足细胞分子

足细胞分子（精选7篇）

足细胞分子 篇1

摘要：随机搜集住院及门诊2014年17月符合原发性肾病综合征诊断标准的患者57例, 分未经治疗的PNS患者活动期组30例, PNS完全缓解组27例, 正常对照组17例, 采用ELISA法测定尿足细胞Nephrin蛋白分子, 同时测定活动期组患者24h尿蛋白的水平。活动期组患者尿足细胞Nephrin水平明显高于缓解组和正常对照组 (P<0.05) 。缓解组与正常对照组相比, 缓解组尿足细胞Nephrin水平高于正常对照组 (P<0.05) 。活动期组尿足细胞Nephrin水平与24h尿蛋白水平无相关性 (P>0.05) 。动态监测尿足细胞Nephrin分子可观察足细胞的活动变化, 对判断和评估肾小球损伤水平及治疗有一定的临床意义。

关键词：尿足细胞分子,原发性肾病综合征

原发性肾病综合征 (PNS) 是常见肾小球疾病, 临床表现为大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症及水肿。其主要表现是大量蛋白尿。然而, 大量蛋白尿可造成肾脏的损伤, 且蛋白尿严重程度与慢性肾衰竭的进展呈密切相关[1,2]。所以, 减少蛋白尿是治疗原发性肾病综合征的关键。蛋白尿可造成肾小球中系膜细胞、足细胞及肾间质的损害。当肾脏发生病变时, 足细胞损伤、凋亡、脱落, 从而引起足细胞数目减少, 导致肾小球基底膜电荷屏障和裂孔隔膜的破坏, 使得尿蛋白漏出[3]。足细胞的减少可反映肾脏损伤严重程度的重要观察和预测指标。近几年来, 研究证实肾小球足细胞Nephrin表达的多少和滤过屏障的通透性密切相关[4], 并认为足细胞Nephrin是裂孔膜上最重要的分子[5]。因此, 本研究主要测定尿中Nephrin分子水平, 评估尿足细胞Nephrin分子是否可以作为PNS疾病活动的一项临床观察指标, 探讨是否对PNS患者临床治疗和预后有一定的指导意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机搜集遵义医学院附属医院肾病风湿科住院及门诊2014年1~7月符合PNS诊断标准的患者共57例, 男39例, 女18例, 年龄33.52±16.01岁, 未经治疗的PNS活动期组30例 (尿蛋白≥3+, 24h尿蛋白定量≥3.5g/L, 血清白蛋白 (ALB<30g/L) , 其中男20例、女10例, 年龄37.20±17.30岁;PNS患者缓解组27例 (血生化、尿检基本正常) , 其中男19例、女8例, 年龄29.44±13.37岁;正常对照组17例 (为健康体检者) ;除外紫癜性肾炎、乙型肝炎病毒相关性肾炎、狼疮性肾炎、肾淀粉样变性及糖尿病肾病等继发性肾病综合征, 无心、脑、肝及肾等疾病。三组性别、年龄、病程等一般资料比较, 差异不明显, 具有可比性。

1.2 尿Nephrin分子的测定

将留取三组患者晨尿10ml, 按2000r/min离心5min, 收集上清液, ￣20℃保存, 用于尿Nephrin的测定。采用酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定尿Nephrin的浓度 (试剂盒由上海素尔生物科技有限公司提供) , 按照Nephrin试剂盒说明书进行操作, 测定OD值并绘制标准曲线, 计算样品的实际浓度。

1.3 24h尿蛋白的检测

采集PNS活动期组患者24h尿液, 混匀, 记录尿量, 使用分析仪测定24h尿蛋白定量。

1.4 统计学分析

运用SPSS 17.0软件进行分析, 计量资料采用均数±标准差表示, 组间比较采用t检验;相关性分析采用Pearson相关分析, P<0.05有统计学差异。

2 结果

2.1 各组尿Nephrin分子水平测定结果的比较活动期组患者尿Nephrin分子水平13.84±1.27ng/m L, 完全缓解期组12.24±1.01ng/m L, 对照组7.96±0.96ng/m L。活动期组患者尿Nephrin分子水平明显高于完全缓解组, 具有显著统计学差异 (P<0.05) ;同对照组相比, 活动期组尿Nephrin分子水平也明显升高, 有显著统计学差异 (P<0.05) ;缓解组同对照组相比, 尿足细胞Nephrin分子水平明显高于正常对照组, 差异有显著统计学意义 (P<0.05) 。见附表。

注:△△与对照组相比P<0.05;##与缓解组相比P<0.05

2.2 活动期组尿Nephrin与同期24h尿蛋白水平的相关性活动期组尿足细胞Nephrin水平与同期24h尿蛋白水平无相关性 (r=￣0.105, P>0.05) 。

3 讨论

足细胞起源于间叶细胞, 是肾小囊脏层上皮细胞, 主要通过稀疏的足突附于肾小球基底膜的外侧, 是肾小球电荷屏障的重要组分之一。有研究证实, 足细胞的损伤程度是PNS尿蛋白产生和疾病进展的关键细胞[6]。足细胞可以表达多种裂隙膜蛋白分子, 包括Nephrin、PCX等。近年来, 国内外研究肾小球足细胞Nephrin已成为众多学者研究的热点。Nephrin属于免疫球蛋白超家族, 是足细胞裂孔隔膜上的关键蛋白分子, 具有传导信号和粘附的作用。Nephrin是最先发现的裂隙膜分子, 可成为足细胞损伤的早期标记, 研究表明Nephrin的减少与蛋白尿的产生和肾脏病变密切相关[7~9]。通过取肾组织采用Realtime PCR检测肾小球足细胞Nephrin的表达, 结果发现PNS患者肾小球中Nephrin的表达明显减少[10]。但目前尚未有关于尿足细胞Nephrin蛋白分子在原发性肾病综合征患者中的测定。所以, 本实验主要通过测定尿足细胞Nephrin蛋白分子在原发性肾病综合征中的水平, 评估尿足细胞Nephrin蛋白分子是否能成为诊断PNS疾病活动的一项指标, 以及判断PNS患者临床治疗和预后是否有一定的临床意义。

本研究结果发现, 疾病活动期和缓解期的PNS患者尿Nephrin蛋白分子水平均高于正常健康对照组, 疾病活动期患者尿Nephrin蛋白分子水平明显高于疾病缓解期, 说明足细胞损伤在活动期更严重。本研究中未发现活动期患者尿Nephrin分子水平与24h尿蛋白水平有相关性 (P>0.05) , 可能因本实验研究样本量小, 需要更多病例的研究。

综上所述, PNS是常见的原发性性肾小球疾病, 足细胞损伤、脱落参与了发病过程。动态监测尿足细胞Nephrin蛋白分子排泄可作为临床评估PNS病情进展及预后一项较好指标, 同时尿足细胞Nephrin蛋白分子的检测对于一些不愿行肾穿刺活检术的患者具有简便、无创伤性的特点, 有助于临床应用。

参考文献

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[10]史秀岩, 张春.CD2相关蛋白在肾病综合征中的表达及意义[J], 临床与实验病理学杂志, 2012, 28 (5) :490.

