眼习惯等。另外，增加户外活动时间对于预防近视也很重要。美国、澳大利亚的学者研究发现，每天户外活动时间达到2～3小时，可有效缓解长时间、近距离用眼对眼睛的不良影响，可减缓近视进展。
每一种防治近视的方法各有其优缺点，应根据自身眼睛情况选择最合适的措施。一般地说，近视进展较快者可考虑配戴角膜塑形镜，高度近视者可考虑配戴RGP，渐进多焦点眼镜对伴有内隐斜的近视有一定治疗作用。
专家简介：
戴锦晖
复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科教授、主任医师、博士生导师
医疗专长：擅长近视、远视、斜视、弱视诊治和各种眼病所致低视力的康复治疗，尤其对近视眼激光手术矫治、复杂性屈光不正矫治有丰富的临床经验。
特需门诊（需预约）：周二下午、周三上午、周五上午
激光扫描共聚焦显微镜的选型评估 篇4
激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscopy,LSCM)是上世纪80年代发展起来的高科技产品。它通过在荧光显微镜上加装激光扫描及共轭装置,用紫外或可见光激发荧光探针,并利用计算机进行图像处理,从而得到细胞或组织内部微细结构,是细胞生物学、生物化学、药理学、生理学、遗传学、胚胎学、神经生物学、微生物学和寄生虫学等多学科强有力的研究工具。目前我国尚无同类产品生产,全部靠进口。根据品牌及配置的不同,价格在人民币150万元～500万元之间,属昂贵研究设备,所以在引进激光扫描共聚焦显微镜前进行充分的选型评估是非常重要的。
1 市场情况分析
进行医疗设备选型评估的第一步是了解当前市场的供需信息,它主要包括两个部分:一是产品的历史及现状,二是不同厂家的市场占有率。
1.1 激光扫描共聚焦显微镜的历史发展及现状
全球第一台商品化激光扫描共聚焦显微镜是Bio-Rad公司于1984年开发成功的SOM-100型,扫描方式为台阶式扫描。两年后,Bio-Rad公司推出了光束扫描的MAC-500型激光扫描共聚焦显微镜,宣告了显微光学新时代的到来。随后,Meridan、蔡司(Zeiss)和徕卡(Leica)公司也分别推出了自己的产品。1990年我国引进了五台,到1997年已有三十多台,大部份是Bio-Rad公司的MRC系列及Meridan公司的ACAS系列。
进入2000年以后,激光扫描共聚焦显微镜市场发生了巨大的变化,日本的奥林巴斯(Olympus)和尼康(Nikon)也推出了自己的激光扫描共聚焦显微镜。由于激光扫描共聚焦显微镜价格昂贵,主要面对高端研究用户,市场相对狭小,新公司的出现使市场竞争日趋激烈。先是2002年Meridian公司为英国King公司收购,退出了这一市场。2004年5月,德国Zeiss公司收购Bio-Rad公司细胞科学部的建议获英国平等竞争委员的批准,Bio-Rad公司在激光共聚焦方面的一系列技术专利被Zeiss公司纳入囊中,Bio-Rad公司也退出了。至此,激光扫描共聚焦显微镜市场形成了现在的由Zeiss、Leica、Olympus和Nikon“四强顶立”新态势。
1.2 市场情况
激光扫描共聚焦显微镜系统作为一种复杂的高端研究仪器,其昂贵的价格决定了其市场相对狭小。具不完全统计,至今国内引进的总数也就250台左右。而参与的厂商有徕卡(Leica)、蔡司(Zeiss)、奥林巴斯(OLympus)、尼康(Nikon)四家之多,因此市场竞争是非常激烈的。
2 激光扫描共聚焦显微镜的构成及成像原理
充分了解设备的构成及运作原理是设备采购的重要环节,它对采购方向的确定往往起决定性的作用。
2.1 激光扫描共聚焦显微镜的构成
传统的光学显微镜使用的是场光源,标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰。而激光扫描共聚焦显微镜则在荧光显微镜成像基础上利用激光作为光源,采用共轭聚焦装置,并利用计算机对所观察分析对象进行数字图像处理的一套观察和分析系统。主要组成包括:显微镜、激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统(包括数据采集,处理,转换,应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统(见图1)。
⑴激光器随着激光技术的飞速发展,可以根据研究需要选择不同的激光器。如:R-HeNe(633nm)、ArUV(351、364nm)、HeCd(442nm)、AR(458、477、488、514nm)、ArKr(488、568、647nm)、Kr(568nm)、G-HeNe(543nm)、Diode(405nm)等。
⑵照明针孔照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的。激光经照明针孔形成点光源,相干性好,频率、振动方向、相位高度一致。
⑶光束分离器从样品上反射和散射的光与荧光束混合在一起,所以需要用光束分离器将激发和释放光束分开。
⑷物镜选大数值孔径平场复消色差物镜为好,有利于荧光的采集以获得更清晰的成像。
⑸焦平面激光点光源照射标本,在焦平面处聚焦,激发荧光标记的样本发射荧光,形成焦点光斑。该光斑经过物镜、光束分离器等一系列装置的处理,分别在照明针孔及探测器针孔两处聚焦,共聚焦的含义由此而来。
⑹探测器针孔起到空间滤波器的作用。最大限度地阻碍非聚焦平面散射光和聚焦平面上非焦点斑以外的散射光,以保证探测器针孔所接受到的荧光信号全部来自于样品光斑焦点位置,因此样品上衍射聚集光斑和探测器针孔成像光斑包含相同信息。
⑺探测器用光灵敏度极高、响应速度极快的电倍增管(PMT)检测激发荧光,转变为电信号传输至计算机,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。
2.2 激光共聚焦显微镜的工作原理
采用激光照射标本,在焦平面上形成一个轮廓分明的小光点,该点被照射后发出的荧光被物镜收集,并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔,分别称为照明针孔和探测针孔,相对于焦平面上的光点,两者是共轭的,即光点通过一系列的透镜,最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样,来自焦平面的光,可以会聚在探测孔范围之内,而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品,探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像,调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。
