组织学前列腺炎（通用7篇）
组织学前列腺炎 篇1
前列腺癌(prostate cancer,Ca P)是男性特有的肿瘤。小鼠中没有自然发生的前列腺癌,利用基因工程技术建立小鼠前列腺癌模型对临床前期前列腺癌的研究具有至关重要的意义。最近,利用前列腺特异性蛋白94(prostate specific protein 94,PSP94)启动子建立了转基因前列腺癌小鼠模型(transgenic mouse adenocarcinoma prostate model,TGMAP)和基因敲入前列腺癌小鼠模型(knock-in mouse adenocarcinoma prostate model,KIMAP),后者尤其显示了与人类相近的肿瘤特征[1,2,3,4,5]。
在本文的研究中,通过比较大量的TGMAP和KIMAP模型小鼠肿瘤的异质性和多病灶的特点,尝试证明KIMAP拥有更多近似于人类Ca P的特点。这个研究更多地证明KIMAP作为新的小鼠前列腺癌模型能够被用来作为目前广泛应用的转基因模型的补充模型。
1 材料与方法
1.1 小鼠模型
TGMAP(转基因小鼠前列腺癌)小鼠模型和KIMAP(基因敲入小鼠前列腺癌)小鼠模型,均由3842 bp的小鼠PSP94启动因子/增强子区域特异性介导SV40 Tag基因在前列腺组织中表达产生的[1,2,3,4,5]。通过在PSP94部位定向插入SV40 Tag建立的KIMAP模型,肿瘤生长缓慢,如图1A所示,在52周时肿瘤直径为3 mm,质量0.3 g,在晚期KIMAP小鼠中1年后发现了多组织转移。TGMAP模型在20周时发生了巨大的可视肿瘤(～12 mm,5 g,图1B),并且有淋巴结转移。
1.2 小鼠Ca P的组织学特征和定义
为研究TGMAP和KIMAP小鼠前列腺癌模型中肿瘤的组织学特征,依照前列腺癌临床诊断的Gleason五级10分制的组织学分级和评分标准,建立了基因工程(GE)小鼠模型的分析标准[6,7,8,9]。观察到的腺癌组织通过5个不同的组织学分级来评估:GE分级1(分化很好):单个、孤立、均一腺体紧密排列,有明确界限;GE分级2(分化好):单个、孤立、均一腺体疏松排列,有不规则边界;GE分级3(有变异和变形的腺体结构):单个、孤立、均一分散腺体和平滑的局限的乳头状/筛状团块;GE分级4(低分化):有不整齐、浸润边界和融合腺管的筛状团块;GE分级5:非腺性固体,圆形的细胞团块,中心坏死的筛状组织(称作粉刺状癌)以及未分化癌。新的GE评分系统采用五级10分制的分法,即将肿瘤分成主要类型和次要类型,每个类型分五级计5分,最后分级的评分为两者之和。如主要类型为三级计3分,次要类型为四级计4分,则此例前列腺癌的分级为七级计7分。
1.3 小鼠的解剖、繁殖和基因型确定
TGMAP小鼠通过快速PCR基因分型法鉴定。转基因小鼠的繁殖首先与野生型交配,然后逐渐在转基因小鼠中交配。所有的KIMAP小鼠的繁殖鼠背景为CD1、129Sv和C57 BL6。基因分型通过快速PCR基因分型法来进行[1,2]。
小鼠的解剖:前列腺连同性腺,即腹侧(ventral prostate,VP)和背外侧前列腺(dorsolateral prostate,DLP)、精囊(seminal vesicles,SV)和前侧腺体(anterior prostate,AP,或者coagulation gland,CG)被一同解剖并分离[1,2]。
1.4 统计学分析
评分率的比较采用χ2检验进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较方差齐性时用LSD方法分析,方差不齐时Dunnett's方法分析,以P<0.05为差异有统计学意义。应用SPSS 10和Sigma Plot 2000软件进行统计学处理。
2 结果
2.1 GE组织学分级和评分的分布
对来源于转基因(TGMAP,n=187)和基因敲入(KIMAP,n=169)小鼠前列腺癌模型的小鼠进行对照研究。为了区分GE小鼠前列腺肿瘤组织结构的异质性和多病灶的特点,我们建立了近似于人类、新的GE小鼠分级系统标准对小鼠Ca P进行分级。TGMAP(n=44)和KIMAP(n=96)模型的每只Ca P小鼠根据主要类型和次要类型相结合的GE组织学评分标准进行评分。一般而言,TGMAP小鼠由于缺少异质性,不适用于此系统。TGMAP小鼠Ca P的病理分级是依据标准近似得到的。KIMAP和TGMAP中GE组织学评分的分布描绘在图2A中。KIMAP小鼠中,GE组织学评分在不包括10的4～9范围内,比TGMAP分布更加平均。KIMAP主要的评分是9(27.1%)和6(26.0%),其他的评分是4(5.2%)、5(5.2%)、7(19.8%)和8(16.7%)。相反,TGMAP GE组织学评分全部分布在高数值范围(6～10)内,没有中间范围即GE组织学分数4和5。TGMAP主要的评分是在最高值10(59.1%)。KIMAP和TGMAP模型GE组织学评分分布的不同在统计学上差异有显著性(P=0.000)。
2.2 小鼠Ca P组织的异质性和多病灶特征
TGMAP和KIMAP模型之间肿瘤组织异质性和多病灶特征的明显差别通过混合组织学评分的百分率进一步比较,即在总的Ca P小鼠中具有混合组织学评分(两种不相同的组织学评分的结合)小鼠的比率。在这个研究中采用这个参数的主要原因是大多数TGMAP小鼠由于缺乏异质性和多病灶特征,而没有表现出混合组织学评分。KIMAP的混合组织学评分百分率是52.1%(n=96),非常接近于临床报道的比例[9,10,11](50%,附表),高于TGMAP小鼠(25%,n=44,附表)。
然后,我们研究了混合组织学评分百分率与小鼠年龄的关系。混合组织学评分百分率和非混合(具有两种相同的组织学评分)评分百分率根据不同的年龄组的分布绘制于图2B和图2C。在TGMAP小鼠中,只有11/44小鼠表现了混合组织学评分,发现在年龄组(19～26,27～34和35～43周)分布比率各自为4/11,6/23和1/5。与TGMAP相反,大部分KIMAP小鼠(50/96)表现了较高的混合组织学评分百分率,在各年龄组(从12周开始)分布比率各自为20.0%(12～18周)、30.8%(19～26周)、42.9%(27～34周)、46.7%(35～43周)和77.8%(>43周)。KIMAP小鼠表现了混合组织学评分百分率与年龄相关的增长的趋势(P=0.001)。
如图2C所示,与图2B混合组织学评分百分率一致,KIMAP小鼠表现了非混合组织学评分百分率与年龄的负相关(P=0.001),而在TGMAP小鼠中与年龄没有相关性,表明了在那些小鼠群体中肿瘤组织结构的非异质性的随机性分布。
3 讨论