足细胞分子 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年5~12月于河南中医学院第一附属医院儿科住院的40例HSPN患儿及同一时期的20名健康献血儿童作为研究对象。HSPN患儿符合临床HSPN诊断标准, 临床分型属血尿及蛋白尿型, 其中男23例, 女17例, 年龄6~13岁, 平均 (9.15±2.94) 岁。除外系统性红斑狼疮、乙型病毒性肝炎等其他疾患。健康儿童献血者纳入健康儿童组, 男8例, 女12例, 年龄5~11岁, 平均 (8.12±2.35) 岁。近1个月无呼吸道、胃肠道等黏膜感染史, 肝肾功能正常, 无镜下血尿和蛋白尿。两组儿童性别、年龄比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 主要试剂及材料

Agarose-Jacalin亲和填料购自Invitrogen公司, 蜜二糖购自Aladdin公司, 50 k D/2 m L超滤离心管购自Pall公司, 胎牛血清 (FBS) 及RPMI1640均购自Gibco公司, 噻唑蓝 (MTT) 购自Solarbio公司, 小鼠TNF-α定量酶联检测试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 血清Ig A1的分离、纯化及鉴定

抽取患儿及健康儿童静脉血5 m L, 室温下静置30 min后3000 r/min离心15 min, 收集血清于-70℃冻存备用。采用Jacalin亲和层析联合Superdex-200分子筛层析法将血清纯化、分离得到Ig A1, 并将单聚体Ig A1 (monomeric I-g A1, m Ig A1) 热聚合为热聚合Ig A1 (aggregated Ig A1, a Ig A1) [10]。

1.3.2 小鼠永生化足细胞 (MPC) 的培养

MPC细胞株由南京军区总医院刘志红院士惠赠。MPC细胞株培养增殖期用含10%FBS、100 U/m L小鼠γ-干扰素的RPMI 1640的完全培养基培养, 培养条件为33℃、95%空气和5%CO2的细胞培养箱, 传代后改用含10%FBS的RPMI 1640不含小鼠干扰素-γ完全培养基培养, 培养条件为37℃、95%空气和5%CO2的细胞培养箱, 每2~3天换液1次, 培养10~14 d使其分化成熟。

1.3.3 a Ig A1-MES上清液的制备

用含0.5%FBS的RPMI1640培养基稀释的终浓度为50、100、250μg/m L的HSPN患儿a Ig A1刺激系膜细胞48 h, 收集3种浓度的上清液作为a Ig A1-MES上清组并保存于-70℃备用。

1.3.4足细胞增殖的MTT测定

将分化成熟的MPC细胞用含5%FBS的RPMI1640培养基浓度稀释为5.0×104/m L, 按每孔5000个、体积200μL接种于96孔培养板中, 置于条件为37℃、95%空气和5%CO2的细胞培养箱培养。待细胞贴壁后以含0.5%FBS的RPMI1640培养基培养细胞18~24 h, 使细胞同步化于G0期。用以含0.5%FBS的RPMI1640培养基稀释的终浓度为0、50、250μg/m L HSPN组和健康儿童组a Ig A1以及三种浓度a Ig A1-MES上清组刺激足细胞24 h和48 h, 设一组用含0.5%FBS的RPMI1640且不含刺激物的培养基培养为阴性对照组, 另设一组用含10%FBS的RPMI1640培养基培养为阳性对照组。在刺激结束前4 h, 于每孔中加入20μL浓度为5 mg/m L的MTT溶液, 继续孵育4 h后终止培养。弃去上清液, 每孔中加入150μL DMSO吹打后, 摇床上震荡10 min, 使结晶充分溶解。酶标仪上检测每孔OD值, 波长设为492 nm, 以无细胞只加0.5%FBS的RP-MI1640培养基的溶液为基准调零。

1.3.5 TNF-α分泌水平的测定

采用以含0.5%FBS的RPMI1640培养基稀释的a Ig A1终浓度为50、100、250μg/m L HSP组、健康儿童组a Ig A1以及三种浓度刺激足细胞48 h的Na Ig A1-MES上清组, 收集各组上清液保存于-70℃备用。采用酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 测定。实验前从冰箱中取出样品及酶联检测试剂盒及待测上清液平衡至室温。参照小鼠TNF-α定量酶联检测试剂盒说明书建立标准曲线并进行样本检测, 每个样本设5个复孔, 酶标仪测量波长为450 nm, 根据待查样本OD值在标准曲线中查出TNF-α含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 ( ±s) 表示, 对正态分布数据, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验, 若方差不齐, 采用Games-Howell检验, 对偏态分布数据, 采用非参数检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度a Ig A1-MES上清组、HSPN组及健康儿童组a Ig A1对足细胞增殖的影响

24 h MTT结果显示, 三种a Ig A1浓度下HSPN组和健康儿童组足细胞OD值与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) ;a Ig A1-MES上清组100、250μg/m L a Ig A1浓度下足细胞增殖OD值与阴性对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 足细胞增殖受到抑制;a Ig A1-MES上清组在100、250μg/m L两种a Ig A1浓度下足细胞OD值与HSPN组及健康儿童组比较, 足细胞增殖受到明显抑制 (P<0.05) 。见表1、图1。

注:P值均为与阴性对照组比较;“-”表示无数据;MTT:噻唑蓝;HSPN:过敏性紫癜性肾炎

与阴性对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;HSPN:过敏性紫癜性肾炎

48 h MTT结果显示, 三种浓度的a Ig A1-MES上清组OD值与阴性对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 足细胞增殖受抑制, 且随a Ig A1浓度增高, 足细胞增殖受抑制越明显;三种浓度的HSPN组和健康儿童组OD值与阴性对照组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。a Ig A1-MES上清组在三种a Ig A1浓度下的OD值与HSPN组及健康儿童组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 足细胞增殖均明显受抑制。见表2、图2。

2.2 不同浓度a Ig A1-MES上清组、HSPN组及健康儿童组a Ig A1对足细胞分泌TNF-α水平的影响

48 h后各组上清液中TNF-α含量结果显示, a Ig A1-MES上清组TNF-α含量明显高于阴性对照组, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) , 且随Ig A1浓度升高TNF-α含量越高;三种浓度的HSPN组及健康儿童组TNF-α含量与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) 。见图3。

注:P值均为与阴性对照组比较;“-”表示无数据;MTT:噻唑蓝;HSPN:过敏性紫癜性肾炎

与阴性对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;HSPN:过敏性紫癜性肾炎

与阴性对照组比较, **P<0.01;HSPN:过敏性紫癜性肾炎;TNF-α:肿瘤坏死因子

3 讨论

目前研究报道已经证实, 异常糖基化的Ig A1与HSPN的发病密切相关, HSPN患者血清中聚合的I g A1可引起系膜细胞损伤, 造成系膜细胞增生、多种炎症因子分泌增加国内外均有较多报道。在获得性肾小球疾病中足细胞多表现为数量的减少及结构的破坏, 从而产生蛋白尿[11]。在HSPN患者中病理表现中常伴有足细胞肿胀、脱落, 足突融合, 但是Ig A1究竟以何种方式作用于肾小球足细胞导致细胞损伤, 现今未见报道。近年来国内外学者在有关Ig A肾病 (Ig AN) 发病机制的研究中发现, 致病的Ig A1不能直接作用于足细胞, 而是通过系膜细胞-足细胞轴作用引起足细胞损伤的一系列改变, 产生大量蛋白尿[12]。用Ig AN患者血清中异常糖基化的Ig A1与系膜细胞共培养上清可以诱导足细胞的凋亡并刺激足细胞分泌TNF-α增加, 从而造成足细胞损伤[13,14,15,16]。既往研究发现, HSPN与Ig AN在免疫机制改变上尤其是Ig A的致病机制上非常相似, 那么是否Ig A1在HSPN的损伤机制中也是通过系膜细胞-足细胞轴作用造成足细胞损伤, 有待进一步研究。

