生物信息学分析

生物信息学分析（共12篇）

生物信息学分析 篇1

在植物的生长发育过程中,从早期的胚胎发育至后期侧生器官的分化,极性的建立起着重要的作用。随着遗传学和分子生物学技术的发展,人们对植物极性建立分子机理的认识也深入到分子水平。背腹极性是植物侧生器官发育过程中建立的主要极性之一,YABBY基因家族在控制背腹极性建立中发挥重要作[1]。在拟南芥中已分离出6个YAB基因家族成员:CRC、FIL(YAB1)、YAB2、YAB3、INNER NO OUTER(INO)和YAB5[2,3,4]。此外,人们陆续从金鱼草、水稻等植物中分离出YABBY基因家族成员,这表明YABBY基因广泛地存在于双子叶植物与单子叶植物中[5,6,7]。

虽然在双子叶植物拟南芥中关于背腹极性建立的分子机理取得了重要进展,然而在单子叶植物尤其是禾本科植物中所获得的涉及极性建立的突变体较少,因此关于单子叶植物的背腹极性建立的模式研究较少。小麦是主要的禾本科植物之一,同时也是重要的粮食作物,研究其极性建立具有非常重要的意义。为了研究小麦侧生器官极性建立的分子机理,笔者已经分别从小麦的小穗及心皮中分离出2个具有YABBY基因保守区域特征的基因成员Ta YAB1与Ta CRC,并在Gen Bank中注册。Ta YAB1基因的c DNA全长为1 216 bp,编码297个氨基酸。Ta CRC基因的c DNA全长为1 103 bp,编码199个氨基酸。这2个基因编码的氨基酸序列在N端具有zinc finger-like结构域,在C端具有YABBY结构域,是YABBY基因家族成员[8]。本研究以Ta YAB1与Ta CRC为研究对象,利用生物信息学方法,对这2个基因编码的蛋白结构与功能进行预测,同时构建其同源基因的系统进化树,从而为揭示小麦侧生器官背腹极性建立的分子机理提供重要资料。

1 材料与方法

1.1 材料

以从小麦的小穗及心皮中分离出的YABBY基因家族成员Ta YAB1(AY330228)与Ta CRC(AF545436)作为研究对象。

1.2 Ta YAB1与Ta CRC蛋白基本理化性质分析

利用Expasy软件包中的Prot Param工具(http://www expasy.ch/tools/protparam.htm L)[9],进行蛋白的氨基酸组成、分子质量、等电点及疏水性等理化性质的分析。

1.3 Ta YAB1与Ta CRC蛋白结构分析

利用Swiss model workspace(http://swissmodel.expasy org/workspace/)[10]网站工具预测Ta YAB1与Ta CRC蛋白的二级结构。

1.4 Ta YAB1与Ta CRC蛋白亚细胞定位与功能分析

利用CBS(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)网站工具,对Ta YAB1与Ta CRC蛋白进行跨膜分析预测。利用(http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/)网站工具预测蛋白的信号肽。利用PSORT(http://psort.nibb.ac.jp/form2.htm L)网站工具进行Ta YAB1与Ta CRC蛋白亚细胞定位预测[11]。利用CBS(http://www.cbs.dtu.dk/services/Prot Fun/)网站工具,预测蛋白的功能。

1.5 Ta YAB1与Ta CRC蛋白序列系统进化树构建

利用NCBI数据库中的Blast软件将目的基因编码的氨基酸序列与Gen Bank中的氨基酸序列进行比对和相似性搜索,进而利用DNA man软件进行多序列同源性比对和聚类分析。聚类分析包括以下序列:小麦的Ta YAB1(AAQ93323)和Ta CRC(AF545436);水稻的Os YAB1(AAC72848),Os Y-AB2(AAS07125)、O s YAB3(NP_922256)、Os YAB5(CAD-41530)和DL(BAD06552);拟南芥的FIL(AAD33715)、YAB2(AAD33716)、YAB3(AAD33717),YAB5(NM_179750)、INO(AAF23754)和CRC(AAD30526);金鱼草的GRAM(AAS-10177)和PROL(AAS10178)。

2 结果与分析

2.1 Ta YAB1与Ta CRC蛋白基本理化性质分析

Ta YAB1蛋白分析结果:分子质量为31 431.5,等电点为8.62;负电荷残基总数(Asp+Glu)为20,正电荷残基总数(Arg+Lys)为23,分子式为C1379H2168N404O417S11,原子总数为4 379,不稳定系数为60.23,该蛋白分类为不稳定蛋白。脂肪系数为71.08,Grand average of hydropathicity(GRAVY)亲水性评估为-0.358。该蛋白中相对含量比较多的氨基酸为Ala(35个,占11.8%),含量比较少的氨基酸是Trp(1个,占0.3%)。

Ta CRC蛋白分析结果:分子质量为22365.7,等电点为9.24;负电荷残基总数(Asp+Glu)为18,正电荷残基总数(Arg+Lys)为26,分子式为C977H1548N290O283S15,原子总数为3 113,不稳定系数为54.62,该蛋白分类为不稳定蛋白,脂肪系数为62.71,亲水性评估为-0.585。该蛋白中相对含量比较多的氨基酸Pro(31个,占13.1%),含量比较少的氨基酸是Trp(2个,占1.0%)。

2.2 Ta YAB1与Ta CRC蛋白结构分析

Ta YAB1蛋白二级结构分析预测,有95个α-螺旋,占32%,38个伸展片段,占13%,164个自由卷曲,占55%。Ta CRC蛋白二级结构分析预测,有73个α-螺旋,占37%,22个伸展片段,占11%,104个自由卷曲,占52%。结果表明,Ta YAB1和Ta CRC蛋白的二级结构的构成和比例基本一致(见表1)。

2.3 Ta YAB1与Ta CRC蛋白亚细胞定位与功能分析预测

Ta YAB1与Ta CRC蛋白跨膜区及蛋白的信号肽分析结果表明,Ta YAB1与Ta CRC蛋白不是膜蛋白,无跨膜区,属于非分泌性蛋白。Ta YAB1与Ta CRC蛋白亚细胞定位预测结果表明,Ta YAB1蛋白定位于细胞核、细胞质、胞外、线粒体、分泌系统囊泡及细胞骨架的概率分别是47.8%、17.4%、13.0%、13.0%、4.3%及4.3%。Ta CRC蛋白定位于细胞核、细胞质、线粒体、分泌系统囊泡及内质网的概率分别是56.5%、17.4%、17.4%、4.3%及4.3%。由此可知,Ta YAB1与Ta CRC蛋白定位于细胞核的概率最大(见表2)。同时蛋白的亲水特性表明该蛋白是亲水性蛋白,从而推断这2个蛋白可能都定位于细胞核内。

Ta YAB1与Ta CRC蛋白的功能预测结果表明,Ta YAB1蛋白具有转录、转录调控功能的概率分别为0.145和0.075,其概率高于其他功能(见表3)。Ta CRC蛋白具有转录、转录调控功能的概率分别为0.225和0.347,其概率高于其他功能(见表3)。由此说明Ta YAB1与Ta CRC可能具有转录与转录调控功能。

(%)

2.4 Ta YAB1与Ta CRC蛋白系统进化树构建

用NCBI数据库中的Blast软件将目的基因编码的氨基酸序列与Gen Bank中的氨基酸序列进行比对和相似性搜索,进而利用DNAman软件包中的MASED软件,对来自拟南芥、金鱼草、水稻和小麦的15个YAB家族成员,采用Neighbor-Joining的方法进行进化树分析,发现Ta YAB1与水稻的Os YAB3与Os YAB5聚为同一分支,Ta CRC与水稻的DL、拟南芥的CRC聚为同一分支(见图1)。

3 结论与讨论

生物信息学是生物学与计算机科学以及应用数学等学科相互交叉而形成的一门新兴学科,将计算机科学和数学应用于生物大分子信息的获取、加工、存储、分类、检索与分析,以达到了解这些生物大分子信息的生物学意义。分别从小麦的小穗及心皮中分离出分离出2个具有YABBY基因保守区域特征的基因成员Ta YAB1与Ta CRC,在此基础上对其进行生物信息学分析。利用expasy中的Prot Param工具进行蛋白的氨基酸组成、分子质量、等电点及疏水性等理化性质的分析。Ta YAB1与Ta CRC蛋白分类均为不稳定蛋白,Ta YAB1蛋白中相对含量比较多的氨基酸为Ala,含量比较少的氨基酸是Trp。Ta CRC蛋白中相对含量比较多的氨基酸为Pro,含量比较少的氨基酸是Trp。通常根据蛋白的GRAVY值来预测蛋白疏水性,GRAVY值的范围在2与-2之间,正值表明此蛋白为疏水蛋白,负值表明为亲水蛋白。Ta YAB1与Ta CRC的GRAVY值均为负值,表明这2个蛋白为亲水性蛋白。Ta YAB1与Ta CRC蛋白跨膜分析预测分析结果表明,Ta YAB1与Ta CRC蛋白不是膜蛋白,无跨膜区,属于非分泌性蛋白。亚细胞定位分析结果可知Ta YAB1与Ta CRC蛋白定位于细胞核的可能性最大。同时蛋白的亲水特性表明该蛋白是亲水性蛋白,从而推断这2个蛋白可能都定位于细胞核内。Ta YAB1与Ta CRC蛋白具有转录与转录调控的可能性高于其他功能。因此,在小麦背腹极性建立中,小麦Ta YAB1与Ta CRC基因蛋白很可能在转录与转录调控中发挥重要作用。此外,作为小麦YABBY基因家族的2个不同成员,Ta YAB1与Ta CRC基因编码的蛋白在理化性质、二级结构等方面具有一些差别。在系统进化树分析中,Ta YAB1与水稻的Os YAB3与Os YAB5聚为同一分支,Ta CRC与水稻的DL、拟南芥的CRC和金鱼草的Am CRC聚为同一分支。这些结果表明这2个家族成员在背腹极性建立的过程中起着不同的作用。研究结果为深入了解YABBY基因家族成员的结构及其进一步的功能研究奠定∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥∥了基础,有助于阐明YABBY基因家族在侧生器官极性建立中的作用。

参考文献

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[3]BOWMAN J L,SMYTH D R.CRABS CLAW,a gene that regulatescarpel and nectary development in Arabidopsis,encodes a novel proteinwith zinc finger and helix-loop-helix domains[J].Development,1999(126):2387-2396.

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[11]NAKAI K,HORTON P.PSORT:a program for detecting sortingsignals in proteins and predicting their subcellular localization[J].Trends Biochem Sci,1999(24):34-36.

生物信息学分析 篇2

以黄瓜CsEXP10 cDNA片段为信息探针,利用电子克隆和序列拼接方法获得了1191bp的cDNA序列.应用生物信息学软件预洲了该蛋日的`理化性质、卷曲螺旋、疏水性、信号肽、跨膜结构、糖基住点、活性位点、亚细胞定位及二级和高级结构.结果表明:该蛋白是一个疏水性稳定蛋白,定位于细胞壁,含有4个α-螺旋,11个β-折叠,5个跨膜区域,10个糖基化位点,具有催化域和多糖结合域两个结构域.