3 不同品牌产品的介绍
3.1 尼康
尼康的激光扫描共聚焦显微镜系统的激光共聚焦部份叫C1si,光学部份用TE2000系列显微镜,由于其激光扫描共聚焦显微镜进入中国较迟,目前的市场占有率较低。其特点是:采用32个光电倍增管的光谱检测器,可全部或部分同时工作;光栅效率增强技术,使接收信号强度提高;双积分器信号处理技术,信号采集时损失少。
3.2 奥林巴斯
奥林巴斯的新产品是FV1000系列。特点是:应用同步双扫系统-SIMScanner,当一束激光对样品进行刺激的同时,另一束激光同时采集到高分辨率的成像,实现光刺激和观察同步进行。应用高效离子沉积镀膜技术的滤光片,增加了系统的灵敏度,使共聚焦系统能够观察极弱的激光所激发出的荧光,从而把对活细胞的损伤减至最小。
3.3 徕卡
徕卡新产品为TCS-SP5型。特点是:内置5组Leica独家专利可程序调控分光光谱检测系统,每一组的光谱范围广达400～850 nm间(波长分辨率2 nm)。因为,光通过滤镜的数目减少,其光学穿透有效率更高,影像更为鲜明,解析更高。棱镜分光的专利设计保证了高信噪比的优势,光程最短,中间滤片不再需要,光能透过率达88%,棱镜的光能损失只有3%,总光能损失只有10%。非常好的光传导性可以检测到更微弱的荧光,避免了其他公司为提高灵敏度而加大激光激发强度进而导致样本的荧光淬灭。
3.4 蔡司
蔡司在共聚焦显微镜方面有一系列的产品:LSM 510META DuoScan型是通用型激光扫描共聚焦显微镜,其特点是:采用X和Y轴独立的双镜,进行完全线性的扫描,可定义多至99个任意大小和任意形状区域,区域精确到一个像素;每个荧光通道均有其独立可调的针孔,在多重标记检测过程中,特别是在一些三维扫描时,保证每个通道扫描光切平面和光切厚度的一致性;高度自动化的“FIND”自动预扫描功能,避免了频繁重新设置扫描参数,减少了样品不必要的激光照射时间而无谓淬灭。
LSM 5 LIVE DuoScan型是高速激光扫描共聚焦显微镜,它被称为世界上最快的显微镜,只需10s就能截取1000张分辨率为512×512像素的图像。扫描速度:最快可达120幅/s(512×512像素,12位,双通道)及1010幅/s(512×50像素,12位,双通道),线扫描速度60,000线/s。
LSM 5 DUO型是高速高分辨率激光扫描共聚焦显微镜,是将LSM 510 META DuoScan和LSM 5 LIVE DuoScan主要模块的组合。
2008年蔡司推出新产品:LSM 710系列,提出PTC激光概念,激光通过光纤接至扫描头,配置灵活、免维护,同时确保了观察的精确性和可重复性。
4 选型评估的具体步骤
对激光扫描共聚焦显微镜进行具体选型评估的步骤如下:
4.1 举行产品说明会
激光扫描共聚焦显微镜技术复杂,科技含量高,不同公司的产品在技术细节、操作方法、成像方式等方面是有很大差异的,本着“优中选优”的原则,召集四家公司的产品应用专家,进行1～2次产品说明会是非常重要的。在说明会上,供方可通过讲座介绍自己的产品,需方可对自己感兴趣的焦点提出针对性的问题,通过互动方式来进行答疑解惑,达到“货比三家”的目的。
4.2 外出参观,现场操作,获取更多一手信息
目前,我国引进的激光扫描共聚焦显微镜约有二百多台,各种品牌、各种型号均有在中国落户,它们大部分分布在国内的科研院校中。而国内许多科研院校的实验室是对外开放的,对于激光扫描共聚焦显微镜,只要支付几百元的费用就可租用1～2h。因此,我们可积极走出去,制作统一的标本,分别到不同品牌的仪器上进行测试,获取更多一手信息,为今后商务谈判或招标技术参数的确定打下坚实的基础。
4.3 选择适合自己的产品
激光扫描共聚焦显微镜的选型主要应从两个方面进行考虑:
4.3.1 根据学科研究的需要来进行选型评估。
激光扫描共聚焦显微镜各种选配件非常多,而且针对不同的研究方向,一些厂家还配有特定的软件。由于各类选配件及软件都是要另外付费,且价格不菲,因此在选型时应格外严谨。比如:研究的主方向是“药物对活细胞的作用及动力学”,则选型时除考虑激光扫描共聚焦显微镜要有较高的“线扫描速度”外,还要考虑增配微型CO2培养系统。此外,选型时还应根据研究的方向,考虑空间复消色差水平的要求、温度稳定性的要求、光谱分辨率的要求等多个方面。
4.3.2 根据经济能力,即科研资金的多少来考虑。
激光扫描共聚焦显微镜不同牌品、不同型号之间的价格相差悬殊。即便是同牌品、同型号的仪器,价格也会因选配件的不同而有极大的不同。就价格而言,Zeiss最贵,Leica次之,而OLympus与Nikon的价格要较以上两家低很多。
5 总结
我们认为,“适合自己的,才是最好的”,设备的性能再好,搭配不好,得无所用,也是浪费。因此,激光扫描共聚焦显微镜选型最好根据研究的需要和经济能力,综合权衡利弊,再做选型决定。
生命科学、医学和药学研究的进展,很大程度决定于研究者是否拥有最先进的工具。激光扫描共聚焦显微镜优异的高分辩率和高灵敏度很自然的就成为整个细胞生物学领域科研工作者梦寐以求工作利器。随着我国国力提升,科研经费的增加,激光扫描共聚焦显微镜这种极昂贵的研究设备正以前所未有的速度进入我国,把好选型关,使有限的资金发挥最大的作用是每个采购者的责任所在。
参考文献
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激光共聚焦 篇5
1 激光共聚焦显微镜的组成及原理
激光共聚焦显微镜作为一种图像采集和分析的大型精密仪器, 它主要由激光光源 (氩离子激光器:457nm、477nm、488nm、514nm, 氦氖绿激光器:543nm, 氦氖红激光器:633nm, 半导体激光器:405nm) 、扫描装置 (检测针孔光栅、分光镜、发射荧光分色器等) 、显微镜、检测器 (PMT高灵敏度的光电倍增管, 电压越高, 则光信号转换成的电信号越强, 可将荧光图像的强度按照0-255分级显示) 、计算机控制系统 (包括数据采集、处理、转换, 应用软件) 、图像输出设备及光学装置 (如光学滤片、分光器、共聚焦针孔及相应的控制系统) 等部分组成。