这种新的基因敲入小鼠前列腺癌模型显示出了与人类临床Ca P相似的特性。根据这个研究中建立的与人类临床相似的新的GE组织学分级和评分系统,TGMAP显示了完全不同的GE组织学评分的分布,与KIMAP或者人类临床报道的Ca P相比,GE混合组织学评分百分率明显降低,表明只有KIMAP模型拥有相似于人类的高度异质性和多病灶的Ca P结构。
由于转基因技术的局限性,无约束的肆意的肿瘤增长是转基因小鼠Ca P模型的重要特点,这与临床Ca P的实际情况相差较大:快速进展为低分化Ca P,前列腺组织特异性的快速消失,没有骨转移。
由于Ca P的生物异质性,要想在治疗上取得重要的进展,首先必须进一步了解Ca P的生物学特性[12,13,14]。外在的因素、Ca P细胞之间的相互作用以及前列腺器官的微环境是关键性的因素。仅凭经验性的治疗是不可能带来理想的治疗进展。动物模型的应用提供了理想的研究Ca P生物学特性的体内系统。对于Ca P,为了发展更有效的预防和治疗对策,必须深入地了解肿瘤的发生、进展和转移扩散的分子机制。由于小鼠模型可以模仿Ca P的病理和生化特性,在前列腺癌的研究中发挥着无可替代的重要作用。
组织学前列腺炎 篇2
关键词：前列腺良性增生症,免疫组织化学,原位杂交,α平滑肌肌动蛋白,图像分析技术
前列腺良性增生症是老年男性常见疾病, 其发病率随着年龄的升高呈递增趋势。最近十多年来, 随着人口老龄化的到来, 人们生活质量的提高, 前列腺良性增生症的治疗已成为国际性关注的重大疾病, 对前列腺增生的研究则更具迫切性。前列散瘀胶囊是贺菊乔教授临床应用多年治疗前列腺良性增生症的经验方研制而成[1]。本研究通过免疫组织化学、原位杂交等实验方法观察前列散瘀胶囊对大鼠前列腺增生组织中α平滑肌肌动蛋白 (α-smooth muscle actin, α-SMA) 阳性表达影响, 从翻译和转录水平探讨该胶囊治疗良性前列腺增生的相关分子机制, 以便前列散瘀胶囊能更好地推广应用。
注:与空白组比较:△P<0.05△△P<0.01;与模型组比较:*P<0.05**P<0.01;与癃闭舒组比较:▲P<0.05▲▲P<0.01
1 实验材料
1.1 实验动物
雄性SD大鼠60只, 体质量250～300g (由河北医科大学动物实验室提供) 。
1.2 药物及制备
前列散瘀胶囊:由黄芪、泽兰、丹参、蒲黄、三七等药物制作而成 (由湖南中医学院附属一医院制剂室制成颗粒剂, 临用时用双蒸水配成混悬液) 、丙酸睾酮注射液 (上海第九制药厂生产沪卫药准字1995第009001号, 批号07402) 、癃闭舒胶囊:每粒含成药0.3g, 石家庄科迪药业有限公司生产 (国药准字ZI0960007, 批号070606 067临用时用双蒸水配成混悬液) 免疫组织化学试剂:多聚甲醛: (天津市化学试剂研究所, 批号20070609) , 丙酮: (中国仙桃市第一化工厂, 批号200704087) , 二甲苯: (衡阳市有机化学试剂厂, 批号20071213) , 柠檬酸缓冲液: (湖南试剂厂, 批号3-831101) , 无水乙醇: (长沙的波化学试剂厂, 批号070809) , 医用过氧化氢: (上海桃浦化工厂, 批号070104) , PBS, DAB。中性树胶: (上海标本模型厂, 20071110) , SMA检测试剂盒购于博士德公司。
1.3 实验仪器
电子天平: (JY3002, 上海精密科学仪器有限公司) MIAS图形图像分析系统 (Profssional Series, 厦门) ;石蜡切片机: (Shandon, Finesse 325型, 英国) ;微波炉: (Mitsubishi, RA-800S型) ;双目显微镜: (DMLB2, 莱卡, 德国) ;电热恒温水箱: (HHS-2S, 上海市南阳仪器有限公司) ;照相机: (莱卡, MPS30) ;电热恒温培养箱: (DNP-9162, 上海精密实验设备有限公司) 。
2 实验方法
2.1 造模与分组
将大鼠普通饲养1周以适应环境, 并经普通观察无异常后, 随机取10只作正常对照组, 其余50只进行造模。造模方法按文献[2,3,4,5], 先用戊巴比妥钠麻醉后, 常规消毒皮肤, 经阴囊摘除双侧睾丸, 残端处结扎, 以确保止血, 缝合皮肤, 肌内注射青霉素20万U/只。待大鼠苏醒后, 随机分为模型组、癃闭舒组、前列散瘀胶囊低中剂量组、高剂量组。从去势第8天起, 每只大鼠皮下注射丙酸睾酮1mg/ (300g·d) , 连续30d。
2.2 给药方法
正常组与模型组:普通饲养, 从去势第8天起, 按1m L/100g体质量给予生理盐水灌胃, 1次/d, 连续30d。前列散瘀胶囊低、中、高剂量组:从去势第8天起, 按1m L/100g体质量分别给予低、中、高浓度前列散瘀胶囊剂浸膏混悬液灌胃, 1次/d, 连续30d。癃闭舒组:从去势第8天起, 按1m L/100g体质量给予癃闭舒混悬液灌胃, 1次/d, 连续30d。
2.3 检测方法
2.3.1 免疫组织化学采用SABC法
2.3.2 前列腺组织形态分析
以MIAS图形图像分析系统对SMA免疫组织化学染色图片进行图像分析。每张图片随机取5个视野 (40×) , 测量腺上皮总面积及间质面积, 计算各组间间质、腺上皮和面积差异。
2.3.3 检测指标的意义
平均灰度:图像上各粒子颜色深浅 (浓淡度) 程度的平均值, 即黑度值越大, 图像各粒子颜色或染色深度及浓度越高。免疫组织化学染色的黑度代表阳性物质的深度。
积分光密度:是被测个体截面积内光密度的积分值, 表示吸光物质的总含量, 免疫组织化学片的积分光密度代表阳性物质的量。
2.4 统计学处理
各项指标结果以均数±标准差表示, 实验数据用SPSS11.5软件包进行处理
3 结果与分析
由表1可见:模型组大鼠前列腺增生组织中SMA平均灰度值、积分光密度、阳性细胞总面积明显高于空白对照组。前列散瘀胶囊高、中剂量组、癃闭舒组大鼠前列腺增生组织中SMA灰度值、积分光密度明显低于模型组。前列散瘀胶囊各剂量组、癃闭舒组大鼠前列腺增生组织中SMA阳性细胞总面积明显低于模型组。前列散瘀胶囊高剂量组大鼠前列腺增生组织中SMA灰度值低于癃闭舒组, 积分光密度明显低于癃闭舒组、前列散瘀胶囊高剂量组大鼠前列腺增生组织中SMA阳性细胞总面积与癃闭舒组接近。
结果表明:模型组大鼠前列腺增生组织中SMA平均灰度值、积分光密度、阳性细胞总面积明显增高, 前列散瘀胶囊高、中剂量组、癃闭舒组可降低大鼠前列腺组织中SMA灰度值、积分光密度。前列散瘀胶囊各剂量组、癃闭舒组均可缩小大鼠前列腺增生组织中SMA阳性细胞总面积。前列散瘀胶囊高剂量组在降低大鼠前列腺组织中SMA平均灰度值方面优于组癃闭舒组, 在降低大鼠前列腺增生组织中SMA积分光密度方面明显优于组癃闭舒组, 在缩小大鼠前列腺组织中SMA阳性细胞总面积方面与癃闭舒组接近。