作 者：孙涌栋 张传来 罗未蓉 张兴国 SUN Yong-dong ZHANG Chuan-lai LUO Wei-rang ZHANG Xing-guo 作者单位：孙涌栋,张传来,罗未蓉,SUN Yong-dong,ZHANG Chuan-lai,LUO Wei-rang(河南科技学院园林学院,新乡,453003)

张兴国,ZHANG Xing-guo(西南大学园艺园林学院,重庆,400715)

生物信息学分析 篇3

关键词：藏山羊；FGF21基因；克隆；生物信息学分析

中图分类号：S827.2 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0044—04

成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）是一类由FGF基因家族编码的结构相关的蛋白质。人类的FGF家族包括22个成员，按种系和序列又分为7个亚科，大部分FGF因子对细胞的生长和分化具有调节作用。成纤维细胞生长因子FGF21（fibroblast growth factor 21）是FGF家族的一个新成员，属于FGF家族中FGF19亚家族成员之一。FGF21主要在肝脏、脂肪和其他组织表达，它对机体的能量平衡调节和糖代谢具有重要作用，已经成为全球糖脂代谢研究的热点基因。

研究指出生酮饲喂小鼠可使小鼠体质量减轻，并且用生酮饲喂FGF21基因敲除大鼠，则老鼠出现体质量明显上升现象。Coskun等报道FGF21过表达的转基因鼠对多食诱导的肥胖有明显的改善作用，并可逆转肝脏脂肪变性及胰岛素抵抗，使体质量下降约20%。学者在给患糖尿病的恒河猴注射FGF21后发现其不仅对血糖有控制作用，还具有轻度的减重作用。研究发现肥胖患者空腹血清FGF21表达水平显著高于正常对照组，FGF21表达水平与腰围以及WHR、FPG、HbA1c、FINS、TG、hsCRP的表达水平呈显著正相关，与HDL-C呈显著负相关。上述研究结果都反映出，FGF21在脂肪代谢和控制体质量方面都起了非常重要的作用，但上述研究均集中在人和小鼠等动物及细胞系上进行，在动物脂肪沉积方面的研究尚不深入。在山羊上尚未见相关报道，仅见山羊FGF21的预测序列，因此需要进行更深入的研究。

藏山羊是我国青藏高原特有畜种，又称为“克什米尔”山羊，其肌肉细嫩、风味好，是藏族同胞重要的生产和生活资料。且藏山羊一般不需要专门肥育，是研究山羊优良肉质性状形成的理想材料。因此本研究以藏山羊为研究对象，应用RT—PCR技术获得FGF21基因序列，同时进行生物信息学分析，为进一步研究FGF21基因在藏山羊脂肪代谢及能量平衡中的作用机制，对提高藏山羊的育肥效率、提高肉品质提供新的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物与组织的采集 以四川省若尔盖种羊场饲养的成年健康公藏山羊为试验动物，现场屠宰，迅速采集背最长肌组织样本，立即置于液氮中保存带回实验室备用。

1.1.2主要试剂 Trizol试剂盒、荧光定量试剂盒SYBR@Premix Ex TaqTM（2×）、pMD-19T Vector均购自大连TaKa-Ra公司，反转录试剂盒Revert Aid First Strand cDNA SynthesisKit均购于Thermo公司，Taq聚合酶、胶回收试剂盒与E.ColiDH5a感受态细胞均购于天根生化科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA合成按照Trizol试剂盒说明書提取藏山羊背最长肌的总RNA，测定D_260nm与D_280nm比值在1.8～2.0之间，检测RNA浓度和质量，然后取2μg按照反转录试剂盒说明书来合成cDNA第一链，-80℃保存备用。

1.2.2引物设计与合成根据GenBank上山羊FGF21基因预测序列（XM_005692688），利用Primer Premier 5.0软件设计PCR克隆引物（正：5′-ACTGATGGGCTGGGACGA-3′；反：5′-TGCACAGCGGACGTCTTC-3′），产物长度为650 bp。引物送交四川成都擎科梓熙生物技术有限公司进行合成。

1.2.3藏山羊FGF21基因克隆 利用RT-PCR技术克隆臧山羊FGF21基因序列，PCR反应总体系为：2×Taq PCRMaster Mix 12.5μL，模板cDNA 1μL，上、下游引物各1μL（10μmol/L），最后加水至25μL。扩增条件：94℃4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃90 s，36个循环；72℃10 min。然后1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，胶回收试剂盒纯化目的片段，然后再将产物与pMD-19T载体连接，并转化至感受态细胞中，经菌液PCR鉴定后送至四川成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.2.4藏山羊FGF21基因和蛋白的生物信息学分析 Prot-Param（http：∥web.expasy.org/protparam/）分析蛋白理化性质；ProtParam（http：∥Web.expasy.org/protparam/）分析蛋白理化性质；NetPhos 2.0分析预测磷酸化位点；Signal P 4.1Server信号肽预测；TMHMM预测跨膜结构域；NPS预测二级结构，SWISS-MODEL三级结构预测；NCBI在线程序CDD预测保守功能域；通过PSORTⅡ进行亚细胞定位，利用STRING交互式数据库进行搜索蛋白相互作用分析；NCBI中Blast在线比对同源性分析，Clustalx 1.83和MEGA 5.0构建进化树；

2结果与分析

2.1山羊FGF21基因的克隆

用藏山羊背最長肌组织cDNA为模板经PCR扩增后获得FGF21目的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测与预期相符（图1），测序后经Blast比对后确定其为藏山羊FGF21基因序列650 bp，分析表明FGF21基因序列起始密码子ATG位于5 bp处，终止密码子位于634 bp处，其中核苷酸序列的碱基组成分别为：A 17.2%，C 34.3%，G 29.8%，T 18.6%。

2.2藏山羊FGF21生物信息学分析

2.2.1蛋白理化性质分析 蛋白理化性质分析表明，藏山羊FGF21蛋白由209个氨基酸残基组成（图2），分子式为C₁₀₂₂H₁₅₉₆N₂₇₆O₂₉₆S₅，分子质量为22.65 ku。带负电荷的氨基酸残基总数（Asp+Glu）为22个，带正电荷的氨基酸残基总数（Arg+Lys）为20个，即该蛋白质可能带负电荷。结合不稳定系数（52.g7）、理论等电点（6.08）和平均疏水指數（0.293）可知，FGF21蛋白为不稳定、酸性不溶类蛋白。且分析显示藏山羊FGF21的47～164位氨基酸序列残基存在FGF结构域（图2、图3）。

2.2.2蛋白磷酸化位点分析 经磷酸化位点预测，在76、79、122、152、195、200、204和206位共有8个丝氨酸（Ser）磷酸化位点，在68和98位共有2个苏氨酸（Thr）磷酸化位点，在132、201和207位共有3个络氨酸（Tyr）磷酸化位点。

2.2.3蛋白跨膜结构分析信号肽 分析结果指出山羊FGF21蛋白无跨膜螺旋结构。在1～28位氨基酸处存在信号肽。

2.2.4亚细胞定位及蛋白相互作用分析 通过PSORTⅡ预测，主要在细胞质（55.6%）和细胞核（22.2%）发挥生物学作用，少量作用于液泡（11.1%）和线粒体（11.1%）。利用STRING交互式数据库进行搜索FGF21蛋白相互作用，条件限制在10个蛋白以内。搜索结果表明，FGF21蛋白可能和FGFR1、IGF1R、FGFR2、INSR、FGFR、PPARA、CSF1R、CYP7A1、FGFR3和FGFR4蛋白存在相互作用。构建蛋白相互作用网络（图4）。

2.2.5蛋白二级结构与三级结构预测 通过SOPMA在线软件预测藏山羊FGF21蛋白二级结构（图5），结果显示，在藏山羊FGF21的209个氨基酸中，33个（15.7%）氨基酸可能形成α-螺旋（h），48个（22.97%）氨基酸可能形成β-折叠占（e），19个（9.09%）氨基酸可能形成β-转角（t），109个（52.15%）氨基酸可能形成无规则卷曲（c）。通过I-TSSER软件预测山羊FGF21蛋白三级结构（图6），该三级结构与二级结构预测结果基本一致。

2.3藏山羊FGF21预测的氨基酸序列与其他物种同源性比较

通过NCBI中BlastN程序和BlastP程序分别进行同源性在线分析，结果表明，藏山羊FGF21推测的氨基酸序列与藏羚羊（XP_005955412）、牛（XP_005895443）、印度水牛（XP_006050969）、猪（NP_001156882）、马（XP_001489202）、人（NP_061986）、小鼠（NP_064397）、大鼠（NP_570108）、家犬（XP_541510）和野骆驼（XP_006173890）的同源性分别为99%、99%、99%、91%、86%、85%、75%、74%、90%和90%，表明藏山羊与藏羚羊的亲缘关系最近（图7）。

3讨论与结论

FGF21是近年来发现的一种与糖脂代谢关系密切的内源性脂肪细胞因子，有助于脂肪的代谢，是饥饿时抑制生长的重要因子。并且体外研究表明它可以降低血糖、抑制胰高血糖素的分泌、改善脂代谢。Varady等指出FGF21在猪的脂肪控制中具有调控作用，并且生长激素可以直接刺激牛肝脏中FGF21的表达。基于此，畜牧工作者对FGF21在动物脂代谢中的作用也非常关注。因此本试验通过克隆得到藏山羊FGF21基因序列，为后续在山羊中的研究奠定基础。

本试验通过RT-PCR技术克隆得到藏山羊FGF21基因序列650 bp，编码209个氨基酸，具有FGF家族典型的结构。推测的氨基酸序列与藏羚羊的同源性最近，这符合物种的进化规律。同时利用生物信息学分析了藏山羊的磷酸化位点、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、二级和三级结构以及蛋白相互作用等。结果发现，藏山羊FGF21没有跨膜结构，具有信号肽结构，含有13个磷酸化位点，并主要发生在丝氨酸残基上（8个），推测其翻译后修饰主要是通过此来进行的。二级结构预测发现在藏山羊FGF21氨基酸序列主要有33个α-螺旋、48个β-折叠、19个β-转角和109个无规则卷曲结构，并且三级结构预测也证明了二级结构的预测，有利于进一步阐明藏山羊FGF21的功能。

本研究发现经过蛋白质相互作用分析预测与藏山羊FGF21相互作用的蛋白可能是FGFR1、IGF1R、FGFR2、INSR、FGFR、PPARα、CSF1R、CYP7A1、FGFR3和FGFR4等。

生物信息学分析 篇4

关键词：绵羊,INHA基因,生物信息学,序列,蛋白

抑制素(Inhibin,INH)主要由雌性动物卵巢颗粒细胞和雄性动物睾丸的Sertoli细胞分泌,能有效抑制垂体促卵泡素的合成与分泌[1]。抑制素是由α、β2个不同的亚基通过二硫键构成的异二聚体糖蛋白质激素,是转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族成员,该家族成员参与体内各种影响细胞发育和分化的功能[2]。α亚基(INHA)上有糖基化位点,是INH的生物活性中心。1932年,Mc Cullagh在牛睾丸水溶液提取物中发现了一种对FSH分泌具有反馈抑制作用的活性物质,命名为“抑制素”。D.M.Robertson等[3]和N.Ling等[4]分别从牛和猪的卵泡液中分离出抑制素A和B,此后由于卵泡液中其他非甾体类激素的干扰,有关抑制素的研究进展缓慢。猪抑制素有A、B两型,牛和绵羊只发现A型,其主要功能是通过反馈调节机制抑制FSH的合成与分泌,进而影响动物的相关生殖功能,将动物的繁殖力控制在种属特有的水平。研究人员早已开始利用抑制素的这种特性,采取主动或被动的免疫途径,对动物繁殖进行调控并取得了积极的效果。S.Hiendleder等[5]报道,INHA基因对绵羊产羔数有显著影响。因此,对绵羊INHA基因的研究有重要的意义。

