SSR技术

SSR技术（共12篇）

SSR技术 篇1

农产品是指来源于农业的初级产品, 包括稻谷、棉籽等, 近些年随着人类的进步和消费物质的不断丰富, 对农产品的要求已经不仅限于数量, 更多是关注农产品的质量与安全。因此, 鉴定并加以定性区分农产品品种以保证其质量与安全势在必行[1,2,3]。SSR分子标记技术由Tautz等[4]于1989年创立, 近些年, 随着DNA分子标记技术的不断发展, SSR技术不断成熟, 逐渐成为了农产品品种鉴定的重要方法。简单序列重复 (SSR) , 又称微卫星DNA, 一般是指由2~4个核苷酸为单位多次串联重复的DNA序列, 也有少数以1~6个核苷酸为串联重复单位。在真核生物基因组中SSR的存在具有普遍性, 其在基因中的分布也具有不确定性, 在内含子、外显子及染色体中均有分布[5], 不同农产品中微卫星重复单位的碱基组成及拷贝数也不相同, 其高度多态性主要源于微卫星串联数目的不同。基于SSR具有的丰富多态性, 可对农产品的基因组进行筛选[6]。研究发现:微卫星两端的序列具有保守性, SSR分子标记技术正是利用这一特性, 根据碱基互补配对原则, 为微卫星两端保守序列设计引物, 通过PCR反应扩增微卫星片段, 将扩增物进行凝胶电泳处理, 根据分离片段的大小确定农产品的基因型及基因频率[7,8,9], 最后可以通过检测农产品样品是否具有某品种的特有指纹片段来有效鉴定其真伪及纯度, 最终实现农产品的质量监测, 保证农产品的质量与安全。

1 DNA分子标记鉴定法

近些年, 现代生物分子学发展迅猛, DNA指纹技术在品种鉴定中得到长足发展和广泛应用。分子标记是通过对农产品分子水平上可标识的遗传多态性进行分析, 也就是对基因组中任何位点上的相对差异进行分析[10,11,12]。DNA分子标记技术的主要应用对象是样品的DNA, 也就是含有遗传物质的基因片段[13], 对农产品基因中碱基序列差异进行分析, 最终达到鉴定、区分农产品品种的目的。

DNA分子标记技术应用范围广, 不会受到环境、数量的限制;准确性、稳定性及重复性较高;分子标记表现为共显性, 能同时检测出显性和隐性等位基因, 可以鉴定农作物是纯合或杂合基因型。目前, 可以将数十种DNA分子标记技术分为4类[14]。第1类是利用限制性内切酶得到大小不等的DNA片段, 通过凝胶电泳对DNA条带进行分析, 最终探究DNA的多态性, 这一技术发现较早且具有代表性的是RFLP;第2类是与PCR技术紧密结合的分子标记技术, 根据选择引物的不同可以分为RAPD以及SSR、ISSR等, 区别在于PCR扩增时使用的是随机引物还是特定引物;第3类是将PCR与酶切技术相结合的分子标记技术, 根据扩增与酶切的先后顺序可以分为AFLP和CAPS;第4类是利用单核苷酸多态性的分子标记技术, 如SNP。目前, RFLP、AFLP、RAPD、SSR这4种DNA分子标记技术均被广泛地应用于玉米、稻谷等农产品品种鉴别及图谱构建中, 分析结果都能够直观地通过DNA表达出来, 季节、环境对其影响较小, 基因特征数量多且多态性丰富, 表现中性, 不会影响性状的表达, 但在实际的应用过程中, 这4种分子标记技术都具有不同的特性。RFLP在多态性检测方面不够灵敏, 操作复杂且操作条件要求较高, 需要使用放射性同位素;RAPD在结果的准确性方面存在不足, 可靠性中等, 同时还存在迁移的可能性, 影响因素较多, 因此重复性较差[15];AFLP要求在农产品样品中提取出高纯度的DNA, 对酶的质量及实验设备精度要求较高;SSR技术则是在引物的开发方面费用较高[16]。4种常用分子标记的特性如表1所示。

2 SSR技术优势与局限性

2.1 与RFLP、RAPD、AFLP相比的技术优势

英国遗传学家Jeffreys等于1985年建立DNA指纹技术, 该技术的发展主要经历了3个阶段:20世纪90年代RFLP、RADP以及AFLP的成功创立标志着第1代DNA分子标记技术诞生;21世纪初, SSR作为第2代DNA分子标记技术逐渐兴起;近些年, 第3代DNA分子标记技术SNP正处于启动研究之中[17]。其中, SSR技术是应用于品种鉴定中时间最长, 应用范围最广的[18]。

实践证明, 最理想的农产品品种鉴定技术应当满足可操作性好、自动化程度高、较为可靠等要求, SSR技术作为与PCR技术紧密结合的新型DNA分子标记技术, 具有其他分子标记技术所不能比拟的优势。首先, 农产品基因中的SSR覆盖整个基因组, 信息量大, 多态性丰富[19,20,21,22]。在SSR分子标记法中, 选择不同引物对应基因上的SSR位点也不相同, 不同样品SSR带型之间存在的差异是DNA水平上差异的具体表现。因此, 可以将SSR位点作为样品基因的一个特征, 并且这种特征基因数量多, 不会受到环境的影响, 稳定性和可靠性强;其次, SSR技术在具有RFLP标记遗传学优点的同时避免了使用同位素, 在重复性、可信度以及标记成本方面远远优于RAPD, 已经逐渐发展成为农产品DNA分子标记中的重要手段;再次, SSR技术比较成熟, 前期研发基础较好, 有大量已知染色体位置的共享位点;最后, SSR技术操作简单, 易于推广。SSR技术对应试样品中提取出DNA的纯度和实验仪器要求不高, 即使部分DNA受外部环境影响发生降解, 其中也可能包含足够用来扩增的SSR位点, 不会连接影响结果[23], 在没有昂贵仪器的情况下也可以进行SSR检测。SSR技术体系主要包括DNA提取、PCR扩增目的基因、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术[24], 且近些年在DNA提取及PCR扩增技术方面都取得了一定的进展, 使得SSR技术的优越性更加突出。匡猛等[25]将单粒棉花种子作为材料提取纯化基因组DNA, 结果表明该方法极其适用于棉花品种的SSR分析。陈浩东等[26]研究、分析了适合棉花纯度检测的多重PCR组合条件, 将多重PCR组合程序进行优化, 使得快速鉴定棉花杂交品种技术更加成熟。王绍鹏等[27]利用扩增条带分布在不同范围的4对马铃薯SSR引物进行分析, 成功优化马铃薯SSR标记多重PCR体系模型, 为马铃薯DNA指纹图谱的构建打下基础。

2.2 SSR技术在农产品品种鉴定中的局限性

SSR指纹图谱可以在最大程度上避免受到环境、农作物生长、发育时间的影响, 且可以鉴定表型上难以鉴别的农作物品种, 具有非常大的发展潜力, 但局限性也不可忽略。首先, 欲使用SSR技术标记农产品基因, 必须要确定目标序列信息, 即需要构建基因组文库, 同时还需测序鉴定克隆获得的SSR, 工作难度较高;其次, 因SSR分子标记技术的一定种属限制, 大部分的SSR标记都不可以用于亲缘关系较近的农作物物种之中;最后, SSR鉴定能力受到待鉴定品种育成方式的影响, SSR只能对常规方法育成的品种进行鉴定和区别, 如果待鉴定品种接受过转基因技术、辐射等处理, DNA中的某个基因位点就可能发生变化, 如碱基替换、染色体替代等, 则不能直接进行鉴定和分析[28]。

3 SSR技术在农产品品种鉴定中的应用

3.1 SSR技术在马铃薯品种鉴定中的应用

叶景秀等[29]利用SSR技术提取、分析了20种青海省审定的马铃薯DNA, 经PCR扩增, 共检测出136条清晰的多态性条带, PIC平均值可达到0.7683。Mc Gregor等[30]在2000年分别使用RFLP、AFLP、RAPD、SSR等4种分子标记法鉴定、区分39个马铃薯栽培品种。结果表明, 4种分子标记技术都可独立区分39种马铃薯栽培品种, 其中多态性方面AFLP优于SSR, 但是在重复性方面SSR可以达到100%, 并且利用5对SSR引物可以将南美的24种马铃薯品种进行有效区分。王绍鹏等[31]在2009年利用STM001、STM002、STM003、STM004等4对引物成功地对黑龙江省7个马铃薯主栽品种进行区别, 4对引物共获得144条多态性条带, PIC值均高于0.8, 其中STM001、STM003、STM004等3对引物对黑龙江省7个马铃薯主栽品种的区分率达到100%, 试验重复性、稳定性较高, 可应用于马铃薯品种鉴定中。

3.2 SSR技术在棉花品种鉴定中的应用

武耀廷等[32]利用27对棉花SSR核心引物对30个棉花品种和4个杂交种亲本进行鉴定, 只用其中4对引物就可以成功将湘杂2号等4个棉花杂交品种的亲本与其他品种分离。Tyagi等[33]利用120对棉花SSR引物对来自美国的378份陆地棉材料进行研究, 结果表明美国陆地棉遗传多样性水平较低, 遗传基础较为狭隘。冯艳芳等[34]利用15对SSR核心引物分析鉴定20个棉花品种, 平均每对引物可检测出3.8个多态性位点, PIC平均值为0.878 2, 成功将各品种进行区分并建立了20个应试棉花品种的DNA指纹图谱。聂新辉等[35]从5 000对棉花SSR引物中筛选出75对核心引物, 多态性位点达226个, PIC平均值为0.662 4, 可以一次性区分开51份棉花常规品种中的21份, 利用40对引物则可以完全区分供试的51个品种, 并可构建供试品种的指纹图谱。

3.3 SSR技术在水稻品种鉴定中的应用

田大刚等[36]利用SSR标记技术构建了123份重要水稻品种的指纹图谱, 结果表明, 24对水稻SSR引物可以成功的区分鉴别这123份水稻品种。肖小余[37]在2006年利用SSR标记对四川省42份主推杂交水稻亲本进行了DNA指纹库构建研究, 在国内外首次报道了主栽水稻品种DNA标记指纹库的构建工作。彭锁堂[38]选取26对水稻SSR引物对我国9个杂交水稻组合品种及其亲本进行标记分析, 其中21对引物扩增出62条多态性条带, 能够有效区分所有恢复系和大部分不育系。罗兵等[39]利用平均分布在水稻12条染色体上的24对SSR引物对19份粳稻进行分析, 得到4对能够完全区分19个应试水稻品种的核心引物, 成功将应试品种区分为2个亚群。

4前景展望

农产品纯度一直是农业生产中所面临的突出问题之一, 是衡量农产品质量的重要指标, 受到农民及农产企业的密切关注。然而在农产品种植及运输过程中经常出现隔离不严、低温灾害等自然因素或机械混杂、人为掺假等情况, 导致农产品纯度受到影响。因此, 研究快速、准确的农产品真伪及纯度检测方法迫在眉睫。SSR技术准确性高, 信息量大, 可识别性强, 大力推广该技术可以有效防止不合格农产品流入市场, 维护农产品企业良好形象, 保证农产品的质量与安全, 促进社会稳定和谐。此外, SSR分子标记技术是国际植物新品种权保护联盟在BMT测试指南中确定用于构建DNA指纹数据库的标记方法, 该技术已经成为了当前农产品建库首选的分子标记法。实践证明, SSR分子标记技术在农产品的DNA指纹图谱数据库建立过程中起到不可替代的重要作用, 并且随着我国农业的快速发展, SSR技术将会应用于更多农产品品种鉴定及DNA指纹数据库的建立中, 有望成为传统田间小区种植鉴定方法的重要补充甚至是替代技术。

摘要：SSR分子标记技术具有稳定性好、正确性高、定性精准等优点, 已被广泛应用于农产品品种鉴定及其真实性和纯度验证之中, 对厘清我国农产品不同品种种质间的亲缘关系及种质创新具有重要意义。主要平行比较和分析了同等技术下, SSR分子标记技术的优越性及局限性, 简单介绍其在农产品品种鉴定中的应用情况, 并对其发展前景进行展望。

关键词：SSR技术,农产品,品种鉴定,应用进展

SSR技术 篇2

SSR标记在棉花遗传育种中的应用

SSR是建立在PCR基础上的分子标记,具有多态性高、重复性好、共显性、操作简单等优点,已在棉花研究中被广泛应用.综述了SSR标记的原理与特点,以及其在棉花遗传图谱构建、功能基因及OTLs定位分析、标记辅助育种、种质鉴定及遗传多样性分析等方面的应用:展望了SSR分子标记技术广阔的`应用前景.