本研究通过不同浓度的HSPN及健康儿童的a Ig A1刺激足细胞的MTT增殖实验结果发现, 在0~250μg/m L浓度范围内, 不论是HSPN患儿还是健康儿童的a Ig A1对足细胞的增殖不能产生影响, 说明在这一浓度范围内a Ig A1不能直接对足细胞的增殖产生影响, 这与Lai等[9]报道的足细胞上没有Ig A受体相符合。而本研究采用a Ig A1与系膜细胞共培养的上清刺激足细胞的MTT增殖实验结果发现, a Ig A1-MES上清可以导致足细胞的增殖受到抑制, 且这一结果随刺激时间的增加和a Ig A1浓度的增加更加明显。本研究通过ELISA的方法检测不同浓度HSPN及健康儿童两种a Ig A1刺激足细胞48 h分泌的TNF-α的含量变化的结果发现, 不论是HSPN还是健康儿童的a Ig A1均不能刺激足细胞分泌更多的TNF-α, 说明用a Ig A1不能直接诱导足细胞分泌、合成更多的TNF-α。而本研究检测a Ig A1-MES上清培养48 h后的足细胞上清液中TNF-α含量结果发现, 三种浓度的上清组中TNF-α浓度均明显升高, 说明a Ig A1与系膜细胞共培养上清可以诱导足细胞分泌更多TNF-α, 且随a Ig A1刺激浓度的升高TNF-ɑ的浓度升高更明显。

大鼠足细胞原代培养及观察 篇3

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用清洁级SD大鼠幼仔, 雌雄不限, 由第三军医大学实验动物中心提供种鼠, 遵义医学院医学与生物学研究中心动物室屏障环境繁育。

1.2 主要仪器与试剂

Olympus IX71倒置相差显微镜, Leica DM2500细胞图像分析系统, 60、100目不锈钢细胞筛网购自上海生工。DMEM、RPMI-1640培养基由Hyclone公司提供, 胎牛血清 (FBS) 购自Gibco, 青链霉素、胰蛋白酶购自Solarbio, 兔抗大鼠Nephrin多克隆抗体由Santa cruz公司提供, 多聚体抗兔Ig G-HRP两步法免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德 (BOSTER) 公司。考马斯亮蓝R250、HE染色液由Beyotime公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 鼠尾胶原的制备

取SD大鼠鼠尾洗净, 75%乙醇浸泡5~10 min;剪开鼠尾, 无菌条件下抽出银色的鼠尾腱, 充分剪碎, 以每克鼠尾腱50 m L的比例加入0.1%醋酸溶液, 4℃软化1周;4000 r/min, 离心10~15 min, 吸取上清, 分装成小瓶, -20℃储存。

1.3.2 动物消毒与取材

用37℃双蒸水清洗幼鼠两次, 75%酒精浸泡消毒5~10 min, 颈椎脱臼处死, 无菌下开腹取肾, 放入冰浴含有双抗PBS的15 m L离心管中, 置于超净台。

1.3.3 足细胞的分离和培养

参照Lan等[5]肾小球培养法, 用含有双抗的PBS冲洗肾组织3次, 将肾转移到无菌培养皿中, 用眼科镊、眼科剪尽可能去除肾表面的筋膜及肾蒂的血管和脂肪组织, 转入新的无菌培养皿充分剪碎成1 mm3大小, PBS冲洗、吹打、静置、丢弃漂浮物, 重复2次。将剪碎的肾组织块转入小的无菌锥形瓶中, 加入不含血清的1640培养基、0.2%胰蛋白酶各5 m L, 37℃孵育10~15 min (期间每3分钟摇动1次) ;消化完成后加含胎牛血清的培养基终止消化, 将细胞悬液和没有消化完全的组织块经60目、100目细胞筛过滤, 用20 m L注射器内塞, 在细胞筛上轻柔研磨, 使组织块内肾小球与肾小囊分离并促进肾小球滤过细胞筛, 用1640培养基冲洗细胞筛, 收集滤液, 1 200 r/min离心5 min, 弃除上清液, 在沉淀中加入2 m L DMEM生长培养基重悬, 接种到鼠尾胶原蛋白包被的25 cm2培养瓶。培养条件:DMEM高糖培养基 (10%FBS、青链霉素100 U/m L) , 37℃、5%CO2及饱和湿度。培养6 h后补加2 m L DMEM生长培养基, 置于孵育箱培养3 d后第一次换液, 首次换液后续培养改用1640培养基 (5%FBS) , 以后每48小时换液, 倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况。

1.3.4 足细胞的传代培养

待细胞生长8 d左右汇合度达70%~80%, 用0.25%胰蛋白酶充分消化5min, 以1:2比例传代培养, 每2天换液1次, 倒置显微镜下观察。

1.3.5 大鼠足细胞的鉴定

取传代培养7 d的细胞, 用PBS洗净培养基, 4%多聚甲醛室温固定15 min, 蒸馏水冲洗;3%H2O21份+纯甲醇4份混合30 min, 蒸馏水冲洗;5%BSA封闭液37℃30 min, 甩去多余液体, 不洗;滴加稀释的一抗, 4℃过夜, PBS冲洗;滴加相应聚合HRP标记抗兔Ig G, 37℃30 min, PBS冲洗;滴加DAB显色液显色, 镜下控制反应时间, 必要时可用苏木素复染;脱水、透明、封片。PBS代替一抗做阴性对照。结果判定:以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性染色。

1.3.6 大鼠足细胞形态观察

第一次换液培养后每天跟踪观察足细胞的形态变化, 选取原代培养第3天、第8天和传代培养的足细胞显微镜下观察拍照, 挑选传代培养的足细胞HE染色观察。将培养的足细胞种植于盖玻片上, 生长密度达60%~70%时, 用1%Triton X-100室温下处理细胞爬片25~30 min, 4%多聚甲醛固定10 min, 0.2%考马斯亮蓝R250染色30 min, 封片镜下观察微丝。

2 结果

2.1 肾小球的分离及培养

从大鼠肾脏分离的肾小球呈球形细胞团, 镜下折光性好, 受机械研磨作用多数肾小球脱离肾小囊, 视野中肾小球较多, 基本未见肾小管。经组织块培养法种植肾小球3 d后, 大部分肾小球已贴壁, 有囊肾小球组织周围有细胞爬出且数量逐渐增多呈铺路石样排列的细胞集落, 并有少量大的树枝状细胞分布在细胞集落外围 (图1A) 。无囊肾小球周围爬出的细胞呈树枝样, 排列不规则 (图1B) 。