α-SMA是具有收缩功能的肌动蛋白微丝, 主要存在于平滑肌细胞, 肌上皮细胞和成肌纤维细胞也有表达[6]。α-SMA单克隆抗体可与上述细胞反应, 而成为平滑肌细胞的标志物。本实验免疫组织化学结果显示:前列散瘀胶囊可降低大鼠前列腺组织中α-SMA表达。由于平滑肌组织增生在前列腺良性增生症发生中具有重要地位, 其增生程度直接影响着前列腺良性增生症的临床症状, 因此, 选择有效的前列腺平滑机松弛剂以及阻止前列腺平滑肌细胞的增生可望为前列腺良性增生症的非手术治疗提供有效的手段;前者已取得了一定的进展, 但尚无抑制前列腺平滑肌细胞增生的药物[7,8]。本实验表明, 前列散瘀胶囊可抑制前列腺平滑肌细胞的增生, 可望成为治疗前列腺良性增生症较为理想的药物, 但其抑制前列腺平滑机细胞增生的机制仍有待进一步研究。
参考文献
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组织学前列腺炎 篇3
1 资料与方法
1.1 材料
收集2007年4月~2010年7月我院行前列腺癌根治术的前列腺癌标本41例, 年龄在60~81 (平均73) 岁。全部病例均由组织学病理确诊, 术前均未行放疗及化疗。对每位入组的患者建立病历资料库, 通过定期门诊复查和电话随访发现, 19例出现骨转移, 其余22例骨转移。同时选择20例增生的前列腺组织为对照组。
1.2 方法
石蜡切片采用柠檬酸抗漂修复缓冲液高温抗原修复法, 采用SP免疫组织化学法染色, 严格依照试剂盒所附步骤进行检测, 同时用已知阳性片比照.采取PBS液代替一抗作空白对照, 并与癌旁组织进行对照。
1.3 结果判定
RANKL蛋白癌细胞胞膜, 呈明显棕黄色反应即为阳性。每个标本切片选取5个高倍视野 (400倍) , 计算各视野中阳性细胞数的百分比数作为该视野的阳性细胞百分比, 进而算出平均阳性细胞百分比作为该切片的阳性细胞百分比。染色评判标准:按阳性细胞百分比将染色结果评为3个级别阳性细胞百分比小于10%为阴性 (-) , 百分比位于10%和50%之间为阳性 (+) , 大于50%为强阳性 (++) , 其中, 阳性和强阳性标本计入阳性组, 两组间进行统计学处理。
1.4 统计学处理
统计分析采用SPSS 12.0软件, 组间计数资料进行用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RANKL蛋白在前列腺癌组织和正常组织中的表达情况
RANKL蛋白在20例前列腺增生组织中有5例 (15.00%) 有阳性表达;在41例骨肉瘤组织中, 有26例 (63.41%) RANKL蛋白阳性表达。经列联表χ2检验分析得出:前列腺癌组织与前列腺增生组织之间的RANKL蛋白表达差异性具有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
2.2 RANKL蛋白表达与前列腺癌骨转移的关系
实验组41例病例中, RANKL阳性表达26例, 其中疾病后期出现骨转移者有18例, 即骨转移组 (共19例) RANKL阳性率为94.73%;另外8例未出现骨转移, 即无骨转移组 (共22例) 阳性率为36.36%。因此, RANKL在有无骨转移情况的病例间阳性表达差异具有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
前列腺癌在病情加重期和疾病晚期普遍发生的骨转移已成为当代医学治疗的一大难题和研究热点。尽管前列腺癌骨转移常见于成骨性或混合性改变, 愈来愈多的证据显示, 破骨细胞和成骨细胞共同参与了前列腺癌的骨转移[3]。没有骨的再吸收, 转移细胞将不容易在浸润矿化的组织中存活[4]。因此, 调节破骨细胞和成骨细胞的细胞因子影响前列腺癌细胞的发展与转移。
破骨细胞来源于造血组织中的单核巨噬细胞系统, 其形成受多种理化因素调控但ANKL/RANK分子的相互作用是这个过程中最终的共同通路。人类RANKL是一个由13 q1 4基因序列编码的肿瘤坏死因子超家族成员, 属于Ⅱ类跨膜蛋白。已证实RANKL主要存在于成骨细胞、骨髓基质细胞、树突状细胞和T淋巴细胞中, 在骨组织中高表达[5]。RANKL是破骨细胞前体细胞表面的受体-细胞核因子KB受体活化因子RANK唯一的功能是配体, 两者结合后通过一系列的级联反应和信号传导, 使得前体细胞分化、发育为成熟的破骨细胞[6]。因此, 配体RANKL-受体RANK信号通路可能在前列腺癌骨转移的生存和转移中扮演不可缺少的重要角色。
同时有数据显示RANKL在骨髓微环境中大量表达对细胞迁移和肿瘤细胞组织特异性骨转移发挥了重要作用[7]。我们的研究结果也表明, 在前列腺癌骨转移的患者组织中RANKL蛋白表达阳性率更高。而肿瘤特异性的转移受到肿瘤细胞和转移前灶间相互作用的影响。有文献指出RANKL可被看做是肿瘤细胞转移的组织特异性因子, 尤其是对于上皮性肿瘤, 它是一个重要的骨特异性转移“土壤因子”[8]。因为RANK受体在多种上皮性肿瘤细胞系中大量表达, 而且这些肿瘤更容易转移到骨骼[2]。而且在黑色素瘤模型中, 应用OPG抑制RANKL/RANK信号通路可以选择性的减少骨转移和肿瘤负荷。并提出应用RANKL/RANK相互作用抑制剂可能会成为一种可行的靶向干扰肿瘤骨转移及进展[9]。
综上所述, 配体RANKL-受体RANK信号通路在破骨细胞形成过程中发挥重要作用。RANKL在前列腺癌组织中大量表达促进前列癌骨转移。RANKL/RANK信号通路在前列腺癌, 细胞生存和转移中扮演不可缺少的重要角色, 为前列腺癌等的骨转移治疗和研究开辟了一条新途径。
参考文献
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组织学前列腺炎 篇4
1实验材料
1.1 动物
选择清洁级3月龄健康雄性SD大鼠, 体重180～220g, 共60只, 由浙江大学医学院动物实验中心提供, 合格证号:SYXK (浙) 2007-0098。
1.2 药物
益气化瘀方:由生黄芪、怀山药、鹿角霜、片姜黄、地鳖虫、川牛膝、蓬莪术、补骨脂、马鞭草、鬼箭羽等组成, 颗粒剂, 江阴天江药业有限公司生产, 每袋4.2g, 约含生药12g, 60kg体重成人的临床剂量为0.14g/kg·d-1, 按体表面积折算大鼠的等效剂量为0.875、1.75、3.5g/kg·d-1 (分别相当于临床人体等效剂量的1、2、4倍) , 临用时以蒸馏水配制成0.175、0.35、0.7g·ml-1浓度的混悬液。泽桂癃爽胶囊:江苏正大天晴药业股份有限公司, 规格:每粒0.44g, 批号: (98) 卫药准字Z-108号, 60kg体重成人的临床剂量为0.044g/kg·d-1, 按体表面积折算大鼠的等效剂量为0.55g/kg·d-1 (相当于临床人体等效剂量的2倍) , 临用时以蒸馏水配制成0.11g·ml-1浓度的混悬液。丙酸睾酮注射液:上海通用药业股份有限公司, 规格:10mg·ml-1, 批号:国药准字H331020524。
