鸭瘟病毒感染鸭（共5篇）
鸭瘟病毒感染鸭 篇1
随着人类对肠道正常菌群功能认识的深入,肠道菌群结构多样性和种群的动态变化也逐渐成为人们研究的热点。由于人们对许多细菌尤其是动物肠道内细菌的生存状况及其生理特性缺乏了解,绝大部分的细菌种群无法通过纯培养的方法获得,采用传统的细菌选择性培养和分型鉴定方法则会低估菌群的结构多样性,分离到的细菌种群也不一定是肠道中的代表菌、优势菌和主要功能菌。传统的微生物分离鉴定方法也无法实现对细菌群落结构变化的动态监测。随着分子生物学的发展,一些微生物分子生物学分型方法也已经被用于微生物群落结构多样性研究及种群动态变化的分子监控中。ERIC-PCR是Versalovic J等[1]在Sharples G J等[2]研究的基础上开创的一种用于研究菌群结构多样性的分子生物学分型方法,该法具有较高的分辩能力、稳定性和可重复性。试验采用ERIC-PCR法对鸭瘟病毒经皮下和口服感染鸭不同肠道内的菌群结构多样性及其动态变化进行研究,了解鸭瘟病毒感染鸭肠道菌群结构的变化规律,为鸭瘟病毒感染鸭非特异性黏膜免疫研究提供试验数据。
1 材料和方法
1.1 毒株
DPV CHv株,四川农业大学禽病防治中心分离、鉴定并保存。
1.2 试剂
TaqDNA聚合酶、SDS、饱和酚、蛋白酶K、dNTP、 DL-2 000 Marker,均购自宝生物工程(大连)有限公司; UltraPureTMPCR产物回收试剂盒、pMD18-T载体试剂盒、琼脂糖,购自北京塞百盛基因技术限公司。其他试剂均为分析纯。
1.3 试验鸭
健康四川麻鸭(20日龄),购自雅安地区非鸭瘟(DP)疫区,经ELISA检测鸭瘟病毒(DPV)抗体为阴性,PCR检测血液中鸭瘟病毒阴性。
1.4 引物合成
参照参考文献[1]设计引物:ERIC-1为5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′,ERIC-2为5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′,引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
1.5 反应体系和反应条件
参照参考文献[1]进行PCR反应。采用50 μL反应体系: 10×Taq Buffer(500 mmol/L KCl,100 mmol/L Tris-HCl,15 mmol/L MgCl2) 10 μL,25 mmol/L dNTP 1.5 μL,Taq酶1.5 μL,50 pmol上、下游引物各2 μL, DNA模板6 μL, ddH2O 27 μL。反应条件:95 ℃ 3 min; 94℃ 30 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 4 min, 35 个循环;72 ℃ 6 min。
1.6 试验动物分组和处理
将试验鸭随机分为3组:1组和2组分别为皮下感染组和口服感染组,每组50只,攻毒剂量为鸭瘟病毒Chv株每只0.25 mL(1 000LD50);第3组为对照组50只,隔离饲养。攻毒后于60 分钟、90 分钟、4小时、12小时、48小时、72小时、6天、9天、12天、15天采样,攻毒组和对照组每次采5只。分别收集十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠内容物放入80%甘油中,-20 ℃保存。对照鸭同时采样。
1.7 细菌模板总DNA的抽提
将上述预处理的样品从-20 ℃条件中取出,待溶后转入15 mL离心管中加入适量的PBS,涡漩2～3 min;充分悬浮清洗菌体,600 r/min离心3 min;取上清液加入适量PBS,涡漩2～3 min,700 r/min离心3 min;取上清液以6 000 r/min离心5 min;弃上清液,在沉淀中加入适量的-20 ℃预冷的丙酮,充分涡漩、清洗沉淀2～3次,6 000 r/min离心5 min;弃上清液,取沉淀按常规方法提取细菌DNA,所得DNA于-20 ℃保存,备用。