2.2 肾小球足细胞的免疫组化鉴定

经间接免疫细胞化学染色, 传代培养的细胞Nephrin蛋白呈阳性表达, 部分足细胞的阳性染色颗粒位于核周及细胞质, 部分足细胞的阳性染色颗粒分布于核周及细胞膜 (图2A、2B) 。以PBS代替Nephrin抗体作为一抗的免疫组化染色足细胞显示为阴性。

2.3 肾小球足细胞的形态学观察

肾小球周围生长活跃的足细胞集落细胞体积中等, 胞体呈多边形, 无突起伸出, 细胞排列有序, 呈鹅卵石样外观 (图3A、3B) 。消化传代后的足细胞继续生长, 细胞体和细胞核较去分化状态明显增大, 自细胞体伸出多条树枝样突起, 可见双核, HE染色可清晰观察到相邻细胞间突起形成连接 (图4) 。传代7d后大部分细胞呈完全分化状态。传代培养的足细胞经Triton-100抽提, 考马斯亮蓝染色后, 显微镜下观察清晰可见大鼠足细胞胞质充满染成蓝色的由微丝组成的应力纤维 (图5) 。

A:有囊肾小球培养的足细胞原代培养第3天 (×200) ;B:无囊肾小球培养的足细胞原代培养第3天 (×200)

A.足细胞显棕色颗粒 (×100) ;B.足细胞显棕色颗粒 (×200)

A.原代培养第4天 (×200) ;B.原代培养第8天 (×200)

3 讨论

足细胞的体外培养一直广受学者关注, 近年来已有一些足细胞株的建立, 特别是人、小鼠永生足细胞株的成功构建, 极大地加快了足细胞的研究进程。然而, 这些细胞株经过不同程度的基因改造, 与体内足细胞尚存在差异。相比之下, 原代培养的足细胞更接近活体足细胞的生物学特性, 可联合永生细胞株更完善地研究足细胞[6]。

原代足细胞生长的关键是肾小球的分离和贴壁, 贴壁肾小球的数量越多, 足细胞爬出的总量越多。本实验在采用Lan等肾小球培养法的基础上, 用20 m L注射器内塞轻轻碾压肾组织, 使肾小球与肾小囊分离, 同时用不含血清的1640培养基冲洗, 促进肾小球从细胞筛上洗脱过滤。为降低胰酶消化对细胞的影响, 采用鼠尾胶原包被培养瓶, 促进肾小球更好地贴壁。关于促进足细胞从肾小球爬出的手段, 许多学者建议采用胶原酶、胰酶、脱氧核糖核酸酶进行肾小球消化, 然而有些学者提出, 酶消化的浓度、时间难以掌控, 不利于肾小球贴壁, 可能过度消化足细胞, 不利于足细胞生长, 故不推荐酶消化分离足细胞[7]。综合上述因素, 本实验采用低浓度胰蛋白酶较短时间消化幼龄大鼠肾组织, 并采用鼠尾胶原包被培养瓶, 在促进肾小球贴壁的同时, 防止足细胞的过度消化, 有利于足细胞从肾小球爬出。采用普通的DMEM和1640培养基, 没有添加胰岛素转铁蛋白和亚硒酸钠, 细胞生长良好。

为获得纯度较高的足细胞, 要选择合适的首次传代时机。最先从肾小球爬出来的细胞为毛细血管内皮细胞, 由于内皮细胞需要特异的血管内皮生长因子才能存活[8], 否则培养1~2 d后内皮细胞大量死亡。随后爬出来的是足细胞, 培养第3天后首次换液即可见到肾小球周围有足细胞生长, 一般7~10 d为足细胞的优势生长期, 有文献报道第7天即有系膜细胞从肾小球爬出, 若不消化传代, 最终系膜细胞将取代足细胞[9]。本研究选择第8天开始传代, 此时细胞生长密度达到70%~80%, 达到了合适的细胞数量, 避免了杂细胞的污染, 特异性Nephrin蛋白免疫细胞化学染色进一步证实所获细胞95%以上为足细胞。Nephrin蛋白是一种跨膜蛋白, 属于免疫球蛋白超家族成员, 特异表达于足细胞, 对维持足细胞足突的完整性具有重要作用

本实验观察到从肾小球爬出的足细胞有3种形态, 其进一步分化及成熟定位有待证实。无囊肾小球中爬出的细胞多呈分支状, 文献报道其与体内足细胞表型相同, 为足细胞来源;从有囊肾小球中爬出的细胞表现出两种明显不同的细胞形态, 一种位于细胞集落的周边, 细胞体积大且呈不规则形, 另一种位于细胞集落中心, 呈多边形铺路石样的细胞;文献报道前者为壁层上皮细胞, 后者为不同分化状态的足细胞[3]。

有文献报道在大鼠足细胞系和SV40转化的人足细胞系中, 增殖态细胞胞体较小, 呈鹅卵石样, 分化态细胞为星形、胞体大, 且有突起伸出。本实验中观察到原代培养中细胞呈鹅卵石样, 传代后培养, 形态发生改变, 呈胞体大、有突起的星形细胞, 这与文献报道相一致[10]。

综上所述, 本实验成功建立了大鼠足细胞原代培养方法, 简单实用, 比永生化足细胞系具有成本低, 实用性强, 无需特殊试剂和仪器, 无外源基因影响的优点, 在一定程度上弥补了永生足细胞株的不足, 可用作普通实验平台的肾病研究。

参考文献

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[9]潘晓勤, 王晓燕.肾小球系膜细胞培养及鉴定[D].南京医科大学学报:自然科学版, 1995.

足细胞分子 篇4

1材料和方法

1.1 材料

足细胞:由英国Bristol大学Saleem教授赠送; 10%的胎牛血清、杭州四季青生物有限公司;RPMI1640培养液及1%ITS (胰岛素10μg/ml、转铁蛋白5.5μg/ml、亚硒酸钠5ng/ml) :美国Sigma公司;血管紧张素II:美国Anaspec公司;PCR反应体系试剂:上海生物工程有限公司;黄芪注射液:购自大理药业有限公司。

1.2 足细胞培养

培养基为RPMI1640培养液, 含10%的胎牛血清, 1%ITS;在33℃、5%CO2培养箱中传代增殖, 细胞成鹅卵石状, 之后转入37℃、5%CO2培养箱中两周, 使其分化成熟为树枝状时接种于25cm2的培养瓶中, 待细胞生长至80%融合, 无血清同步12小时后进行实验。

1.3 实验分组

1.3.1 AngII浓度梯度对人足细胞IV胶原基因表达的影响

干预细胞各组中分别加入AngII, 其终浓度是0、10-9、10-8、10-7mol/L, 培养24小时后收集细胞实验。

1.3.2 黄芪注射液对AngII刺激人足细胞IV胶原基因表达的影响

正常组, AngII组 (10-7mol/L) , AngII (10-7mol/L) +黄芪小剂量 (10g/L) 组, AngII (10-7mol/L) +黄芪中剂量 (100g/L) 组, AngII (10-7mol/L) +黄芪大剂量 (200g/L) 组, 培养24小时后收集细胞实验。