传统的光学显微镜使用的是场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰;激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描, 标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像, 而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡, 由探测针孔后的光电倍增管逐点接受, 在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。所以照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的, 也就是说照明针孔与探测针孔具有共同的焦平面。在载物台上加一个微量步进马达, 使载物台沿Z轴上下步进移动, 将样品新的一个层面移到焦平面上, 这个层面又成像在显示器上, 随着Z轴的不断移动, 就可得到样品不同层面连续的光学图像, 从这些连续的光切图像可得到样品的真实的三维结构。
2 基本功能
2.1 多荧光探针标记样品高清晰度、高分辨率图像的采集。
2.2 无损伤连续光学切片图像的采集—显微“CT”。
2.3 三维图像重建。
2.4 时间序列扫描:xyt、xyzt和xt扫描。通常指共聚显微镜系统沿着时间轴对活体细胞和活体组织内被标记物变化的动态跟踪。如测细胞内Ca2+、K+、Na+等离子浓度的变化。
2.5 感兴趣区域的扫描。
2.6 定位、定量测定。
2.7 图像处理功能。
3 使用与维护
3.1 样品的制备
样品制备是上机检测前的关键步骤。样品需经荧光探剂标记 (单标、双标、三标) 。
标本可以是固定的或活的组织, 也可以是固定的或活的贴壁培养, 细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上, 悬浮细胞, 甩片或滴片后, 用盖玻片封片。样品的最大厚度约1～2 mm, 使用的盖玻片厚度应小于0.17 mm, 载玻片厚度应在0.8～1.2 mm之间, 而且表面光洁, 厚度均匀, 没有明显的干扰荧光。固定样品常用封片剂进行封片, 常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。
3.2 样品观察的一般步骤及参数的选择
(1) 根据荧光探针的激发波长和发射波长, 选择合适的激光器、激光功率, 分光镜滤片和发射滤片。
(2) 确定扫描方式:点、线、面、三维扫描。
(3) 确定扫描密度 (分辨率) :256×256、512×512、1024×1024、2048×2048, 分辨率越高, 扫描速度越慢, 图像信噪比越好, 但也越容易发生光漂白。
(4) 选取物镜的倍数及电子放大倍数:这个条件被确定后, 扫描范围即被确定, 物镜的光透射率与数值孔径 (NA) 的4次方成正比, 与物镜的放大倍数的平方成反比, 因此, 应尽量选择高数值孔径的物镜。
(5) 根据样品的制备质量选择合适的针孔大小, 调整激光管电压、光电倍增管功率、降噪等至最佳状态, 这些参数选择或设置有非常密切的关系, 选择时应综合考虑。
(6) 确定光切范围, 即扫描样品的厚度, 锁定起始位置和结束位置。
(7) 给出光切的层数及取图时累计平均次数。
(8) 获取图像并保存。
3.3 日常维护
激光扫描共聚焦显微镜是大型精密仪器, 其价格昂贵, 在使用过程中要特别注意做好保养和维护工作。
(1) 设立专门实验室, 实验室光线暗淡, 电源电压稳定。安装在防震台上, 室内要安装空调, 保持一定的温度, 最好保持在21℃±1℃。
(2) 注意防尘。为保持良好的工作状态, 延长使用寿命, 工作环境应保持清洁、干燥、远离辐射源。每次使用后, 要做好清洁工作, 包括目镜、物镜等容易污染的光学部件的清洁。
(3) 严格按照操作规则使用, 避免因使用不当造成损坏。注意开机关机的顺序及激光管的保护, 使用需预热约半小时。
(4) 注意保护仪器的光纤, 防止被挤压, 仪器常用的零配件由专门人员负责管理。
(5) 扫描后的图像及数据严禁用软盘拷贝, 以防病毒浸染激光共聚焦显微镜系统。
(6) 使用者需经培训后, 方可上机操作。
参考文献
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[2]丁文骏, 欧阳贵.激光共聚焦显微镜的使用和管理[J].医疗卫生装备, 2008, 29 (2) :118.
激光共聚焦 篇6
激光共聚焦实验室隶属于笔者所在高校医学实验与测试中心的形态学平台, 目前实验室拥有:Leica双光子激光共聚焦显微镜1台、Leica单光子激光共聚焦显微镜2台、高速激光共聚焦实时成像分析系统、体视学显微图像分析系统、显微图像分析系统、荧光显微镜等多套设备。激光扫描共聚焦显微镜 (Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM) 是精密大型仪器, 可以对样品进行断层扫描和成像, 无损伤地观察和分析细胞的三维空间结构, 进行活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察, 现已成为细胞生物学、生理学、医学免疫学、药剂学等研究领域中的重要工具之一。
曾有一段时间, 该高校Leica SP5单光子激光共聚焦显微镜及双光子激光共聚焦显微镜每天开机8小时以上, 仍然满足不了学生使用的需求。另外, 实验室于2011年新增了高速激光共聚焦实时成像分析系统, 此系统支持24小时或48小时过夜观察。为了更好地为学科建设服务, 提高大型仪器设备的使用效益, 2012年该高校经过讨论和调研, 决定将一批仪器设备开放使用, 对于暂时不具备开放条件的紧缺仪器的使用, 采取中午连续开机, 连续安排实验。根据实验需要实验室工作人员可晚上值班。
1 激光共聚焦实验室开放流程
目前, 激光共聚焦显微镜实验室开放使用的小型仪器有:Leica荧光显微镜、Olympus MVX10宏观显微镜、MBF体视学显微图像分析系统、Leica DMLA显微图像分析系统、Olympus摄影生物显微镜。这些仪器的操作相对简单易学, 可用于普光和荧光样品的图像采集、图像的统计分析。由测试者提出独立操作申请, 仪器管理员对其进行培训, 如果是在正常工作时间, 测试者独立完成实验并登记使用记录, 并由管理员检查实验室安全后签当日安全记录。在非工作时间即周一至周五17:00至22:00开放, 上机人员可在实验室独立操作。