1.3 试剂及仪器
兔抗VEGF多克隆抗体、兔抗endostatin多克隆抗体试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司;鼠抗人单克隆抗体CD34试剂盒:福州迈新生物技术有限公司;二抗即用型试剂盒 (En Vision Kit) :北京中杉生物技术有限公司;DAB显色试盒:美国 Sigam公司。光学显微镜:德国Leica公司;显微成像系统:日本Nikon公司;HM325石蜡切片机:德国MICROM公司。
2实验方法
2.1 分组与造模
动物购入后适应性饲养1周, 经观察无异常后编号称重, 按体重层次随机分为正常组, 模型组, 泽桂癃爽组和益气化瘀方低、中、高剂量组, 每组10只。除正常组外, 其余各组参照《西药新药临床前研究指导原则汇编》[2]进行造模。戊巴比妥钠40mg·kg-1腹腔注射麻醉后, 无菌条件下经阴囊摘除双侧睾丸, 结扎残端以确保止血。缝合皮肤, 肌肉注射青霉素20万U/只, 恢复1周。从去势后第8天起, 每只大鼠腹部皮下注射丙酸睾酮5mg/kg·d-1, 1天1次, 连续30天。
2.2 给药
从去势后第8天起, 正常组和模型组按1ml/200g体重灌胃 (ig) 方式喂饲生理盐水;泽桂癃爽组按1ml/200g体重给予泽桂癃爽混悬液灌胃 (0.11g/ml) ;益气化瘀方低、中、高剂量组按1ml/200g体重分别给予低、中、高浓度益气化瘀方混悬液灌胃 (0.175、0.35、0.70g/ml) , 均1天1次, 连续30天。各组大鼠在实验期间按组分笼饲养, 自由进食、饮水, 每周称体重1次, 以调整给药用量。
2.3 标本采集
各组连续ig给药后第31天, 称体重, 股动脉放血处死大鼠, 完整摘取前列腺, 去除被膜后用电子天平称湿重, 计算各组大鼠前列腺体积和前列腺指数。取相同部位腺体组织用10%中性福尔马林固定, 48小时内石蜡包埋, 连续切片。免疫组化法检测VEGF、endostatin蛋白表达。
2.4 检测指标及方法
2.4.1 前列腺指数 (PI)
称取大鼠体重和前列腺湿重, 计算前列腺指数。公式为:PI=前列腺重最 (mg) /大鼠体重 (g) ×100
2.4.2 前列腺体积
用排水法测量体积。在5ml量杯中加入定量生理盐水, 将大鼠前列腺由中间切为两部分放入量杯中, 用1ml注射器抽取液面增高的部分读取数据, 即为前列腺体积。
2.4.3 前列腺组织VEGF、endostatin表达
采用免疫组织化学法。兔抗大鼠VEGF多克隆抗体作浓度为1:50, 兔抗endostatin多克隆抗体工作浓度为1:40, 以PBS代替一抗作为阴性对照, DAB显色, 按试剂盒说明操作。结果判定:以镜下血管内皮细胞、基质细胞及间质细胞胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。采用全自动真色彩图像分析系统进行观察并计算阳性细胞。每张切片随机选择10个视野, 经数据转换, 计算VEGF、endostatin光密度。
2.5 统计方法
数据以undefined表示, 采用SPSS for Windows 12.0统计软件包进行单因素方差分析 (q检验) 。
3实验结果
3.1 各组大鼠前列腺体积、前列腺指数的比较
见表1。
与正常组比较*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较△P<0.05, △△P<0.01;与泽桂癃爽组比较▲P<0.05
3.2 各组大鼠前列腺组织VEGF表达测定
免疫组化染色结果显示, VEGF主要定位在增生的前列腺上皮细胞浆或细胞膜, 一些间质血管内皮也可见弱阳性表达, 阳性着色呈棕黄色。各组VEGF表达见表2。
3.3 各组大鼠前列腺组织内皮抑素 (endostatin) 表达测定
免疫组化染色结果显示, endostatin主要在上皮细胞和间质组织中表达, 前列腺上皮细胞也有表达。各组endostatin表达见表2。
与正常组比较*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较△P<0.05, △△P<0.01;与泽桂癃爽组比较▲P<0.05
4讨论
一般认为, BPH属于良性实体瘤, 是以基质和腺体增生为特征的增殖性疾病。Folkman[2]指出, 任何实体瘤的生长与转移均需新生的血管形成。国内学者报道[3], BPH间质组织中MVD显著高于正常前列腺组织, 而且BPH的MVD与间质面积百分比密切相关, 提示新生血管形成增多在BPH的发生发展过程中起着重要作用。目前已知, VEGF是最重要的促血管生成正性调节因子之一, 其主要功能有诱导血管通透性增加, 促进血管内皮细胞迁移, 刺激内皮细胞增殖进而促进血管生成[4]。而endostatin是血管新生主要的负性调节因子, 它能与VEGF竞争细胞表面的硫酸肝素黏蛋白类受体, 阻断血管内皮细胞有丝分裂生长因子的信号传导而抑制其增殖[5]。本研究结果显示, 模型组大鼠前列腺体积、前列腺指数增大, 前列腺组织VEGF表达显著高于正常组 (P<0.01) , endostatin表达显著低于正常组 (P<0.01) 。
BPH属中医“癃闭”、“淋证”、“精癃”等病症范畴。BPH局部腺体增生、梗阻尿道, 肛门指检可触及肥大的腺体, 此乃有形之征, 具有“”、“积”的病理特点。中医认为, BPH基本病机是肾气亏虚, 瘀血痰浊聚结, 属于正虚标实、虚实互见的病证。血瘀贯穿于BPH病程的始终, 是其发生、发展的病理基础[6]。泽桂癃爽胶囊主要成分为泽兰、肉桂、皂角刺等, 具有化瘀散结、行气利水功效;该药能抑制丙酸睾酮所致家兔和大、小鼠的前列腺增生, 缩小前列腺体积, 降低前列腺指数, 减少残余尿量, 减轻上皮细胞增生, 对前列腺增生有较好的疗效[7]。益气化瘀方在应用蓬莪术、片姜黄、地鳖虫、川牛膝等活血化瘀、软坚散结的基础上, 重视补肾益气以治本, 以王清任的“黄芪甘草汤”为基础, 重用鹿角霜、黄芪、山药补肾益气, 兼顾养阴。本实验结果表明, 中、高剂量的益气化瘀方能显著缩小BPH模型大鼠增生的前列腺体积, 降低前列腺指数, 其作用明显优于泽桂癃爽胶囊 (P<0.05) ;益气化瘀方组大鼠前列腺组织VEGF低表达、endostatin高表达, 与模型组比较, 差异有显著性意义 (P<0.01) , 提示调节VEGF、endostatin表达, 进而影响前列腺组织新生血管形成, 可能是其抗前列腺增生的作用机制之一。
参考文献
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[6]黄向阳.活血化瘀法治疗前列腺增生32例临床观察.中国中医药科技, 2009, 16 (1) :60.