1.4 IV胶原mRNA的检测

逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 。

1.4.1 总RNA提取 弃细胞培养上清液, 用PBS洗涤3遍, 弃PBS后, 每50ml培养瓶加入1mlTrizol, 移液枪吹打瓶底使细胞脱落转移到1.5ml Eppendorf管中, 振荡仪上剧烈振荡20秒, 加入200μl氯仿, 剧烈振荡混匀30秒, 冰上放置5分钟后, 12000r/min, 4℃离心25分钟, 将上清液小心转移到无RNase的1.5ml离心管中, 加入与上清等体积的异丙醇, 振荡混匀, 冰上放置15分钟, 12000r/min, 4℃离心10分钟, 小心弃去上清, 留下白色RNA沉淀, 70%乙醇1ml洗涤2次, 放在室温下将酒精空干, 沉淀用50μl DEPC-H2O溶解。

1.4.2 RT 用紫外分光光度计检测总RNA浓度, 将总RNA浓度用DEPC-H2O稀释到0.21μg/μl, 65℃温育5分钟, 取10μl加入TP5×4.0μl, dNTP2.0μl, Oligo (dT) 181.0μl, RNase Inhibitor1.0μl, Reverse1.0μl DEPC-H2O1.0μl, 37℃温育60分钟, 95℃温育5分钟。

1.4.3 PCR 取1.0μl加入10×Buffer2.5μl, MgCl21.5μl, dNTP0.5μl, 上下游引物各1.0μl (IV胶原266bp5′-CTGGGTGGCGGAGTTTGT-3′, 5′-GATGTGCGTGCGGATGAG-3′;GAPDH255bp5′-TACTAGACAAGATGGTGAAG-3′, 5′-TGACGGGATCTCGTCCCTGGAAGAT-3′, 上海生工) , Taq酶0.5μl, DEPC-H2O18μl。放入PCR仪扩增: (1) 95℃5分钟。 (2) 95℃30秒, 60℃30秒, 72℃60秒, 35个循环。 (3) 72℃退火10分钟。扩增产物在1.7%的琼脂糖凝胶中电泳, 紫外凝胶成像并分析。重复3次RT-PCR过程。

1.5 统计分析

实验数据以均数±标准差 (x±s) 表示, 采用SPSS11.5医学统计软件, 对实验数据进行单因素方差分析。

2结果

2.1 不同浓度AngII对足细胞IV胶原mRNA表达的影响 见表1。

与空白组比较*P<0.05, **P<0.01

2.2 黄芪对AngII刺激足细胞分泌IV胶原的干预作用 见表2。

与AngII组比较*P<0.05**P<0.01

3讨论

IV胶原是哺乳动物基膜的最基本成分, 在肾脏肾小球基底膜 (GBM) 中含量最丰富, IV胶原由足细胞分泌至细胞外后, 自我结合形成多边形IV胶原网, 再与层粘连蛋白、巢蛋白、蛋白聚糖和其他糖蛋白一起形成基底膜[1]。IV胶原分泌的异常或因基因突变引起表达的异常将直接导致肾脏病的发生。

肾脏局部的肾素血管紧张素系统 (Renin-Angiotension System, RAS) 在慢性肾脏病变的发生发展中的重要作用越来越受到人们的关注, RAS的主要效应因子血管紧张素II (AngII) 与许多肾脏疾病的发展过程密切相关。研究表明[2], AngII可以通过促进生长作用、激活炎症细胞、影响代谢等作用促进肾脏细胞外基质积聚, 引起肾小球硬化和间质纤维化。Chen S[3]等人研究证实, 血管紧张素II可以通过TGF-β和血管内皮生长因子信号途径刺激小鼠肾脏足细胞分泌IV胶原α3链, 引起肾小球硬化。

黄芪是治疗慢性肾病的常用药物, 有显著的免疫调节活性和抗氧化作用。近年的临床研究表明, 黄芪具有利尿消肿、减少尿蛋白、调节免疫、稳定肾功能等作用[4]。动物实验证明, 黄芪可降低链脲佐菌素致糖尿病大鼠尿蛋白的排出, 并可抑制肾肥大, 减轻肾小球基底膜增厚, 降低糖尿病大鼠肾皮质IV型胶原和TGF-β1的表达[5,6]。笔者前期实验证实黄芪对AngII诱导的足细胞分泌VEGF (血管内皮细胞生长因子) 有明显抑制作用[7]。本研究表明黄芪可以明显抑制血管紧张素II引起的肾足细胞IV胶原表达上升, 推测黄芪可以通过降低足细胞IV胶原表达, 而减少细胞外基质的积聚, 延缓肾小球硬化及慢性肾脏病的发展, 为黄芪的临床应用提供了进一步的理论依据, 但是黄芪通过何种途径减低足细胞IV胶原表达, 还有待继续研究。

参考文献

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[6]徐郁杰, 张庆怡, 陆敏, 等.黄芪对糖尿病大鼠肾皮质TGF-β表达的影响.中华内分泌代谢杂志, 1998, 14 (5) :312.

足细胞分子 篇5

1 资料与方法

1.1 研究对象

我科收治的41例按世界卫生组织1982年诊断标准确诊的Ig A肾病患者,男性31例,女性10例,平均年龄(24.9±10.9)岁。所有患者除外紫癜性肾炎、乙肝病毒相关性肾炎和狼疮性肾炎等继发性疾病,以及肿瘤切除后远离瘤体的正常肾组织(6例)。41例患者均行经皮肾活检术,肾活检组织学经升汞-苦味酸固定,切片厚度2μm,分别行HE、PAS、PASM和Masson染色。由病理医师在单盲情况下观察病理形态学改变。Ig A肾病的肾组织病变在光镜下按LEE等[4]组织学改变分为I~V级,其中I~III级24例,IV~V级17例。详细收集所有患者肾活检时血压、24 h尿蛋白定量及肾功能等临床资料。

1.2 免疫组织化学染色

小鼠抗人WT1单克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品)、PV-9000(北京中山第2代通用型2步法检测)试剂盒购自北京中山生物技术工程公司。所有患者肾活检组织经丙酮固定,3μm石腊切片常规脱蜡水化后,3%过氧化氢灭活,胃蛋白酶抗原修复后,加入稀释的一抗(1∶400)。4℃过夜后,再加入2抗试剂A。37℃孵育20 min后,再加入2抗试剂B。37℃孵育30 min,二氨基联苯胺(DAB)发色5~7min。苏木素复染后,脱水、透明并封片。每组染色设以PBS液替代一抗的阴性对照。免疫组织化学染色:3μm石腊切片常规脱蜡水化后,3%过氧化氢灭活。0.05%胰酶37℃抗原修复10 min后,血清封闭20 min(室温)。加入兔抗人VEGF多抗(购自美国Santa Cruz公司)(1∶50),4℃孵育过夜。次日用PBS漂洗后,加入生物素标记的山羊抗兔Ig G抗体(购自北京中山生物技术公司),室温孵育20 min。PBS漂洗后,加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素(购自北京中山生物技术公司)室温孵育20 min。DAB-H2O2显色,苏木素复染后,脱水、透明并封片。空白对照片不加一抗,其余步骤同上。

1.3 计算机图像分析

足细胞缺失定量分析采用IMS-2000分析软件,分别测量10个非硬化肾小球总面积及每个肾小球内WT1阳性细胞所占的面积,根据每个肾小球WT1阳性细胞所占面积比,计算出足细胞密度并取其平均值[5]。在400倍视野下,每例随机选取10个肾小球计算VEGF阳性面积占肾小球面积的百分比,取其均值作为表达指标。