作 者：单莹 那艳斌 何伟锋 沈丹 赵丹  作者单位：辽宁省经济作物研究所,辽宁辽阳,111000 刊 名：现代农业科技 英文刊名：XIANDAI NONGYE KEJI 年，卷(期)： “”(4) 分类号：S562.032 关键词：SSR   棉花   遗传育种  

浪潮 SSR是主机的安全后盾 篇3

随着信息全球化趋势愈发明显,信息安全得到了国家政府、关键业务运营商以及大型企事业单位的高度重视。作为信息基础架构的重要组成部分,服务器担负着对信息和数据存储、传输、处理和发布的重要任务。

然而目前,中国主流的服务器操作系统市场基本是IBM AIX、HP UNIX、SUN Solaris、Linux,而中低端基本上都采用的是Windows。这些由国外设计研发的系统,对于运营关键业务的行业客户(例如金融,电信等行业)以及国家重要部门而言,可信级别明显偏低。因此,主机安全已成为技术经理们所关注的重中之重。

据介绍,浪潮SSR产品通过分权管理、进程保护、强制认证等功能实现了对操作系统内核层面的安全加固,从而避免了针对服务器系统的各类攻击以及病毒的侵害。

SSR分子标记在花生上的应用 篇4

1 SSR的基本原理及特点

1.1 SSR标记的原理

SSR(Simple Sequence Repeats)标记即微卫星标记,是由1~6个核苷酸为单位串联重复而成的DNA序列,长度一般在200 bp以下,两端为较保守的单拷贝序列。由于重复序列数目不同或重复程度不完全相同而呈现多态性,呈孟德尔式遗传,共显性。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计位点专一的引物,利用PCR技术扩增每个位点的微卫星序列,扩增产物经聚丙酰胺凝胶电泳分离、显色后,比较谱带的相对迁移距离,分析核心序列的长度多态性。

1.2 SSR标记的特点

目前,在所应用的几种代表性的分子标记中,RFLP标记对DNA质量要求高,且分子杂交时会用到放射性同位素,对人体有害,其探针的制备、保存和发放也不方便,而且分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高,多态性程度偏低[2];RAPD标记受许多因素影响,试验的稳定性差。另外,RAPD对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg浓度,因此试验的重复性差[3];AFLP技术过程复杂,涉及诸多步骤,试验过程中不论哪个环节出现问题,都不会得到理想的结果。此外,AFLP技术试验成本较高,且受专利保护[4]。与其他分子标记相比,SSR具有以下优点:一是数量丰富,多态性高,检测程序简单;二是共显性遗传,不易被自然选择和人工选择所淘汰,符合孟德尔遗传定律[5,6];三是保守性,SSR位点两侧的序列具有高度的保守性,在等位基因中多相同,便于重复利用已知引物;四是易于利用PCR技术分析,对DNA质量要求低,用量少,仅需微量组织便能有效地分析鉴定;五是费用低,易于检测、重复性好、便于自动化分析,同时可进行多位点的检测。SSR具有高度多态、共显性、保守性、DNA需量少、操作简便、重复性好、稳定可靠等优点,已广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、分子标记辅助育种等方面的研究。

2 SSR标记在花生上的应用

2.1 花生遗传图谱构建

遗传图谱(Genetic Map)又称遗传连锁图谱(Genetic Linkage Map),是指以染色体重组交换率为相对长度单位,以遗传标记为主体的染色体线状连锁图谱[7]。构建遗传图谱不仅能了解基因的组成和结构,还能作为研究作物性状遗传、种质进化、基因克隆的工具。Moretzsohn等[8]利用野生品种A.duranensis和A.stenosperma为亲本,构建了F2群体。他们在433对SSR引物中筛选出204对在亲本间表现多态的引物,构建了1张花生的遗传连锁图,总长达1 230.89 c M,其中有170位点定位到11个连锁群中,这11个连锁群的长度在20.07~280.10 c M,平均每个标记之间的距离为7.24c M。姜慧芳等[9]用抗青枯病花生品种远杂9102与感病品种Chico杂交,从F2起用单粒传法构建了花生重组近交系群体(RIL)F6和F7。采用354对SSR引物对重组近交系F6群体的基因组DNA鉴定,获得多态性标记45个。结合重组近交系群体F6和F7青枯病抗性鉴定结果,构建了栽培种花生部分遗传连锁图。图谱总长度为603.9 c M,含29个标记(28个SSR标记和1个表型标记)的8个连锁群,还有17个独立的SSR标记;获得了与青枯病抗性相关的SSR标记2个(7G02和PM137),位于该图谱的第1连锁群上,与青枯病抗性基因间的遗传距离为10.9 c M和13.8 c M,并且位于抗性基因的两侧,两标记间的距离为23.7 c M。洪彦彬等[10]以粤油13和阜95-5为亲本,通过杂交构建包含184个F6重组自交系的遗传作图群体。对652对genomic-SSR引物和392对EST-SSR引物对亲本进行多态性检测,从中筛选出121对多态性引物,在亲本中共检测到123个多态性位点。利用作图群体对多态性SSR位点进行遗传连锁分析,获得包含108个SSR标记(102个genomic-SSR标记和6个EST-SSR标记),涉及20个连锁群、总长568 c M、平均图距为6.45 c M的花生栽培种遗传图谱。

2.2 花生遗传多样性分析

进行栽培和野生花生遗传多样性及亲缘关系的研究,对花生种质资源的收集、保存和育种工作都具有重要意义。SSR标记作为重复性稳定性高的共显性标记,在种内品种间多态性高,在基因组中分布广泛,很适合进行遗传多样性分析。Hopkins等[1]首先利用SSR标记对5个栽培品种的遗传多样性进行了研究。唐荣华等[11]从36对SSR引物中筛选出10对引物,能在24个珍珠豆型花生品种DNA中扩增出多态性片段,每对SSR引物可扩增出1~6个DNA片段,扩增位点数为2~11个,平均6.5个;多态性位点为1~11个,平均6.1个。根据SSR标记分析24个珍珠豆型花生的遗传距离为0.04~0.69 c M,平均为0.37 c M。聚类分析将24个珍珠豆型花生品种划分为4个品种群。陈静等[12]利用10对SSR引物对参加我国北方区域试验的27个花生品种进行PCR扩增分析,共扩增出57条带,其中45条呈现多态,多态性比率为78.95%。27个品种间的遗传相似系数在0.311~0.962,平均为0.651。聚类分析结果表明,27个参试花生品种在遗传相似系数0.61处分为3个类群,同一类型的参试品种优先聚为一类,同一地区或同一育种单位提供的品种往往首先聚为一类。

2.3 花生分子标记辅助育种

分子标记辅助育种(Marker Assisted Selection,MAS)是指把分子标记技术应用于育种过程中,利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择的现代育种技术。姜慧芳等[9]从354对SSR引物中筛选出2个与花生青枯病抗性相关的SSR标记7G02和PM137,其与青枯病抗性基因的遗传距离分别为10.9、13.8 c M。王辉等[13]利用抗、感北方根结线虫病花生品种为亲本配制杂交组合花育22号×D099,以其F2分离群体为研究材料,采用SSR技术和BSA分析方法,获得了2个与花生北方根结线虫病抗性基因连锁的SSR分子标记S322380和S892140,其与抗病基因间的遗传距离分别为4.421、7.404 c M。洪彦彬等[14]选用100对SSR引物对12个抗感黄曲霉花生品种的基因组DNA扩增,结果表明共有41对引物在不同品种间检测出2~4个等位基因,多态性信息量(PIC)为0.153~0.750。供试品种SSR标记基因型与黄曲霉侵染指数间的关联分析表明有5个标记与抗性相关,其中标记p PGSseq19D9与抗性关联度最高,Pearson相关系数达0.913。进一步观察发现,p PGSseq19D9的扩增带型能直接区分抗感品种,初步推断p PGSseq19D9可能与1个贡献率较大的抗黄曲霉基因连锁。

2.4 花生亲缘关系的比较和鉴定

利用形态指标进行植物分类时,易受环境影响而影响分类的准确性,且对于一些形态指标相近、性状较少的品种则难以区分。应用分子标记技术可以对花生的亲缘关系进行较全面的比较和鉴定。陈本银等[15]用44对SSR特异引物对花生属不同区组的21份种质进行了分析,获得能稳定揭示花生属种间差异的34对SSR引物。结果表明:21份材料间存在很大的遗传变异,平均遗传距离为0.63 c M,变异范围为0.08~0.95 c M。聚类分析表明,区组间的遗传分化大于区组内的遗传分化,匍匐区组的遗传分化大于其他区组的遗传分化,同一物种不同种质间也存在很大的差异。栽培种花生与花生区组材料的亲缘关系相对较近,与花生属的植物学分类一致,其中A基因组的A.duranensis和A.villosa及B基因组的A.batizocoi与栽培种花生的亲缘关系更近一些。唐荣华等[16]以5份花生栽培种资源和花生属6个区组的19份野生种资源为研究材料,通过SSR分子标记技术分析其DNA多态性并进行聚类分析。结果表明,大多数花生SSR引物为多位点引物,花生属种间种质存在丰富的DNA多态性,A.duranensis是花生栽培种(A.hypogaea L.)的野生种亲本之一,与花生区组野生种亲缘关系最近的是异形花区组,最远的是大根区组。周桂元等[17]对花生品种粤油14及亲本共7份资源进行了SSR标记聚类分析。结果表明:粤油14与湛油12、汕油27、汕油71的亲缘关系最近,其次是粤油116、粤油367,亲缘关系最远的是印度花皮。