到目前为止,对绵羊INHA基因生物信息学的研究鲜有报道。本研究利用生物信息学技术对绵羊INHA基因及编码蛋白质的理化性质、结构以及功能进行分析,并构建了绵羊INHA基因同源基因的系统进化树,旨在为今后INHA基因的进一步研究提供信息学参考。

1 材料

从NCBI数据库下载绵羊INHA的CDs序列(L28815.1)和蛋白质序列(AAA31553.1),使用BLAST检索下载绵羊INHA的同源序列,包括山羊(Capra hircus,NM_001285606.1)、牛(Bos taurus,NM_174094.4)、水牛(Bubalus bubalis,EU884446.1)、野猪(Sus scrofa,DQ356013.1)、人(Homo sapiens,M13144.1)、绒鼠(Chinchilla lanigera,EXM_005395512.1)、家猫(Felis catus,AY258627.1)、马(Equus caballus,NM_001081910.1)的INHA基因CDS序列。

2 方法

利用MEGA 5.05软件基于近邻结合(NeighborJoining,NJ)法(number of Bootstrap replication:1000)对绵羊及其他16个物种INHA的CDs序列构建进化树,进行系统发育分析;利用Prot Param(http://web.expasy.org/protparam/)工具,分析INHA蛋白的理化性质;利用在线工具Net Phos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net Phos/)分析绵羊INHA磷酸化位点,利用Net NGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net NGlyc/)分析其糖基化位点;利用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)数据库对绵羊INHA蛋白进行二级结构分析;利用Singnal P软件分析预测绵羊INHA蛋白的信号肽;利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)TMpred(http://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)软件分析预测绵羊INHA蛋白的跨膜结构;利用Ex Pasy站点上的Target P 1.1 Server软件、PSORTⅡ预测绵羊INHA蛋白质亚细胞定位;利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)工具在线分析绵羊INHA蛋白的三维结构,使用Py MOL软件展示出所分析的三维结构。

3 结果和分析

3.1 绵羊INHA系统进化树

9个物种INHA基因进化树系统发育分析结果表明,绵羊与牛、水牛、野猪、山羊处于同一个较大分支,具有较高的同源性,绵羊与山羊处于同一个小分支,在系统进化树中距离最近。见图1。

3.2 绵羊INHA蛋白的理化性质的分析

绵羊INHA基因序列编码857个氨基酸,分子质量为73 098.2 u。Prot Param软件分析结果表明,绵羊INHA蛋白的原子组成是C2497H4139N857O1024S329,原子质量为8 846,其消光系数在280 nm时为20 500,不稳定系数为61.94(40以下为稳定蛋白),说明该蛋白是一个不稳定蛋白;脂肪系数为14.24,总平均亲水性为0.968,说明该蛋白是一个疏水蛋白。

3.3 绵羊INHA蛋白的一级结构

哺乳动物INHA都有一个较大的前体,含有多个潜在的蛋白水解位点。Net Phos 2.0 Server分析结果表明,绵羊INHA蛋白有7个Ser磷酸化位点(22,46,67,124,132,243,248位氨基酸残基),6个Thr磷酸化位点(26,111,133,233,241,242位氨基酸残基),2个Tyr磷酸化位点(247,251位氨基酸残基)。Net NGlyc 1.0 Server分析INHA蛋白存在2个N-糖基化位点,为Asn45和Asn167。

3.4 绵羊INHA蛋白的二级结构(见227页彩图2)

由227页彩图2可知,绵羊INHA蛋白的二级结构由39个的α-螺旋(14.72%)、15个β-转角(5.66%)、156个无规则卷曲(58.87%)和55个延伸链(20.75%)组成。其中延伸链和无规则卷曲共占79.62%,所占比值较大。由此可知,二者是构成INHA蛋白二级结构的主要元件。

3.5 绵羊INHA蛋白的信号肽

预测蛋白质结构的同时对其信号肽进行分析,有助于蛋白质功能域的区分和蛋白质细胞的定位。预测所得绵羊INHA蛋白的信号肽见图3。

图3中,C行是剪切位点打分,S行是信号肽打分,Y行是综合剪切点打分,由此可以判断绵羊INHA蛋白无信号肽。

3.6 绵羊INHA蛋白亚细胞定位

亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位(如细胞核、线粒体、细胞质、内质网等),使用PSORTⅡ对绵羊INHA蛋白进行亚细胞定位分析,结果表明,该蛋白最可能在细胞核发挥生物学作用。另外,在细胞质、线粒体及囊泡分泌系统中也有存在的可能(见表1)。用Target P1.1软件预测INHA蛋白质亚细胞定位结果中,显示INHA有信号肽的可能性很小,只有0.046,而定位于其他位置的可能性最大,得分为0.757。

%

3.7 绵羊INHA蛋白的跨膜结构分析

跨膜结构域是膜内在蛋白与膜脂结合的主要部位,一般由20个左右的疏水氨基酸组成,形成螺旋,它固着于细胞膜上起“锚定”作用。跨膜结构域的预测和分析,对正确认识和理解蛋白质的功能、结构、方位及细胞中作用的部位均有重要的指示意义。亚细胞定位结果表明,跨膜区域预测INHA多肽链的N-末端有两种跨膜模式,一种为由胞外向胞内进行跨膜,由117~142位共26个氨基酸残基组成;另一种为由胞内向胞外进行跨膜,分别由20(49~68位),19(216~234位)个氨基酸残基组成。由此可以推测,INHA蛋白更倾向于由胞内向胞外的跨膜模式,见图4。

注:跨膜分值>500时为明显的跨膜区域。

3.8 绵羊INHA蛋白三级结构

用SWISS-MODEL分析绵羊INHA蛋白的三级结构,对蛋白质三级结构的分析预测有助于理解蛋白质结构和功能之间的关系,结果表明,其主要由延伸链和无规则卷曲组成。8个延伸链走向不太一致,但与无规则卷曲和α-螺旋形成了一个稳定的结构,见227页彩图5。

4 讨论

从进化树可以看出,所选9个物种INHA基因的进化与哺乳动物的分类学大体一致,可见分子进化与物种分化方向的协调性。

磷酸化和糖基化是常见的蛋白质翻译后修饰过程。蛋白质的磷酸化是指在蛋白激酶催化作用下把ATP或GTP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基的过程[6]。糖基化是真核生物翻译后重要的修饰之一,它可以影响蛋白质的抗原决定簇、蛋白质的电荷性质以及酶学性质,特别是蛋白质的热稳定性。经分析,绵羊INHA蛋白含有14个磷酸化位点,其中主要为Ser磷酸化位点,2个N-糖基化位点。本研究对绵羊INHA蛋白的潜在糖基化位点进行预测,可为进一步研究INHA蛋白的表达提供理论依据。

信号肽在新合成的多肽链中指导蛋白质进行跨膜转移和定位,通常位于分泌性蛋白质的N端,一般有16~26个氨基酸残基,其中包括疏水核心区、信号肽的C端和N端3部分[7]。经分析,绵羊INHA蛋白肽链中不含信号肽,不属于分泌性蛋白。亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位,经分析该蛋白属于跨膜蛋白,说明其在细胞膜上发挥其生物学功能。跨膜结构域是指由20个左右的疏水氨基酸残基形成的α-螺旋,该蛋白有3个跨膜区,跨膜模式为由胞内向胞外。

营养与食疗学分析 篇5

中医食疗历史悠久，内容丰富，安全有效，寓防治于日常饮食之中，是中国营养学独具

特色的组成部分，备受世人青睐。尽管中医食疗与现代临床营养学的理论体系有所不同，但

二者可以相互配合，优势互补，对于提高临床疗效有着十分重要的意义。

第一节

中医食疗的指导思想

一、整体观念

1．天人相应整体观

·

中医认为人处于天地之间，生活于自然环境之中，为自然界的一部分，因此人和自然具

有相通相应的关系。自然界的气候变化对人体产生一定的影响，所以饮食当顺应四时的变化

作出相应的调整，否则易患疾病。春季阳气升发，万物生机勃勃，为了顺应这种变化，可食

用一些辛散之品，如葱、姜、蒜、香菜、豆豉等，以振奋身体的阳气；夏季天气炎热，宜食

苦寒清热之品，如苦瓜、绿茶、绿豆等；三伏天暑湿较重，宜食健脾化湿之物，如冬瓜、薏

苡仁、白菜等；秋季气候干燥，宜食甘润之晶，如百合、枇杷、蜂蜜等；冬季气候寒冷，又

逢身体休养生机之时，宜予温补之品，如羊肉、狗肉等。

2．人体自身整体观

中医认为人体的各个部分都是有机地联系在一起的，这种相互联系的关系是以五脏为中

心，通过经络的作用而实现的。它体现在脏腑与脏腑、脏腑与形体各组织之间的生理、病理

各个方面。在临诊过程中可以根据五官、形体、色脉等外在的变化，了解脏腑的虚实，气血 的盛衰，以及正邪的消长，从而确定治疗原则。如老年人常见腰酸腿软、眼花耳聋等症，考

虑到目与肝有关，肾与骨、耳有关，可知上述症状为肝肾不足所致，治疗原则宜补益肝肾，经常食用枸杞子、桑椹、羊肉、黑芝麻、核桃仁等，从而达到聪耳明目、坚骨延年的效果。

二、平衡阴阳

中国古代认为阴阳是指一切事物或现象相互对立统一的两个方面。就人体而言，也存在

着阴阳两个方面。身体失健患有疾病，究其原因，无一不是阴阳失调所致，如阴阳之偏盛偏

衰。因此饮食治疗应以调整阴阳平衡为基本指导思想。“谨察阴阳所在而调之，以平为期”

(《素问·至真要大论》)，以达到“阴平阳秘，精神乃治”的正常生理状态，从而保证身体健

康。

三、食药同源

．

食物与药物皆属于天然之物，均具有形、色、气、味、质等特性，因而二者在性能上有

相通之处，食物也具有类似药物的四气五味、升降浮沉、归经、功效等属性。正如宋代《养

老奉亲书》所说：“水陆之物为饮食者，不管千百品，其四气五味，冷热补泻之性，亦皆禀

于阴阳五行，与药物无殊……人若知其食物，调而用之，则倍胜于药也……善治药者不如善

治食。”食物与药物同理，是食物具有保健和治疗作用的理论基础。

既然食药同源、食药同理，那么食药同用即属自然之现象。从古代众多的本 2 草、方剂典

籍中不难发现药食同用的例子，如当归生姜羊肉汤、百合鸡子黄汤、青蒿醪等，这些都属于

我国古代的治疗食品。

但是食物与药物还是有所不同，与药物相比，食物性质比较平和，作用和缓，没有毒副

作用，不似药物偏性较大，作用比较峻烈。

第二节

食物的性能

食物的性能主要有性、味、归经等几方面内容。

一、食物的“性”

“性”是指食物具有寒、凉、温、热四种性质，中医称为“四性”或“四气”。其中温热

与寒凉属于两类不同的性质。温与热、寒与凉是其共同性，但温次之于热，凉次之于寒，即

在共同性质中又有程度上的差异。还有一类食物，寒热性质不太明显，作用比较和缓，则归

于平性食物，食物中以平性者居多。

常用食物四性归类举例如下：

重．寒性食物

马齿苋、苦瓜、莲藕、食盐、海带、紫菜、鸭梨、西瓜、冬瓜等。

2．凉性食物

茄子、白萝卜、丝瓜、苋莱、芹菜、大麦、绿豆、茶叶等。

3．热性食物

芥末、肉桂、辣椒、花椒、生姜等。

4．温性食物

韭菜、茴香、葱白、香菜、糯米、胡桃仁、雀肉、羊肉、羊乳等。

5．平性食物

粳米、小米、圆白菜、黄豆、扁豆、莲子、牛肉、牛乳等。

从生活和临床应用食物的经验来看，寒凉性食物多有滋阴、清热、泻火、凉血、解毒的

作用；温热性食物多有温经、散寒、助阳、活血、通络等作用；平性食物大都具 3 有补益滋养 的功效。

二、食物的“味”