当使用大型精密仪器如高速激光共聚焦实时成像分析系统时, 对需要8小时以上持续观察即需过夜观察的测试者开放。测试者提出独立操作申请, 经过仪器管理员培训认可后才能独立操作仪器。因为是在非工作时间开放, 为保证实验室安全, 上机人员需提前向仪器管理员借实验室钥匙, 并签订钥匙租借及实验室使用协议, 在此协议中明确了实验室管理员及测试者双方需遵守的责任与义务, 目的是在于提醒测试者在独立操作期间严格按照操作流程操作, 并保证实验室安全, 实验完成后需认真如实地填写实验记录以及实验室安全记录, 锁好门后离开实验室。见图1。
2 实验室开放管理
2.1 制度化的管理
根据该校相关管理规定, 结合仪器的具体情况制定与开放使用配套的管理制度, 保证实验室开放工作规范化、科学化、程序化。制订的管理制度主要有:仪器开放使用预约登记办法、仪器开放使用规程、仪器开放使用损坏赔偿制度、仪器开放使用收费办法、大型精密仪器有偿使用服务管理办法等。有了各项管理制度, 便能做到分工明确, 有序地进行大型仪器设备的开放。
2.2 技术培训
古人云“工欲善其事, 必先利其器”, “利其器”一是选择适用的工具, 二是尽力用好它。实验室管理员针对仪器使用者的不同实验目的, 推荐适用的仪器和方法, 不能只为把图像照得漂亮些就一定要使用激光共聚焦显微镜。为了保证大型精密仪器的开放使用, 必须先行一步, 对使用的人员进行技术培训。仪器使用人员应掌握基本操作和常遇到的简单问题处理方法, 在仪器管理人员对其进一步实际操作考核后, 确认能够独立上机测试时, 被培训人员才可利用开放时间上机独立测试自己的样品。由于测试者在开放性实验过程中会提出各种各样的问题, 因此, 实验室指导教师不仅要具备一定的理论基础和实验技能, 还要有广博的知识, 才能够给学生提供恰当的指导。
2.3 合理的时间安排
实验室的开放需要有序的安排, 因此技术指导需提前完成。如何在样本的预选、图像采集、显微图像分析等系列环节进行技术服务, 更加有效地利用实验室的设备是需要关注的问题。有时遇到个别学生在用了激光共聚焦显微镜时才发现自己的样本没有制作好, 白白浪费了预约的时间段。按照形态学实验观察及分析的实验流程, 实验室指导教师及时发现学生在样本的制作、预选、保存等过程中出现的问题, 提出参考意见是非常重要的。根据不同学生的实验进度及技术掌握程度, 合理安排实验时间。对于刚刚开始做实验的学生, 开放的仪器是小型仪器, 开放的时间一般是在工作时间, 便于实验室管理人员及时处理出现的问题。对技术掌握程度比较高, 已熟悉相关实验流程的学生再开放大型仪器, 开放的时间也可安排在晚上。
2.4 实验设备维护
精密仪器的正常运转有赖于日常的保养维护, 也是开放实验室的基础。精密仪器的使用前后都应进行维护, 确保每位使用人员的实验顺利进行。由于在实验室开放期间有实验器材损耗, 这就需要及时清点、整理, 对有问题的仪器及时联系设备公司的维修工程师进行维修, 补充常用耗材。在每学期对仪器与设备进行清查、统计, 及时向学校提出需增购的器材清单, 使实验室的仪器处于良好的状态, 为实验室开放提供保障。
3 不足与改进方案
实验室开放工作的每一个具体环节都要落到实处, 以免因一时疏忽造成损失, 影响整体工作进展, 实验室的开放并不是一件易事。实验室开放涉及实验室资源的配置、实验队伍优化、配套的管理制度建设等内容。从开放运行以来, 在实践中发现了一些不足。
3.1 开放力度较小
目前, 该实验室完全开放的仪器较少, 因一些大型仪器相对精密稀缺, 如果完全开放极易因误操作造成损坏, 需要专职人员操作管理, 造成了实验时间不够自由, 需要提前预约等候等问题。另外, 在非工作时间开放过程中, 缺乏专职人员的指导, 若测试者在实验过程中有新的发现, 不能及时的调整实验方法, 极易错过难得的实验现象[3]。
3.2 运行机制、管理制度仍需完善
实验室管理规章制度不具体, 责任不明确, 实验室不能高效利用[4]。缺乏激励实验技术人员的创新机制, 现有的制度还未能充分调动实验室人员提高业务的主动性。
3.3 管理方式
实验室目前还没有建立相应的信息化网络, 不能准确得到测试者具体的实验开始及结束时间, 完全依靠测试者的自觉性登记, 造成年终时仪器的数据统计困难, 如有相应的信息化预约及极时统计数据库系统作支持就可解决以上问题[5]。
提出以下几点改进方案:
根据现有的仪器和实验管理人员情况, 通过加强对使用人员的技术指导, 减少实验失误, 少走弯路, 提高效率, 尽量让每次实验采集图像时都能有准确清晰的图像, 正确运用图像分析系统得出可靠的结果。在学生逐渐熟练掌握操作方法后, 加大开放力度, 尽可能满足学生对仪器使用的要求。
完善管理机制, 使实验室管理规范化和科学化, 从而保证开放式实验室的教学和科学研究的正常进行。强化学生的管理, 实行导师负责制, 对进入开放实验室的学生进行安全教育, 每次进入实验室都必须认真填写《实验室开放使用记录》。进一步明确实验室管理人员的职责, 加强管理, 落实责任。先进的仪器需要高水平、高素质的技术人员管理。为了增强实验技术队伍的技术素质, 重视实验室队伍的进修和业务学习。组织技术人员参加各种知识讲座和全国性的学术会议, 掌握新的技术方法。
健全网络化管理与服务系统。构建仪器开放网络, 实现实验网上预约、登记、管理系统。在网络上应有仪器教学内容, 包括仪器使用的多媒体课件和仪器使用心得的交流, 让学生在实验前自主学习, 弄清实验原理和操作注意事项, 分享他人的实验经验。这样做既保证了大型精密仪器对学生开放, 又避免了仪器由于不当操作而造成的无谓损害, 提高仪器的使用率。
高校实验室是培养创新型人才的重要基地, 是培养学生创新能力、动手能力、科研能力、团队合作能力的重要场所。实验室开放为学生提供实践学习的机会, 充分调动和激发学生学习的主动性和积极性, 使学生有独立思考、自由发挥、自主学习的时间和空间, 做到因材施教, 培养高素质人才[6]。仪器的开放使用能够有效地安排测试时间, 给学生提供很多方便的条件, 培养研究生使用仪器设备及分析测试结果的能力[7]。今后要进一步完善相关细节, 把实验室开放工作做得更好。
摘要：从笔者所在高校激光共聚焦实验室的开放及管理出发, 分析了目前实验室开放过程中遇到的管理机制、实验技术培训、仪器维护等问题, 并提出相应对策, 以期对高校实验室的开放提供有益参考。
关键词：实验室开放,管理,实验流程
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激光共聚焦 篇7
1 激光扫描共聚焦
1.1 传统激光共聚焦