1.8 ERIC-PCR产物主带的回收、克隆
将ERIC-PCR产物的主带进行切胶回收,回收方法按北京赛百盛基因技术有限公司PCR产物纯化试剂盒提供的方法进行。回收产物的克隆按参考文献[3]进行。
1.9 质粒DNA的测序及分析
将质粒DNA送宝生物工程(大连)有限公司进行测序,测序结果用BLAST软件进行分析。
2 结果
2.1 正常对照鸭各肠段的菌群结构特征
正常鸭各肠段菌群DNA的ERIC-PCR扩增结果显示,同一个体各肠段菌群DNA的ERIC-PCR扩增条带数量以盲肠最多,其次为回肠、直肠和空肠,十二指肠最少。
2.2 鸭瘟病毒感染鸭各肠段菌群结构的变化规律
皮下攻毒组24 h和口服攻毒组48 h前,各肠段ERIC-PCR扩增条带没有明显变化,至皮下攻毒48小时和口服攻毒72小时时,ERIC-PCR条带大小和数量与正常鸭相比都存在一定差异,其中皮下攻毒组盲肠及口服攻毒组回肠的条带数量明显增加。随着感染时间的延长呈逐渐减少的趋势,其中以皮下攻毒组鸭表现最为明显,死亡鸭各肠段的ERIC条带最少(见图1～6)。在皮下攻毒组鸭直肠和口服攻毒组鸭盲肠、回肠和直肠的ERIC-PCR扩增条带中均可见1条大小介于250～500 bp之间的约300 bp的主带(亮度最高的DNA条带,如图3～6中箭头所示)。
M.DL-2 000 Marker; A.攻毒48 h;B.攻毒72 h;C.死亡鸭。
2.3 DNA序列与GenBank中已知细菌DNA序列的比对结果
M.DL-2000 Marker;A.死亡鸭;B.攻毒72 h;C.攻毒48 h。
M.DL-2 000 Marker;A.攻毒48 h;B.攻毒72 h;C.死亡鸭。
M.DL-2 000 Marker;A.攻毒72 h;B.攻毒12 d; C.攻毒15 d;D.攻毒9 d。
M.DL-2 000 Marker;A.攻毒72 h;B.攻毒15 d; C.攻毒9 d;D.攻毒12 d。
M.DL-2 000 Marker;A.攻毒72 h;B.攻毒15 d; C.攻毒9 d;D.攻毒12 d。
2.3.1 皮下攻毒48h直肠ERIC-PCR主带DNA序列的比对结果
测序结果通过BLAST与GenBank中登录序列进行比较,序列与大肠杆菌K-12 MG1655、W3110、O157:H7和志贺菌属的鲍氏志贺菌(Shigella boydii)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、副痢疾志贺杆菌(Shigella flexneri)和志贺痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)的同源性都较高。
2.3.2 口服攻毒72h盲肠ERIC-PCR产物主带DNA序列的比对结果
测序结果通过BLAST与GenBank中登录序列进行比较,BLAST分析结果同上。
2.3.3 口服攻毒72h回肠ERIC-PCR产物主带DNA序列的比对结果
测序结果通过BLAST与GenBank中登录序列进行比较,同源性都较低。此片段的来源菌可能是1个未知病原菌,也可能是肠道中的1个未知正常菌。
2.3.4 口服攻毒72h直肠ERIC-PCR产物主带DNA序列的比对结果
测序结果与GenBank中登录序列进行比较,序列与大肠杆菌K-12 MG1655、W3110、O157:H7和志贺菌属的志贺痢疾杆菌、鲍氏志贺菌、宋内志贺菌和副痢疾志贺杆菌的同源性较高,与沙门杆菌属的伤寒沙门杆菌和副伤寒沙门杆菌也有较高的同源性。
3 讨论
3.1 关于肠道内正常菌群的分布及其稳定性