中医在长期的食疗实践中发现，不同滋味的食物作用往往不同，而滋味相同的食物却常

有共同之处。食物的“味”是指食物的具体味道。食物主要有五种味，即辛、苦、甘、酸、咸，它们各自的特点是：

1．辛味食物有发散、行气、行血的作用。如生姜、葱白发散风寒，适用于外感表证；

陈皮、香橼、佛手行气解郁，适用于肝郁气滞等证。

2．苦味食物能清热、泄火、燥湿、泻下。如苦瓜清热解毒，用于火热实证；杏仁润肺

降气、化痰止咳，适用于外感咳嗽、气喘等。

3．酸味食物有收敛、固涩等作用。如乌梅、石榴等，前者可安蛔止痛，用于蛔虫病；

后者可涩肠、止血、止咳，可治疗泻痢、脱肛、下血、咳喘等。

4．咸味食物能软坚散结、泻下通便。如海藻、海带等，适用于甲状腺肿大(中医称为 瘿瘤)等。

5．甘味食物有补益、缓急、和中作用，多用于治疗虚证、疼痛等，如蜂蜜、大枣、山 药等。

三、食物的“归经”

归经就是指食物对于机体某部分的选择性作用——主要对某脏腑及其经络或某几经发生

显著的作用，而对其他经则作用较小或没有作用。如鸭梨、芹菜同属寒性食物，虽然都有清

热作用，但其作用范围侧重点不同，前者偏于清肺热，后者偏于清肝热：各有所 4 长。按归经

分类，食物可分为：

重．归心经的食物

百合、龙眼肉、莲子、酸枣、小麦等。

2．归肺经的食物

梨、甘蔗、荸荠、枇杷、·白果、罗汉果等。

3．归脾经的食物

粳米、小米、大豆、大枣、猪肉、莲藕等。

4．归肝经的食物

马齿苋、芹菜、枸杞子、香橼、佛手、黑芝麻等。

5．归肾经的食物

猪肾、羊肾、海参、海马、火腿、紫河车、桑椹等。

6．归胃经的食物

粳米、小米、糯米、扁豆、土豆、萝卜、猪肚、牛肉等。

7．归膀胱经的食物

刀豆、玉米、冬瓜、肉桂、茴香等。

8．归小肠经的食物

食盐；赤小豆、冬瓜、苋莱等。

9．归大肠经的食物

马齿苋、茄子、苦瓜、苦菜、荞麦、木耳等。

“性”、“味”、“归经”都是从一个侧面反映食物的特性，在选择食物的时候，要将其多

种性能综合考虑，合理应用，才能收到良好的预期效果。

第三节

食物的治疗作用

食物的治疗作用概括起来有三个方面，即“补”、“泻”、“调”。

一、补益正气

人体各种组织、器官和整体的机能低下是导致疾病的重要原因，中医学把这种病理状态

称为“正气虚”，其所引起的病证称为“虚证”。虚证的临床表现由于有阴虚、阳虚、气虚、血虚等的不同，因而各具其证候特点，但总体上表现为精神萎靡、身倦乏力、心悸气短、食

．

欲不振、腰酸腿软、脉象细弱或沉细。

凡是能够补充人体物质，增强机能，提高抗病能力，改善或消除虚弱证候的食物，都具

有补益脏腑、扶助正气的作用。这类食物大多为动物类、乳蛋类或粮食类食物。具体有以下 几类：

重．补气类

粳米、糯米、小米、籼米、黄豆、豆腐、牛肉、鸡肉、兔肉、鹌鹑、鸡蛋、鹌鹑蛋、土豆、胡萝卜、大枣等，用于气虚证。

2．补血类

猪肉、羊肉、猪肝、羊肝、牛肝、甲鱼、海参、菠菜、胡萝卜、黑木耳、桑椹等，用于血虚证。

3．滋阴类

鸡蛋黄、鸭蛋黄、甲鱼、乌贼、猪皮、鸭肉、桑椹、枸杞子、黑木耳、银

耳等，用于阴虚证。，4．补阳类

羊肉、狗肉、鹿肉、兔肉、羊肾、猪肾、鸽蛋、鳝鱼、虾、淡菜、韭菜、枸杞子、刀豆、核桃仁等，用于阳虚证。

二、祛除邪气

外界致病因素侵袭人体，或内脏机能活动失调、亢进，皆可使人发生疾病。如果病邪较

盛，中医称为“邪气实”，其所引起的病证则称为“实证”。实证的范围很广，如邪闭经络或

内结脏腑，或气滞、血瘀、痰湿、积滞等都属于实证范围。一般常见实证的症状有呼吸气

粗、精神烦躁、脘腹胀满、疼痛难忍、大便秘结、小便不通或者淋沥涩痛、舌苔黄腻、脉实

有力等。

用于实证的食物大都具有除病邪的作用，邪去则脏安，身体康复。泻实类食物的种类较

多，分别介绍如下：

1．辛温解表类

生姜、大葱、蒜等，用于风寒感冒。

2．辛凉解表类

杨桃、茶叶、豆豉等，用于风热感冒。，3．清热泻火类

苦瓜、苦菜、蕨菜、芦根、西瓜等，用于实热证。

4．清热燥湿类

茄子、荞麦、马齿苋等，用于湿热病证。

5．清热解毒类

绿豆、赤小豆、马齿苋、苦瓜、蓟菜、豆腐、豌豆等，用于热毒证。

6．清热解暑类

西瓜、绿豆、绿茶等，用于暑热证。

7．清热利咽类

荸荠、罗汉果、青果、无花果等，用于内热咽喉肿痛。

8．清热凉血类

茄子、藕节、丝瓜、黑木耳等，用于血热证。

久通便类

香蕉、菠菜、竹笋、蜂蜜、核桃仁、黑芝麻等，用于便秘证。

10．祛风湿类

薏苡仁、木瓜、樱桃、鳝鱼等，用于风湿证。

U．芳香化湿类

扁豆、蚕豆等，用于湿温、暑湿、脾虚湿盛证。

12。利水类

玉米、玉米须、黑豆、绿豆、赤小豆、冬瓜、冬瓜皮、白菜、鲤鱼等，用

于小便不利、水肿、淋病、痰饮等。

13．温里类

干姜、肉桂、花椒、茴香、胡椒、辣椒、羊肉等，用于里寒证。

14．行气类

香橼、佛手、刀豆、玫瑰花等，用于气滞证。

直5．活血类

山楂、茄子、酒、醋等，用于血瘀证。

16．止血类

藕节、黑木耳等，用于出血证。

17．化痰类

海藻、昆布、海带、紫菜、萝卜、橘络、杏仁、生姜等，用于痰证。

18．止咳平喘类

杏仁、梨、白果、枇杷、百合等，用于咳喘证。

19．安神类

莲子、小麦、百合、龙眼肉、酸枣仁、猪心等，用于神经衰弱、失眠。

20．收涩类

乌梅、莲子等，用于泄泻、尿频等滑脱不禁。

三、调和脏腑

中医认为脏和腑虽然各有不同的生理功能，但它们之间既分工又合作，互相帮助，相互

依赖，构成了有机整体，从而保证身体正常的生命活动。如果脏腑之间或脏与脏、腑与腑之

间失去协调、平衡的关系，也会导致疾病的发生。如脾胃都是饮食消化的主要器官，胃主受

纳、腐熟，脾主运化；脾气以升为顺，胃气以降为和。若脾胃不和，脾气该升不 7 升，则出现

食欲不振、食后腹胀、倦怠乏力、头晕脑涨等清阳不升、脾不健运的症状；胃气当降不降则

出现食停胃脘的胃脘胀满、胃痛、恶心欲呕的症状。治宜调和脾胃，予以扁豆、生姜、山

药、猪肚、胡萝I＼、麦芽、谷芽等食物。调和脏腑也是食物的一个重要作用。

第四节

饮食治疗原则

一、平衡膳食

在日常生活中力求饮食多样，荤素搭配，平衡膳食。《黄帝内经》提出“五谷为养，五

果为助，五畜为益，五菜为充，气味合而服之，以补精益气”。即以谷类食物滋养人体，动

物类食品补益脏腑，蔬菜水果作为副食补充，这样配制的膳食含有人体所需要的各种营养成

分，比例适当，避免五味偏嗜是保持身体健康、防治疾病的基本保证。在此基础上，结合个

人体质、具体病证予以相应的膳食。最终达到“阴平阳秘，精神乃治”的状态。

二、辨证施食

辨证论治是中医治疗学的一条基本原则，它也是中医食疗的精髓之一，具体体现为辨证

施食。辨证施食是由辨证与施食相互联系的两个部分所组成。辨证不是各种症状的简单罗

列，而是通过对症状、舌苔、脉象等进行综合分析，从中找出内在的联系，得出证型的概

括，并以此作为治疗处方的重要依据。辨证是决定治疗的前提和依据，施食是治疗的手段和

方法。《黄帝内经》中指出“虚者补之”、“实者泻之”、“寒者热之”、“热者寒之”等一系列

治疗原则。所以辨证配膳时要根据病证的阴阳、表里、虚实、寒热，分别给予 8 不同的饮食治

疗。例如对虚证虽然都应该补益，但还要注意区别是阴虚还是阳虚。《黄帝内经》中有“形

不足者，温之以气；精不足者，补之以味”的训诫。这就是说，阳气虚弱的病证应该给甘温

益气之品，如粳米、小米、山药、黄豆、大枣、牛乳等，以使阳气旺盛；而对于阴精亏损的

患者，则要用厚味之物，如猪肉、鸡蛋黄、桑椹、甲鱼等，以补益精血，使阴精充足。又如

热病烦渴要给予清凉的饮食，如西瓜、黄瓜、甘蔗、荸荠、鲜藕、番茄等；如中寒腹痛就要

用温热的饮食，如生姜、胡椒、茴香、羊肉、红糖等。

其次，还要辨明疾病属于哪一脏腑，根据病证所在的脏腑，采取不同的饮食营养疗法。

如水肿的治疗，对于证属风邪犯肺、肺失宣化的阳水，应施以宣肺利尿的饮食，如葱白粥、五皮饮等；如证属脾虚水湿滞留的水肿当健脾利湿，予以薏苡仁、扁豆、茯苓、鲤鱼等食

物。

三、顾护脾胃

中医学认为“胃为水谷之海”、“脾为气血生化之源”。胃主受纳，脾主运化，二者互为

表里，共同协作完成食物的受纳、腐熟、消磨和对精微物质的吸收与输布，进而滋养五脏六

腑、肌肉筋骨、皮肤毛发，所以脾胃为人体的后天之本。如果脾胃失健，就会变生他病。如

胃气不和，受纳失司，则进食减少、恶心呕吐。脾胃运化无力，则出现腹胀便秘、疲倦乏

力、少气懒言、面色萎黄等一派虚弱的征象。因此脾胃功能的强弱对于疾病的 9 传变、转归、康复都起着重要的作用。我们在实际生活中，不论是以食健身还是以食治病，都要注意补益