组织学前列腺炎 篇5
1 对象与方法
1.1 供体蜡块的选择
选择南京医科大学第一附属医院病理科2005～2007年前列腺癌根治手术标本48例,患者年龄50～81岁,平均(67.5±7.4)岁,术前均未接受过放疗或化疗,标本离体后均经4%中性甲醛固定,常规石蜡包埋,所收集病例均为前列腺腺泡癌,根据前列腺癌Gleason评分系统,Gleason≤6分18例,Gleason评分≥7分30例。
1.2 前列腺癌组织芯片的构建
复习HE切片,在相应的蜡块上标记具有代表性的区域1～2个,参考文献[2],用组织芯片点样仪(Beecher Instruments公司)在空白蜡块上打孔,每个组织芯直径2.0 mm,再在肿瘤蜡块已做标记的区域钻取组织芯植入空白蜡块相对应的孔内,设计组织陈列点数共68个。待全部组织芯植入后,将组织芯片蜡块置55 ℃烘烤2 h,使组织芯与受体蜡块完全融合。冷却至室温后,冻存30 min,作4 μm连续切片,多聚赖氨酸玻片(福州迈新公司)捞片,62 ℃烘烤3 h,备用。
1.3 免疫组化
采用EnVision二步法,高温高压抗原修复,DAB显色。试剂兔抗人多克隆抗体EZH2(克隆号 6A10,浓缩型)购自美国Zymed公司,工作液浓度为1∶100,操作参考试剂盒说明书。
1.4 原位杂交
EZH2原位杂交mRNA试剂盒购自武汉博士德公司,地高辛标记的EZH2寡核苷酸探针由该公司合成,序列为:5′-CAGACTGGGAAGAAATCT￣G￣A￣G￣A￣A￣G￣G￣G￣A￣C￣C￣A￣G￣T￣T￣T￣G-3′;5′-A￣A￣G￣T￣A￣T￣G￣T￣C￣G￣G￣C￣A￣T￣C￣G￣A￣A￣A￣G￣A￣G￣A￣A￣A￣T￣G￣GAAATCCC-3′。原位杂交所使用蒸馏水、器皿均用DEPC水处理。以RNA酶预处理作为阴性对照。实验步骤严格参照产品说明书。常规切片脱蜡梯度乙醇水化;3%H2O2灭活内源性酶;3%胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段;后固定后,在41 ℃恒温箱中进行预杂交3 h及杂交过夜处理;在37 ℃环境中依次滴加封闭液30 min,生物素化鼠抗地高辛60 min,SABC 20 min,生物素化过氧化物酶20 min;各步骤间用PBS或SSC液漂洗,最后DAB显色。苏木精复染、脱水、透明、封固。
1.5 结果判断
1.5.1 组织芯片与常规组织切片HE染色重新进行Gleason评分:
采用双盲法,由两位病理科医师重新对每个组织芯进行Gleason评分并与相应常规石蜡切片Gleason评分比较,相同记为符合,否则为不符合。
1.5.2 组织芯片与常规组织切片免疫组化及原位杂交评价标准:
EZH2蛋白阳性细胞胞核中呈现有棕黄色细颗粒。EZH2 mRNA阳性细胞胞质中呈现有棕黄色细颗粒。采用双盲法,由两位病理科医师对组织芯片上每个位点的免疫组化及原位杂交染色进行评价,分别记数每个位点高倍镜下100个细胞,取其平均数。阳性细胞数≤25%为阴性,>25%为阳性。
1.6 统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件处理,结果一致性采用Kappa法分析。
2 结果
2.1 组织芯片的质量
制作阵列蜡块过程中,68个组织芯排列整齐,无一例缺失,用作HE染色、免疫组织化学实验过程中均有2片组织折叠,原位杂交实验过程中组织缺失1片,折叠2片,最终有效病例均为48例。
2.2 组织芯片HE染色结果
HE切片镜下每一组织芯均可见具有诊断意义的肿瘤组织结构,所有组织中,细胞核呈蓝色,细胞质呈红色,核质比清晰,细胞的形态结构基本清楚。
2.3 组织芯片与常规切片中Gleason评分结果比较
重新评价前列腺癌组织芯片的Gleason评分结果见表1,组织芯片与常规HE切片Gleason得分进行比较,结果发现,两者总体符合率达到89.58%。
2.4 组织芯片与常规切片免疫组化及原位杂交结果比较
EZH2蛋白、EZH2 mRNA阳性信号分别定位于细胞核和细胞质,呈棕黄色颗粒或团块(图1,2)。组织芯片阳性结果与常规切片阳性结果进行比较发现,EZH2蛋白、EZH2 mRNA 表达符合率分别为96.65% 和90.90%。统计学分析Kappa系数分别为0.810、0.727,均在0.7以上,说明两者有较高的符合率,见表2。
3 讨论
组织芯片又称组织微阵列(tissue microarray,TMA),是将数十个乃至数以千计不同来源的组织样品粘贴到同一张固相载体如玻璃片或硅片上,形成组织微阵列。在同一反应条件下进行免疫组化、原位杂交、FISH和原位PCR等以了解病变组织与相应正常组织内靶基因或蛋白质的细胞来源、分布特征和表达差异等。虽然该技术已在科研中得到广泛应用,但组织芯片的代表性和有效性仍被人们关注。
本研究结果显示,无论在组织芯片还是常规切片中,EZH2蛋白和EZH2 mRNA的表达符合率均高于90%,Kappa系数均>0.7。表明直径2.0 mm的组织芯片中每个组织样本,可以反映原始组织结构的信息,没有出现明显的偏差,从总体上是能够代表普通组织研究的。Manley等[3]收集了Michigan大学肿瘤研究小组1995～2001年的前列腺癌病例1300例,用TMA技术对PSA、E-cadherin、p27及ki-67免疫组化表达进行研究,同样取得了满意结果,进行临床、病理及分子水平的研究显示,组织芯片上并不是每一个组织芯都能完全代表原来的组织结构信息,但这细小的差异并不影响总体的结果,在统计学上没有意义。本实验中,EZH2免疫组化和原位杂交在组织芯片中分别有2例和4例与常规切片结果有差异,在有差异的这几例常规切片中,我们观察到在同一张切片中不同区域的癌细胞免疫组化和原位杂交染色的强弱及阳性细胞所占的百分数也有差别。另外在Gleason评分有差异的这几例中,我们观察到芯片中丢失了原来肿瘤部分信息,尤其在Gleason评分为5分、7分、9分中不符合率均较高,这些差异主要是由于肿瘤形态以及生物学特征的异质性造成的。即使同一个肿瘤,在不同的肿瘤细胞间生物标志的表达水平也不尽一致,特别在多组织起源的肿瘤中这个问题很难避免,此外还由于标本本身的客观性差异和阅片者主观判断的不稳定性造成的。
另外,组织芯片上标本位点的丢失也是影响检测结果可靠性的重要因素[4]。本实验中组织丢失和折叠,也不同程度影响了结果。以往的研究发现,在组织芯片切片和染色过程中会导致大约15%～30%的芯片位点标本的丢失[4]。为此,近年来有研究者就组织芯片检测前列腺癌中肿瘤标志物表达情况的有效性和可靠性进行了探讨[4],建议增大样本组织或采取2点甚至多点取材,可有效减少组织芯片和常规组织标本检测结果的差异,提高组织芯片检测的可靠性和有效性。取材时,准确的组织定位是关键,其次用于芯片制作的组织样本应略厚于常规组织取材的样本厚度,以3.0 mm厚为宜[1]。此外,若用水漂浮裱片,水温过高易导致组织片移位。若使用石蜡切片辅助带移系统进行干裱片及紫外线灯烤片,同时再用0.1%E的多聚赖氨酸等预处理载玻片,能有效地避免制片过程中组织片的移位或脱落。组织芯片是否具有代表性以及实验结果的可靠性,组织芯片样本量及组织芯的面积的选择也很关键,尤其肿瘤分化程度的差异大或肿瘤的异质性明显时更为重要。研究认为,在直径为2.0 mm的组织片上有约100 000个细胞,而直径0.6 mm的组织片上仅有约30 000个细胞。在TMA设计中不是组织片的数量越多越好,目前,国际上常用的TMA的样本量多为60～100个,组织片的直径在2.0 mm左右[1]。