1.4 肾小球系膜增殖和肾小球硬化程度判定

在光学显微镜计算机图像分析系统屏幕上,计算每例正切肾小球中系膜增殖或肾小球硬化面积与肾小球总面积的百分比;再按照OKADA等[6]介绍的方法进行评分。病变累及肾小球面积小于30%者为1分,30%~60%者为2分,大于60%者为3分;取其平均值作为每例患者肾小球病变的平均值。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理,计量资料数值以均数±标准差表示,组间比较采用t检验和直线相关分析方法。P<0.05代表差异有显著性。

2 结果

2.1

I~III级组与IV~V级组患者在性别上无显著差异,IV~V级组患者的平均年龄高于I~III级组患者,另外两组血清肌酐也存在显著差异,蛋白尿则无明显差别(表1)。病理资料分析显示,I~III级组在系膜的增殖程度、肾小球硬化程度与IV~V级组患者也有显著差异(表2)。

注:1)P<0.05;2)P<0.01

随着病变加重,硬化肾小球增加,足细胞数目减少也增多。IV~V级组患者(见附图A)与I~III级组患者比较足细胞数目减少及肾小球内VEGF的表达(见附图B)均有显著性差异(表2)。

注:1)P<0.05;2)P<0.01

2.2 免疫组织化学结果与临床病理指标的相关分析

Ig A肾病患者足细胞病变与肾小球内VEGF的表达呈正相关性(r=0.575,P<0.05),Ig A肾病患者足细胞病变与收缩压、舒张压及24 h尿蛋白定量无显著相关性,但与血清肌酐、肾小球硬化呈正相关性(r=0.776,P<0.01,r=0.658,P<0.01)。在I~III级病变组,肾小球内VEGF的表达与患者24 h尿蛋白定量呈正相关(r=0.558,P<0.05),在IV~V级病变组则无相关性;肾小球内VEGF的表达与收缩压、舒张压及血清肌酐无显著相关性,但与系膜细胞增殖程度呈正相关(r=0.714,P<0.01),与肾小球硬化呈负相关(r=-0.669,P<0.01)。

3 讨论

VEGF是一种促进血管内皮生长及渗透的特异细胞因子,通过受体flk-1和flk-2发挥作用。成人肾组织VEGF主要表达于肾小球脏层上皮细胞(足细胞),并以VEGF165为主[7]。本研究发现,Ig A肾病患者足细胞病变与肾小球内VEGF的表达呈正相关性,FOSTER等[8]发现,正常肾小球中足细胞分泌的VEGF通过自分泌调节足细胞钙离子平衡,降低足细胞细胞毒性,进而提高足细胞存活率。病理情况下,VEGF可介导单核吞噬细胞的趋化或活化,进而产生大量毒性的促生长物质,如蛋白水解酶、细胞因子、活性氧簇(ROS)、环氧合酶及脂氧合酶产物、血小板活化因子和生长因子等而引起足细胞损伤[9]。足细胞产生VEGF,以旁分泌形式结合于表达VEGF受体的小球内皮,参与局部调节,两种细胞互相作用使GBM保持完整性和正常功能。在重度Ig A肾病患者的肾小球内,VEGF表达反而减少,这可能与重度病变时肾小球系膜硬化加重导致脏层上皮细胞损伤有关。

本研究发现,I~III级病变组肾小球内VEGF的表达与患者24 h尿蛋白定量呈正相关。VEGF能够减少肾小球基底膜阴离子数目,诱导肾小球内皮细胞的小窗形成,可能同时影响肾小球基底膜的电荷屏障及机械屏障,故VEGF分泌的异常增加可以导致肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增高,导致蛋白尿。在IV~V级病变组则无相关性,可能是重度病变肾小球脏层上皮细胞损伤导致屏障破坏的结果[10]。对糖尿病动物模型的研究发现,高糖环境下足细胞受损,VEGF表达增加,尿蛋白排泄升高,细胞外基质沉积增多,单核巨噬细胞明显浸润,促进了局灶性节段性硬化的发生[11,12]。有研究证实,体外培养的人系膜细胞上有VEGF受体,VEGF可通过激活MAP激酶促使系膜细胞胶原合成增加。本研究发现,肾小球内VEGF的表达与系膜细胞增殖程度呈正相关(r=0.714,P<0.01),与肾小球硬化呈负相关(r=-0.669,P<0.01)。可能与肾小球VEGF增多并通过旁分泌途径刺激系膜细胞分泌细胞外基质,进而参与肾小球硬化有关。

本文通过对Ig A肾病足细胞损伤中的血管内皮生长因子表达的研究,表明两者互相作用可保持GBM完整性和正常功能,在Ig A肾病进展过程中起重要作用,如增加微血管通透性、促进蛋白尿形成、诱导细胞外基质合成及促进肾小球局灶节段性硬化等。通过干扰VEGF与足细胞的相互作用,可能会减轻Ig A肾病肾脏损伤,并为Ig A肾病治疗开辟新的途径。

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足细胞分子 篇6

1 材料与方法

1.1 对象

132例患者均为我院2008年2月至2010年9月在广州市海珠区第一人民医院住院和门诊患者, 其中男78例, 年龄48～73岁, 女54例, 年龄48～65岁, 其中高血压, 糖尿病 (DM) 、糖尿病肾病 (DN) 、慢性肾小球肾炎、肾病综合征患者分别23例、51例、36例、13例、9例。21例正常对照为2008年5～10月在广州市海珠区第一人民医院健康体检人群, 年龄46～62岁, 均排除肾脏和心血管方面的疾病。各检测标本按实验要求留取。

注:与正常对照组比较, ▲P<0.05表示有显著性差异, ▲▲P<0.001表示有极显著性差异

1.2 试剂和方法

胱抑素C (Cys C) 、血清肌酐 (SCr) 、血清尿素氮 (BUN) β2微球蛋白 (β2-MG) 等试剂由利德曼公司提供, 足细胞标志蛋白podocalyxin采用广东虹业抗体科技有限公司的免疫比浊法试剂, 实验对象血标本均早上空腹采血, 离心后检测。尿液标本为中段晨尿, 按试剂说明书处理。以上各项检测指标参数均按照说明书设置。所用仪器为日本奥林巴斯AU400全自动生化分析仪。

1.3 统计学方法

运用SPSS10软件, 对实验数据进行统计学处理, 组间比较用t检验, P<0.05表示有显著性差异, P<0.001表示有极显著性差异。

2 结果

2.1 PCX和肾功能水平

见表1, 各组患者尿液中PCX与CysC、Cr、BUN、β2-MG水平呈正相关, 与对照组比较有显著性差异。在各组患者中, PCX水平以糖尿病肾病组最高。糖尿病肾病 (DN) 、慢性肾小球肾炎, 肾病综合征等组患者PCX水平与正常对照组比较有极显著性差异。

(%)

2.2 PCX和肾功能指标的异常检出率

见表2, 高血压和糖尿病 (DM) 、糖尿病肾病 (DN) 、慢性肾小球肾炎、肾病综合征等组患者PCX异常检出率分别为11.7%、18.2%、66.7%、100%、100%, 其中慢性肾小球肾炎组中PCX异常检出率明显高于其他肾功能指标。