2.5 花生突变体分析

我国花生辐射育种从20世纪60年代开始后,许多花生科技人员相继做了大量工作,但由于各种原因,较少开展突变分子机理的研究。近年来,对辐射诱变后代材料分子水平的研究始有报道,其中运用SSR标记进行分析的较多。周桂元等[18]用返回式卫星搭载花生品种粤油7号种子为材料,经过3年的地面种植和选择,获得21个变异株系。选用110对SSR引物对21个变异株系进行SSR多态性分析,有5对引物的扩增在变异株系与对照品种之间表现出多态性。苗华荣等[19]以60Coγ射线辐照花生品种鲁花11号,通过调查其M2代植株农艺性状,筛选到7个叶部特征明显变异的突变材料,利用107对SSR引物对其进行分析。结果发现突变材料与原品种之间存在不同程度的多态性,且均呈现多个位点突变。分析表明,60Co辐照诱变可使花生的DNA分子多个区段内发生重复或缺失等结构性变异。陈静等[20]以辐照处理花生品种鲁花11号M2为材料,通过农艺性状调查筛选变异材料。利用107对SSR引物对7个有代表性的变异材料进行PCR扩增,分析花生辐照诱变材料的SSR遗传多态性。同时,将筛选到的多态性标记用于分析原品种和诱变后代材料间的遗传相似性。结果表明,诱变材料与原品种之间存在不同程度的多态性,且呈现多个位点突变;60Co辐照诱变可使花生的DNA分子多个区段内发生重复或缺失等结构性变异,并非单纯的点突变。

2.6 其他方面的应用

SSR引物组合法在检测品种纯度上具有高效性和可靠性,在花生品种鉴定中也得到了应用。詹世雄等[21]以3对SSR引物对汕油21繁育种子60个样品进行种子纯度检测,共有2对标记引物检测到3个杂株样品,该批种子的纯度为95.0%;SSR标记在阐明物种进化关系的研究方面应用广泛。He等[22]利用珍珠豆型栽培种与花生区组二倍体野生

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种杂交产生的后代研究野生花生遗传物质渗入栽培种在分子方面的证据,研究认为杂交后代材料整合了野生亲本的遗传物质,并找到了野生亲本的特异微卫星标记(PM36、PM305)的谱带。在某些杂种后代中也扩增出亲本所没有的DNA条带,表明基因融合过程中发生了遗传物质的缺失或重组。

3 结语

目前花生SSR标记的研究已取得了一定的进展,初步展现出其在花生连锁图谱构建、分子标记辅助选择、遗传多样性分析、亲缘关系比较等方面发挥的重要作用,但目前可利用的SSR标记还远远不能满足上述研究的要求,因此SSR分子标记的开发将是未来一段时间花生分子生物学研究的重点。随着文库构建技术的不断成熟、方法的改进,以及花生基因组测序计划的启动,花生SSR标记将会更加丰富,在花生中的应用前景也将更加广阔。

摘要：综述了近年来SSR技术在花生遗传图谱构建、遗传多样性分析、分子标记辅助育种、亲缘关系鉴定等方面的应用情况,从而为相关研究提供参考。

SSR技术 篇5

以中国板栗、茅栗和锥栗的叶片为材料,提取栗属的DNA.针对栗属植物富含多酚类等次生物质的特点对栗属DNA的提取方法进行了改良,采用CTAB-蛋白酶K法加重复抽提,去除栗属植物中的相关次生物质,获得了高质量的DNA.所提取的`DNA完全满足PCR、RAPD、SSR等一些分子生物学实验要求.

作 者：艾呈祥 余贤美 刘庆忠 张力思 AI Cheng-xiang YU Xian-mei LIU Qing-zhong ZHANG Li-si 作者单位：艾呈祥,刘庆忠,张力思,AI Cheng-xiang,LIU Qing-zhong,ZHANG Li-si(山东省果树研究所,山东省果树生物技术育种重点实验室,山东,泰安,271000)

余贤美,YU Xian-mei(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所,海南 儋州 571737)

SSR技术 篇6

关键词 西番莲 ；SSR ；种质资源 ；遗传多样性

中图分类号 Q949.759.5

西番莲别名鸡蛋果、百香果，是西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora Linn）热带多年生草质到半木质藤本攀缘果树，广泛分布于热带、亚热带地区。西番莲富含17种氨基酸，具有柠檬、柑、桔、橙子、菠萝等水果香味，素有“饮料之王”、“水果味精”的美称，是生产果汁饮料的重要原料和添加剂。南美洲安第斯山脉地区被认为是西番莲属遗传多样性中心，拥有450多个种，尽管其中只有少数可食且具有香味的西番莲被开发和商业化[1]。其中在中国有19种，当前作为果实供食用的主要有6个种：紫果种（Passiflora edulis Sims）、黄果种（P. edulis Sim. F， flavicarpa Deg.）、樟叶西番莲（P. laurifolia L.）、大果西番莲（P.quadrangularis L.）、甜果西番莲（P. ligularis Juss）、香蕉西番莲（P. mollissima （HBK））等6类[2]。

分子标记的应用和发展在西番莲商业化品种选育上具有重要的作用，分子标记能直接从DNA水平反映种质之间的遗传差异，也是研究植物遗传多样性的有效工具。西番莲属自交不亲和，因此通过西番莲群体的基因流研究可解释种群间的遗传多样性[1]。目前，利用SSR标记对国内西番莲种质遗传多样性研究方面鲜有报道，尚缺乏较系统、有针对性地对不同产地的西番莲资源进行分子水平上的遗传评价与鉴定分类。本实验采用SSR标记分析西番莲遗传多样性，SSR标记数量众多，属于共显性遗传，具高度多态性、重复性和稳定性，简便可靠，因此被广泛地用于遗传多样性研究。它们丰富且均匀地分布在整个基因组中[3-4]，这使得它们适合于系谱关系的研究[5]。目前，SSR标记已经广泛地应用遗传图谱构建、基因定位和克隆、基因组结构、起源进化研究、分子标记辅助育种等方面。本研究以24份西番莲种质为材料，在前期体系优化的基础上，利用SSR分子标记技术研究西番莲资源的遗传多样性，以期为西番莲种质资源的分类、育种和资源的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验采用的西番莲叶片取自中国科学院西双版纳热带植物园（采集地简称勐腊）、云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所（采集地简称保山）、中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心（采集地简称儋州）西莲种质圃，详见表1。

实验所用Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、标准分子量DNA（100 bp plus Marker）购自TaKaRa公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表2）。电泳所用主要试剂甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、去离子甲酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺等均为国产分析纯。

1.2 方法

西番莲总DNA提取参考Kit等[6]的改良CTAB法，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，将DNA浓度稀释至20 ng/μL。利用已开发的45对SSR引物，筛选出扩增多态性好、条带清晰的16对引物，对24份材料进行扩增。

PCR反应体系为20 μL，其中包括0.2 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、60 ng DNA模板、0.5 μmol/L引物及10×PCR buffer（含Mg2+）。PCR进行扩增的程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，52-62 ℃（根据具体引物的退火温度而定）复性1.0 min，72 ℃延伸1.0 min，32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用8 % PAGE胶进行检测，PAGE胶经30 min预电泳，之后加入经变性剂变性后的产物4.0 μL进行点样，75 W恒功率电泳1 h，电泳结束后银染检测。

1.3 数据分析

选择重复性好、清晰可辨的照片进行谱带统计，依据SSR扩增图谱中同一位置上电泳条带的有无统计建立二元矩阵表，每个引物迁移率相同的条带记为1个位点，有条带的赋值为1，无条带的赋值为0，构建SSR的0、1数据库。

按照Nei等[7]的方法计算材料间的相似系数，并利用GS值按类平均法进行遗传相似性聚类分析和构建聚类图。应用NTSYSpc-2.10版软件，计算24份西番莲种质间遗传距离或遗传相似系数，然后根据非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，构建亲缘关系聚类树状图。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

从45对引物组合中筛选出16对扩增带清晰、重复性好的引物组合，分别对24份材料的DNA进行PCR 扩增，16对引物共产生68条扩增带，其中58条为多态性条带，多态性条带比率平均为85.3 %。

2.2 聚类分析

24份西番莲资源以0.45为阈值，可分为7个类群，第Ⅰ类群包括2份种质，来自农业部质检中心儋州基地的樟叶西番莲、Danzhou 1号；第Ⅱ类群包括1份种质，来自儋州农业部质检中心基地的双花西番莲；第Ⅲ类群包括1份种质，来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃的Passiflora yucatanesic；第Ⅳ类群包括15份种质，其中来自儋州农业部质检中心基地的有9份，包括Danzhou 2号、Danzhou 3号（黄果）、Danzhou 4号（紫红果）、Danzhou 5号、Danzhou 6号（黄果）、Danzhou 7号、Danzhou 8号、Danzhou 9号、紫果西番莲，表明分子标记不能区分种质的果实颜色；来自云南农科院热经所保山种质圃的有3份，包括紫果西番莲、黄果西番莲、泰国种；来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃的有3份，包括澳A、澳B、Passiflora edulis（紫果）；第Ⅴ类群包括2份种质，P.Coccinea和Passiflora coccinea，来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃；第Ⅵ类群包括1份种质为Passiflora faetida，来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃；第Ⅶ类群包括2份种质，大果西番莲和Passiflora guadrangularis（大果西番莲），分别来自云南农科院热经所保山种质圃和中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃（图1）。

3 讨论与结论

西番莲变异系数大，可用于一些重要农艺性状的、定位的天然杂交群体[1]。开展西番莲基因流、迁移率和有效群体大小的预测对了解国内西番莲自然群体活力和物种生殖系统的研究很重要。Diana等[8]利用AFLP、SSR对来自哥伦比亚的70份材料进行种内变异研究；Juliana等[9]利用ISSR标记评估改良和未经改良的黄果西番莲遗传变异研究；Cerqueira-Silva1等[10]利用16条RAPD引物区分14种基因型西番莲种质；Eileen等[11]利用7条RAPD引物和SSR A08FP1引物对供观赏用的3个新品种西番莲杂种进行确认，扩增得到杂合西番莲种属特异性片段。冷言峰[12]利用14条ISSR引物对33份西番莲种质进行遗传多样性分析，多态位点比率为99.56 %，说明西番莲种质资源存在广泛的遗传变异，这与本研究结果相一致。

Danzhou 1号西番莲叶片的叶形与樟叶西番莲相似，叶革质、卵状长圆形、基部圆形、全缘、无毛、叶脉羽状，与樟叶西番莲的相似性系数为0.78，故其亲缘关系较近。其中双花西番莲单独聚为一类，在叶形、果实大小方面与黄果、紫果西番莲相比有较大的差异，其结果在分子与形态学上有着一定程度的一致性。

大多数供试的西番莲材料的亲缘关系较远，遗传相似性系数为0.09-1.0，可能由于西番莲属异花授粉植物，长期的开放授粉使不同基因型间基因频繁交流，使得种质之间存在一定的差异。种质间的遗传差异与材料采集地的关系不太明显，来自云南勐腊的澳A、澳B和来自云南保山的紫果、黄果、泰国种与来自海南儋州的大部分聚为一类，这与冷言峰[12]的研究结果一致。但来自儋州地区的Danzhou 2号、Danzhou 3号、Danzhou 4号、Danzhou 5号、Danzhou 6号、Danzhou 7号、Danzhou 8号、Danzhou 9号、紫果西番莲等大多数西番莲聚为一类，这也表明目前儋州地区西番莲种质资源的遗传基础较为狭窄。其可能是该地区引进的品种较为单一；也可能是育种者为保持其亲本的的优良性状，采用无性繁殖的方式，而推广优良无性系是西番莲繁殖的主要途径，使得在这些种质的某些性状的基因趋于一致，从而导致后代亲缘关系多数较近；还有以实生选种为主的育种过程，也是同一地区种质的遗传关系趋向于一致。在国内西番莲的研究还处于初级阶段，地域之间的种质交流不频繁也是导致这一结果形成的原因。

本研究结果还发现黄果西番莲和紫果西番莲聚为一类，在分子上不能按果实颜色来区分种质。其原因在于西番莲种质之间的亲缘关系近，这跟国内的一些育种现状相吻合，黄果西番莲是紫果西番莲的突变种，其亲缘关系较近，如‘占果1号’、‘古杨1号’均是从黄、紫果种杂交后代中选出的优良品系[13]。

来自云南农科院热经所保山种质圃的大果西番莲与中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃的Passiflora guadrangularis（大果西番莲）两者聚为一类，表明大果西番莲与其他品种西番莲的差异较大，分子标记能完全将大果种西番莲与其他品种的西番莲区分开来。来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃P. coccinea、Passiflora coccinea聚为一类，相似性系数为0.83，亲缘关系很近，可能为同一品种的不同突变株。来自儋州的紫果西番莲与来自勐腊的Passiflora edulis（紫果）相似性系数为1，可能为同一个品种材料。

参考文献

[1] Oliveira E J，Vieira M L C，Garcia A A F，et al. An integrated molecular map of yellow passion fruit based on simultaneous maximum-likelihood estimation of linkage and linkage phases[J]. J Amer Soc Hort Sci，2008，133（1）：35-41 .