激光共聚焦显微镜技术已经成为光学显微镜发展应用中最重要的一种手段。在常规的宽视野光学荧光显微镜中,样本发射的继发性荧光在物镜焦平面上黯淡不清[1],使一些细节丢失。共聚焦显微镜改善了中轴(Z轴:平行于显微镜视轴)和侧平面(X轴和Y轴:样品平面的维度)的光学分辨率,并且能够减少在成像过程中由样品在焦平面中产生的继发性荧光。即使共聚焦显微镜较传统的宽视野显微镜有了很大的提高[2],但是它不能动态实时观测活细胞各项生理指标,活细胞激光共聚焦显微镜弥补了传统共聚焦显微镜的这一不足。
1.2 活细胞激光共聚焦
活细胞激光共聚焦成像系统是在显微镜上添加了1个透明的小型细胞培养箱,内部二氧化碳气体浓度为5%,温度可保持在37℃,因而可以长时间动态地观测到细胞内从开始到结束的生物完整活动过程。在机械部分采用的转盘扫描技术减少了光毒性和光漂白。同步控制技术确保了样本的照射只在图像采集时进行,使得长时间、连续地观察活细胞数十分钟或数小时后仍能保持细胞的活性,其在这方面大大优于传统的点扫描型的激光共聚焦系统[3]。
在提高图像清晰度的基础上,活细胞共聚焦成像系统能够完成各种复杂的活细胞过程的成像。例如,在高分辨率和高灵敏度的情形下观察快速的生物过程,如蛋白质的细胞膜输运和钙释放/钙闪过程,并用超视频的速率记录和回放这些过程;可以根据实验的需要长时间地检测完整的细胞分裂循环和胞内活动过程[5]。在膜电位测定中,传统共聚焦只能测其固定时间点的膜电位,活细胞激光共聚焦则可以在一段时间内观测到细胞膜电位的动态变化过程,也可实时观测到细胞内复杂的生理活动,包括质粒穿梭、囊泡运动、负载荧光的药物靶向进入细胞的动态过程。
1.3 双光子激光共聚焦
双光子激光共聚焦与普通共聚焦相比,光强度可减少9倍,为药理学实验打下了良好的基础。例如,在心肌细胞钙闪的电位钳研究中,一系列电位钳脉冲在同一区域要扫描上千次[10],双光子的高效性可以在相同时间内搜集到更多的数据,而且对钙荧光指示剂的光损伤和光漂白作用比较小。在平滑肌内荧光指示信号在动物体内要比室温更易丢失。在未受损的动脉中,钙离子指示荧光信号也可被双光子共聚焦很容易地收集从而被检测到。
传统激光共聚焦显微镜的两大局限:(1)光毒性现象:因为共聚焦的针孔必须足够小,以获得高分辨率的图像,而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色,荧光信号会随着扫描进程变得越来越弱。(2)在激光照射下,荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素,因此实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度,以保持样品的活性。活细胞激光共聚焦与双光子激光共聚焦弥补了传统激光扫描共聚焦显微镜的一些缺点,为生命科学提供了有效的检测工具[16]。
2 激光扫描共聚焦在神经科学中的应用
2.1 激光扫描共聚焦技术在阿尔茨海默病中的应用研究
2.1.1 研究tau蛋白过度磷酸化与阿尔茨海默病的关系
在多数神经退行性疾病中,如阿尔茨海默病(alzheimers disease,AD)、第17号染色体异常导致的额颞叶型痴呆伴帕金森症(frontotemporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17,FTDP17)、进行性核上瘫(progressive sup ranuclear palsy,PSP)等,均可见异常tau蛋白聚集在细胞体和树突内所形成的tau蛋白包涵体,并伴有轴突的退行性变,这类疾病称为tau蛋白病(tauopathy或taupathy)。在这类疾病中,关于tau蛋白聚集的原因可能与表达tau蛋白的基因突变、tau蛋白转录后的异常修饰、淀粉样蛋白的沉积和局部脑组织内的胶质激活等因素有关[21]。其中,过度磷酸化引起的tau蛋白的构象改变而导致的tau蛋白聚集可能是tau蛋白的重要毒性形式[22]。过度磷酸化tau蛋白形成的成对螺旋丝(paired helical filamnents,PHFs)是神经细胞内神经元纤维缠结(neuronal fibrillary tangle,NFT)的主要成分[23]。因此,tau蛋白的异常聚集被认为与神经元丧失及认知功能障碍有关。利用基因重组技术将人的全长tau基因插入到pEGFP-C1表达载体中,构建成带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的tau融合蛋白真核细胞表达质粒pEGFP-C1-tau,并转染无内源性tau蛋白表达的293T细胞,建立了瞬时和稳定表达tau蛋白的非神经元细胞系。在激光共聚焦显微镜下,通过观察荧光蛋白的表达情况及细胞的状态来动态观察过度表达的tau蛋白对细胞生长和分化的影响,从而了解tau对细胞的直接毒性作用。表达人tau蛋白的质粒转染293T细胞后16～24 h,通过激光共聚焦显微镜可以观察到大多数细胞的形态发生了变化,主要表现为细胞胞体变圆、突起变短或消失、细胞的贴壁性差等,而转染空载体的对照细胞大部分形态正常。
2.1.2 β-淀粉样蛋白(β-amy-loid,Aβ)在老年斑内定位研究
Aβ在脑内的病理性沉积并引起神经元死亡也是AD病因之一。体内的Aβ由β-淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)经β-和γ-蛋白水解酶水解而成[26]。到目前为止,对触发不溶性Aβ形成的原因还不是十分清楚。但国内外研究表明,金属离子,尤其是锌离子是导致Aβ在细胞外聚集进而形成老年斑的重要原因之一。锌离子通过连接相邻Aβ分子的第13位上的组氨酸导致Aβ聚集。锌离子在脑内的代谢与一组拥有8个成员的锌转运体(zinc transporter,ZnT)家族密切相关,其中锌转运体23(ZnT3)在大脑内的表达具有特异性。对AD患者尸检时发现大脑皮层老年斑内有大量锌离子聚集。ZnT3是体内的一种重要的锌转运蛋白,存在于轴突终末的突触小泡膜上,其主要功能是将锌离子转运至突触小泡内聚集,并在突触活动时释放到突触间隙,发挥锌离子的神经调质功能[26]。经ZnT3基因敲除的小鼠,锌不能存在于大脑皮层,在杏仁体、嗅球、听觉核和海马的苔状纤维上积累,而ZnT3基因敲除可明显抑制APP转基因小鼠老年斑的形成,提示Zn T3在Aβ聚集及老年斑形成过程中起着重要的作用[26]。ZnT3广泛分布于野生型小鼠海马苔藓纤维的轴突终末,在APP/PS1转基因小鼠的海马苔藓纤维中同样存在着ZnT3的广泛表达。同时,通过激光共聚焦观察分析,发现ZnT3与Aβ共表达于老年斑内,提示ZnT3可能通过调节锌离子的聚集过程,进而参与APP/PS1转基因小鼠大脑内Aβ老年斑的形成;同时也进一步证实了突触小泡内的锌在Aβ聚集过程中的关键性作用。应用免疫荧光和共聚焦激光扫描显微镜技术进一步对ZnT3在APP/PS1转基因小鼠大脑内的表达,及其与Aβ在老年斑内的位置关系进行了研究,以期为脑锌代谢紊乱与AD发病的相关性研究提供重要的形态学依据。用激光共聚焦显微镜可以观察到APP/PS1转基因小鼠、Aβ免疫阳性的老年斑广泛分布于大脑皮层各层及海马的齿状回、CA12CA3区域。ZnT3免疫荧光除了分布在海马苔藓纤维外,还可见于大脑皮层和海马的Aβ老年斑中,而且几乎所有的老年斑均有不同程度的ZnT3表达。Aβ阳性反应产物呈红色荧光,主要分布于老年斑的核心。而强阳性的ZnT3反应产物呈绿色,主要定位于老年斑周围变性的神经元及突起内,围绕老年斑的Aβ核心分布。将双通道扫描的ZnT3和Aβ图像复合后,清晰可见二者共同表达于老年斑内。