脾胃以生气血，顾护脾胃而不伤中州。此外，平时要饮食有节，不加重脾胃的负担。

四、以食为主

在中医饮食疗法中，常可以看到食物与药物同用的现象。如用当归生姜羊肉汤治疗产后

血虚腹痛；人参胡桃汤治疗肺虚久咳久喘。食药同用除基于二者系同一来源的原因外，更主

要的是基于食药的应用皆在同一理论指导下进行。食物与药物的性能相通，二者配合应用，可以更好地发挥疗效。

然而中医食疗并非都一定要添加药物，一般情况下还是尽量选用食物，以食平疴，必要

时才可用少量药物起着画龙点睛的效果。

药物的选择应注意从偏性小、作用缓和、无毒副作用几个方面综合考虑。一般来讲，既

町食用又可作药用的天然之晶较为适宜。如枸杞子、山药、茯苓、薏苡仁、冬虫夏草、麦

第五节

饮食宜忌

所谓“饮食宜忌”指的就是有关食物之“所宜”与“非所宜”的诸般情况。中医学对此

非常重视，认为“所食之味，有与病相宜，有与身为害，若得宜则补体，害则成疾。”《饮食

须知》也强调：“饮食藉以养生，而不知物行有相宜相忌，纵然杂进，轻则五内不和，重则

立兴祸患。”饮食宜忌贯穿于疾病的各个时期，它对于疾病的发生、发展和转归都有着十分

重要的影响。

中医学在饮食与病情宜忌方面积累了大量的经验，值得借鉴。

一、病中宜忌

1。寒热虚实证

(1)寒证：宜食温热性食物，忌食寒凉、生冷食物。

(2)热证：宜食寒凉平性食物，忌食温燥伤阴食物。

(3)虚证：阳虚者宜温补，忌寒凉；阴虚者宜清补，忌温热、辛辣。由于一般虚证病人

大多脾胃功能减退，消化力弱，所以不宜食用油腻、坚硬、黏滞难化的食物，饮食宜清淡、有营养。

(4)实证：宜食清利淡渗食物，忌食温补食物。

2．生冷

脾胃虚寒而致胃痛、呕吐、腹泻者忌食大量生的蔬菜、水果及冷饮(如口冰茶、汽水、冰淇淋等)和冷食(如冷饭、冷菜等)。

3．发物

风寒感冒、哮喘咳嗽、斑疹伤寒、痤疮、疖肿、病后初愈的病人应忌食腥膻、辛辣发物，如海鱼、无鳞鱼、虾、蟹、羊肉、芫荽、葱、姜、蒜等，以免引起新病加重、旧

病复发。

4．黏滑

脾虚痰湿或夏月感受暑湿的患者不宜进食黏滑油腻的食物，如糯米、肥肉、奶酪、油炸食品等。

5．辛辣

辣椒、花椒、韭菜、葱、姜、蒜等辛辣之物为内热证患者所忌。

6．油腻

脾湿或者痰湿患者应忌食荤油、肥肉、油煎炸食品、乳制品(奶、酥、酪)。

7．腥膻

海产品、羊肉、狗肉等食物为风热、痰热、斑疹、疮疡等所忌。

二、服药宜忌

清代医学家章杏云说：“病人饮食，藉以滋养胃气，宜行药力，故饮食得宜 11 为药饵之助，失宜则反与药饵为仇”。有的食物可以减轻药物的作用，降低疗效。如萝卜可以减弱补气类

药物的功效，所以二者不宜同服。

茶叶可与多种药物发生化学反应，因此饮茶时间与服药时间最好隔开。《本草纲目》中

还记载了一些经验，如薄荷忌蟹肉、甘草、黄连，桔梗忌猪肉等，仅供参考。

三、胎产宜忌

怀孕、分娩是特殊生理时期，饮食要格外注意。

妊娠期由于胎儿的生长发育的需要，应给予营养滋补的食物，避免吃辛热温燥、不易消 化的食物。

分娩后的乳母可多用鸡、鸭、鱼、牛肉、猪蹄炖汤喝，既补充营养，又促进乳汁分泌。

避免生食寒冷或辛辣之物。但也不要禁忌太多，以免影响母亲及乳儿的健康。

食物在治疗过程中虽有一定的作用，但由于食物的性质多平和，偏性不著，作用和缓，久服才能生效，在临床治疗中多是起辅助作用。

·

第一节

感

冒

感冒是以鼻塞、流涕、喷嚏、咳嗽、头痛、恶寒、发热等为主要临床表现的一种病症。

多因感受六淫或时行疫毒，肺卫失和所致。本病四季均可发病，尤以春、冬季为多见。

西医学的上呼吸道感染、流行性感冒可参考本节有关内容治疗。

一、膳食原则

1．一般感冒多为实证，治疗以解表透邪为主。风寒感冒予以辛温解表；风热感冒治以

辛凉解表；夹有暑湿者当清暑祛湿；体虚感冒应标本兼顾。

2．饮食应清淡，选择容易消化的食物，慎食油腻、黏滞、辛辣的食物。

二、辨证食疗

重．风寒感冒

[证候] 鼻塞，流清涕，咳嗽声重，咯痰稀薄，恶寒，发热，肢体酸痛；舌苔薄白，脉浮紧。

·

[治法] 辛温解表，宣肺散寒。

[食疗方]。

(1)葱豉汤(《》I、缺肘后方》)

原料组成：葱白10g，豆豉10g。

制作及用法：用温水泡发豆豉，洗净备用。将清水放人锅中，大火烧开后放人葱白、豆

豉煮10—15分钟即可。每日1剂，每日2次。

方解：此方中葱白味辛性温，有发表通阳的作用；豆豉味辛甘，微苦，性凉，有解表除

烦的作用。二者配合具有发表散寒之功，可用于风寒感冒轻证。

(2)紫苏粥(《粥谱》)

原料组成：紫苏10g，粳米100So

制作及用法：粳米洗净，如常法煮粥，临熟时加入紫苏，继续煮10-15分钟即可停火。

方解：紫苏味辛性温，善于发表散寒、开宣肺气、行气宽中；粳米味甘性平，可补中益

气。两味配伍，共奏解表散寒、行气宽中、调和肠胃之功效。尤其适合风寒感冒兼胃肠症状

者。

2．风热感冒

[证候] 发热重，恶寒轻，咳嗽，咽痛，头痛；舌边尖红，苔薄黄，脉浮数。

[治法] 辛凉解表，清肺透邪。

[食疗方]

(1)荆芥粥(《养老奉亲书》)13

原料组成：荆芥10g，薄荷5g，淡豆豉10g，粳米100g。

制作及用法：先将荆芥、薄荷、淡豆豉另煎，煮开后继续煎煮10分钟即可，去渣取汁，备用。粳米煮粥，米烂时兑人药汁，同煮为粥。每日1剂，每日2次，趁热服食。

方解：方中以荆芥、薄荷为主，长于散风热、清头目、利咽喉；豆豉、粳米为辅，豆豉

味辛，微苦，性寒，可解表除热，粳米滋养脾胃，有助于驱邪外出。四物配合，具有疏散风

热、辛凉解表之力。本方适用于风热感冒或外感风寒、郁而化热之证。

(2)银花茶(《疾病的食疗与验方》)

原料组成：银花凹g，茶叶6g，冰糖适量。

制作及用法：将银花、茶叶放人锅中，武火烧开，改用文火煮10分钟即可停火。或将

原料放人茶杯中，用开水冲泡，代茶饮。每日1剂，连服2—3天。

方解：方中银花味辛性凉，既可清宣疏散，又可清热解毒；茶叶苦、甘、性凉，町清头

目，除烦热，利小便，生津液；冰糖和诸味。三物相合可辛凉解表、宣散风热。

3．暑湿感冒

[证候] 身热，微恶风，汗少，肢体酸重或疼痛；头晕头痛，咳嗽痰黏，鼻流浊涕，心烦口渴，小便短赤；舌苔薄黄腻，脉濡数。

[治法] 清暑祛湿解表。

[食疗方]

(1)白扁豆汤(《中医食疗学》)

·

原料组成：白扁豆60g，粳米100g，食糖适量。

制作及用法：先将白扁豆洗净，用温水浸泡1小时，再与粳米同煮为粥，食糖调味。每

日1次，分早、晚服食。

方解：白扁豆味甘，性平，擅长健脾和中、化湿消暑；粳米味甘，性平，是健脾益胃的

佳品。二者合用，相辅相成，共奏健脾化湿之功，是外感暑湿之证的较好治疗食品。

(2)清络饮(《温病条辨》)

原料组成：西瓜翠衣6g，扁豆花6g，银花6g，丝瓜皮6g，荷叶6g，竹叶6g。

制作及用法：将上述六味原料放人锅中，加清水，大火烧开后改用小火继续煮15分钟

即可停火。去渣取汁，代茶饮。每日1剂，每日2次。

方解：方中西瓜翠衣即西瓜皮，味甘淡，性寒凉，有清热解暑之功效；扁豆花化湿解

暑；银花辛凉解表；丝瓜皮清热通络、利尿解暑；荷叶清暑利湿；竹叶清心利尿。诸味配

合，共奏清热解暑、化湿升阳之功。本方尤适于夏天的暑湿感冒。

4．体虚感冒

[证候l 恶寒发热，头痛鼻塞，倦怠乏力，气短懒言，发复发作；年老或多病，恶风，易汗出；舌质淡，苔薄白，脉浮无力。

[治法] 扶正解表。

[食疗方]

(1)生姜红枣粥(《常见病的饮食疗法》)

原料组成：生姜10g，红枣3枚，粳米100g。

制作及用法：将生姜切片，红枣掰开，粳米淘洗干净，放人锅中，加清水煮粥。每日1

次，分早、晚服。

方解：生姜味辛，性温，有发表散寒之功；红枣味甘，性温，长于补中益气、养血安

神；粳米味甘，性子，健脾益气之功较强。三物相配，既益气养血，又发散解 15 表，适用于平

素气血虚弱复感风寒的病人。

，(2)葱豉煲豆腐(《饮食疗法》)

原料组成：淡豆豉10g，葱白10g，豆腐100So

制作及用法：锅内放入豆腐、清水煮开后，加入食盐、葱白、豆豉，煮5-10分钟后即

可停火。趁热服食，服后盖被取微汗。

方解：方中淡豆豉、葱白为主料，豆豉长于疏散解表，葱白主发散风寒邪气，配以益气

和中的豆腐健脾益气，扶正以驱邪外出。全方辛温而不燥烈，扶正而不滞邪，可用于年老体

虚外感证。

第二节

发

热

发热有外感、内伤之分，外感发热可参见有关章节的内容。凡因气血阴阳亏损，脏腑功

能失调导致的发热，称为内伤发热。内伤发热一般以低热多见，或患者自觉发热而体温不

高。

西医学的功能性发热以及肿瘤、血液病、结缔组织病、慢性感染性疾病、内分泌疾病等

出现的发热，可参照此节治疗。

一、膳食原则

1．发热的治疗必须根据发热的不同类型施以不同的方法，或疏肝解郁，或活血化瘀，或益气补虚，或补血退热，或滋阴增液。

2．慎用苦寒或辛辣之品，以免苦寒太过，损伤脾阳，辛辣易化燥伤阴，反而加重病情。

3．饮食清淡爽口，容易消化，忌油腻、辛辣、腥膻之物。

二、辨证食疗

1．肝郁发热

[证候] 心烦身热；性情急躁，胸胁胀满，喜叹息，口苦；舌苔黄，脉弦数。

[治法] 疏肝解郁。

[食疗方]

(1)金玫饮(《中医食疗学》)

原料组成：郁金10g，干玫瑰花6s，冰糖适量。

制作及用法：郁金加水煎汤，后入玫瑰花煮开即可，酌加冰糖，代茶饮。经常饮用。

·

方解：玫瑰花味甘，微苦，性温，能疏肝胆之郁气、和血行血、健脾降火；与清凉之性 的冰糖相配，既可用于肝郁发热之证，也可用于血瘀发热之证。

(2)菊花粥(《慈山粥谱》)