[2] 吉 方. 西番莲生长特性观测及选育研究[D]. 昆明：西南林学院，2008.

[3] Stallings R L，Ford A F，Nelson D，et al. Evolution and distribution of（GT）n repetitive sequences in mammalian genomes[J]. Genomics，1991，10（4）：807-815.

[4] Weissenbach J，Gyapay G，Dib C，et al. A second generation linkage map of the human genome[J]. Nature，1992，359（4）：794-801.

[5] Goldstein D B，Linares A R，Cavalli-Sforza L L，et al. Genetic absolute dating based on microsatellites and the origin of modern humans[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（33）：6 723-6 727.

[6] Kit Y S，Chandran S. A simple，rapid and efficient method of isolating DNA from Chokanan mango（Mangifera indica L.）[J]. African Journal of Biotechnology，2010，9（36）：5 805-5 808.

[7] Nei M，Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Science，1979，76（26）：5 269-5 273.

[8] Diana C O，Adriana B，Myriam C D，et al. Evaluating purple passion fruit（Passiflora edulis Sims f. edulis）genetic variability in individuals from commercial plantations in Colombia[J]. Genet Resour Crop Evol，2012，59（5）：1 089-1 099.

[9] Juliana L C，Onildo N J，Gilmara A F O，et al. Effect of selection on genetic variability in yellow passion fruit[J]. Crop Breeding and Applied Biotechnology，2012，12（2）：253-260.

[10] Cerqueira-Silva CB1， Cardoso-Silva CB， Concei

o LD， et al.Comparison of coefficients and distance measurements in passion fruit plants based on molecular markers and physicochemical descriptors[J]. Genetics and Molecular Research，2009，8（3）：870-879.

[11] Eileen A S，Margarete M S，Priscilla P A，et al. Confirmation and characterization of interspecific hybrids of Passiflora L.（Passifloraceae）for ornamental use[J]. Euphytica，2012，184（2）：389-399.

[12] 冷言峰. 西番莲（Passiflora Linn.）种质资源遗传多样性研究[D]. 重庆：西南大学，2008.

SSR技术 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

番茄为野生种醋栗番茄 (Lycopersicon pimpinellifolium) 和栽培种 (共120份) 由西北农林科技大学园艺学院番茄课题组提供。

引物根据茄科数据库 (http://solgenomics.net/) 公布的番茄SSR引物序列, 由上海生工合成。

供试试剂有Master Mix (康为世纪公司) , 产品编号为CW0682、琼脂糖 (Sigma公司) 、四甲基乙二胺 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) 、甲基乙二胺二钠盐 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) 、异丙醇 (分析纯, 四川西陇化工有限公司) 、硝酸银 (分析纯, 四川西陇化工有限公司) 、异戊醇 (分析纯, 四川西陇化工有限公司) 、乙醇 (分析纯, 四川西陇化工有限公司) 、三羟甲基氨基甲烷 (分析纯, 科密欧化学试剂厂) 、丙烯酰胺 (分析纯, 科密欧化学试剂厂) 、β-巯基乙醇 (分析纯, 科密欧化学试剂厂) 、聚乙烯吡啶烷酮 (分析纯, 科密欧化学试剂厂) 。

主要仪器设备有电泳仪:ECP3000, 北京君意东方电泳设备有限公司;水平电泳槽:DYCP-32A, 北京六一;垂直电泳槽:JY-SCZ8, 北京君意公司;水浴锅:BG25, 杭州朗基科学仪器有限公司;冷冻离心机:5424R, 德国Eppendor公司;PCR仪:MYCYCLER, 美国BIO-RAD公司;凝胶成像系统:GBDX-HR, 英国SYNGENE公司。

1.2 方法

试验于2014年3月在西北农林科技大学园艺学院试验教学中心进行。

1.2.1 基因组DNA的提取

将试验番茄种子播种于96孔育苗穴盘, 采用无土育苗基质, 气候室内培养番茄幼苗, 待番茄长出幼苗后, 取番茄的鲜嫩叶片, 参照方宣钧等[18]的CTAB法并略加改进提取番茄基因组DNA, 采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, DNA保存在-80℃备用。

1.2.2 PCR反应各因素水平的确定和正交方案的设计

Mix中包含了Mg2+、dNTPs和Taq酶, 可综合评价其对番茄PCR反应体系的影响。反应中各个因素的水平见表1, 该试验采用L9 (33) 正交设计, 具体信息见表2。试验所用样本DNA浓度为50ng·μL-1, 引物浓度为1μmol·L-1。

1.2.3 SSR-PCR扩增产物及产物检测

PCR反应体系为25μL, 各反应如表2所示, 不足部分用ddH2O补足。PCR反应体系为94℃预变性5min, 94℃变性4min, 55℃退火45s, 72℃延伸1min, 35个循环, 然后72℃延伸10 min, 最后4℃保存。

PCR反应产物首先在1.5%琼脂糖上检测扩增产物, 然后利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。

1.2.4 反应体系的验证

以野生种和栽培种等8份材料DNA为模板, 随机选取番茄数据库中30对引物验证反应体系的可靠性, 用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测试验结果。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果检测

为保证及验证DNA提取质量, 该试验一批次同时提取了6份样。由图1可以看出, 样品DNA提取效果较好, 条带清晰无杂带, 且浓度较高。

2.2 PCR扩增产物检测结果

为减少试验误差, 该试验中每个反应均设置3个重复, 9个处理 (见表2) 。从琼脂糖凝胶电泳图 (见图2) 中可以看出, 27个反应均出现目的条带, 大小在100~250bp, 与SSR-PCR反应预期得到的条带大小相近, 且条带差异比较明显, 其中处理3、6、8效果最好, 2、5、9次之, 1、4、7最差。另外, 同一处理不同重复之间差异较小, 试验结果表明, 该方法具有较高的可重复性。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明 (见图3) , 其和琼脂糖凝胶电泳效果一致, 且具有更高的分辨率。综合比较可知, 最优的反应体系为处理6。

A, B, C为3个重复结果A, B and C mean three repeats

2.3 对各处理及因素间的综合比较分析

结合琼脂糖凝胶电泳结果和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果, 综合分析后对各个处理进行评分, 最优记为9, 最差记为1, 依此得到各个处理的具体分数 (见表3) 。

2.3.1 评分结果及分析

根据表3的信息对各个处理进行极差分析和方差分析, 结果见表3、表4。通过对模板、Master Mix和引物的极差分析可知, 极差由大到小的顺序为引物>模板>Mix, 表明引物用量对反应结果影响最大, 模板用量次之, Master Mix对PCR结果影响最小。

通过利用SPSS数据分析软件对各个处理进行分析 (见表3与表4) , 发现处理6和处理8之间无显著差异, 且评分最高, 是最好的处理组合;处理8和9之间存在极显著差异, 而处理9和处理3差异不显著;处理3和处理5之间存在极显著差异, 而处理5和处理2之间差异不显著;处理1、4、7之间差异不显著。

注:不同大、小写字母表示差异极显著或差异显著 (P<0.01, P<0.05) 。Note:Different capital letters and lowercases mean significant difference at 0.01and 0.05level respectively.

注:Ki指每个重复的相应得分和, Xi指相应重复的总得分均值。Note:Ki means corresponding scores of each repeat, Xi means average total score accordingly repeat.

结合琼脂糖凝胶电泳结果和聚丙烯酰胺凝胶电泳结果, 发现最好的组合为处理6, 处理8次之, 且两者之间无显著差异。所以Master Mix所加量在8~10μL时均是可以的, DNA的量在2~3μL均可以, 但在2μL左右效果较好, 引物浓度可控制在2~3μL, 最好为3μL。

2.3.2 对反应体系的验证

通过对30对SSR引物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明, 80%以上的引物条带都比较清晰 (见图4) , 个别条带比较模糊, 整体效果较好;从30对引物中共筛选出有多态性的引物11对, 占全部引物的36.7% (见表5) 。

为进一步验证引物的多态性和反应体系的可靠性, 分别选取引物SSR306、LEaat003和120份番茄材料, 对反应结果进行进一步验证。结果见图5和图6。图5中竖向的3个箭头从左到右分别表示3种不同大小的带型, 说明引物SSR306在这120份材料中有3种带型, 且没有杂合体。图6中前两个竖向箭头表示两种不同的带型, 而第3个竖向箭头所指示的材料同时具有两种带型, 表明其为杂合体。通过验证结果表明, 这120份番茄材料在不同引物之间的多态性较大, 且不同的引物的反应结果均较好。

3 结论

SSR技术 篇8

1 SSR的基本原理及特点

微卫星DNA由两部分组成, 即核心序列和两翼的序列, 核心序列即前面所称“重复”的短序列, 两侧一般是相对保守的单拷贝序列。在PCR基础上的SSR分析是根据微卫星DNA两翼区域的序列设计位点专一的引物, 以总基因组为模板进行PCR扩增, 扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶分离, 用放射自显影、银染或荧光进行检测。这种序列广泛分布于真核生物基因组, 其重复次数的不同就产生了等位基因之间的多态性。由于SSR两端多为相对保守的单拷贝序列, 通过设计引物便可以PCR扩增, 进行多态性检测。

与其他分子标记相比, SSR有以下优点: (1) 共显性遗传, 不易被自然选择和人工选择所淘汰, 符合孟德尔遗传定律[1,2]; (2) 多态性高, 可通过PCR扩增呈现出来, 试验程序简单, 重复性高; (3) SSR序列的两侧序列较保守, 在等位基因中多相同, 便于重复利用已知引物; (4) 易于检测、重复性好、可进行自动化分析, 1个位点一般可在24h内完成, 且可同时进行多位点的检测; (5) 对DNA质量和数量的要求不高, 仅需微量组织便能有效的分析鉴定。尽管微卫星作为分子标记有许多优点, 但同样存在不足之处, 其中一个最大的麻烦就是必须预先知道试验材料的基因组信息, 至少必须知道重复序列两翼的序列信息, 才能设计出适宜的引物, 这大大地限制了它的应用。