综上所述,本实验无论在HE染色还是免疫组化和原位杂交结果,通过对前列腺癌组织芯片和常规切片比较表明,直径为2.0 mm的组织芯可以代表原组织用于前列腺癌的实验研究。该技术为前列腺癌临床病理学研究提供了一种可靠的、快速、经济的高通量分析工具。
摘要：目的 探讨前列腺癌组织芯片结果的可靠性。方法 收集48例前列腺癌病例,构建成直径2.0mm的组织芯片,进行HE染色并重新评价Gleason得分,同时应用免疫组化、原位杂交技术分别检测EZH2,并对照常规石蜡组织切片结果,进行统计学分析。结果 前列腺癌组织芯片Gleason评分与常规石蜡切片比较,两者总体符合率为89.58%。前列腺癌组织芯片与常规石蜡切片比较,免疫组化结果一致率为95.65%(Kappa=0.810);原位杂交结果一致率为90.90%(Kappa=0.727)。结论 采用规范的组织芯片制作程序,直径2.0mm组织芯片上的组织样本可以反映原组织结构的信息,可作为一种可靠的、有代表性的高通量组织分子分析工具用于前列腺癌大样本、回顾性的临床病理学研究。
关键词：前列腺癌,组织芯片,免疫组化,原位杂交,EZH2
参考文献
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组织学前列腺炎 篇6
MAPK是细胞内信号传递途径的共同通道和汇聚点[1]。目前已经证明,MAPK家族中ERK的表达促进恶性肿瘤的发生,P38参与细胞的应激反应和凋亡。我们采用免疫组织化学S-P方法检测在前列腺增生症、前列腺癌和正常前列腺中的表达,探讨其在PC和BPH形成过程中的作用。1材料与方法1.1实验标本40例BPH和15例PC标本来自附属第一医院泌尿外科,经耻骨上前列腺摘除术和前列腺癌活检获得,年龄55～74岁。10例正常前列腺来自于附属第一医院尸检病例,年龄25～35岁。以上标本均经染色、病理科两名医生校验证实。1.2检测方法免疫组织化学检测采用S-P法,MAPKⅠ抗及Ⅱ抗(包括ERK、JNK、P38MAPK)为公司产品,购于北京原平皓生物公司;免疫组化S-P试剂盒及DAB显色剂为武汉博士德生物公司产品。1.3结果判定一般认为:活化的存在于细胞核内发挥生物学效应,因此我们以细胞核棕黄色着色者作为阳性细胞记数标准。每张切片随机观察5个高倍视野,各记数200个上皮细胞和基质细胞。计算阳性细胞百分比。1.3统计学处理实验结果以(x±s)表示。采用SPSS统计分析软件处理,方差齐性分析及t检验进行统计分析。2结果ERK在BPH、PC的基质细胞和上皮细胞的胞浆和胞核中均有不同程度的染色。在正常前列腺基质细胞胞浆和胞核中染色,而上皮细胞仅胞浆中有染色胞核中无染色。ERK在BPH基质细胞核染色约为79%,而PC约为50%,正常前列腺48%。前者与后两者存在着差异,具有统计学意义(P≤0.05)。而PC和正常前列腺两者间差异无显著性(P>0.05)。BPH上皮细胞核染色约为72%,PC上皮细胞核染色为0。三者间均存在着明显差异,均具有统计学意义(P≤0.05)。JNK在BPH、PC及正常前列腺上皮细胞及基质细胞中均染色,但核染色较低,而且它们之间不存在明显差异,没有统计学意义(P>0.05)。表2JNK在BPH、PC及正常前列腺中表达结果(x±s)注:各组间比较,差异均无显著性,P>0.05P38在前列腺正常组织和增生组织中均有表达,两者比较无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。上皮细胞中分别约为28%和32%,而基质细胞中分别为25%和21%。在癌组织中上皮细胞表达明显增加,约为57%;而基质细胞表达减少,约为15%。与正常前列腺表达存在明显差异,具有统计学意义(P≤0.05)。表3P38在BPH、PC及正常前列腺中表达结果(x±s)注:1)与PC组比较,差异有显著,P≤0.05;2)与正常前列腺比较差异有显著P≤0.053讨论MAPK是一组具有丝/苏氨酸活性的蛋白激酶,广泛存在着心、脾、肾、前列腺组织中,在许多细胞中都有表达。它主要有3个亚型:细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)、应激活化蛋白激酶(Jun N-terminal kinase,JNK)和蛋白激酶P38。激活的MAPK转运入细胞样本n上皮细胞基质细胞BPH4019.08±9.1416.39±7.75PC1515.42±7.3922.08±12.95正常前列腺1021.88±9.6517.55±8.59样本n上皮细胞基质细胞BPH4027.83±7.441)25.64±6.601)PC1556.83±13.412)14.83±3.832)正常前列腺1032.11±7.9521.11±5.16核,激活转运因子和靶蛋白,与DNA结合来调整基因表达[2]。ERK主要参与促进有丝分裂,JNK和P38主要参与细胞凋亡。国外的文献报导,ERK在正常前列腺、BPH、PC的上皮细胞中的表达差异有显著性,PC中ERK的表达明显高于增生组织,在基质细胞中三者间差异不明显[3]。在笔者的实验中3种组织上皮细胞的检测结果与上述结果是相似的。但在基质细胞中增生组织的ERK表达水平显著高于癌组织及正常组织。ERK在不同组织中及上皮细胞和基质细胞间表达的差异可能与疾病发生的病理机制密切相关。PC是以上皮细胞基因突变后恶性化克隆形成的,细胞增生分化的生物学效应主要在腺上皮。因此表现为上皮细胞ERK的过度表达和活化。其机制可能是表皮生长因子及其受体等分泌模式改变和活性的提高增强了对Ras→Raf→MEK→ERK信号传递途径刺激的结果。活化后的ERK,易位入核,再磷酸化其下游底物,其中包括原癌基因c-jun、c-myc等编码的转录因子,启动初级和次级应答基因的转录和翻译[4],这可能与PC的发生有关。ERK在前列腺增生组织中表达明显区别于PC,在基质细胞的表达显著增高,这可能与BPH病理学基础有关。从组织学角度来看主要是腺体的基质细胞增生,其中基质平滑肌细胞占据了增生的前列腺细胞的40%[5]。这种变化被认为是由于基质细胞通过自分泌和旁分泌等途径使EGF、FGF、PGF等生长因子增高,这些生长因子刺激ERK的表达,从而使BPH基质细胞ERK表达明显增高。通过基质细胞与上皮细胞相互作用,上皮细胞也有一定程度的增生,因此其在上皮细胞中表达也相应增强。笔者的实验中JNK/SAPK在正常前列腺、BPH和PC表达之间差异无显著性,但在同一种组织中,其表达差别较大。此途径参与广谱的细胞应答,包括炎性反应,应激反应和凋亡。应激刺激包括热休克、细胞因子、抗氧化剂、紫外线及DNA损伤[6]。因此可以认为JNK/SAPK是一个短时的调节途径。