原料组成：菊花10g，粳米100g，冰糖适量。

制作及用法：先将粳米加水煎煮，至米熟时放入菊花、冰糖煮10分钟即可停火。每日

1次。

方解：菊花味辛、甘、苦，性微寒，善于疏风、平肝、解热；粳米甘平，可健脾益气；

冰糖甘凉。三者相配，既可用于肝郁发热之证，也可用于风热外感之证。

2．瘀血发热

[证候] 下午或夜晚发热，口干咽燥，身体常有固定痛处或肿块，面色黯黑；舌质紫

暗，脉象细涩。

[治法] 活血化瘀。

[食疗方]

(1)桃仁粥(《太平圣惠方》)

原料组成：桃仁10s，粳米100s，冰糖适量。

制作及用法：将粳米洗净，桃仁去皮尖打碎，备用。锅中放人粳米、清水，煮成粥，以

冰糖调味。每日1次。

方解：方中桃仁味苦，性平，有活血祛瘀、润肠通便的功效；粳米味甘性平，可补中益

气。二者与性味甘平的冰糖相配，泻中有补，以免伤及正气。既可用于血瘀发热证，也可用

于肠燥便秘证。孕妇忌服本品。

(2)山楂汤(《简单便方》)

原料组成：山楂30s，冰糖适量。

制作及用法：山楂冲洗干净，去核切片，放入锅中，加清水煮沸约凹分钟，以冰糖调

味即可停火，代茶饮。每日1剂。

方解：山楂酸甘，微温，有散瘀血、消食积的作用；冰糖味甘性凉。甘酸合用，化瘀血

而不伤新血，开郁气而不伤正气。本方除用于瘀血发热外，还可以用于消化不良症、高脂血

症等。

3．气虚发热

[证候] 发热常在劳累后发作或加重，头晕乏力，自汗，容易感冒；气短懒言，食少

便溏；舌质淡，苔薄白，脉细弱。

[治法] 益气补血。

[食疗方]

(1)参麦茶(《陕西中草药》)

原料组成：太子参10g，浮小麦15so

制作及用法：将太子参、浮小麦切碎，放人茶杯中，用开水冲泡，温浸15分钟即可饮

用，代茶饮。或放人锅内，加水煎煮20分钟后去渣取汁，饮服，每日1剂，每日2次。

方解：太子参味甘微苦，性平，具有补气生津的功效，是补气药中一味清补 18 之品；浮小

麦为小麦未成熟的颖果，味甘性凉，可益气除热，且能止汗。二者相配，具有益气解热止汗

之功效，适用于气虚发热、汗出等症。

(2)粟米粥(《本草纲目》)

原料组成：粟米50so

制作及用法：粟米淘洗干净，放人锅中，加清水上武火煮开后，改用文火煮至粥成。经

常食用。

方解：粟米即小米，味甘咸，功同粳米，长于补中益气而性质偏凉，尤适于气虚发热者

食用。

4．血虚发热

[证候] 发热，热势多为低热；或面色无华，心悸不宁，身倦乏力；或月经稀少色淡；

舌质淡，苔薄白，脉细弱或细弦。

[治法] 补血益气。

[食疗方]

·(1)鸡肝粥(《寿亲养老新书》)

’

原料组成：鸡肝50g，粳米100g，豆豉、食盐各适量。

制作及用法：鸡肝洗干净后切碎备用。粳米淘洗干净，放人锅中，加清水、豆豉，煮至

粥将成时，加鸡肝、食盐，煮开后5分钟即可停火。经常食用。

方解：方中以鸡肝为主，可补血养肝；以粳米、豆豉为辅，粳米健脾益气，豆豉清热除

烦。诸料合用，共成补肝明目之方。本方适用于血虚发热以及血虚目暗、头晕等症。

(2)百合鸡子黄汤(《金匮要略》)

原料组成：百合7枚，鸡子黄1枚，冰糖适量。

制作及用法：将鸡蛋分出鸡蛋黄，备用；百合剥开，洗净，放人锅中，加入清水，武火

烧开后改用文火，调入鸡蛋黄搅匀，煮开后以冰糖调味食用。每日1次。

方解：方中以百合为主，可润肺清心；鸡子黄为辅，可滋阴清热。合用而成滋阴润肺、清心安神之方。本方重在滋阴清热，清而补之，以清虚热为主。原用于百合病，现可用于阴

虚发热、热病后期阴血损伤、余热扰心等证。

5．阴虚发热

[证候] 午后或夜间潮热，手足心热，或骨蒸颧红；心烦盗汗，失眠多梦，口干咽燥，或腰膝酸软，大便干结，尿少色黄，男子遗精，女子月经稀少；舌质红，无苔或少苔，脉象

细数。

[治法] 滋阴清热。

[食疗方]

(1)地黄粥(《太平圣惠方》)

原料组成：生地黄20g，粳米100so

制作及用法：先将生地黄煎取汁液，备用，粳米放人锅内，加水煮至米烂时，兑人生地

黄汁。每日1剂，每日2次。

’。

方解：生地味甘苦，性寒，具有滋阴凉血、清热生津的作用；配以补中益气的粳米，更‘

添补虚之功。本方适用于阴虚内热所致的潮热，又适用于温病后期余热未尽、阴津损伤的发

热、咯血证。

(2)枸杞叶粥(《太平圣惠方》)

原料组成：鲜枸杞叶250g，粳米100g，豆豉汁、葱白、食盐各适量。

制作及用法：枸杞叶择洗干净，切碎备用；粳米淘洗干净，放入锅中，加清 20 水煮至米熟

时，加入枸杞叶、葱白、豆豉汁、食盐，煮至粥成。每日1剂。

方解：方中重用枸杞叶为主，可补虚劳、清内热；以粳米、豆豉为辅佐，粳米滋养脾

胃，豆豉清热除烦。诸料合用，可补虚劳、清内热，补中有清。除用于阴虚发热外，还可以

用于热病后调养。

(3)地骨皮饮(《千金要方》)

，原料组成：地骨皮15g，麦门冬6g，小麦6So

制作及用法：将上述三种原料放人锅内，加清水煎煮，至小麦熟停火，去渣取汁，代茶’

饮。每日1剂，每日2次。

方解：方中地骨皮味甘性寒，长于清虚热、止盗汗；麦冬养阴生津、清热除烦；小麦益

气固表、宁心止汗。三物合用具有滋阴清热、宁心止汗的作用。适用于素体阴虚、热病后

期、肺痨阴虚所致的低热盗汗等症。

第三节

咳

嗽

咳嗽是以咳嗽、咯痰为主要临床表现的一种病症，多因外邪侵袭肺脏，或脏腑功能失

调，内伤及肺，肺失宣降所致。咳嗽是肺系疾病的一个常见病症，根据其发生的原因，可将

咳嗽分为两大类：外感咳嗽和内伤咳嗽。外感咳嗽是由外邪(风寒、风热、燥热)侵袭肺卫

引起；内伤咳嗽则是由脏腑功能失调所致。

西医学的上呼吸道感染、支气管炎、肺炎、肺结核等疾病所引起的咳嗽，可参考本节内

容治疗。

一、膳食原则

1．外感咳嗽宜宣肺散邪；内伤咳嗽多为虚实夹杂，宜标本兼治，偏虚者以扶正补肺为

主，偏实者以祛邪化痰为要。

2．饮食宜清淡，多吃蔬菜和水果，慎食辛辣、油腻、腥膻之品。

二、辨证食疗

1．风寒袭肺

[证候] 咳嗽声重，咯痰稀薄色白；鼻塞，流清涕，恶寒，发热，肢体酸痛；舌苔薄

白，脉浮紧。

[治法] 疏风散寒，宣肺止咳。

[食疗方]

(1)生姜粥(《饮食辨录》)

原料组成：生姜10g，粳米100g，葱白10So

制作及用法：生姜切片，葱白切碎，备用。将粳米煮粥，待米熟后加人生姜、葱花，粥

成时将生姜片取出。每日1—2次。

方解：此粥中生姜解表散寒、温肺化饮；葱白发散解表、通阳散寒；粳米健脾益气。合

用而成辛温发散、解表散寒之方。风热咳嗽及内伤咳嗽忌用本方。

(2)姜糖苏叶饮(《本草汇言》)

原料组成：生姜6g，紫苏叶3g，红糖适量。

制作及用法：生姜切丝，苏叶碾碎，与红糖一起放人瓷杯中，用开水冲泡，温浸10分

钟即可饮用，代茶饮。

方解：生姜与苏叶皆为辛温之品，生姜发散风寒，兼以和胃降逆；苏叶发表散寒、·开宣

肺气、行气宽中，二者配伍，相须为用；红糖温中补虚。诸味配伍，共奏解表散寒、行气宽

中、调和肠胃之功，尤其适合风寒咳嗽兼胃肠症状者。

2．风热犯肺

·

[证候] 发热头痛，微恶风寒，咳嗽咽痛；苔薄黄，脉浮数。

[治法] 疏风清热，化痰止咳。

[食疗方]

(1)无花果茶(《饮食疗法》)

原料组成：无花果30g，绿茶15So

制作及用法：取无花果、绿茶放人茶杯内，用沸水冲泡，温浸10—15分钟，加入冰糖

调味。代茶饮。

方解：无花果味甘性凉，功能清热、生津、利咽；绿茶味苦甘，性凉，有清热解毒、生

津止渴的功效；并以冰糖调味。三者合用，有清热、生津、利咽止咳的作用。

(2)二花茶(《小儿常见病食疗方》)

原料组成：金银花5g，绿茶3So

制作及用法：将金银花洗净，放人锅中，加水适量，煮开5分钟后去渣取汁，倒人装有

茶叶的杯子中，加盖焖5分钟即可。代茶饮。

方解：金银花味甘，性寒，既能清热解毒，又有轻宣疏散之效；绿茶味苦甘，性凉，可

清热除烦、通利小便。二者合用，适用于外感风热或温病初起的咽痛、咳嗽等症。

3．肺燥咳嗽

[证候] 干咳无痰，或少痰不易咯出，口舌干燥；舌红少津苔薄，脉细数。

[治法] 润肺止咳，生津润燥。

[食疗方]

(1)秋梨膏(《本草求原》)

原料组成：梨20阗g，款冬花30g，百合30g，麦门冬30g，川贝母30g，蜂蜜500g。

制作及用法：将梨削去皮，切成块，用榨汁机榨成汁，备用；款冬花、百合、23 麦冬、贝

母放人锅内，加水煎煮，去渣取汁，共3次，合并汁液，以文火煎熬浓缩至黏稠如膏，加入

蜂蜜，加热至沸，停火待冷，装瓶备用。每次15g，沸水冲泡，每日2次。

方解：方中主料梨味甘、微酸，性凉，功能滋阴润燥、润肺止咳；款冬花辛温，可润肺

下气、止咳化痰；百合与麦冬皆有润肺养阴之功；川贝母苦甘微寒，善于清热化痰；蜂蜜甘

平，可润肺健脾。诸物相合，共奏润肺止咳、生津润燥之功。

(2)五汁饮(《温病条辨》)