3 讨论

肾脏层上皮细胞 (又称足细胞, podocyte) 、内皮细胞和肾小球基底膜 (GBM) 组成肾小球滤过膜, 足细胞是肾小球滤过膜的重要组成部分, 它在维持毛细血管撑的结构稳定、调节肾小球的滤过功能及GBM的代谢平衡中发挥重要作用[3]。正常人体肾脏内成熟的足细胞是一种终极分化的细胞, 在分化成熟后不再发生有丝分裂, 不具有增殖能力, 足细胞在各种致损伤因素的作用下可发生非形态学和形态学以及细胞骨架成分的变化, 而足细胞的损伤则导致基底膜裸露, 后者与壁层上皮细胞粘连形成节段硬化, 造成肾小球的不可逆性损伤[4], 从而发生肾小球性蛋白尿、血尿。尿蛋白是公认的与肾脏疾病进展相关的独立因素之一, 足细胞能摄取滤过的蛋白, 造成细胞结构和功能改变[5]。足细胞损伤后, 由早期的足突融合, 如足突回缩、整个足突消失, 发展至足细胞胞体缩小, 假囊形成, 阴离子电荷减少, 最终足细胞从GBM上分离、脱落到肾小囊中, 随尿液排出, 因而尿中足细胞检测阳性。研究表明当足细胞数减少10%～20%时, 即开始出现肾小球硬化过程[6]。

足细胞体伸出许多突起 (足突, foot process, FP) , 相邻足突经细胞结相连组成肾小球的裂隙膜, 裂隙膜由许多蛋白组成[6], 包括nephrin、podocalyxin、CD2AP[6]、ZO-1、FAT[6]、podocin[6]等。nephrin、podocin等蛋白在神经组织也表达, 特异性稍差, 而podocalyxin是足细胞中最特异的标志蛋白, 只存在于足细胞上, 且是足细胞表面的主要组成成分。podocalyxin与其他蛋白在足细胞表面形成阴离子外衣, 并通过电荷的相斥而维持足突相互分开, 控制足细胞裂孔的开放, 维持肾小球囊腔的空间结构和功能。研究表明, podocalyxin通过ezrin和NHERF2 (Na+/H+交换子调节子) 与细胞骨架肌动蛋白 (actin) 在足细胞顶膜区形成免疫共沉淀复合物, 与细胞骨架肌动蛋白等结构蛋白相连[6], 以识别浆膜上的一种多蛋白信号复合体, 调节足细胞和裂隙膜的结构。

血清胱氨酸蛋白酶抑制剂C (Cystatin C, Cys C) 是目前临床认为能准确反映GFR的可靠指标, 特别是能反映早期GFR障碍。Cys C是一个由122个氨基酸组成的小分子多肽, 是胱氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员之一, 具有半胱氨酸蛋白酶抑制物性质, 在所有的有核细胞稳定表达。Cys C几乎完全被肾小球滤过, 然后被肾小管吸收和降解。因此, 血浆或血清中的Cys C的浓度就由肾小球滤过率决定。但血清Cys C在早期肾脏损害的诊断方面也不过理想。因为, 只有在肾小球滤过功能受到一定程度的损害时, 血清Cys C含量才有明显的上升。

近几年的研究发现, 足细胞损伤和脱落是肾病最早期的病理改变。当糖尿病、高血压等疾病引起肾脏损伤时, 足细胞首当其冲, 开始表现为形态方面的改变, 如足突融合、收缩, 胞体缩小, 假囊肿形成等变化, 接着与血管基底膜剥离, 脱落至肾小囊中, 随尿液排出。足细胞脱落后, 血管基底膜裸露, 打破了毛细血管袢血压与肾小囊内静水压之间的平衡, 毛细血管扩张, 直至与肾小囊壁层细胞粘连。此外, 足细胞脱落后大量蛋白渗漏, 使毛细血管袢透明样变性, 这些因素都是最后导致肾小球硬化的关键[7]。最近几年大量的研究证实, 尿液中足细胞的出现是诊断早期微小病变和局灶性节段性肾小球硬化最有效的方法[7]。

在本文的结果中, 高血压与糖尿病组POX的异常检出率分别为11.7%和17.5%, 与其他肾功能指标比较未有明显变化, 但在水平上的变化却比其他指标显著, 说明POX在肾功能早期损害中, POX比较敏感。在糖尿病肾病 (DN) 、慢性肾小球肾炎, 肾病综合征等组患者中, POX的异常检出率分别为66.7%和100%, 100%。特别是慢性肾小球肾炎组, POX的异常检出率明显高于其他肾功能指标, 其水平升高也较明显。而在肾病综合征组中, 和指标的异常检出率都较高, 升高的水平方面, Cr和BUN的变化水平较大, 这说明Cr, BUN等指标在反映肾功能早期损害方面的敏感性较差, 只有在肾功能明显受损时才能有显著变化, 这和国内的一些报导相一致[7]。在各组结果中, 糖尿病肾病组的POX水平升高较明显, 糖尿病的病理特征是肾小球细胞外基质堆积, 系膜变宽, 基底膜变厚。肾小球基底膜成分改变及细胞外基质聚积是糖尿病肾病的关键性改变, 另外, 高血糖可能通过加速足细胞的分泌过程, 从而影响肾小球基底膜的正常结构, 在DN时足细胞脱落增加。因此, 在糖尿病肾病患者中, POX水平的变化较为明显。

综上所述, POX在诊断肾小球早期损害中是一项较为理想的指标, 同时, 由于POX是检测患者的尿液, 尿液本身受喝水, 运动和各种因素的影响较大, 在检测中应留意各种影响因素。

参考文献

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[2]李惊子, 黄海长, 刘颖, 等.检测尿足细胞在活动性肾小球疾病中的意义[J].北京大学学报 (医学版) , 2005, 37 (5) :463-466.

[3]成丽岚, 郑少雄.足细胞损伤与糖尿病肾病的研究进展[J].医学综述, 2008, 14 (3) :412-413.

[4]朱吉莉, 丁国华.蛋白尿形成相关足细胞的结构蛋白[J].国际泌尿系统杂志, 2006, 27 (7) :540-544.

[5]于宏, 朱元开, 杨颖, 等.成人微小病变肾病血管病变与足细胞排泄的关系[J].中国实用内科杂志, 2008, 28 (9) :732-735.

[6]Zhou H, Cheruvanky A, Hu X, et al.Urinary exosomal tran-scriptionfactors, a new class of biomarkers for renal disease[J].Kidney Int, 2008, 74 (5) :613-621.