正常情况下,肠道正常菌群是机体内一种相对稳定的微生态系统,与宿主相互依赖又相互作用,保持着动态的微生态平衡。虽然肠道内细菌的种类和数量会随着肠道内环境的改变和年龄的增长等生理因素而有所改变,但正常菌群的种类、每种细菌的数量及所占的比例、不同细菌所定居的部位等在每种动物是相对稳定的。试验对不同时间段内正常对照鸭各肠段菌群结构的检测结果表明:鸭各肠段内的菌群结构在正常情况下相对稳定,其中十二指肠和空肠的ERIC-PCR条带最少,可能是由于小肠(十二指肠和空肠)是个过渡区,肠液流量大,绝大部分细菌在繁殖前就被冲洗到远端回肠,十二指肠和空肠相对含菌量较少。回肠中的细菌浓度明显增加,因此ERIC-PCR条带也有所增加。盲肠中ERIC-PCR条带最多,郭延奎等[4]的研究结果也显示回肠和盲肠是肠道菌群定植最多的部位。
3.2 关于鸭瘟病毒感染鸭肠道菌群结构的变化规律
鸭瘟病毒经皮下和口服感染鸭后,皮下组48 h、口服组72 h ERIC-PCR条带的数量和大小发生改变,结合鸭瘟病毒对感染鸭免疫器官的噬性[5],表明当机体的免疫器官受到攻击,免疫力下降时,肠道正常菌群的微生态平衡被破坏,一些原籍菌和外籍菌得以大量繁殖,反映在临床上则多表现为鸭食欲减退,饮水量增加。而随着鸭瘟病毒在肠道内的大量繁殖,肠道黏膜受到了不同程度的破坏。皮下感染鸭后期,肠道出血严重,镜下可见大量肠绒毛脱落,使附着在肠黏膜上的细菌随之脱离肠壁,并随着肠道内容物排出体外,这可能是各肠道菌群ERIC-PCR条带随着病程的加重逐渐减少的原因之一。有研究结果表明:黏膜免疫系统是机体免疫系统的重要组成部分,抗原经消化道、呼吸道和生殖道进入机体可有效激活黏膜免疫系统[6,7]。分泌型IgA(SIgA)是黏膜免疫系统的主要免疫球蛋白,可调节肠道菌群的分布,并有效防止正常菌群发生移位和细菌对黏膜的穿透作用[8],在一定程度上减缓了菌群失调的速度,这可能是口服组ERIC-PCR条带减少的速度没有皮下组快的原因之一。结合感染鸭肠道的损伤程度及肠道菌群的变化规律可以看出,肠道菌群变化越明显,肠道黏膜的损伤也越严重,表明肠道菌群的平衡与肠道黏膜的损伤程度相关,维持肠道菌群的平衡对机体的健康也至关重要。
3.3 关于鸭瘟病毒感染鸭肠道内优势菌分析
家鸭肠道内正常菌群多以厌氧菌为主,这与其他动物基本相似。当机体发生菌群失调性腹泻时,需氧菌和兼性厌氧菌数量增加。对ERIC-PCR产物主带的测序及DNA序列比对结果显示,需氧菌或兼性厌氧菌成为攻毒鸭肠道中的优势菌群。除大肠杆菌K-12 MG1655为非致病菌株外,其他几种同源性较高的细菌都是临床上能引起痢疾症状的主要病原微生物之一。由于鸭瘟病毒感染使机体免疫力下降或丧失,肠道黏膜功能不正常和菌群失调等因素,导致外籍菌尤其是致病菌如大肠杆菌、志贺菌和沙门杆菌得以在此繁殖,这也可能是感染鸭瘟病毒鸭发病时,临床上通常会表现出不同程度下痢的原因之一。口服攻毒鸭回肠ERIC-PCR主带经测序比对,与GenBank已经登录的序列同源性都较低,因此该序列的来源菌可能还没有被人们所认识,为未知菌,这也说明传统的分离培养方法并不能对菌群结构进行全面的估计,而ERIC-PCR方法能够弥补这方面的不足。
摘要：应用ERIC-PCR法对鸭瘟病毒强毒株经皮下和口服感染20日龄鸭的十二指肠、空肠、回肠、盲肠和直肠中细菌菌群的结构多样性和动态变化进行了检测。结果表明:对照鸭肠道内的菌群结构相对稳定,其中十二指肠和空肠的ERIC-PCR条带最少,盲肠最多;皮下感染24 h和口服48 h前,各肠段ERIC-PCR扩增条带没有明显变化,皮下感染48 h的鸭盲肠、口服感染72 h的鸭盲肠和回肠条带数量明显增加,随着感染时间的延长,条带数呈逐渐减少的趋势,死亡鸭各肠段的条带最少。对ERIC-PCR扩增条带中主带的测序结果表明,大肠杆菌、志贺菌、沙门杆菌等需氧菌或兼性厌氧菌成为皮下感染鸭的直肠、口服感染鸭的盲肠(回肠和直肠)的优势菌群;口服感染鸭的回肠中一个未知菌成为优势菌群。
关键词：ERIC-PCR,鸭瘟病毒感染鸭,肠道菌群结构
参考文献
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[8]IAMM M E.Interaction of antigens and antibodies at mucosal sur-faces[J].Annu Rew Microbiol,1997,51:311-340.