在本实验中则可能与前列腺组织的取材、手术及术前的局部检查操作等因素有关。笔者推测JNK在前列腺增生及前列腺癌的发生、发展中没有起决定性作用。目前资料认为P38MAPK是调节细胞凋亡的主要信号传导途径之一,另外还参与一些其他的生理功能的调节[7]。国外文献报道:P38在3种组织中均有表达,而且三者之间差异有显著性,在PC上皮细胞中的表达最高,BPH次之,正常前列腺最少。而在基质细胞中与此相反[3]。笔者实验结果是在3种组织中均有表达,无论上皮细胞还是基质细胞BPH与正常前列腺间表达差异均无显著性。比较而言,PC上皮细胞中表达最高,基质细胞中表达最少,其机制尚不清楚,可能是对癌组织中上皮的异常增殖状态的局部调节反应,通过增加凋亡来抑制增殖。对于前列腺癌细胞的凋亡状态目前研究尚少,随着研究的深入也许会对P38的功能得到进一步的了解。从笔者的实验可以知道:BPH中基质细胞ERK表达最高,而上皮细胞ERK表达较高。JNK及P38在BPH各种细胞中表达与正常前列腺组比较,差异无显著性。PC中ERK在上皮细胞中表达最高。P38在PC上皮细胞中表达也高,在基质细胞中表达低。JNK的表达差异无显著性。因此笔者推测:ERK的过度激活,可能是BPH和PC发生的一条主要信号传递途径。而P38相对抑制可能是BPH和PC发生的另一方面。ERK抑制剂可能会抑制细胞增殖,P38抑制剂会使细胞凋亡减少。随着对MAPK传导通道与PC和BPH关系及MAPK激动剂和抑制剂在PC和BPH中作用的深入研究,这必将为治疗PC和BPH提供一个新的途径
摘要：目的通过丝裂素激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)在前列腺癌(prostaticcancer,PC)、前列腺增生症(benign prostatic hyperplasia,BPH)及正常前列腺中的表达,探讨MAPK在PC和BPH形成过程中的作用。方法采用免疫组织化学S-P法对40例BPH、15例PC、10例正常前列腺患者标本进行检测。结果ERK在BPH、PC的上皮细胞和基质细胞胞浆、胞核中均有着色,正常前列腺基质细胞胞浆、胞核均着色,上皮细胞无核着色。ERK在BPH基质细胞核染色约为79%,而PC约为50%,正常前列腺48%。前者与后两者差异存在显著性,(P≤0.05)。而PC和正常前列腺两者间差异无显著性(P>0.05)。BPH上皮细胞核染色约为72%,PC上皮细胞核染色为0。三者间均存在着明显差异,均具有显著性(P≤0.05)。JNK在BPH、PC及正常前列腺上皮细胞及基质细胞中均染色,但核染色较低,而且他们之间差异无显著性(P>0.05)。P38在前列腺正常组织和增生组织均有表达,两者差异无显著性。在PC中上皮细胞增加,基质细胞表达明显减少。与正常前列腺表达差异存在显著性(P≤0.05)。结论ERK的过度激活,是BPH和PC发生的一条主要信号传递途径。JNK与BPH和PC的发生的病理机制无关。P38的相对抑制是BPH和PC发生的病理机制的另一个方面。
关键词：MAPK,前列腺增生症,前列腺癌,信号传导途径
参考文献
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组织学前列腺炎 篇7
前列腺癌(prostate cancer,PCa)是一种老年男性常见病,其发病率在美国居男性恶性肿瘤之首,占男性死亡原因的第二位。近年来,在我国的发病率亦逐年增高[1~3]。尽管PCa病因学的分子机制尚未完全阐明,但其发生发展也是一个涉及多因素、多步骤、多基因的过程。研究发现[4,5,6],CD258是一种在T细胞的活化和增殖过程中有重要的共刺激作用,并兼具诱导肿瘤细胞凋亡及细胞毒作用的多功能细胞因子,提示其有可能在PCa的发病中扮演抑癌基因的角色。本研究应用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)的方法检测了CD258基因在正常前列腺、BPH及PCa组织中的表达,以探讨CD258基因在PCa病因学中所起的作用。
1 对象和方法
1.1 对象
32例PCa标本来自本院,全部病例经病理确诊,中位年龄71岁(62~83岁),Gleason评分<7 20例,≥7 12例。PSA 4.2~165.7 ng/mL。临床分期Ⅰ期12例,Ⅱ期11例,Ⅲ期7例,Ⅳ期2例。病理确诊BPH15例,中位年龄72岁(61~84岁),PSA 0.2~8.3 ng/mL。另取10例对照为前列腺手术或尸体供肾时取的正常前列腺组织。
1.2 试剂和仪器
Trizo试剂、MMV逆转录试剂盒购自晶美生物公司;引物由上海博亚公司合成。采用德国罗氏公司Light Cycler system荧光PCR,混合荧光染料SYBR Premix Ex Taq购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 总R NA提取
常规提取组织中的RNA,加入适量Trizol,用移液管反复吹打至透明无颗粒,室温下放置5 min,每1 m L TRIZOL加0.2 m L氯仿,盖紧样品管盖,振荡器剧烈混匀15 s,室温放置10min。在4℃下12 000×g冷冻离心15 min。将水样层转移到干净的试管中,每1 m L TRIZOL对应0.5m L异丙醇,小心倾倒混匀,室温下放置10 min。4℃下12 000×g冷冻离心10 min,可见胶片状沉淀附着于试管壁和管底。移走上清,DEPC水配制的80%的乙醇洗涤RNA沉淀1次。简单干燥,DEPC水溶解,贮存于-80°C备用。
1.3.2 c DNA制备
每个总RNA样品取5μg,加无RNase水至4μL,加入50μmol/L Oligo(dT)1μL,70℃加热2 min,室温放置5 min后,依次加入RNase抑制剂1μL,5×RT缓冲液4μL,2.5 mmol/L dNTP2μL,0.1mmol/LDTT2μL,SupperScript-RTase 1μL,无RNase水补足20μL。42℃反应1 h,70℃加热10 min终止反应,-20℃保存备用。
1.3.3 PCR引物设计
CD258及GAPDH基因引物设计均根据标准荧光定量PCR引物设计原则,通过Primer 5.0程序设计。CD258引物序列为:上游引物:5'-ACCCACTGCTTACTGGCTTA-3',下游引物:5'-CTTATATAGACCTCCCACCGTA-3'。GAPDH引物序列为上游:5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3',下游引物:5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3'。
1.3.4 实时荧光定量