2 SSR标记在棉花遗传育种中的应用

2.1 SSR标记在棉花遗传图谱构建中的应用

遗传图谱 (Genetic map) 是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图, 是植物遗传育种及分子克隆等应用研究的理论依据和基础。而SSR作为一种新型分子标记技术, 由于其丰富的多态性信息含量, 被广泛的应用于棉花遗传图谱的构建。2008年陈利等[3]利用3 458对SSR引物筛选陆地棉中棉所35和渝棉1号间的多态性引物, 获得了173对, 以多态性引物检测两者杂交的F2群体180个单株的标记基因型, 共获得178个标记位点。构建的遗传连锁图谱包括148个标记, 36个连锁群, 总长1 309.2cm, 标记间平均距离8.8cm, 覆盖了棉花基因组的29.5%。李朋波等[4]利用70个SSR标记和15个AFLP标记构建了总长为814cm的遗传图谱, 覆盖棉花基因组的18.3%。与AFLP标记相比, SSR标记通常只扩增1个基因座位, 有利于遗传图谱之间的比较, 这对于确定连锁群所属的染色体及QTL具有比较重要的意义。

2.2 SSR标记在棉花功能基因及QTLs定位分析中的应用

QTLs定位是阐明控制有关数量性状的主要基因数目, 这些基因在染色体上的位置, 以及其联合效应的遗传图。高密度SSR连锁图的构建为基因或QTL定位奠定了基础。利用SSR标记技术对棉花遗传育种进行研究的一个重要方面就是QTLs定位。利用SSR标记技术, 可使棉花育种表型选择逐步过渡到基因型选择, 进一步利用QTLs定位的成果进行标记辅助选择, 大大提高育种的效率。杨昶等[5]用5 300对SSR引物筛选亲本多态, 获得了115个多态位点并进行标记间连锁分析, 构建了一张包括20个连锁群全长560.1cm的陆地棉品种间分子标记遗传图谱。用复合区间作图法进行QTL定位, 在苗期检测到了3个抗病QTL, 成株期检测到9个与纤维品质相关性状的QTL及11个产量构成因素的QTL, 为棉花抗病育种同时兼顾产量和品质育种提供了非常有用的信息。胡文静等[6]用陆地棉优质品系7235、渝棉1号做亲本, 以7235×渝棉1号的F2与F2:3分离群体为材料, 从5514对SSR引物中筛选到117个多态性标记, 并用其中80个标记构建了总长为1 147.8cm的遗传图谱;应用复合区间作图分析了该组合的F2单株和F2:3家系纤维品质性状, 共检测到36个纤维品质QTL。

2.3 SSR标记在棉花标记辅助育种中的应用

分子标记辅助育种 (molecular marker-assisted selection MAS) 是现代分子生物学与传统遗传育种相结合, 借助分子标记对育种材料从DNA水平上进行选择, 从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良[7]。它是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在[8]。与传统的表型性状选择相比, 标记辅助育种具有标记基因型鉴定可以在低世代和植株生长的任何阶段进行、共显性的分子标记允许在杂合体阶段鉴定隐性基因、对目的基因的选择不受基因表达和环境条件的影响等优点。应用标记辅助育种, 理论上只要回交3代就可以选到理想的材料。因此, 可以加快育种速度, 提高选择效率, 特别是对多基因位点控制的许多重要农艺性状的准确选择很有利, 同时对于开发高新产品具有重要意义。石玉真等[9]用一个已定位的高强纤维QTL紧密连锁的2个SSR标记, 在2套杂交组合的不同世代群体中进行分析研究, 成功培育出9个纤维优质的株系。

2.4 SSR标记在棉花种质鉴定及遗传多样性分析中的应用

遗传多样性是指生物种内不同群体之间或群体内不同个体间遗传变异的总和, 它是生物多样性的基础和重要组成部分[10]。不同基因型的种质材料或棉花品种中存在简单重复核苷酸序列差异, 应用同一个SSR引物进行PCR扩增时, 由于引物互补的模板DNA数目和位点不同, 所扩增条带的数目和片断大小就存在差异, 从而呈现出多态性。武耀廷等[11]对36份陆地棉栽培品种SSR遗传多样性研究表明, 分子标记确定的遗传关系基本上与品种系谱的种质系统一致, 但并不能按系谱或种植生态区简单的确定品种的归属。庞朝友等[12]利用37对多态性SSR引物和15个表型性状对155份棉属种间杂交基因渐渗系及其10份陆地棉亲本进行了聚类分析, SSR聚类结果与种质材料的系谱来源基本吻合, 而表型性状聚类结果与材料系谱来源相差悬殊。因此, 综合利用SSR、表型性状聚类结果将促进棉属种间杂交基因渐渗材料的高效利用。朱四元等[13]利用22对多态SSR引物对14份不同类型的抗虫棉花材料进行扩增, 运用Jaccard遗传相似系数计算14个品种间的遗传距离为0.035~1.056, 聚类分析表明14份棉花品种可分为2大类4亚类, 揭示了大多数品种的遗传基础比较狭窄。陈光等[14]利用24对扩增效果好的引物对53个海岛棉种质资源进行遗传多样性的检测分析, 共检测出多态性等位基因变异97个, 占总数的91.5%, 采用UPGMA法对所选材料进行聚类分析表明, 53个品种被分为2大类, 与系谱来源一致, 这证明了SSR分子标记在鉴别品种和品种遗传多样性研究方面具有重要的作用。

3 展望

与其他分子标记技术相比, SSR分子标记技术是一种较为快捷、简单、稳定的遗传标记。在未来的发展中, 相信随着大量可利用的微卫星序列的开发, 其在棉花遗传育种中的应用前景会更加广阔。

摘要：SSR是建立在PCR基础上的分子标记, 具有多态性高、重复性好、共显性、操作简单等优点, 已在棉花研究中被广泛应用。综述了SSR标记的原理与特点, 以及其在棉花遗传图谱构建、功能基因及QTLs定位分析、标记辅助育种、种质鉴定及遗传多样性分析等方面的应用;展望了SSR分子标记技术广阔的应用前景。

SSR技术 篇9

二次雷达 (Secondary Surveillance Radar, SSR) 目标识别系统能够通过发射特定的射频脉冲序列对装有应答机的目标进行“一问一答”式的询问, 由应答机的应答脉冲码获得目标的高度、编号等信息。航管二次雷达常用的基本工作模式为传统的A/C模式和新近的S模式。A模式提供飞机的代码, C模式提供飞机的高度码。但是, 传统的A/C模式存在一些技术缺陷, 如多目标代码交织、重叠、多径反射, 同步窜扰, 异步干扰等。这在大型航空港等飞机非常密集的地方, 时间不同步和混淆信号已经越来越严重, 同时单脉冲二次雷达无法提供数据链路的服务。

针对上述情况出现了一种新式的二次雷达——S模式二次雷达。S模式是一种先进的雷达询问系统, 它建立在独立编址和选择性询问的基础上, 能够解决在模式A/C中具有的信号干扰、有限的信息编码、幻影 (garble) 和异步应答 (fruit) 等问题, 同时在数据链路方面也具有巨大的潜力[1⁃2]。

本文采用通行的FPGA+DSP结构[3⁃4], 结构简单清晰, 功能强大, 成本相对较低, 实现了3/A、C、二级S模式码发射;接收并处理三路射频信号, 检测并正确提取AC码、S码及相应参数, ;输出航管的A模式, C模式和S模式编码信号, 并有较强的抗干扰能力。

1 二次雷达处理机基本性能要求

二次雷达指标为:工作模式3/A、二级S模式功能, 处理能力≥10 000点/帧, 同时≥900批/帧。抗异步串扰密度10 000 fruits/s;检测概率≥99%, 虚警率1个/帧, 解码有效率≥99%;具有接收旁瓣抑制和询问旁瓣抑制能力, 可自适应反串扰和他站应答干扰;具有抑制反射假目标的能力。

根据上面基本要求, 二次雷达可以按任务分解为:解码、发射时序、点迹处理、通信四种功能。相对而言, FPGA易于处理大数据量的流水数据, 不适于复杂算法的事务处理, 开发调试困难。DSP功能强大、运算速度快、寻址灵活、通信能力强, 易于开发;但有些功能仅DSP无法完成, 必须有FPGA配合。这就要在FPGA和DSP之间合理分配任务。因此这里除了点迹由DSP处理外, 其他都由FPGA来完成。系统结构如图1所示。

FPGA完成三通道采样、下变频、AC码、S码检测提取, 两片DSP分别完成AC码、S码点迹处理。FPGA同时完成与航迹管理机双向通信, 及控制发射机的发射时序。

系统接口一般有FIFO和双口RAM, 前者适于顺序事务处理, 但速度慢, 而且需要加同步头, 不适于DMA处理。这里全部采用FPGA内部的双口RAM, 并且置为乒乓结构, 这样可利用DMA高速处理大量数据。同时为了加快处理速度, DSP外总线全部采用同步方式。

根据性能要求, 为了同时装配4路AC码, 专门设计了接口同时捕获4路信号, 并顺序处理捕获的信号。

2 系统软件流程及功能

从系统的性能及硬件结构可以看出, FPGA的任务相当复杂, 要完成解码、发射及相应的通信功能。解码框图如图2所示, 基本过程是下变频, 幅度、相位校正, 门限处理, 再分别AC通道和S通道处理。

FPGA除了完成解码、还要完成编码和时序控制功能, 编码框图如3所示。由于航迹管理机有空中飞机的历史航迹, 因此发射模式是由航迹管理机来配置的。航迹管理机根据历史航迹来确定某一方位的询问是全呼叫还是点名, 并确定回答概率等参数。然后并将这些参数传入发射模式表。编解码根据方位读取相应参数, 并产生相应编码脉冲。

2.1 编码主要系统软件流程及功能

2.1.1 下变频模块

二次雷达要求和、差、控制三通道同步, 因此系统中频放到了信号处理机, 这样便于同步。系统中频是60 MHz, 采样80 MHz, 采样后, 必须滤波并抽取。下变频一般用DDS模块, 但DDS占用资源较大, 这里I, Q通道各自只用了4个预置值。一般预置值I通道采用[1, 0, -1, 0], Q通道采用[0, 1, 0, -1]。但这样遇到采样值是[1, 0, -1, 0]或[0, 1, 0, -1]时, 一个通道输出是0。因此这里采用这样保证每一个通道都有输出值。但这样做会扩大了数据位数, 直接截位会影响小信号检测。为了不影响小信号处理, 必须在抽取滤波时加大数据位数, 最后再截位处理。

2.1.2 求模与相角

求模与相角采用cordic核, 这样将I, Q数据转化为模与相角。表1是cordic核数据范围表, 输入的I, Q的范围是[-1, 1]。在cordic核中模与相角分别采用1QN、2QN表示形式, 例如在幅度是用1QN表示的。假设cordic核的数据长度是10位, 即幅度用1Q8表示中, 因此1和-1表示为:

同时来自AD的I, Q数据也是用补码表示的。假定AD数据长度也是10位, 那么正数最大是29-1, 即0111111111。这样就超过了cordic核的表示范围, 因此cordic核的位数必须正确设置才能不损失动态范围。并且相位的范围是[-π, π], 补偿后相位必须归算到[-π, π]。

2.1.3 幅度与相角补偿

一般通道校正可以在射频补偿[5], 也可在I, Q通道补偿[6⁃7], 但都是复数乘法补偿, 必然有舍入损失。这里插入了log模块, 将乘法简化为加法, 因此直接在求模与相角后补偿相角, 并在求log后补偿幅度。这样将乘性误差转化为加性误差, 补偿精度比直接在I, Q通道补偿高很多, 如图4所示。

2.1.4 AC通道处理

AC通道在边沿检测、脉冲预处理、框架检测后提取AC码参数, 并且进行去除幻影处理。幻影框架是因为不同框架脉冲交叠在一起, 产生多个虚假的框架, 从而产生多个虚假的应答, 必须去除。