鸭瘟和鸭病毒性肝炎鉴别诊断 篇2
1 鸭瘟和鸭病毒性肝炎定义
(1)鸭瘟又叫鸭病毒性肠炎是由鸭瘟病毒引起的一种急性败血性传染病。是鸭、鹅、天鹅、雁等水禽的一种急性、高度死亡率的传染病,是危害养鸭业最为严重的一种传染病,所以都把鸭瘟视为养鸭业的大敌。
(2)鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起的雏鸭的一种传播迅速和高度致病的传染病。特征是体积增大和有出血斑点,开始发病时的死亡率高达90%以上,造成很大损失。
2 病源
(1)鸭瘟病毒属疱疹病毒科的病毒。核酸为双股DNA。在核内的病毒粒子直径为91nm,其芯直径为48nm,在胞浆内的病毒粒子直径为181nm,芯直径为75nm。本病毒对外界环境的抵抗力不强。病毒在4~20℃污染的禽舍内存活5d,80℃下加热5min死亡。但对低温抵抗力较强,在-5~-7℃经3个月毒力不减弱。对消毒药品抵抗力较弱,0.1%升汞10min,0.5%漂白粉和5%石灰乳30min可致弱和杀死病毒。
(2)鸭肝炎由3种不同病毒引起,分别是鸭肝炎病毒(DHV)I、II、Ⅲ型,最常见的为DHVI型,属肠道病毒,DHVⅡ型呈星状病毒,DHVⅢ型呈小核糖核酸病毒。DHVI IIⅢ型有明显差异,各型之间上交叉免疫性。本病由I病毒感染所致。病毒的大小20~40nm,能够在发育鸡胚的尿囊内生长繁殖,但不大适应一般的细胞培养。病毒对外界环境的抵抗力很强,在污染的育雏室内的病毒至少能够生存10周,阴湿处粪便中的病毒能够存活37d。含有病毒的胚液保存在24℃冰箱内700d后仍保持存活。病毒在2%来苏儿溶液中37℃能够存活1h,在0.1%福尔马林中能够存活8h。
3 问诊鉴别
(1)如果发病鸭经为成鸭或者成鸭发病多于幼鸭,主要危害成年鸭和青壮年鸭,则可初步诊断为鸭瘟的可能性大于病毒性肝炎。
(2)如果发病鸭多为雏鸭或者是绝大部分为雏鸭,而成鸭很少发病,主要危害雏鸭,则可初步诊断为鸭病毒性肝炎的可能性大于鸭瘟。
4 临床诊断鉴别
4.1 鸭瘟
急性、败血性传染病。主要是产蛋鸭、成鸭的发病率和病死率高于1月龄以内的雏鸭,发病率高和死亡率高。发热、腹泻、怕光、肿头流泪,眼周围有分泌物,两颊麻痹和排绿色稀粪,两腿麻痹。剖检可见皮肤有出血点,皮下组织胶样浸润,消化道黏膜充血,有坏死假膜或溃疡,泄殖腔黏膜充血、出血和水肿、坏死,肝脏间有不规则大小不一的坏死和出血点。
4.2 鸭病毒性肝炎
雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病。仅发生于鸭,雏鸭发病严重,易感性和病死率随雏鸭日龄的增大而降低。发病常见于5~10日龄雏鸭。病死率较高。特征为发病急,传播迅速死亡率高,肝脏肿大,有出血点和神经症状。初发病时表现精神委顿、缩颈、翅下垂、不爱活动,行动呆滞或跟不上群,厌食、运动失调。发病12~24h即发生全身性的抽搐,病鸭多侧卧,头向后背,两脚痉挛性地蹬踏,有时在地旋转十几分钟即死亡,喙短褐,爪尖瘀血呈暗紫色。少数病鸭死前排黄白色或绿色稀粪,有时死亡之快惊人。内脏主要变现为肝脏肿胀,发黄红色或花斑状,表面见有大小不等的出血点、出血斑,胆囊肿大,充满胆汁;脾脏有时肿大,外观也类似肝脏的花斑;多数肾脏充血、肿胀;心肌如煮熟状;有些病例有心包炎、气囊中有微黄色渗出液和纤维素絮片。
4.3 鸭病毒性肝炎与鸭瘟鉴别
鸭瘟是由鸭瘟病毒引起鸭的一种高死亡率的急性传染病,虽然各种日龄的鸭均可感染发病,但3周龄以内的雏鸭较少发生死亡,而病毒性鸭肝炎对1~2周龄易感雏鸭有极高的发病率和致死率,超过3周龄雏鸭不发病,这在流行病学上是重要鉴别之一。从患鸭瘟的鸭食道、泄殖胯和眼睑黏膜呈出血性溃疡和假膜为主要特征性病变,与鸭病毒性肝炎完全不同,可作为重要鉴别之一。用抗鸭瘟病毒高免血清和抗鸭病毒性肝炎高免血清,在易感1~7日龄雏鸭作交叉中和试验,或交叉保护试验,可作为重要鉴别之二,必要时用鸭胚和鸡胚作为病毒分离检验。
5 流行特点