2.2 活细胞激光共聚焦在转染神经母细胞瘤融合蛋白定位中的应用
新近发现的一种下丘脑神经肽黑色素浓集激素(melanin-concent rating hormone,MCH)能够调节能量代谢,增进食欲,与肥胖关系密切。目前的研究已发现MCH有2个受体亚型MCHR1和MCHR2,而关于MCHR2的研究较少,其功能也不明确。MCHR1和MCHR2主要位于中枢神经系统,目前还很少用神经母细胞瘤细胞对MCHR2进行研究。构建黑色素浓集激素受体(MCHR2)/增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,转染人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y,建立稳定表达人MCHR2的SH-SY5Y细胞系MCHR2-SH-SY5Y。用基因重组方法克隆到质粒pEGFPN1,构建真核表达载体pEGFPN1-MCHR2,并用LipofectamineTM转染到SH-SY5 Y细胞,通过G418筛选建立稳定表达MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞系,用活细胞激光共聚焦显微镜观察融合蛋白亚细胞定位。活细胞激光共聚焦显微镜观察融合蛋白MCHR2/EGFP的亚细胞定位情况,在稳定转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞中可以清楚地看到细胞膜上有绿色荧光蛋白表达,而稳定转染空质粒pEGFPN1的SH2SY5Y细胞观察到全细胞有绿色荧光蛋白表达。可观察到MCHR2在稳定表达人MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞株中的定位情况,即稳定细胞株MCHR2-SH-SY5Y构建成功。活激光共聚焦显微镜观察转染pEGFPN1-MCHR2的MCHR2-SH-SY5Y细胞融合蛋白定位于细胞膜,而转染空质粒pEGFPN1的SH-SY5Y细胞EGFP定位于细胞质。
3 激光扫描共聚焦在抗肿瘤研究中的应用
3.1 激光扫描共聚焦显微镜对凋亡的肿瘤细胞的分子水平监测
近年来关于肿瘤细胞凋亡分子机制的研究已有了很大的突破。细胞凋亡的信号传递途径及其调控涉及到大量的酶级联反应、生物大分子的空间移位等。而激光扫描共聚焦显微镜以其定量、定时、定位的优点,结合众多荧光探针的应用,成为研究细胞凋亡分子水平变化的有力手段。以下就肿瘤发生凋亡中较常规的几个指标进行简单综述。
3.1.1 凋亡肿瘤细胞中DNA损伤
肿瘤细胞中的大分子DNA断裂以及染色质的异常凝聚是细胞凋亡的关键,同时也是细胞核在细胞凋亡中具有标志性的变化[18]。而在对细胞凋亡和细胞坏死区别的研究中,Kressel等[14]在培养的白血病K562细胞中加入放线菌素D以诱导凋亡,并对肿瘤细胞的DNA片段进行了3′-OH末端标记。经激光扫描共聚焦显微镜连续动态观察,发现白血病K562细胞凋亡早期有大量DNA片段出现,且DNA片段弥散分布于除核仁外的细胞核区。伴随着凋亡的进行,细胞核内出现大量高标记密度的圆形小体。而采用快速冻融法使细胞坏死的实验中,经激光扫描共聚焦显微镜观察证实,在坏死开始阶段并无DNA片段的出现,至少在坏死发生24 h后才有DNA片段产生。
3.1.2 Caspase家族在肿瘤细胞及神经细胞凋亡中的作用
Caspases是一组高度保守的半胱氨酸蛋白酶,目前发现其有11个成员。多数肿瘤细胞凋亡是通过Caspase家族蛋白的激活并作用于其关键底物实现的。Caspases激活的关键又在于该家族蛋白间的级联反应,因此Caspases被认为是肿瘤细胞凋亡的中心环节和执行者。利用激光扫描共聚焦显微镜可对肿瘤细胞凋亡中激活的Caspase-3重分布进行研究[15]。用丁酸处理细胞后,观察到DNA的裂解与Caspase-3的激活成正相关,而Bcl-2的过度表达则可抑制上述2个过程。同时还发现:(1)激活后的Caspase-3重分布到核区。(2)裂解局部的DNA和PARP(聚腺苷二磷酸核糖多聚酶)。(3)裂解产物又被释放到核外的细胞液。而Caspase-3的抑制物四肽(DEVD-CHO)又可抑制上述的3个连续步骤。该研究提示:激活的Caspase-3在核内的重分布构成了丁酸所诱导的细胞凋亡中的一个重要凋亡信号。另外,在用激光扫描共聚焦显微镜对Q79诱导大鼠神经元凋亡的研究中,Sanchez等[17]发现了Q79对Caspase-8的聚集和激活,通过对Caspase-8的抑制则可阻止细胞的凋亡,用Western blot加以分析后建立了Caspase-8的激活和某些神经退行性疾病(如舞蹈病)的关系。
3.1.3 激光扫描共聚焦观察PTEN基因敲除对肿瘤凋亡的影响
乳腺癌MCF-7细胞中存在PTEN蛋白表达,也常伴有PTEN蛋白的表达缺失或减弱[21]。JNK信号通路在细胞分化、凋亡以及多种人类疾病的发生、发展中起着至关重要的作用。PTEN可通过负性调控MAPK信号通路调节细胞的增殖、分化、凋亡等。JNK信号通路是MAPK中重要的通路之一,其大致模式可归纳为:应激等刺激因子→生发中心激酶(GCK)→MEKK→SEK1→JNK→细胞生长阻滞、凋亡。另有研究表明,JNK通路的激活与多种系统的促凋亡作用有关[22]。已有研究表明,JNK通路激活可作为乳腺癌进展的一个指标[24]。利用反义寡核苷酸方法敲除人乳腺癌MCF-7细胞中的PTEN基因,旨在探讨MCF-7细胞中PTEN表达或缺失对JNK通路活性的影响,为更好地选择以JNK为靶点的乳腺癌治疗人群提供理论依据。PTEN基因通过直接或间接作用整合复杂的信号网络系统,并影响靶分子及其下游信号级联反应,敲除MCF-7细胞中PTEN基因对JNK通路活性的影响。PTEN反义寡核苷酸转染后,通过激光共聚焦显微镜检测MCF-7细胞内的PTEN蛋白表达,MCF-7细胞中JNK通路激活与PTEN表达水平相关,PTEN缺失而使MCF-7细胞中JNK通路活化,与未经PTEN基因敲除的MCF-7细胞相比,凋亡率明显下降。