单脉冲二次雷达目标信号处理去除幻影的基本思路是利用单脉冲二次雷达和、差通道的信号幅度信息来去除幻影框架[5]。属于同一框架脉冲的AMP值应具有一致性, 不具有AMP一致性的两个脉冲很可能属于不同的框架。并且通过以下步骤去除幻影:

(1) 可能的幻影框架判定

根据完全重叠的定义, 对所有收到框架中的F1和F2脉冲进行完全重叠判定。通过判断该F1, F2脉冲是否在另一个框架的F1后n×29±3 (n=0, 1, …, 14) 的位置上 (系统时钟选20 MHz) 。即计算两个脉冲的距离值差, 如果等于n×29±3 (n=0, 1, …, 14) , 即为可能的幻影框架。

(2) 构成交叠关系的框架

根据构成交叠关系的框架的定义, 对于上步找到的n个可能的幻影框架, 找出与每个框架Ai (1≤i≤n) 构成交叠关系的所有框架, 即计算两个框架的距离值差, 如果等于n×29±3 (n=0, 1, …, 14) , 就是构成交叠关系的框架, 假定有m个构成交叠的框架。

(3) 去除幻影

根据判定幻影框架充分必要条件中的Σ, Δ值均具有一致性的原则, 分别计算出每一个可能幻影框架Ai (1≤i≤n) 的参考信号的Σ值, 跟每个与之构成交叠关系的框架Bi ( (1≤i≤m) 的参考信号的Σ值之差, 同时也计算出两者的Δ值之差。只要其中有一组的Σ值之差具有一致性, 且Δ值之差也具有一致性, 就将该框架作为幻影删除。

这里去幻影是流水处理, 为了处理方便将此算法放在FPGA内处理。

2.1.5 S通道处理

S通道经过边沿检测, 报头检测, 计算参考值, DF认证, 重触发, 参数提取模块完成S模式应答信号的检测与提取[6⁃7]。

S模式信号报头为8μs, 并且数据可长达112μs, 提取电路相对复杂。这里采用移位寄存器来提取码值。即检测到有效报头后, 等数据脉冲部分到来后, 再启动数据提取, 将数据逐次打入。

2.2 编码主要流程及功能

信号处理机还须进行编码发射时序处理, 发射时序如图5所示。根据图3流程, 航迹计算机来配置每一SCAN的发射模式及参数表。信号处理机来顺序读取每个脉冲的模式及相应参数, 并据此来控制发射波形。

这里模式仅分为三种, 分别是00、01、02。如图5所示, 00模式是AC模式, 即AC交替模式, 用于发射AC码。01模式是S和AC联合全呼叫模式, 这样装有S模式和只装AC模式的飞机都能应答。02模式是点名呼叫模式, 这样地址一致的S模式飞机才响应并应答。

2.3 点迹处理

信号处理机同时完成点迹处理, 即将飞机的多个应答处理为一个点迹报告, 并传送到航迹计算机, 这部分任务由DSP完成。

点迹处理处理分点迹相关和点迹凝聚的两个过程。其中点迹相关的基本流程如图6所示。

相关上的点迹形成一个链, 码值的凝聚则根据链上所有应答的置信度来凝聚码值, 生成距离、方位、点迹质量、紧急/识别标注等, 然后生成点迹报告送至航迹计算机。

3 结论

本系统采用FPGA+DSP的方式设计、实现了单脉冲二次监视雷达实时信号处理机, 结构清晰简单, 功能强大, 成本相对较低。经测试SSR信号处理机, 可以达到≤15 m级的距离分辨率。并且根据二次雷达设备规范[8], 每个SCAN可以达到约600个目标, 或每个扇区可处理64批目标, 检测概率大于99%, 测角精度优于0.05°。同时系统有BIT功能, 可以离线或在线检测, 可靠性很高。另外, 系统简单扩展既可以实现1、2、B、D、IFF等功能。综上所述, 本二次雷达信号处理机具有较高的性价比, 市场前景广阔。

摘要：针对二次雷达的通用处理要求, 采用流行的FPGA和DSP结构的处理机, 并且合理设计处理流程和算法, 有效地整合二次雷达接收、发射、信号处理、点迹处理的功能, 并适于FPGA流水处理和DSP事务处理。该处理机结构简单、紧凑, 功能强大。经测试, 能有效处理AC模式和S模式应答信号, 实施S模式询问管理及相应功能。

关键词：二次雷达,AC模式,S模式,信号处理

参考文献

[1]王洪, 刘昌忠, 汪学刚.二次雷达S模式综述[J].电讯技术, 2008, 48 (7) :113-118.

[2]张蔚.二次雷达原理[M].北京:国防工业出版社, 2009.

[3]钟睿, 毛士艺, 张永鹏, 等.基于DSP FPGA的二次雷达信号处理机的实现[J].系统工程与电子技术, 2002, 24 (12) :8-11.

[4]牛力丕, 毛士艺, 李少洪.基于多DSP技术的SSR实时信号处理机[J].北京航空航天大学学报, 2003, 29 (5) :394-397.

[5]蒋德富.单脉冲和差通道幅相不平衡校正[J].现代雷达, 1997, 19 (8) :9-11.

[6]梁士龙, 郝祖全.单脉冲雷达数字接收机幅相不平衡的一种校正方法[J].系统工程与电子技术, 2003, 25 (2) :137-139.

[7]杜俊蛟, 曹旭东, 李宝森, 等.基于FPGA的多通道雷达接收机幅相不一致校正[J].电光与控制, 2011, 18 (1) :85-89.

[8]中国民用航空总局空中交通管理局.空中交通管制二次雷达监视雷达设备技术规范[S].北京:中国民用航空总局, 2006.

[9]郑植, 练马林, 张超, 等.模式S应答处理中报头检测算法的研究与实现[J].电子科技大学学报, 2008, 37 (z1) :66-70.

[10]伊娜.模式S应答处理中的视频处理[D].成都:电子科技大学, 2006.

SSR技术 篇10

据王献[7]对我国紫薇种质资源的调查发现, 我国现有紫薇18种, 从东南亚引入3种, 共计21种, 紫薇作为我国夏季重要的观花植物, 在我国占有重要的地位。随着分子遗传学的发展, 利用分子标记开展紫薇遗传多样性、遗传图谱构建、指纹图谱等方面的研究正在成为紫薇研究中的热点和重点。SSR分子标记作为第二代分子标记具有许多优点, 因此利用SSR分子标记开展紫薇的研究势在必行。

目前应用于紫薇的分子标记主要有AFLP[8,9,10]、RAPD[11,12]、ISSR[13], 国外已有部分学者开始了紫薇SSR标记的开发[14,15], 而国内未见到有关紫薇SSR的研究。SSR标记具有多态性好, 可重复性高, 呈现共显性, 在基因组内分布较广且均匀等优点, 现已广泛应用于群落遗传结构的研究[16,17,18]。SSR引物一般分为基因组SSR引物和EST-SSR引物两类, 以EST序列为基础进行引物的开发不必考虑非编码区域, 易于筛选出合适的引物, 而且不用进行大规模的基因组测序, 十分经济简便[19]。SSR-PCR体系中的各种因素对反应结果均有一定的影响, 对其体系的优化是十分必要的。

该研究利用正交设计对紫薇SSR-PCR体系中模板浓度、dNTP浓度、引物浓度、酶浓度等4因素进行优化, 筛选出了最优的反应体系, 并利用最优的SSR-PCR反应体系对紫薇EST-SSR引物进行了筛选, 为紫薇分子遗传学的研究提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

紫薇品种:紫霞、毛叶粉薇、矮生平枝紫、矮生平枝红、粉蕊出墙、白密香、白蝶飞舞, 所有植株均定植于江苏省中国科学院植物研究所苗圃地中, 常规大田管理。选取紫薇新生叶片, 在苗圃取下后, 放入冰盒中, -80℃保存待用。

该文中所用的EST-SSR引物序列来源于文献报道[11,15], 由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成, 序列信息见表1, 其中LID001用于体系的优化, LID004用于最优体系的验证, 其余24对用于引物筛选;Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶均购自Takala公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及引物合成

利用CTAB法提取紫薇叶片DNA, 提取方法因样本不同而进行一定的改进[20]。称取0.3g叶片, 用液氮磨碎, 放入2mL离心管中, 加入600μLCTAB裂解液, 用牙签混匀;65℃水浴30min, 每5min颠倒混匀1次;在离心管中加入600μL氯仿∶异戊醇 (24∶1) , 上下颠倒50次后静置1min;将离心管以11 000r·min-1以上的速度离心20min, 转移上清至新离心管中;加入300μL预冷的异戊醇, 上下颠倒30次, -20℃保存1~2h;将离心管以11 000r·min-1以上的速度离心15min, 弃上清, 沉淀用300μL70%乙醇洗涤2次;在通风厨中风干后, 加入100μL无菌去离子水, 4℃条件下过夜溶解待用。DNA样品用紫外可见光分光光度计检测其浓度 (A260/A280) , -20℃保存。

1.2.2 SSR-PCR反应

在参照Wang等[15]的紫薇SSR反应体系的基础上, 采用4因素3水平L9 (34) 正交设计, 即DNA模板浓度 (20、40、60ng) 、dNTP浓度 (0.08、0.10、0.15mmol·L-1) 、引物浓度 (0.25、0.50、1.00μmol·L-1) 、Taq酶活性 (0.1、0.2、0.4U) (见表2) , 每个体系中加入10×Buffer 1.0μL, 25mmol·L-1Mg2+1μL, ddH2O补至10μL。-20℃保存。扩增程序为95℃预变性3min, 95℃变性40s, 55℃退火40s, 72℃延伸30s (35个循环) , 72℃延伸4min, 4℃保存。每个处理重复3次。

1.2.3 PCR产物的检测

将10μL PCR产物中加入2μL 3×Loading-buffer, 利用8%浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 缓冲液为1×TBE, 上样量为2μL, 进行恒压电泳, 电压185V, 电泳至溴酚蓝带跑出胶最低端为止。胶片用银染方法染色, 染后用250mL固定液 (去离子水、10%乙醇、1%乙酸) 固定10 min, 250 mL 1.5%硝酸银浸泡10min, 250mL去离子水洗涤2遍, 250mL显色液 (去离子水、1.5%氢氧化钠、1%甲醛) 显色10min, 用去离子水冲洗终止反应, 胶片用单反相机拍照, 并利用Photoshop软件进行处理。

1.2.4 引物筛选

利用筛选得到的紫薇SSR-PCR最优反应体系对24对紫薇SSR引物进行扩增, 筛选出带型清晰, 有多态性的EST-SSR引物。

2 结果与分析

2.1 紫薇SSR-PCR反应体系的优化及验证

从图1可以看出, 处理2和处理9仅第3次重复扩增出大小为252bp的条带, 处理1和处理5第3次重复扩增出大小为252和255bp两条带, 处理8的2次重复扩增出大小为252和255bp两条带, 处理3、处理4、处理6和处理7的3次重复都能扩增出大小为252和255bp的两条带, 处理7扩增出的条带最清晰且最稳定, 利于结果统计, 因此选择处理7为最优化的SSR反应体系即10μL体系中含Taq酶0.2U、镁离子2.5mmol·L-1、dNTP 0.15mmol·L-1、引物0.25mmol·L-1、模板DNA 60ng, 去离子水补至10μL。