原料组成：梨1阗0g，鲜藕500g，鲜芦根100g，鲜麦冬50g，鲜荸荠500g。

制作及用法：先把五种原料洗净，然后将芦根切成段，加水煎汤取汁；梨去皮、核，荸

荠去皮，鲜藕去节，麦冬切碎或剪碎，将处理过的后四味原料放入榨汁机内搅拌，取榨好的

汁液与芦根汁共倒人容器中，代茶饮。

方解：方中梨与荸荠均为甘寒养阴之品，可清热润燥；鲜芦根善清肺经之热；鲜麦冬养

阴清肺热；鲜藕润肺生津。五汁相配，具有甘润清补之功，除用于肺燥咳嗽外，还可用于温

热病后期津伤以及内伤消渴等证。

4．痰热郁肺

[证候] 咳嗽痰多，咳声重浊，痰黄黏，咯吐不爽；胸胁胀满，面赤或身热，口干欲

饮；舌质红，苔薄黄或腻，脉滑数。

[治法] 清热化痰，肃肺止咳。

[食疗方]

(1)雪羹汤(《古方选注》)

原料组成：海蜇50g，荸荠4枚，食盐适量。

制作及用法：海蜇用温水洗净，切成丝备用；荸荠去皮洗净，切成片备用。海蜇、荸荠

放人锅中加清水以大火烧开，再改用小火继续煮10分钟，以食盐调味即成。每日1次。

方解：方中以海蜇为主，可清热化痰、润肠通便；以荸荠为辅佐，清热化痰以助海蜇之

力。二者合用而为清热化痰、润肠通便之方。本方不仅适用于痰热郁肺证，也适用于大便秘

结者。

(2)罗汉果饮(《广西中药志》)

原料组成：罗汉果数个。

制作及用法：每次取干罗汉果1个，掰成碎片，放人茶壶中，用开水冲泡，温浸5-10

分钟即可饮用，代茶饮。

方解：罗汉果味甘性凉，长于清热化痰、润肺止咳，并能润咽喉、滑肠通便，不仅用于

痰热郁肺证，也可用于咽痛、便秘等症。

5．肝火犯肺

[证候l 气逆，咳嗽阵作，咳时面红目赤，咳引胸痛，并随情绪波动增减；烦热咽干，痰滞咽喉，咯之难出，口干口苦，胸胁胀痛；舌质红，苔薄黄，脉弦数。

[治法] 清肺泻肝，化痰止咳。

[食疗方]

(1)杏菊饮(《实用中医营养学》)

原料组成：杏仁6g，菊花6g，冰糖适量。

制作及用法：将杏仁去皮尖打碎，与菊花一起放入锅中，加清水煎煮5分钟后放入茶杯

中，温浸片刻即可，代茶饮。

方解：杏仁味酸甘，性微温，有润肺止咳的作用；菊花味辛、甘、苦，性微 25 寒，功能疏

散风热、平肝清热；冰糖味甘，性平，既可调味，又无助热之弊。三物相配，具有疏散风热

或清肝肺之热的功效。

(2)夏枯草饮(《山西医学杂志》)

原料组成：夏枯草10g，冰糖适量。

制作及用法：夏枯草放人锅内，加清水煎煮，武火烧开后改用文火继续煮15分钟即可，以冰糖调味。每日1剂，每日2次。

．

‘

方解：方中夏枯草味辛苦，性寒，具有清肝火、散郁结、降血压的作用；冰糖味甘，性

平。二者合用清热而不燥，适用于肝火犯肺等证。

6．肺阴亏耗

[证候)干咳痰少，或痰中带血，咳声短促；形体消瘦，潮热盗汗，疲乏无力；舌红

少苔，脉细数。

．

[治法] 滋阴润肺，化痰止咳。

[食疗方]

(1)麦冬粥(《食鉴本草》)

原料组成：麦冬20S，粳米100So

制作及用法：先将麦冬煎取汁液，与粳米一同煮粥。每日1次。

方解：方中麦冬养阴润燥、益胃生津；粳米补中益气、健脾和胃。两者合用共奏滋阴润

肺、健脾益气之功。外感咳嗽和痰湿咳嗽忌食本方。

(2)海参鸭羹(《调疾饮食辨》)

原料组成：鸭脯肉250g，发好的海参2508，黄酒、食盐各适量。

制作及用法：鸭肉冲洗干净，细切备用；海参冲洗干净，细切备用。将鸭肉、海参放人

锅中，加清水、黄酒、食盐，小火煮作羹。每次服适量，共服10天。

方解：方中以鸭肉为主，可滋阴润肺、止咳止血；以海参为辅佐，滋补润燥以助鸭肉之

力。二者合用，共成滋阴润肺、止咳止血之方。

(3)黄精粥(《中国药粥谱》)

原料组成：黄精15g，粳米100So

制作及用法：先将黄精放人小碗中，用温水泡软，切成细丁备用；粳米如常法煮粥，临

熟时加入黄精，继续煮15-20分钟即可。每日1次。

方解：黄精味甘性子，功能养阴润肺、健脾益气，与补中益气的粳米相配，滋补作用更

强，适合于久病阴虚者调养之用。

第四节

喘

证

喘证是以呼吸急促困难，甚至张口抬肩、鼻翼扇动、不能平卧为特征的一种病症，为临

床常见病。病程或长或短，病情或重或轻，一般冬季易发作或病情加重。引起喘证的原因很

多，可有寒、热、虚、实的不同。但总体来说，也不外乎外感、内伤两大类。外感为六淫侵

袭所致；内伤可由饮食失节，情志失调，或劳欲、久病所致。病理性质有虚、实两方面，有

邪者为实，为邪壅于肺，宣降失司；无邪者属虚，多为肺不主气，肾失摄纳。

西医学的支气管炎哮喘、肺心病等疾病所见哮喘，可参考本节有关内容治疗。

一、膳食原则

1．喘证治疗当辨虚实，实喘为外邪、肝郁、痰热所致，以泻实祛邪、行气为主；虚喘

以肺、肾之虚多见，治以扶正摄纳为主。

2．少食多餐，饮食清淡，选择富含营养、容易消化的食物，多吃蔬菜和水果。

3．忌肥甘厚味、辛辣香燥之品，忌鱼、虾、羊肉、狗肉等发物。戒烟酒。

二、辨证食疗

1．风寒袭肺

[证候] 喘息，呼吸急促，胸部胀闷；咳嗽，痰多，头痛，鼻塞或流涕，无汗，恶寒；

舌苔薄白，脉浮紧。

[治法] 疏风散寒，宣肺定喘。

[食疗方]

(1)紫苏姜豉汤(民间验方)

原料组成：紫苏10g，生姜10g，淡豆豉6g。

制作及用法：将紫苏、生姜(切片)、淡豆豉放人锅中，加清水上火煎煮，20分钟后去

渣取汁，趁热饮用。每日1剂，每日2次。

方解：紫苏与生姜皆为辛温发散风寒之品，紫苏兼有理气消痰之功，生姜兼有温胃降逆

止呕之效，更以发汗解表的豆豉相配，共奏疏风散寒、宣肺化痰之功，尤其适合风寒喘证兼

有胃肠症状者。

(2)杏仁粥(《食医心镜》)

原料组成：杏仁(去皮尖)15s，粳米100so

制作及用法：将粳米放入锅内，加水煮至熟，再放入杏仁煮即可。每日1次。

方解：杏仁味苦，性微温，长于宣肺降气、止咳平喘、润肠通便；与甘平补中的粳米同

．

煮为粥，既能止咳乎喘，又能健脾养胃。用治咳喘便秘者。

2．风热犯肺

[证候] 咳嗽喘急，甚则鼻翼扇动；咳嗽痰黏，或有胸痛，烦闷口渴，身热汗出，恶

风；苔薄黄，脉浮数。

[治法] 清热解表，宣肺平喘。

[食疗方]

(1)菊杏饮(《中国药膳》)

·原料组成：菊花10g，杏仁10g，桑叶10g，甘草6g。

制作及用法：将四种原料放人茶杯中，用开水冲泡，温浸10分钟即可饮用，代茶饮。

方解：菊花味辛甘苦，性微寒，可疏风清热、解毒明目；桑叶味苦甘，性寒，可疏风清

热、清肝明目；杏仁味苦，微温，可止咳平喘；甘草味甘性平，可补脾益气、润肺止咳。四

物相合，共奏疏风清热、止咳平喘之功。

(2)杏仁炖雪梨(《饮食疗法》)

原料组成：杏仁10g，雪梨1个，冰糖适量。

制作及用法：取杏仁、雪梨放人盅内，隔水炖1小时，以冰糖调味，食雪梨饮汤。

方解：方中杏仁味苦，微温，可止咳平喘；雪梨味甘性寒，可清热润肺、化痰平喘。二

者合用，具有清热、化痰、平喘之效。

3．痰热遏肺

[证候] 喘咳气涌，胸部胀痛；痰多，胸中烦热，面赤，有汗，咽干，口渴，尿赤或

便秘；舌红，苔黄或黄腻，脉滑数。

[治法] 清肺泻热，化痰定喘。

[食疗方l

(1)贝母粥(《资生录》)

原料组成：贝母10g，粳米100g。

制作及用法：将贝母去心研末，备用；粳米洗净，放人锅中，加清水上火煮，煮至米熟

时投入贝母粉，继续煮10分钟，待米烂粥稠时停火。

方解：方中贝母清热化痰、止咳平喘；粳米补益脾肺。

(2)杏仁饼(《丹溪篡要》)

原料组成：杏仁10g，柿饼10个，青黛10s。

制作及用法：将杏仁炒黄研为泥状，与青黛搅拌均匀，放人掰开的柿饼中摊开，用湿黄

泥巴包裹，煨干后取柿饼食用。每次1个，每日2次。

方解：方中杏仁味苦，性平，可止咳平喘；柿饼味甘性凉，能清热、润燥、化痰；青黛

味苦辛，性寒，能退虚热、凉血。诸物配合，具有清肺泻热、化痰定喘之功。

(3)丝瓜花饮(《滇南本草》)

原料组成：干丝瓜花10g，冰糖适量。

制作及用法：每次取干丝瓜花10s＼冰糖适量，放人茶杯中，用开水冲泡，温浸10分钟

．后即可饮用，代茶饮。

方解：丝瓜花味辛性凉，长于清热化痰、止咳平喘；配以清凉润肺的冰糖，其效更强。

4．气郁乘肺

[证候] 每遇情志刺激而诱发，突然呼吸短促，息粗气憋；胸闷胸痛，或伴失眠，心

悸，或不思饮食，大便不爽，心烦易怒，面红目赤；舌质淡红，苔薄白或薄黄，脉弦。

[治法] 开郁降气平喘。

[食疗方]

(1)柚子皮茶(《食物疗法精萃》)

原料组成：柚子1个。

制作及用法：将柚子剥开，取皮，切成细条，晒干备用。每次取20g，放人茶杯内，用

开水冲泡，温浸10分钟即可饮用，代茶饮。

方解：柚子皮味辛苦，性温，能理气、化痰、平喘，适用于气郁痰滞的哮喘证。

(2)橘络茶(民间验方)

原料组成：橘络10g，橘皮丝10g，绿茶15g。

制作及用法：将橘络、橘皮丝、绿茶放人茶杯中，用沸水冲泡，温浸10—15分钟后即

可饮用，代茶饮。

方解：橘络味甘苦，性平，功能宣通经络、行气化痰；橘子皮味辛苦，性温，能理气、化痰、平喘、消食；绿茶味苦甘，性凉，可清热利尿、肃肺消痰。三物配合，具有理气化

痰、止咳平喘、消食的作用。不仅可以用于气滞痰瘀的哮喘证，也可用于饮食过多、消化不

良之证。

5．肺脾气虚

[证候] 气短息促，声低息微，动则喘甚；咳声低微，吐痰稀白，面色咣白，自汗；

舌淡边有齿痕，脉象细弱。

[治法] 益气固肺，健脾益气。

[食疗方]