5.1 鸭瘟
流行没有季节性,一年四季都有发生。通常在春夏之交和秋冬流行比较严重。
5.2 鸭病毒性肝炎
本病一年四季都有发生,春、夏、秋季多发,在暴发时仅发生于雏鸭,一旦发生,发病率可达100%。
6 防治
6.1 鸭瘟
本病可用抗鸭瘟高免血清,进行早期治疗,每只鸭肌肉注射0.5ml,有一定疗效;因此更重要的是要采取综合防制措施。预防鸭瘟应避免从疫区引进鸭,还要禁止在鸭瘟流行区域和野水禽出没区域放牧。平时对禽场和工具进行定期消毒。在受威胁区内,所有鸭注射鸭瘟弱毒疫苗。产蛋鸭宜安排在停产期或开产前一个月注射。肉鸭一般在20日龄以上注射一次即可。发生鸭瘟时应立即采取隔离和消毒措施,对鸭群用疫苗进行紧急预防接种,必要时剂量加倍,可降低发病率和死亡率。
6.2 鸭病毒性肝炎
从健康鸭场引进种苗,严格执行消毒制度;免疫防治:用鸭病毒性肝炎I型弱毒疫苗进行免疫接种,成鸭于产蛋前半个月,肌注1~2头份/只,产蛋中期,肌注2~4头份/只。雏鸭出壳后1日龄或7日龄皮下注射1头份/只。
摘要：鸭瘟和鸭病毒性肝炎一直是困扰养殖户的重大问题,发病死亡率高,给养殖鸭业带来很大的威胁,通过鉴别作出合理防治,降低损失,增加养殖效益。
番鸭细小病毒感染的诊断 篇3
1 发病情况
2010年, 贵州省一养殖户从广西引进番鸭苗1 000只, 鸭苗出壳30小时后从广西启运, 约18小时后到达育雏地, 运输途中即有28只雏鸭发生死亡。鸭苗进入育雏室后, 部分鸭苗出现开食开饮障碍, 伏于育雏网拒食拒饮, 粪便细长呈粗丝状悬于网格间。育雏首日即死亡82只, 随着日龄增加, 死亡不断增加, 2~6天日均死亡24只, 7~9天日均死亡38只;10日龄时死亡率突然升高, 至13日龄, 4天共有467只死亡;14日龄后死亡率开始下降, 至20日龄病情基本稳定时只剩余雏鸭113只。整个育雏阶段病鸭死亡率高达88.7%。幸存鸭生长迟缓或不生长成为僵鸭。
2 临床症状
对剩余雏鸭进行称重, 平均体重仅190 g。鸭只死亡前, 先出现不食, 极少饮水, 离群呆立, 不时尖叫, 随后伏于网上不愿活动, 头向前伸, 死亡前身体反仰, 双脚无力来回划动, 最终转为无力抽动, 并很快死亡, 死亡前泄殖腔周围羽毛沾满水便。从出现症状至死亡, 大约经历20小时。除精神状态不正常外, 最为明显的是部分病鸭粪便灰白, 细长富有粘性, 常沾于泄殖腔周围, 粪便较稀, 内有絮状物及未消化的饲料糊状物。
3 病理剖检
对30只不同日龄病鸭进行解剖, 病理变化表现较为一致, 最为典型的病变是所有鸭肝脏颜色鲜艳呈蛋黄色, 略肿, 表面非均匀分布出血点或出血斑;腺胃严重膨大变形, 腺胃黏膜大面积脱落。 22只病鸭肠道臌气, 18只病鸭脾脏肿大并严重出血, 9只病鸭脾脏萎缩并出血, 9只病鸭心脏变圆、肿大。
4 实验室检验
4.1 材料
5只3日龄病番鸭心血、肝脏;DNA和RNA提取试剂盒及分子生物学诊断试剂 (购于大连宝生物有限公司) ;非免疫健康雏鹅 (购于贵州小鹅瘟非疫区农户) ;鸭瘟病毒DNA阳性对照、Ⅰ型鸭病毒性肝炎弱毒疫苗RNA阳性对照 (贵州大学动物科学学院惠赠) 。
4.2 方法
4.2.1 分子生物学检测
4.2.1.1 番鸭细小病毒核酸检测
将病鸭肝脏加适量生理盐水研磨后, 利用大连宝生物有限公司出售的DNA提取试剂盒提取DNA样本, 针对番鸭细小病毒VP3基因进行PCR扩增。上游引物P1: TAG CAT GTT CGC TCA TTC ACA;下游引物P2: CAT TTC GAG GTT CTT GTA GGT CT, 预扩增片段536 bp。PCR反应体系:DNA模板3 μl;10×PCR Buffer 5 μl, MgCl2 (25 mmol/L) 3 μl, dNTPs (10 mmol/L) 1 μl, Taq DNA聚合酶 (2.5 U/μl) 1 μl, 上下游引物 (20 μmol/L) 各1 μl, 灭菌双蒸水35 μl。反应条件:94 ℃预变性5 min, 再94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 35个循环, 最后72 ℃延伸5 min。反应结束后取5 μl产物电泳检测。