2.2 最优SSR-PCR体系的验证

利用7个不同品种的紫薇DNA分别对最优的处理7体系和随机选择的非最优对照处理2进行SSR-PCR结果验证。从图2可以看出, 反应体系7对不同品种的紫薇DNA均能扩增得到250bp的条带, 体系2的仅有3个品种的紫薇DNA扩增出250bp的条带。验证结果表明7号反应体系作为最优反应体系对于不同的紫薇单株均能得到稳定的SSR-PCR扩增产物。

2.3 引物的筛选

利用紫霞和毛叶粉薇2个紫薇品种的DNA及SSR-PCR最优反应体系对24对紫薇EST-SSR引物进行多态性筛选 (见图3) 结果表明, 24对引物中共有23对扩增得到了清晰的条带, 共扩增出68条清晰带, 平均每对引物2.9条;其中具有多态性的引物16对, 多态性条带占总带数的57.4%;差异条带39条, 有差异的引物多具有2条以上的差异带, 仅有2对引物表现为单一条带差异。

3 结论与讨论

综上所述, 紫薇10μLSSR-PCR的最优反应体系为10μL含Taq酶0.2U、镁离子2.5mmol·L-1、dNTP 0.15 mmol·L-1、引物各0.25mmol·L-1、模板DNA 60ng, 去离子水补至10μL。研究筛选得到了24对可用的EST-SSR引物, 其中有16对具有多态性, 共扩增出条带68条, 差异条带39条。

曾建立的研究认为中国石蒜体系为20μL、树莓15μL、樱桃李25μL[21,22], 从中得出的紫薇10μL SSR-PCR反应体系与其它体系相比, 各种试剂的用量均下降, 尤其是Taq酶, 仅需0.2U, 极大地降低了试验成本。由于正交试验设计能充分考虑各试验因素的平均分配和交互作用, 常用于各种分子标记体系的建立, 通常都能得到较为理想的试验结果。首次利用正交试验对紫薇SSR-PCR体系进行优化, 在得到最优结果后利用其它不同紫薇品种验证最优体系, 结果表明最优体系的稳定性, 与SSR可重复性的特征一致[23], 为利用分子标记开展紫薇遗传多样性和遗传图谱构建等奠定了基础。

摘要：为加强紫薇分子遗传学研究, 以紫薇叶片DNA为模板, 采用4因素 (模板浓度、dNTP、引物浓度、酶浓度) 3水平的L9 (34) 正交设计, 优化紫薇的SSR-PCR反应体系, 并对24对紫薇SSR引物进行了筛选。结果表明:紫薇10μLSSR-PCR的最优反应体系为:Taq酶0.2U、Mg2+2.5mmol·L-1、dNTP 0.15mmol·L-1、Fprimer 0.25mmol·L-1、R-primer 0.25mmol·L-1、DNA 60ng, ddH2O补至10μL;24对EST-SSR引物筛选出可扩增出条带的引物23对, 其中16对具有多态性, 共扩增出清晰条带68条, 差异条带39条。

SSR技术 篇11

关键词 澳洲坚果 ；分子标记 ；SSR

中图分类号 S664.9 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.09.007

Abstract In order to explore the feasibility of SSR-PCR in Macadamia， a singular factor test was used to optimize SSR-PCR amplification system for macadamia. The results showed the optimal PCR reaction system was 2.50 mmol/L Mg2+， 0.10 mmol/L dNTPs， 0.40 μmol/L primers， and 1.25 U Taq DNA polymerase in a volume of 25 μL. Nineteen pairs of SSR primers with amplifications were obtained in SSR-PCR， but only two pairs of primers had different results in PCR amplification in the combination of 900 as female and 294 as male parents. These two pairs of primers can hence be used to identify the F1 generation of the 900×294 combination. Therefore the SSR-PCR could be used for identification of hybrid progeny in macadamia.

Keywords Macadamia ； molecular marker ； SSR

澳洲坚果（Macadamia spp.）属山龙眼科（Proteacase）澳洲坚果属（Macadamia）常绿乔木。原产于澳大利亚昆士兰州东南部和新南威尔士州北部、南纬25°～32°之间的沿海亚热带雨林[1]。素有“干果之王”的誉称。中国于20世纪70 年代引种试种澳洲坚果，在云南、海南、广东、广西、福建、浙江等省（区）引种试种，种植面积近5 400 hm2，产量约600 t，其中种植规模最大的是云南，其他省（区）还处于零星试种阶段[2]。

目前，有关澳洲坚果性状的研究主要集中在形态学的特征性描述与遗传多样性研究。形态标记和生化标记也已应用于澳洲坚果的品种鉴定、分类和亲缘关系研究等方面[3-4]。由各种DNA分子标记衍生的DNA指纹技术在鉴定品种等方面具有高效、准确的特点[5-6]。Steiger等[7-9]利用AFLP技术在澳洲坚果上检测到了丰富的多态性，RAF标记表明澳洲坚果种质资源具有丰富的遗传多样性[10]；Peace等[8]利用PAPD与SSR对澳洲坚果种质进行了遗传多样性研究，与其后Vithanage等[9]采用同工酶研究结果一致，表明DNA标记对澳洲坚果的杂交育种有辅助作用。近年来，一些研究显示DNA分子标记应用于澳洲坚果中具有高度的一致性和可信度[11]。虽然分子标记在澳洲坚果种质资源鉴定上的应用还处于初步阶段，但杂交育种已广泛应用在澳洲坚果选育种中。本课题虽在澳洲坚果杂交育种方面做了大量工作，也得到了大量的杂交子代，但其子代只能使用传统的形态学鉴定方法，完成鉴定必须等到开花结实，周期长达8 a，耗费大量的人力和财力。为了提高育种效率，迫切需要一种快捷简易的鉴定方法。而SSR标记具有共显性的特征，原则上子代将同时含有父母本的特征性条带。为此，本实验选择SSR标记方法，研究SSR标记在澳洲坚果子代鉴定中的可行性。

本研究采用SSR分子标记技术，以900×294组合及其子代为研究对象，采用单因素分析法对影响SSR-PCR的各个因素进行分析，建立SSR-PCR反应体系，并初步探讨SSR-PCR标记在澳洲坚果亲本标记和杂交子代鉴定方面的可行性，为澳洲坚果分子标记辅助育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

采集母本900、父本294及杂交子一代幼叶于液氮中保存。主要试剂有：引物（上海生工合成）；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基磺酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸（EDTA）、琼脂糖、硝酸银等从上海生工购买；Taq DNA聚合酶等PCR试剂为TAKARA产品；氯仿、异丙醇、无水乙醇、丙三醇、饱和酚等为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用改良CTAB法提取基因组DNA[12]。

1.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测

配置1%琼脂糖胶，核酸染料采用goldviewⅡ，每100 mL加5 μL染料，电泳条件为150 V，30 min，结束后置于紫外灯下观察提取的DNA质量。

1.2.3 SSR引物的筛选

从NCBI里查找澳洲坚果DNA系列，用SSRHunter 1.3查找到可能的SSR系列，再用primer 5设计100对引物，送上海生工合成。将合成的引物用灭菌的去离子水溶解至10 μmol/L。采用25 μL PCR反应体系，包括10×PCR buffer（Mg2+ free）2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）2 μL、Primer（10 μmol/L）1 μL、Taq（5 U/μL）0.5 μL、DNA1 μL，用ddH2O补充到25 μL。在确定最适反应体系时，在不改变其他组分的条件下，分别对反应体系各组分浓度进行调整。将最终确定的最佳反应体系用于SSR引物的筛选。PCR 反应为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，最适Tm退火值 30 s；72℃延伸60 s，再重复2～4步，30个循环，后于72℃延伸5 min。PCR 反应产物用琼脂糖凝胶预检测其扩增效果，并用梯度PCR确定每对引物的最适退火温度。调整好最适退火温度，分别以父本、母本为模板再次进行PCR 扩增，PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，找出能区分父本和母本的特异性引物和扩增结果良好的引物（聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高）。

nlc202309082105

1.2.4 F1代鉴定

子代F1和母本900、父本294同时进行PCR扩增（反应体系和条件以上面确定的一致），将扩增后的PCR 产物先用琼脂糖凝胶检测，以确定PCR扩增是否成功，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，硝酸银染色后拍照。

2 结果与分析

2.1 澳洲坚果DNA提取

DNA作为本研究的直接材料，其纯度和完整性是进行SSR-PCR试验的前提条件。本研究采用CTAB法提取DNA，采用琼脂糖凝胶电泳检测（图1）。从图1可看出，所得DNA样本条带清晰，完整度好，且没有RNA污染和降解。说明DNA质量达到PCR的基本要求。

2.2 确定SSR-PCR扩增的最适Mg2+浓度

由于Taq DNA聚合酶是镁离子（Mg2+）依赖性酶，因此Mg2+浓度对PCR扩增有显著影响，在一般的PCR反应中，Mg2+的工作浓度为1.5～2.0mmol/L。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增，但Mg2+浓度过低又会降低Taq DNA聚合酶的活性，得不到扩增产物。本实验设计了1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mmol/L共5个浓度梯度。从图2可看出，各个Mg2+浓度下都可得到清晰的扩增条带，但Mg2+浓度为2.50 mmol/L时条带最亮，因此本实验中最适Mg2+浓度为2.50 mmol/L。

2.3 确定SSR-PCR扩增的最适dNTPs浓度

dNTPs浓度直接影响PCR产物的量，dNTPs浓度过高，会导致聚合酶错配，过低又会降低PCR扩增效率。在一般PCR体系中，dNTPs浓度为0.1 mmol/L。本实验选取0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mmol/L 5个dNTPs浓度进行PCR扩增。从图3可看出，随着dNTPs浓度的增加，得到的PCR产物量也增加，但当dNTPs浓度超过0.1 mmol/L时，PCR产物量的增加不明显，因此本实验中最适dNTPs浓度为0.1mmol/L。

2.4 确定SSR-PCR扩增的最适引物浓度

引物浓度直接影响PCR扩增结果，引物的浓度太低时，扩增产物量太少，但引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。PCR中引物的浓度一般在0.1～1.0 μmol/L。因此本实验选择0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L 5个浓度。从图4可看出，当引物浓度为0.4 μmol/L时，SSR-PCR的效果最好。

2.5 确定SSR-PCR扩增的最适Taq DNA聚合酶浓度

Taq DNA聚合酶是PCR反应中的重要因素，用量过多会引起非特异性扩增，过少又使产物量减少。本实验选择0.5、0.75、1.00、1.25、1.50 U 5个浓度。从图5可看出，随着Taq DNA聚合酶量的增加，PCR扩增条带亮度呈上升的趋势，但当Taq DNA聚合酶用量达到1.00 U后，扩增条带亮度上升不明显，从节约的角度出发，选择1.00 U为本次实验中的使用浓度。

2.6 SSR引物的筛选

由上述SSR-PCR体系优化实验，确定最适PCR体系，即10×PCR Buffer（Mg2+ free）2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.25 μL、MgCl2（25mmol/L）2.5 μL、Primer F（10 μmol/L）1 μL、Primer R（10 μmol/L）1 μL、Taq（5 U/μL）0.25 μL、DNA 1 μL、ddH2O 16.5 μL。由这一PCR反应体系，以900和294植株的DNA为模板，从100对SSR引物中筛选到具有扩增产物的引物19对，再通过梯度PCR确定每对引物的最佳退火温度，筛选结果见表1。

2.7 澳洲坚果杂交F1代的鉴定

确定退火温度后，再一次用900（母本）、294（父本）及其杂交子代F1为DNA模板进行PCR扩增，其PCR产物用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以硝酸银染色，结果显示只有引物15和引物17在此组合中存在特异性条带（图6）。从图6可看出，两对引物所得结果具有同一性，因此SSR标记可以作为澳洲坚果杂交子代鉴定的方法。

3 讨论

虽然SSR标记技术已经广泛应用于作物的辅助育种，但其原理是基于PCR，会受到模板DNA质量、dNTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度以及引物浓度等因素的影响。在本实验中，当各个因素水平较低或较高时，PCR扩增效果都不好，因此对SSR体系的优化很有必要。

传统的澳洲坚果资源鉴定方法是形态性和农艺学性状，即进行性状调查，通过株型、叶型、果型、花色、果色等表型性状对其进行鉴定，费时费力且易受环境因素的干扰，其他作物上研究表明，分子标记是行之有效的遗传多样性的鉴定方法。本实验利用SSR标记技术成功进行了澳洲坚果杂交F1代的鉴定，说明SSR标记技术可以代替传统的鉴定，克服田间调查周期长、易受环境干扰等问题。此外本实验从100对SSR 引物中仅筛选出2对有效的引物，其利用率低。SSR引物的开发主要决定于遗传基因的多态性，但澳洲坚果的不同品种间由于亲缘关系较近，SSR表现出来的多态性都较差，因此澳洲坚果SSR 引物开发难度比较大。但是随着DNA测序技术的发展，更多SSR位点被发现，开发引物的难度将会大大降低，相信在将来SSR标记技术将会广泛应用于澳洲坚果子代鉴定上，成为育种工作的重要辅助方法。

参考文献

[1] 郭凌飞，邹明宏，曾 辉，等. 澳洲坚果ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 林业科学，2008，5：160-164.