3.2 双光子共聚焦显微镜在肿瘤凋亡中的应用
在利用双光子共聚焦显微镜技术研究Sigma-2受体在乳腺癌细胞的亚细胞定位的研究中发现,Sigma-2受体激动剂通过线粒体依赖途径与非线粒体依赖途径诱导乳腺癌细胞凋亡。但是很少有报道提及Sigma-2受体可诱导乳腺癌细胞发生凋亡的这一分子功能。在此研究中,利用SW107、K05-138这2种荧光探针,通过双光子激光共聚焦进行Sigma-2受体在亚细胞中定位的研究。在EMT-6小鼠与MDAMB-435人乳腺癌细胞中,线粒体、溶酶体、内质网、质膜中的Sigma-2受体被荧光标记。K05-138这种荧光探针纳入迅速,5 min可达到荧光强度平台期,这种细胞摄入作用可被细胞吞噬抑制剂氧化苯胂减小到40%。在一些细胞器中,Sigma-2受体的定位在Caspase依赖途径与非依赖的凋亡途径的研究中证明Sigma-2配体是癌症化疗因子。
4 新型激光共聚焦在神经、肿瘤研究中的优势
利用新型激光共聚焦如活细胞激光共聚焦、双光子共聚焦研究肿瘤细胞凋亡具有其独有的优点,可以作为细胞分析的完整应用工具,实时进行高清晰度荧光成像,其低光漂白和光毒性扫描和检测技术最大限度地减少了光对活细胞的伤害。它还可用于第二信使和蛋白因子等信号传导途径分析,也适用于膜和膜泡转运实验[11]。神经细胞培养条件较之肿瘤细胞更为苛刻,活细胞激光共聚焦可以提供细胞生长所必需的条件,如二氧化碳浓度、温度、湿度,保证神经细胞在较长时间内(10 h)的状态良好,以便进行长时间地动态监测。
5 结语
激光扫描共聚焦是近10 a发展起来的医学图像分析仪,其高分辨率,特别是在细胞多种物质含量变化的定量检测、完整细胞的三维立体结构图像重建方面,不是传统光镜和电镜所能相比的。同时,近些年发展起来的新型激光共聚焦可以处理活的标本,不会对标本造成物理化学特性的破坏,更接近细胞生活状态参数测定。激光共聚焦显微镜作为辅助工具为神经、肿瘤研究提供了便利的条件,近年来已逐步在神经、肿瘤研究中得到应用。激光共聚焦与光镜、电镜、流式细胞仪相结合将是神经与肿瘤研究的一大趋势。
摘要：介绍了近年来新出现的共聚焦显微镜新的种类,如传统激光共聚焦和活细胞激光共聚焦,对其功能及在神经、肿瘤研究中的应用进行了综述,使现代显微镜能够更加深入研究和分析细胞的变化过程和结构。活细胞激光扫描共聚焦显微镜与双光子激光扫描共聚焦显微镜实现了对肿瘤、神经活细胞长时间地动态观测,可更加真实地揭示细胞凋亡的机制与规律。
激光共聚焦 篇8
我室引进的Leica TCS SP2型激光共聚焦配有全自动DMIRBE2新型光学显微镜系统;Leica TCS SP2 AOBS扫描头;四通道荧光共焦检测器及一个投射光DIC检测器;八通道AOTF调节器;电脑主机及双屏显示器。可进行组织和细胞的微分干涉及荧光的断层扫描;多重荧光的断层扫描及重叠;实时动态扫描及其动态构建;组织与细胞的三维动态结构构建;荧光共振能量转移的分析 (FRET) ;图像漂白后的荧光修复 (FRAP) 等。功能强大, 性能优良。但复合软件及多功能操作界面的使用对于初学者来说有些复杂, 操作过程中多会出现以下问题。
1 扫描最终图像清晰度不高
造成此类问题的原因主要有两个:
(1) 物镜和ZOOM值选用不正确。初学使用者大多喜欢选用10X物镜后, 再将ZOOM值调到所需要的最大值。通过ZOOM值的增大确实可以将图像放大, 有助于看清图像的细节, 但是ZOOM的增大是有限定的, 这取决于物镜的倍率。例如在10X物镜下, ZOOM值超过10就没有意义了, 而且ZOOM值的增大属于电子放大, 放大倍数越高, 清晰度越差。所以在所观察的样本形态体积较小的情况下, 多采用高倍物镜 (例如63X水镜或油镜) , 再适当调整ZOOM值, ZOOM值以不超过2为佳。
(2) 误将Z-Position旋转球的功能和显微镜焦距微调旋转器的功能等同。在准确调焦的基础上, 通过Z-Position旋转球的左右调节, 可以观察到目标样品图像由Z轴距离变化而引起的图像清晰度的改变, 感觉上和通过调焦使图像变清晰一样。因此很多使用者在没有调焦准确的情况下, 直接使用-Position旋转球来调整图像清晰度而导致成像模糊。
2 扫描背景强, 图像质量差
解决这个问题的关键在于要根据样品的制备质量选取合适的针孔大小, 调整激光管电压、光电倍增管功率、信噪比等参数到最佳状态。这些参数或设置有非常密切的关系, 选择时应该综合考虑;或者是在扫描时使用Aver键和Li.Ai.键 (即简单的数学平均方法) 进行图像平滑减噪, 另外一个方法是在此基础上, 图像扫描完成后通过LCS软件中的图像处理功能键来调节亮度、对比度和进行灰度校正以及通过基线校正去除噪音, 使图像质量最佳化。还有一种明场出现环状波纹背景的情况是由于操作者在使用显微镜观察荧光样品后, 没有将荧光滤镜退出并切换到扫描状态所致。此时只需要转动调节轮至Scan即可。
3 串色
在使用多种荧光染料标记样品时或是样品本身有很强的自发荧光时, 串色的现象就很容易发生。串色又分为两种情况: (1) 两种荧光染料的激发光谱没有重叠, 但是吸收光谱有重叠。这类串色可以通过顺序扫描 (又称序列扫描) 来完成:即先使用一种荧光染料的激发光扫描一张图片, 再使用另外一种荧光染料的激发光扫描第二章图片。 (2) 两种荧光染料的激发光谱和吸收光谱都有重迭, 这种情况只能通过光谱扫描解决。
4 多荧光通道扫描图像的保存及标尺数值的取整
在多通道扫描图像存盘时, 系统默认以不同单通道的颜色分别保存。为了便于直观的观察各种荧光在不同部位的表达, 我们还需要一张各种荧光叠加的合并图像, 此时点击Overlay键即可。在单次扫描图像完成后, 系统自动生成的标尺数值多数情况下为非整数, 即使在图像保存前修改为整数, 但一经后续扫描, 前幅图像中修改过的标尺数值又会恢复到默认的非整数值。解决这个问题也需要用到Overlay功能键, 即在单次扫描完成并将标尺数值修改取整后, 点击Overlay键显示合并图像, 再右键点击选中图片, 使之生成Snapshot图像即可。这两点是初学使用者很容易忽视的。
5 在图像扫描完成后, 各种参数忘记复位
特别是电子放大扫描以后, 很多操作者都忘记将ZOOM还原, 这就造成在下一个样品扫描时无法在显示屏上观察到目标样本。
6 激光共聚焦显微镜的日常维护问题