4.2.1.2 鸭病毒性肝炎病毒核酸检测
将病鸭肝脏利用RNA提取试剂盒提取RNA样本, 针对鸭病毒性肝炎病毒VP1基因, 利用大连宝生物有限公司RT-PCR一步法试剂盒进行检测。上游引物P1:5′-CAGTTTACCGCCCCACTCTAT-3′;下游引物P2: 5′-TGGCTTCCACCTCCTCTTCAT-3′, 扩增片段699 bp。反应体系:PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μl, 2×1 Step Buffer 25 μl, 上下游引物 (20 μmol/L) 各1 μl, RNA 模板2 μl, Rnase Free dH2O 19 μl。反应条件:50 ℃预变性30 s, 94 ℃变性2 min后进入循环, 94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 共35个循环, 最后72 ℃延伸5 min。反应结束后取5 μl产物进行电泳检测。
4.2.1.3 鸭瘟病毒核酸检测
以肝脏DNA为模板, 针对鸭瘟病毒NP基因进行PCR检测, 上游引物P1: 5′-GGACAGCGTACCACAGATAA-3′;下游引物P2: 5′-ACAAATCCCAAGCGTAG-3′, 扩增片段498 bp。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min, 再94 ℃变性1 min, 51.8 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min, 共35个循环, 最后72 ℃再延伸5 min。反应结束后, 取PCR产物5 μl进行电泳检测。
4.2.2 与小鹅瘟病毒鉴别诊断
将病鸭肝脏匀浆液无菌处理后, 以5 ml/只通过消化道接种3日龄非免疫健康雏鹅, 每份病料接种雏鹅2只, 连续20天观察接种鹅生长发育情况, 以鉴别番鸭是否存在小鹅瘟病毒感染。
4.2.3 细菌分离
将病鸭心血、肝脏无菌操作接种鲜血琼脂培养基, 37 ℃分别进行厌氧和正常培养。
5 诊断结果
5.1 分子生物学检测
针对番鸭细小病毒核酸进行PCR扩增, 产物经电泳染色, 置凝胶成像系统观察, 结果见图1。
扩增结果表明: (1) 在检测的5只病鸭DNA样本中, 3只检测到特异性条带, 检出率60%, 条带大小536 bp左右, 与阳性对照一致, 与预期扩增相符, 而阴性对照未扩增出任何条带。 (2) 鸭病毒性肝炎病毒和鸭瘟病毒除阳性对照扩增出特异性条带外, 检测样本和阴性对照均没有扩增出任何条带, 表明病鸭不存在鸭瘟和鸭病毒性肝炎感染。通过以上分子生物学检测结果表明, 鸭群已被番鸭细小病毒感染。
5.2 与小鹅瘟病毒的鉴别
10只试验雏鹅接种病料后, 生长发育正常, 始终未表现出任何小鹅瘟症状, 说明病鸭组织中不存在小鹅瘟病毒, 鸭群没有被小鹅瘟病毒感染。
5.3 细菌分离
病料接种后, 无论厌氧还是正常培养, 均无细菌, 说明病鸭无细菌感染。
6 小结
6.1 长期以来, 番鸭细小病毒病主要流行于广东、福建等地, 贵州省还未见该病的报道。近年来贵州省开始从浙江、广西等省引进番鸭进行饲养, 番鸭细小病毒随之入侵, 此次广西引进番鸭发生番鸭细小病毒感染即是证明, 应引起番鸭养殖者重视。
6.2 在引进鸭苗时, 最好选择在规范化、标准化、信誉较好的养殖场引种 (苗) , 以避免因引入病苗而造成损失。
6.3 番鸭细小病毒病毒病可通过种鸭和雏鸭接种弱毒疫苗进行预防。对发病鸭主要通过高免血清和卵黄抗体进行治疗。
参考文献
[1]辛朝安.禽病学[M] (第二版) 北京:中国农业出版社, 2003.139~142.