[2] 云南澳洲坚果产业调查组. 云南省澳洲坚果产业发展现状、存在问题及建议[J]. 热带农业科技，2007，30（1）：10-14.

[3] 岳 海，陈丽兰，陈国云，等. 云南省澳洲坚果品种鉴别分析研究[J]. 西南农业学报，2008，21（5）：1 395-1 400.

[4] 姚宏伟，张立冬，孙金阳，等. DNA分子标记技术概述[J]. 河北渔业，2010，07：42-46.

[5] 刘爱群，赵丽丽，王国政，等. 分子标记鉴定葫芦科瓜类作物种子纯度的研究进展[J]. 长江蔬菜，2012（8）：6-10.

[6] 梁 勇，李焕秀，何 艳，等. 几种DNA分子标记在种子纯度鉴定上的应用进展[J]. 广西农业科学，2008，39（1）：17-20.

[7] Steiger D L， Moore P H， Zee F， et al.Genetic relationships of macadamia cuhivars and species revealed by AFLP marker[J]. Euphytica， 2003， 132：269-277.

[8] Peace C P， Allan P， Vithanage V， et al.Progress made with molecular markers for genetic improvement of Macadamia[J]. Acta horticulturae， 1998， 461： 199-207.

[9] Vithange V， Peace C P， Carroll B J， et al.Progress made with molecular markers for genetic improvement of Macadamia[J]. Acta horticulturae， 1998， 461： 199-207.

[10] 郭凌飞，邹明宏，杜丽清，等. 利用ISSR和分析澳洲坚果的亲缘关系[J]. 园艺学报，2011，38（9）：1 741-1 746.

[11] 郭凌飞，邹明宏，曾 辉，等. 利用改良CTAB法提取澳洲坚果成熟叶片高质量DNA[J]. 分子植物育种， 2007，5（6）：187-190.

SSR技术 篇12

1 矩阵束算法

矩阵束方法可以用于从系统的扰动响应中直接提取与振荡模态有关的信息, 如模态的频率、幅值、衰减因子等。

将含噪的平稳信号描述为

式中:i为模态序号;m为最大模态数;ai、φi为第i个振荡模态的幅值和初相位;σi为模态阻尼;fi为模态振荡频率值。

利用WAMS实测信号y (k) (k=1, 2, …, N) 作为采样信号, 构造如下Hankel矩阵:

式中L为矩阵束的参数, 恰当选取L可以有效地抑制噪声干扰, 通常L=N/4~N/3。

将Hankel矩阵Y进行奇异值分解, 得

取对角阵S中前M个较大的奇异值σi所在的列构成矩阵S1, σi对应的右奇异向量vi构成V'=[v1, v2, …, vM]。将矩阵V的第一行删去构成V1, 最后一行删去构成V2。定义

令zi=e (-αi+jwi) k, 可以证明:zi是矩阵束Y2-λY1的广义特征值, 即求解

式中:Y1+是Y1的伪逆矩阵。

求出G的n个特征值λi后, 设Ts为采样周期, 利用λi可以得到频率和衰减因子σi:

2 稳定图法

时间序列方法在系统参数识别中, 模型定阶是最关键一步。稳定图法是一种模型定阶的有效方法, 其主要思想是:假定系统具有不同的阶次, 绘出一个以频率为横坐标、阶次为纵坐标含有各阶次的模态参数二维图。随着阶数的增加, 真实模态和噪声等因素所产生的虚假模态会同时出现在稳定图上, 真实模态对应的极点会出现在每个阶次固定的频率上, 在稳定图上表现为一条竖线, 形成一条稳定轴;而虚假模态对应的极点则呈分散形态, 没有稳定轴, 利用这一特征可以将真实模态与虚假模态进行区分, 实现系统定阶。

2.1 稳定图定阶原理

将原始信号y (k) (k=1, 2, …, N) 构造为Hankel矩阵:

式中:下标0/2i-1表示Hankel矩阵第1列的第1个和最后1个元素;下标p和f分别表示过去和将来;下标i表示两个输出的时间间隔;j表示计算系统输出协方差所取的输出数据的组数, j尽量大。利用Y0/2i-1矩阵构造协方差Toeplize矩阵:

对Toeplize矩阵进行奇异值分解, 以达到消除噪声的目的:

构造系统的为可观测矩阵Oi与反转可控随机矩阵Γi。因T1, i=OiΓi, 可得到系统矩阵A为

将A阵进行奇异值分解可得到系统的特征值λi及系统的各种特征参数进而绘制出稳定图。

2.2 利用稳定图定阶的具体步骤

1) 设系统阶数为n, 并假定系统的最大阶次和最小阶次分别为nmax和nmin, 故nmin≤n≤nmax, 且n为偶数, 得到 (nmax-nmin) /2+1个假定阶次。

2) 对每一个n值都进行一次模态识别, 将得到的 (nmax-nmin) /2+1组结果绘入以频率为横坐标、阶次为纵坐标的稳定图中。

3) 在稳定图中, 如果有一条轴上的点满足式 (1) , 则该轴确定为稳定轴, 稳定轴的个数就是系统阶数:

式中:i为模型阶次;fi为在阶次i下的模态频率;δf为容差率。

借助稳定图可以获得正确的模型阶数和模态参数, 杜绝了虚假模态对系统定阶的影响。

3 算法实现步骤

基于稳定图和矩阵束算法的SSR检测步骤如下:

1) 提取发电机转子转矩信号为检测信号。

2) 根据稳定图法判断信号中的频率成分给模型定阶。

3) 利用矩阵束算法计算出检测信号中各分量频率的精确值, 检测其是否含有SSR特征频率。

4) 提取转矩信号中出现SSR的特征频率, 用矩阵束方法来辨识出该频率分量的幅值、衰减因子等参数借此判断其发展趋势。

4 仿真试验

4.1 算例分析

以s (t) =1.5e-0.2tsin (2π×150t+π/4) +0.5e-0.5tsin (2π×100t+π/+e-1.3tsin (2π×50t+π/5) +n (t) 为检测信号。其中n (t) 为高斯白噪声, 检测信号中信噪比为10 d B, 波形如图1所示。信噪比定义为

式中, ψs2和ψn2分别为待测信号和噪声信号的均方值。

利用稳定图为模型定阶, 设容差率δf=1.5%, 检测信号稳定图如图2所示。

由图2可以看到模型中含有3个频率分量, 因为含有噪声, 将模型阶数定为8。

相对误差定义为

分别采用矩阵束方法与TLS-ESPRITS方法进行检测, 结果如表1所示。

从表1可以看出, 在同等噪声强度的环境下, 矩阵束方法对频率、衰减因子的检测精度优于TLS-ESPRITS方法。

4.2 仿真实例

采用IEEE第二基准SSR标准模型进行仿真[6], 如图3所示。

在图3中, 同步发电机轴系模型由多个质量模块构成[7,8], 如图4所示。

各质量模块间的一阶自然扭振频率分别为24.6和32.8 Hz。

在不同串补度的条件下, 通过定子进入发电机的电气谐振频率不同, 引起发电机转子转速信号的变化趋势也不同。采用大扰动条件下获得的发电机机械量:2 s时系统在图3中L2线上发生三相短路故障, 持续0.017 s, 采样频率fs=1000 Hz。分别提取系统串补度为30%和60%时的转子低压缸和高压缸之间的转矩信号为特征信号, 再向信号中加入噪声, 令其信噪比SNR=10 d B, 得到信号如图5所示。

由图5作出判断, 当系统串补度分别为30%和60%时, 转子转矩信号分别呈现出衰减振荡和增幅性振荡的趋势。据此, 分别绘制串补度为30%和60%时的转子低压缸和高压缸之间转矩信号的稳定图, 如图6所示。

由图6可以看到, 2个转矩信号中都存在着2个频率分量。由于噪声的存在, 系统的阶数为6。使用矩阵束方法进行SSR模态辨识, 辨识结果如表2所示。

由表2可以看出, 转矩中出现了频率为32.42 Hz和24.72 Hz的次同步振荡特征信号。在系统的串补度为30%时, 24.81 Hz振荡模式占主要成分, 衰减因子为正;32.42 Hz振荡模式初始幅值较小, 衰减因子为负值, 转子发生了严重的SSR。该结论与发电机的转矩信号图相吻合, 说明结合稳定图的矩阵束方法可以准确辨识SSR模态参数。

4.3 检测方法的性能试验

4.3.1 抗噪性

在不同信噪比条件下采用结合稳定图的矩阵束方法进行检测, 采样点数为4000点, 结果如表3所示。

从表3可以看出, 结合稳定图的矩阵束方法具有很强的抗噪性, 在信噪比达到-10 d B时依然具有很高的检测精度。有必要指出, 在信噪比低于-10 d B时, 结合稳定图的矩阵束方法检测精度明显下降。

4.3.2 准确性

利用不同取样时间长度的信号进行检测, 令SNR=10 d B, 检测结果如表4所示。

由表4可以看出, 结合稳定图的矩阵束检测方法在较短的数据长度下也能够达到较高的检测精度, 实时性好。

5 结语

本文采用矩阵束结合稳定图对电力系统次同步振荡进行模态识别, 通过仿真验证, 在不同的串补条件下, 该方法可以迅速、准确地辨识出SSR参数及其发展趋势, 具有抗噪性强、检测精度高的优点。同时该方法也为SSR的在线监测提供了新的思路。

摘要：次同步谐振 (Sub-synchronous Resonance-SSR) 存在着多种振荡模式, 现有检测方法不能判断其发展趋势, 为此提出一种基于稳定图和矩阵束算法的SSR模态识别方法。该方法不需借助SSR的发生机理, 直接利用测量数据进行辨识。仿真实验表明, 该方法具有检测精度高、抗噪性强、对SSR发展趋势预判准确等优点, 且采用该方法有效、可行。

关键词：SSR,矩阵束,稳定图,模态识别,信噪比

参考文献