足细胞分子 篇7

1 材料

1.1 实验动物

6周龄Sprague Dawley大鼠,雄性,SPF/VAF级,体质量180~220 g,广西中医药大学提供,合格证号:SCXK(桂)2003-0003。

1.2 实验药物

中药复方肾炎康主要药物:八仙草60 g、薏苡仁40 g、鹿衔草40 g、三七20 g,由广西中医药大学附属瑞康医院药房提供;以5倍蒸馏水煎煮3次,分别过滤,合并滤液,常规加热浓缩至2.5 g/m L(生药含量),高压灭菌,装入灭菌药瓶,置4℃冰箱保存待用。厄贝沙坦(安博维):赛诺菲(杭州)制药有限公司。

1.3 主要试剂

嘌呤霉素氨基核苷(PAN):美国Gibco;DMEM培养基:美国Gibco公司;TUNEL检测试剂盒:美国Promega公司;TRIzol Reagent:美国Invitrogen公司;RNA的逆转录试剂盒、SYBR Green mix:日本TOYOBO公司;兔抗大鼠Caspase 3抗体、p53抗体、大鼠多克隆β-actin抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔Ig G:美国Sigma公司;ECL试剂盒:美国Santa Cruz公司。

1.4 主要仪器

细胞培养箱:美国Forma Scientific公司;Gene Amp 2400 PCR扩增仪:美国Invitrogen公司;DYY2C型电泳仪、迷你型垂直电泳槽、半干转移槽:北京市六一仪器厂;凝胶成像及分析系统:美国Alpha Innotech Fluor Chem公司。

2 实验方法

2.1 含药血清的制备

48只Sprague Dawley大鼠,随机分为:正常组、模型组、厄贝沙坦组及肾炎康低、中、高剂量组,每组8只。正常组予以蒸馏水3 m L,2次/d,灌胃;其余各组分别予以PAN 5 mg/100 g、厄贝沙坦片25 mg/kg(成人临床用药剂量10倍)、肾炎康13.5、27.0、54.0 g/kg(分别为成人临床用药剂量5、10、20倍),均蒸馏水稀释至3 m L,2次/d,灌胃,连续7 d。末次灌胃2 h后腹主动脉取血,1 000 r/min离心取上清液,56℃水浴30 min(灭活补体),过滤除菌,分别制成正常血清、PAN血清、厄贝沙坦血清及肾炎康低、中、高剂量血清,-20℃保存备用。

2.2 大鼠足细胞原代培养与鉴定[4]

无菌取肾,通过差异过筛法(80、150、200目筛网)迅速分离肾皮质,收集200目筛网上肾小球,5%CO2恒温(37℃)恒湿培养7 d后消化,产物通过200目筛网过滤,传代培养7 d,流式细胞仪分析细胞纯度,倒置相差显微镜观察足细胞形态及免疫荧光染色鉴定。

2.3 分组及处理

等量足细胞接种和生长,细胞用PBS洗涤2次,在含1%FCS培养24 h,分为6组。正常组:正常血清;模型组:PAN血清+正常血清;厄贝沙坦组:PAN血清+厄贝沙坦血清;肾炎康低剂量组:PAN血清+肾炎康低剂量血清;肾炎康中剂量组:PAN血清+肾炎康中剂量血清;肾炎康高剂量组:PAN血清+肾炎康高剂量血清。每组设平行孔8孔,培养48 h后,检测各观察指标。

2.4 观察指标及测定

2.4.1 足细胞凋亡检测

原位末端标记法(TUNEL)检测。按试剂盒说明书操作。荧光显微镜下凋亡的足细胞核呈绿色。每张爬片在400倍镜下随机选5个视野,记录总细胞数和阳性细胞数,计算凋亡指数(apoptosis index,AI)。AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。

2.4.2 p53、Caspase-3 mRNA水平测定

实时定量PCR方法检测。按说明书用Trizol试剂提取细胞总RNA。按试剂盒操作步骤在逆转录酶作用下,将mRNA反转录为c DNA后,进行实时定量PCR扩增目的基因。引物序列采用Primer Premier 5.0软件设计,以GAPDH为内参照。引物序列:GAPDH上游引物5’-TATCGG ACGCCTGGTTAC-3’,下游引物5’-TCTTCAGTTTGGAGGTTGC-3’,产物长度434bp;P53上游引物5’-AGGGCGAACTGGCATTAG-3’,下游引物5’-CCTGGCTGACTTGGGAAA-3’,产物长度301bp;Caspase 3上游引物5’-CGACAGGGTGCTACGATC-3’,下游引物5’-GTGCTCACAAGGTGGGTC-3’,产物长度298bp。反应条件:94℃2 min预变性,94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s,进行35个循环,72℃7 min延伸。绘制溶解曲线,分析扩增产物的特异性,结果用2-△△Ct法计算各基因的相对表达量。

2.4.3 p53、Caspase-3蛋白表达测定

Western blot检测。吸净细胞培养液,PBS清洗3次,加入RIPA裂解缓冲液,细胞刮轻轻刮下裂解物,置冰上30 min,离心后取上清,标准Bradford法测定总蛋白浓度。每样品取30μg总蛋白,变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜,用含5%脱脂奶粉的TBST液室温封闭1 h。洗膜后加一抗,4℃过夜。洗去一抗,加入相应HRP标记的二抗,室温孵育1 h。洗膜后,ECL化学发光法显色。用图像分析软件(UVI tec,英国)进行半定量分析,目的蛋白的灰度值除以内参β-actin的灰度值(校正误差)为目的蛋白的相对含量。

2.5 统计分析

数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理。计量资料以(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验。

3 结果

3.1 各组足细胞凋亡率比较

见表1。

与正常组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较△P<0.05,△△P<0.01;与厄贝沙坦组比较#P<0.05,##P<0.01

3.2 各组足细胞p53 mRNA及蛋白表达的测定

见表2,图1。

与正常组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较△P<0.05,△△P<0.01;与厄贝沙坦组比较#P<0.05,##P<0.01

1.正常组;2.模型组;3.肾炎康低剂量组;4.肾炎康中剂量组;5.肾炎康高剂量组;6.厄贝沙坦组

3.3 各组足细胞Caspase-3 mRNA及蛋白表达的测定

见表3,图2。

与正常组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较△P<0.05,△△P<0.01;与厄贝沙坦组比较#P<0.05,##P<0.01

1.正常组;2.模型组;3.肾炎康低剂量组;4.肾炎康中剂量组;5.肾炎康高剂量组;6.厄贝沙坦组

4 讨论

越来越多的证据表明足细胞是肾小球损伤和蛋白尿的关键调节器[5],足细胞损伤是绝大多数慢性肾脏病进展的基础。研究表明足细胞减少20%以下就出现系膜扩张、一过性蛋白尿;减少超过40%,就会出现不同程度的肾小球硬化,持续性大量蛋白尿,肾功能下降[6]。凋亡是足细胞减少的主要原因,人类p53基因是一种功能强大的肿瘤抑制基因,p53介导的细胞信号转导途径对细胞周期和细胞凋亡起着关键性调控作用。如Notch信号通路可通过p53和Bcl-2通路介导高糖诱导的足细胞凋亡[7];TGF-β/Smad信号通路介导的足细胞凋亡也与p53活化有关[8];而抑制p53表达,可减少足细胞凋亡[9]。Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,在细胞凋亡中起着不可替代的作用。研究表明,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)可增加miRNA-29b和下调miRNA-186表达,激活Caspase-3,从而诱导足细胞凋亡[10,11];分化的足细胞c-mip的过表达,可诱导Caspase-3活化和上调促凋亡蛋白Bax表达,而抗凋亡蛋白Bcl-2的水平降低,进而促进足细胞凋亡[12];TGF-β1也可通过活化Caspase-3诱导足细胞的凋亡[13]。本研究结果表明,PAN诱导的足细胞凋亡,也与p53及Caspase-3活化有关,这与既往的研究一致。