鸭瘟病毒感染鸭 篇4
1 临床特征
福建省某区域养殖专业人士经常在果树中放养草鸡、肉鹅、番鸭等家禽。于2015年6月购入苗番鸭2 000只, 使用平养地面垫料方式育雏, 饲养6日龄病番鸭前后防渗疫情。病鸭主要出现羽毛蓬松、两翅膀、下垂、厌食、呼吸困难、离群和不同程度的腹泻等行为, 养殖人员服用罗红霉素等治疗并未取得明显效果, 病鸭数量不断增加, 且闭目呈昏睡状态, 行动困难、羽毛蓬松、长期侧卧。后期张口呼吸, 鼻腔内流出浆状液体, 口流稀液, 表现为棕褐色或绿褐色。濒临死亡前双脚麻痹, 且死亡率较高。图1所示为病鸭张口呼吸图。
2 剖检病变
刨检病理发现, 病死番鸭主要出现肝囊充盈、脾脏与肾脏肿大等问题;胰腺肿大且表面经常散布针尖大小的灰白病灶;病死番鸭肠道出现不同程度的炎症, 且伴有不同程度的充血与点状出血;十二指肠与直肠后黏膜较严重;少数番鸭在盲部肠端出现不同程度的膨胀与质地坚硬等现象, 类似香肠状, 肝脏肿大容易碎, 色淡, 表面被纤维蛋白所浮着;部分出现番鸭心包膜增厚等现状, 腹腔内出现黄色积液[2]。
3 实验室检查
3.1 收集并处理病料
无菌收集濒临死亡的番鸭的脾、肝脏和胰腺等组织, 并将其制作为冰冻切片进行检测。
3.2 检测番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒
进行免疫荧光抗体检查。使用长谷冰冻切片机将收集并处理好的病料切成5μm厚度的薄片, 并将其贴在脱脂较好的载玻片上, 干燥后在丙酮室内固定12 min, 并将载玻片放置于30℃的染色架上进行水域, 同时向组织切片滴加2/1 000稀释好的荧光抗体进行染色处理, 0.5 h后取出。使用生理盐水进行冲洗, 并加入1∶50倍稀释的FITC-羊抗小鼠Ig G, 孵育0.5 h, 再使用生理盐水进行冲洗, 之后加入PBS-甘油封片, 进行镜片检查。结果番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒均显示出亮绿色荧光灶。
3.3 检测新型鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒和鸭肝炎病毒
取出250 m L的病料匀浆样品, 使用TRIzol产品, 试剂抽提RNA, 并按照实验室方法进行RT-PCR, 扩增产物可以在10 g/L的琼脂糖浆胶上进行电泳鉴定。电泳试验实现, NDRV、DHV与MDRV等均为检出特异性片段。
4 诊断结果
根据病理学分析及上述检测结果, 可以确诊番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒主要为混合感染。
5 防控措施分析
经过上述分析, 人们已经熟练地掌握了该病的病原, 并及时对没有发病的雏鸭和病鸭进行了隔离处理, 同时对鸭舍、鸭用具等进行了彻底清理和消毒。饲养鸭子时还给其饮用水中添加了电解多维, 给其肥料中添加了恩诺沙星, 主要目的是提高机体自身的抵抗力, 防止继发性感染, 同时结合效果较强的双黄连及情瘟败毒散等中药对疑似发病鸭进行了治疗, 之后控制了番鸭饲养区域的病情传播, 减少了养殖场的经济损失, 取得了很好的控制结果。
6 研究体会
第一, 雏番鸭鹅细小病毒感染也可以称之为雏番鸭小鹅瘟, 是侵害雏番鸭的严重特定性传染疾病, 主要病原为鹅细小病毒, 通常雏番鸭和雏鹅常发此病。经过本次分析发现, 串养雏鸭和番鸭最容易感染此种疾病。因此, 在实际生产和养殖中, 必须重视雏番鸭和小鹅瘟之间的相互传染, 积极做好免疫预防等工作, 及时对幼小或免疫功能较弱的雏番鸭注射防疫育苗, 防止感染。
第二, 鹅细小病毒具有传播速度快、死亡率高等特点, 给番鸭养殖造成了很大危害, 在实际工作中, 必须引起相关人员的重视, 尽早诊断, 尽早实施对症治疗。临床上通常将雏番鸭鹅细小病毒与雏番鸭小鹅瘟相混淆, 但雏鸭小鹅瘟肝脏、肾脏及脾等不会出现白色坏死点。
第三, 番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒在分类学上均属于病毒科细小病毒。两者的病毒形态、结构蛋白、大小、核算类型及理化特征等非常相似, 而且流行病学、病例变化和临床症状等也非常类似, 所以临床上经常会混淆两种病。现阶段相关研究表示, 番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒的单克隆抗体和血清等方面存在差异, 已成为当前检测这两种病原的主要方法, 具有诊断快速、简单和特异性等特点, 具有较广的诊断意义。
本次研究中主要使用RT-PCR与IFA等方法检测出番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒的病原。经过分析发现, 鸭群会率先感染番鸭细小病毒, 而且其肝脏等组织均发生了不同程度的损伤, 降低了免疫力, 由于没有引起重视, 导致之后感染了番鸭小鹅瘟病毒, 混合感染病毒疫情较严重, 给养殖户造成了巨大的经济损失, 必须加强防控, 提高养殖安全。
7 结语
在经济发展的带动下, 我国番鸭细小病毒发病数量不断增加, 而且临床上番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒混合感染较常见, 具有传播速度快、死亡率高等特点, 主要侵害免疫功能较弱的幼龄雏鹅和雏番鸭。为了提高养殖安全, 扩大养殖规模, 必须及时利用科学方法诊断并防治疾病, 避免对水禽饲养造成影响。
摘要：番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒都是引起小鹅瘟和番鸭细小病毒的主要病原。由于疫苗保护性差, 所以致病性不同。小鹅瘟病毒既会感染鹅也会感染番鸭;番鸭细小病毒仅仅发病于番鸭。基于此, 系统地介绍番鸭细小病毒与小鹅病毒混合感染的诊治, 以期给相关研究人员提供借鉴。
关键词：番鸭细小病毒,小鹅瘟病毒,混合感染诊治
参考文献
[1]杨旭东, 王刚.鹅细小病毒和番鸭细小病毒鉴别诊断方法[J].中国畜禽种业, 201 (59) :136.