作为使用频率非常高的大型精密仪器, 激光共聚焦显微镜的日常保养维护非常重要。 (1) 设立专门的实验室, 实行专人管理。室内要求遮光, 有稳定的电源电压。激光共聚焦显微镜的工作温度应该恒定在22摄氏度左右。 (2) 注意防尘。为了保持良好的工作状态, 延长仪器的使用寿命, 激光共聚焦显微镜的工作环境要求清洁、干燥、远离辐射源。每次使用完毕后, 都要做好台面以及目镜、物镜等容易被污染的光学部件的清洁工作。 (3) 严格按操作规程使用, 避免因使用不当造成损坏。扫描后的图片及数据严禁用硬盘拷贝, 只能通过光盘刻录, 避免激光共聚焦显微镜系统感染病毒。 (4) 上机操作人员必须事先经过培训和考核。
摘要：激光扫描共聚焦显微镜从上世纪八十年代起, 被广泛地应用于分子细胞生物学、生物医学、遗传学等研究领域。但复合软件及多功能操作界面的使用对于初学者来说比较复杂, 总结了操作过程中的常见问题, 并提出了解决办法。对激光扫描共聚焦显微镜这项技术的使用具有现实的参考价值。
激光共聚焦 篇9
1 Olympus FV1000型共聚焦显微镜使用及管理方法
1.1 基本操作步骤
Olympus FV1000型共聚焦显微镜基本操作步骤主要有:
(1)打开稳压电源;(2)打开组电源;(3)打开计算机,启动Windows,启动LSM510软件;(4)选择所用染料种类;(5)根据染料的激发波长,选用相应激光管;(6)用明场、DIC或普通荧光观察标本,找到观察对象;(7)光路转换至扫描观察模式;(8)设置扫描分辨率、目镜倍数和扫描放大倍数等,快速预览,调整激光管电压、光电倍增功率、降噪等至最佳状态;(9)获取图像并保存,实验结果拷贝;(10)关激光管电源,退出LSM510软件,让风扇继续工作散热,风扇自动停止时,方可关电源开关;(11)关闭计算机,填写使用记录,保持仪器及室内清洁。
1.2 需准备的器皿及要求
(1)载玻片、盖玻片:盖玻片的厚度应在0.13~0.17mm,载玻片厚度在1.0~1.2 mm,厚度要均匀、光洁、无干扰荧光。样品处理后,将盖玻片扣于载玻片上,上机观察测定。
(2)封片剂:生物样品经过固定后,可以用封片剂进行封片,以防样品干燥及盖玻片脱落。常用的封片剂有甘油和PBS。
1.3 使用注意事项
使用共聚焦显微镜,必须注意以下几点:
(1)严格按照使用规程操作,不得任意改变操作程序,激光共聚焦显微镜系统中的激光发射管使用寿命有限且价格昂贵。所以,在操作使用过程中切记,在开关的启动顺序以及在扫描过程中努力做到保护好激光管。
(2)注意不要暴露在中等功率和高功率的激光辐射中,特别要注意不得注视激光束,甚至不要观看样品;不得在系统附近储存或使用易燃易爆物的固体、液体或气体;可以引燃的材料如布或纸张不得放入光路中。
(3)开机或改变激光功率后,约需20min激光光源才能够达到稳定,关闭系统时,先关闭计算机,等氩离子激光器风扇关闭时,方可关闭系统开关。
(4)扫描后的图像储存在计算机内,可作进一步处理。由于计算机的硬盘有限,应及时储存到用户光盘上,但要警惕任何病毒浸染激光共聚焦显微系统。
1.4 日常管理
共聚焦显微镜是一种集激光技术、显微镜技术、光度技术、计算机及图像处理技术、精密的机械技术等多种高技术于一身的大型仪器。其价格昂贵,在使用过程中要特别注意做好保养和管理工作。通常要做到以下几点:
(1)严格按照操作规则使用,避免因使用不当造成损坏。
(2)为保持良好工作状态,延长使用寿命,工作环境应保持清洁、干燥、远离辐射源。每次使用后,要做好清洁工作,及时清洁目镜、物镜等容易污染的光学部件。
(3)系统应设立专门房间,安装在防震台上,工作间内要安装空调,抽湿及防尘装置。无论仪器是否工作,最好使其环境始终保持在22℃±1℃的恒温。
(4)注意保护仪器的光纤,防止被挤压,仪器常用的零配件及专用工具由专门人员负责保管。
(5)仪器工作间必须常年保持清洁、卫生,操作人员必须穿拖鞋、工作服。
(6)使用者必须培训合格后,在管理人员的指导下,方可上机操作。
2 共聚焦显微镜在生物医学研究中的应用
共聚焦显微镜在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(PH)、微分干涉差显微镜(DIC)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的图像非常精细。
2.1 观察活细胞及其组织
共聚焦显微镜在不损伤细胞的前提下,对活组织、活细胞进行观察和测量,这不仅省去了繁琐的样品前期处理过程(如脱水、脱蜡、染色等);而且观察过的样品还可以继续用于其他的研究。这种功能对于细胞培养、转基因研究尤为重要。这可以说是共聚焦显微镜最大的优势。
2.2 生化成分定位观察
配合专用的分子探针,对于要检测的成分可以定位到细胞水平,甚至到亚细胞水平和分子水平。
2.3 连续长时间观测
在同一样品平面上随时间进行连续扫描,就可分析细胞结构、内含、和标记等动力学变化。目前在这方面做得最多的是使用共聚焦显微镜观察心肌或神经细胞内游离钙离子浓度的动态变化。
2.4 数据、图像的数字化
用计算机代替了普通的照相机,得到的图像是数字化的,可及时输出或长期储存,而且还可进一步加工处理。
2.5 定量测量
首先应用专一的荧光探针对样品进行染色,样品的荧光强度和所测成分的含量呈正比,如果其余条件固定,通过对比各组样品之间的荧光强度值,可得出特定成分的含量比。
3 结束语
通过上述介绍,共聚焦显微镜强大的功能已可见一斑。与其他的生物学技术(如免疫组化技术等)相配合,它的检测范围进一步扩大。目前市场上出售的荧光探针已近2000余种,这就使我们可利用共聚焦显微镜定性、定量地检测细胞内多种生化成分。因此共聚焦显微镜越来越成为生物医学研究人员的好帮手,随着时间的推移,它的使用会日趋广泛。
摘要：共聚焦显微镜是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术相结合的产物,是现代化的光学显微镜,它对普通光镜做了多方面的技术改进:用激光做光源并采用了共聚焦技术消除了透镜的色差和球差;运用点扫描技术,使标本上每一点的图像避免了相邻点的衍射光和散射光的干扰;结果用计算机处理;因而其图像高度清晰且数字化。激光共聚焦显微镜不仅可以观察活细胞、活组织的动态代谢过程,而且可以获得三维图像,与其他的生物学技术相配合,几乎可定性、定量定位地检测组织细胞内的任何一种生化成分。
关键词：共聚焦显微镜
参考文献
[1]袁兰.激光扫描共聚焦显微镜技术教程.北京:北京大学医学出版社.
[2]王春梅.激光扫描共聚焦显微镜技术.西安:第四军医大学出版社.