PCR反应以CD258和GAPDH基因引物加入SYBR greenⅠ荧光染料进行定量PCR反应,反应在密闭的Roche毛细硅管中进行。反应体系:模板1μL,上下游引物各10 pmol,10μL SYBR greenⅠ混合染料,补足无RNase水至20μL。混合后注入毛细硅管,离心后放入热循环仪中进行反应,条件设置如下:95℃10 s预变性,95℃4s,55℃15 s,72℃15 s共45个循环。设定在每个循环的变性期结束后,程序自动记录上一个循环最后10%时间的平均荧光值,以此表示上一个循环结束时的PCR产物量。反应完成后,得到所有标本的记录曲线。软件将自动进行数据分析,调整基线,计算出Threshold cycle(Ct值)。每一次反应均以PCa细胞为阳性对照,以无RNase水代替模板为阴性对照。相对定量公式及表达量计算按文献[7]所述。
1.4 统计学处理
采用SPSS10.0软件进行数据分析,所有数据均采用均数±标准差(±s)表示。均数比较采用t检验。
2 结果
2.1 RNA纯度和完整性分析
所提取总RNA经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测,可见3条清晰的RNA带:28S、18S、5S由强变弱,条带清晰可见,无明显降解(图1)。紫外分光光度计检测,A260/A280比值1.80~2.0,表明RNA纯度较高。CD258基因在3组中均有表达,表达阳性率达到100%。
2.2 CD258基因和GAPDH基因在正常对照组、BPH组及Pca组的荧光定量检测
图2为正常对照组、BPH组及Pca组的GAPDH基因的荧光定量曲线。由图2可以看出,其Ct值较集中,说明各检测标本c DNA差别不大。图3为正常对照组、BPH组及Pca组的CD258基因的荧光定量曲线图,可以看出Pca组的Ct值较大,与正常对照组及BPH组相比,PCR扩增出现较晚,说明其CD258基因的表达量较正常对照组及BPH组低。
横坐标为扩增循环数,纵坐标为收集到的荧光强度,不同颜色代表不同样本的扩增曲线
2.3 D258基因表达的强度
在正常前列腺组织中CD258基因平均相对表达强度为(10.2±1.53);BPH组织中为(9.91±2.01);在PCa组织中为(3.14±1.72)。BPH组及正常对照组比较无统计学差异(P>0.05),PCa组与BPH组及正常对照组比较有统计学意义(P<0.05)。(见附表)。
3 讨论
新近命名的CD258是肿瘤坏死因子超家族的第l4个成员(TNFSF14),是MAURI[8]于1998年在研究HSV感染宿主细胞的过程中发现的HVEM的一个新配体。根据其发现过程与功能,CD258被命名为:可诱导表达的,并可与HSV的包膜糖蛋白D(g D)竞争结合T细胞上HVEM受体的淋巴毒素的同源体(homologous to lymphotoxins,exhibits inducible expression,and competes with HSV glycoprotein D for HVEM,a receptor expressed by T lymphocytes,LIGHT),为Ⅱ型跨膜糖蛋白,能以三聚体的形式诱导表达于活化的T细胞和选择性地表达于未成熟DC上,是一个多功能多效应分子。CD258不仅在T细胞的活化和增殖过程中有重要的共刺激作用,而且兼具诱导肿瘤细胞凋亡及细胞毒作用的多功能细胞因子。研究表明,CD258有可能在肿瘤的发病中扮演抑癌基因的角色[4,5,6,8,9,10,11]。
CD258的抗肿瘤作用,是其最早被揭示的生物学效应之一。ZHAI[9]将CD258基因转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,发现细胞的生长受到明显的抑制,其细胞培养基可明显抑制人结肠癌细胞株HT-29细胞的增生,提示CD258可以分泌性、可溶性的形式,发挥诱导肿瘤细胞凋亡作用。TAMADA[10]通过微质粒携带的方式,利用重组质粒pCD-NA3-CD258治疗肥大细胞瘤P815小鼠,证实治疗组比对照组体内的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性明显提高,也提示CD258具有抗肿瘤作用。本课题组关于CD258/IFN-γ对T24人膀胱移行细胞癌株作用的研究[11]也支持该结论。因此,本研究选择CD258作为目的基因,通过应用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)法检测CD258在PCa中的表达,以探讨CD258基因与PCa发病的关系,以深入了解PCa发病机制,并为其治疗提供新的治疗靶点及策略。
本研究应用的RQ-PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与常规PCR相比,具有特异性更强、有效地解决PCR污染和自动化程度高等特点。同时,荧光检测的灵敏度也更高,可用于检测低于100拷贝m RNA的表达,目前已得到广泛应用。LIVAK[7]设计了一种比较阈值法来测定目的基因的相对表达,根据数学推导得出目的基因的量=2-△△CT,在该公式中,C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数,⊿⊿Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组,所以,2-△△CT表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,这一方法比绝对定量更加简便省时。统计学结果表明,这一方法所获得的结果是相当可靠的。本实验中,笔者根据目的基因CD258和管家基因GAPDH的Ct值,计算CD258基因的表达相对于PCa的变化倍数,由此准确获得了CD258在Pca、BPH及正常组织中表达的强弱,有关结果应用相对定的专用软件REST-XL 2.0可直接计算得出。
本实验应用RQ-PCR方法检测了正常前列腺组织、BPH组织及PCa组织的CD258基因的表达,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳及测序保证其扩增的特异性。研究结果显示,CD258基因在3组中均有表达,表达阳性率达到100%。同时,本研究还对CD258基因在正常前列腺组织、BPH及PCa组织中的表达进行了定量分析。结果发现,在正常前列腺及BPH组织,CD258平均相对表达强度明显高于PCa组织。CD258基因在PCa中出现表达强度降低,提示CD258基因参与PCa的发生过程,可能在致病机制中起抑制肿瘤的作用。推测CD258抗肿瘤作用主要通过以下机制发挥作用[4,5,6,8,9,10]:与静止细胞上的受体HVEM结合,为T细胞的活化和增殖提供一个非CD28依赖的共刺激信号,激活肿瘤特异的CTL反应;在T细胞活化和增殖阶段,诱导分泌IFN-γ、GM—CSF等Th I型细胞因子;与受体LTβR结合,通过募集活化TRAF3,传递死亡信号,发挥直接的细胞毒作用,进而激活caspase导肿瘤细胞凋亡。
综上所述,CD258在PCa组织中出现较低的表达强度,提示其有可能与PCa的发病相关,为进一步深入探讨CD258在PCa发病的机制和分子功能的研究,提供了初步的参考与依据。
参考文献
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