鸭瘟病毒感染鸭 篇5
鸭坦布苏病毒病(DTVD)病原为鸭坦布苏病毒(DTV),是在2010年出现在我国南方主要养鸭地区的一种导致产蛋率严重下降的疫病,主要病理变化为卵泡变性、出血,脾脏出血、肿大,蛋鸭产蛋率下降,雏鸭和青年鸭表现站立不稳、倒地不起等神经症状[3]。该病发病迅速,传播快,给蛋鸭和种鸭的养殖造成严重经济损失。
鸭病毒性肝炎和鸭坦布苏病毒病是经常发生在鸭场的两种重要的病毒性疾病。笔者通过对某鸭场送检的病料进行了综合检测和PCR诊断,最终确定该鸭场发生了鸭病毒性肝炎和鸭坦布苏病毒病的混合感染,现将诊断过程报道如下。
1 临床症状
诸城市某鸭场饲养的1 000余只雏鸭发病,发病率在20%左右,发病雏鸭死亡快速,表现精神沉郁、少食,发病后2~7 d死亡,死亡时背颈缩脖,角弓反张,有神经症状。
2 解剖病变
取送检的2只病死鸭进行病理剖检,解剖后可见心脏、肺脏出血;脾脏肿大;肝脏出血;卵泡出血,表面有出血点和出血斑。根据临床症状和解剖病变初步怀疑该鸭场鸭只发生了病毒性疾病,具体为何种病毒感染有待实验室进一步应用PCR(RT-PCR)法进行确诊。无菌采集病死鸭的肝脏、卵泡及少量脾脏组织送至诸城市畜牧兽医管理局动物疫病预防控制中心实验室进行诊断。
3 PCR诊断
将送检的病料研磨处理,按1∶3加入生理盐水,反复冻融3次,12 000 r/min离心取上清液,按照病毒基因组提取试剂盒的使用说明书提取病毒基因组,根据参考文献[4,5,6,7]中的方法按不同的反应条件进行PCR检测,同时检测鸭病毒性肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ型)和新型(DHV-新型)、鸭瘟病毒(DPV)、新城疫病毒(NDV)、鸭圆环病毒(Du CV)、鸭坦布苏病毒(DTV)、鸡减蛋综合征病毒(EDS-76)等几种常见鸭病病原。引物序列、扩增片段及PCR(RT-PCR)反应程序见表1。
PCR扩增结束后,取5μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,DHV-新型、DTV检测结果为阳性,且扩增条带与预期大小相符,DHV-Ⅰ型、DPV、NDV、Du CV、EDS-76检测结果均为阴性,没有特异性扩增产物,PCR电泳结果见图1。
M.DL-2 000 Marker;1.DHV-Ⅰ型;2.DHV-新型;3.DPV;4.NDV;5.Du CV;6.DTV;7.EDS-76。
4 防治措施
通过PCR检测,最后确诊该鸭场发生了新型鸭病毒性肝炎病毒与鸭坦布苏病毒的混合感染。鸭病毒性肝炎主要致病的是Ⅰ型,近年来鸭病毒性肝炎Ⅰ型不断发生变异,出现了Ⅰ型的变异毒株称为新型鸭病毒性肝炎。鸭病毒性肝炎一年四季都可以发生,该病毒的防治主要有三种方法:首先,注射免疫血清使雏鸭获得人工被动免疫,可以通过免疫高免卵黄抗体使一些处于感染早期的雏鸭抵御病毒的攻击逐渐康复,但使用的高免血清和卵黄抗体要与发病的毒株属于同一种血清型才有保护作用;其次,该病的预防可以通过免疫种鸭使后代雏鸭获得高水平的天然被动免疫;第三,直接用安全可靠的鸭病毒性肝炎活疫苗弱毒株免疫雏鸭,使雏鸭获得人工主动免疫。该病的防治以鸡胚化弱毒疫苗、灭活疫苗、高免血清和高免卵黄抗体为主[8]。
鸭坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属,又名鸭黄病毒,该病毒可以引起蛋鸭产蛋下降、出血性卵巢炎(又名鸭出血性卵泡炎)[9]。鸭坦布苏病毒感染诊断主要靠实验室检查,鸭坦布苏病毒病也可以通过注射高免血清、卵黄抗体及应用安全可靠的疫苗达到防控的目的[10]。建议该鸭场平时加强饲养管理,及时隔离发病鸭,早期确诊治疗,加强疾病的免疫预防。
参考文献
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