(1)山药甘蔗汁(《简单便方》)

原料组成：山药250g，甘蔗250So

制作及用法：将山药放人锅中，煮取汁液；甘蔗榨成汁。两汁相配，饮服。

方解：方中山药味甘性子，长于补肺胃之气阴；甘蔗味甘性寒，能清热泻火。两汁相

配，具有益气、固肺、补中的功效。经常食用可用于支气管哮喘的预防和治疗。

(2)参枣汤(《十药神书》)

原料组成：人参6g，大枣10枚。

制作及用法：将人参、大枣洗净，放人锅内，加清水，以武火烧开后改用文火继续煎煮

15分钟即可停火。

方解：方中人参味甘微苦，性微温，功能大补元气、益肺补脾；大枣味甘性温，可健脾

和胃。

6．肾虚

[证候] 喘促日久，气息短促，呼多吸少，动则尤甚；汗出肢冷，口燥咽干，手足发

冷；舌质淡，苔薄或黑润，脉沉细无力。

[治法] 益肾纳气平喘。

[食疗方]

(1)人参胡桃汤(《济生方》)

原料组成：人参10g，胡桃5个，生姜片5片。

制作及用法：人参切成片；胡桃肉洗净；生姜片洗净备用。人参、胡桃肉放人砂锅内，加人生姜、清水，武火煮开后改用文火煮约20分钟即成。去渣取汁。

方解：方中人参味甘微苦，性微温，功能大补元气、益肺补脾；胡桃仁味甘性温，可补

肾固精、温肺定喘。人参与胡桃仁相配，具有补气益肾、定喘止咳之功。

(2)白果桑椹饮(《中医营养学》)

原料组成：白果10g，人参3g，桑椹20g，冰糖适量。

制作及用法：白果放人锅内炒，去壳，与洗净的桑椹及人参一起煎煮，20分钟后调入

蜂蜜，翻炒片刻即可停火。每日1剂。

方解：方中白果味甘涩苦性子，长于敛肺气、定喘嗽；人参味甘微苦，性微温，功能大

补元气、益肺补脾；桑椹味甘性寒，可滋阴、补肝、益肾。诸物与甘平的冰糖相配合，全方

具有补肾纳气、敛肺平喘的功效。

第五节

心

悸

．

心悸是指自觉心中悸动，惊惕不安，甚则不能自主的一种病症。多因气 32 血阴阳亏虚，痰

饮瘀血阻滞或情志失调，心失所养，心脉不畅，心神不宁所致。

心律失常，如心动过速、心动过缓、期前收缩、心房颤动或扑动，心功能不全，神经官

能症等疾病所引起的心悸，可参考本节内容治疗。

一、膳食原则

1．心悸属气血阴阳亏虚者宜调补阴阳气血；痰瘀阻滞者应化痰祛瘀；情志不畅、心神

不宁者宜养心安神。

2．宜清淡易消化的饮食；不宜烈酒、浓茶、油腻、辛辣、过咸之品。

一、膳食原则

1．胸痹属气血阴阳亏虚者宜调补阴阳；寒凝痹阻者宜温阳散寒通痹；痰浊阻滞者宜行

气化痰；血瘀气滞者宜行气活血化瘀。

2．宜清淡易消化饮食，不宜烈酒、咖啡、浓茶、油腻高脂、辛辣、过甜、过咸之品。

二、辨证食疗

1。寒疑心脉

[证候] 卒然心痛，气短，胸中窒闷，多因受寒后发病或加重；伴手足不温，冷汗出，．

心痛彻背，背痛彻心，面色苍白；舌苔薄白，脉沉紧或沉细。

[治法] 温阳散寒，宣通心痹。

[食疗方]。

(1)薤白粥(《养生粥谱》)

原料组成：薤白10g，葱白2根，香菜适量，粳米100g。，制作及用法：将薤白、葱白洗净，葱白切成小段，与粳米同放人砂锅中，加水后用小火

煮粥，粥熟后加切碎的香菜即成。每日2次，温热服食。

方解：此粥中薤白辛散温通滑利，善散阴寒之凝滞，行胸阳之壅结，为治胸 33 痹之要药；

葱白辛温通阳；香菜味辛性温，具宣通之力；粳米甘平，可健脾养胃。共成温阳散寒、宣痹

之功。适用于寒凝心脉之胸痹、心痛、心悸之症。

(2)姜葱粥(《临床食疗配方》)

原料组成：干姜30g，高良姜30g，葱白50g，大米100go

制作及用法：将干姜、高良姜装入纱袋内，与大米同煮作粥，粥熟后去药袋，加入葱白

煮沸即成。每日1剂，分2次服食。

方解：此药粥中干姜、高良姜皆为散寒止痛之品；葱白辛温通阳；粳米养胃和营。共奏

温阳散寒止痛之功，适用于寒凝心脉之心痛、胸痹。

2．心血瘀阻

[证候] 胸闷心痛，如刺如绞，痛有定处，入夜尤甚，甚则心痛彻背；舌质紫暗，有

瘀斑，苔薄，脉弦涩。

[治法] 活血化瘀，通脉止痛。

[食疗方]

(”丹参绿茶(《中国药茶》)

原料组成：丹参9g，绿茶3g。

制作及用法：将丹参研成粉末，加绿茶，放热水瓶中，冲人半瓶开水，加盖焖10-15

分钟后即可。

方解：方中丹参味苦，微寒，可活血化瘀、养心安神；绿茶清心利小便。二者相配，共

奏活血化瘀、养心宁神之功，适用于胸痹心血瘀阻致心神不宁者。

(2)三七红枣鲫鱼汤(《中华养生药膳大典》)

原料组成：三七10g，去核红枣15枚，去内脏的鲫鱼1条(约150g)，陈皮5g，精盐、34

香油各适量。

制作及用法：将切碎的三七与红枣、陈皮、鲫鱼同人锅中，加水适量，煎煮约30分钟，待鱼熟时加入精盐适量，再煮二沸，淋人香油即成。当菜佐餐，随意食用。

方解：本方中三七活血化瘀，现代药理研究认为三七有扩张冠状动脉的作用；陈皮行气

和胃；红枣、鲫鱼健脾和胃、益气补血。四味合用，共奏活血化瘀、养血和胃之功，适用于

心脉瘀阻之胸痹、心痛。

3．气滞胸痛

[证候] 胸闷、胀痛或刺痛，时发时止；或伴有两胁胀痛，善叹息，易激怒，心情不

遂时易诱发或加重；舌淡红，苔薄腻，脉弦细。

[治法1 行气活血止痛。

[食疗方]

佛手柑粥(《心脑病药膳良方》)

原料组成：佛手柑15S，粳米100g，冰糖适量。

制作及用法：先将佛手柑洗净入锅加水适量，煎煮2分钟，去渣取汁，再人淘洗干净的

粳米及冰糖煮粥即成。早、晚分次食用。

方解：佛手柑又名佛手，为芸香科植物佛手的果实，味辛、苦、酸，性温，能理气化

痰、开胃消食；粳米健脾养胃；冰糖甘以调味。三味合用能理气解郁、活血宣痹，适用于肝

郁气滞胸痹者。

4．痰浊痹阻

[证候] 胸闷重而心微痛，痰多气短，形体肥胖，肢体沉重，纳呆，便溏；舌体胖大

且边有齿痕，苔浊腻，脉滑。

[治法] 化痰祛瘀，通阳宣痹。

[食疗方]

(1)茯苓米粉糊(《家庭药膳全书》)

原料组成：茯苓细粉、米粉、山楂细末、槟榔细末、白糖各20so

制作及用法：将以上五种粉末人盆中，加水适量，调成糊状，蒸熟即成。上午、下午分

次食用。

’

方解：此糊剂中茯苓健脾化痰、宁心安神；山楂活血化瘀；槟榔行气利水；米粉、白糖

养胃调味。共奏化痰利湿、行气开郁之功，适用于痰浊痹阻之胸痹。

(2)薏陈茶(《经验方》)

原料组成：炒薏苡仁30g，炒陈皮10g，绿茶3g。

制作及用法：取洗净的薏苡仁置锅内用小火炒至微黄色，取出放凉备用；晒干的陈皮亦

放人锅内炒至微黄色。将药、茶再人锅，加水适量，大火煮沸后改文火煎煮30分钟，去渣

取汁即成。代茶饮用。

方解：此茶中薏苡仁性凉，味甘淡，能健脾利湿；陈皮性温，味辛微苦，可调中燥湿化

痰。三味合用可健脾化湿、理气化痰，适用于胸痹痰阻之胸闷、气短、痰多等症。

5．气阴两虚

[证候] 心胸隐痛，时作时休，心悸气短，动则益甚；伴倦怠乏力，声音低微，易汗

出；舌质淡红，苔干少津，脉弦细无力或结代。

[治法] 益气养阴，活血通脉。

[食疗方]

(1)人参银耳汤(《中国药膳辨证治疗学》)

原料组成：人参5g，银耳10g，冰糖10So 36

制作及用法：先将银耳温水发胀，人参切片，与冰糖同放人锅，加水适量，小火煎煮2

小时以上即成。早、晚分2次空腹服。

方解：此汤中人参大补元气；银耳滋养心阴；冰糖调味。共成益气养阴通脉之剂，适用·

于气阴两虚之胸痹。

·

(2)人参粳米粥(《老年人饮食指南》)

原料组成：白参末3g(或党参末10s)，冰糖10g，粳米60So

制作及用法：将粳米淘洗干净，人锅加水适量，大火煮熟后改小火煮成稠粥，加入白参

末，再煮2—3分钟即成。早、晚服用。

方解：人参大补元气、补益脾肺，又能生津止渴，现代药理研究认为人参具有一定的抗

氧化、抗衰老作用，还可扩张冠状动脉、加强心肌收缩力、减轻心肌缺血损害，与冰糖、粳

米煮粥后能益气养阴、健脾和胃，适用于气阴不足之胸痹而脾肺虚者。

6．心肾阳虚

[证候] 心痛憋闷，心悸气短，面色苍白，精神萎靡；形寒肢冷，自汗，纳少，四肢

无力，一身浮肿，小便不利；舌质淡，舌体胖大边有齿痕，苔薄白，脉沉细无力或结代。

[治法] 益气温阳，通脉止痛。

[食疗方]

．

(1)紫河车炖鸡(《中华养生药膳大典》)

原料组成：，紫河车30g，仔鸡1只(约500g)，生姜、葱白、盐各适量。

制作及用法：将紫河车洗净、烘干、研成细粉，仔鸡宰杀后洗净，把盐抹在鸡身上，放

人锅内加水适量，置大火上烧沸，用小火炖煮至鸡熟，再加入紫河车粉、姜、葱，炖煮40 37

分钟即成。当菜佐餐，随意食用。

方解：紫河车味甘、咸，性温，归心、肺、肾经。《本草图经》谓其治“男女虚损劳极

……下元衰惫。”为大补气血、双补阴阳、补肾填精、延缓衰老之药；合以鸡肉补气益血，其补益之力大增。长期服用具有良好的保健功效，适用于心肾不足之胸痹。

(2)人参薤白粥(《圣济总录》)

原料组成：人参10g，薤白6g，鸡蛋1个，粳米100so

制作及用法：先将人参单煮，取汁备用；鸡蛋放入碗中，搅拌均匀，备用；粳米如常法

煮粥，米熟时放人鸡蛋、薤白、人参汁，再煮至熟。每日1次。

方解：人参味甘、微苦，性微温，可大补元气、益气固脱；薤白味辛、苦，性温，能通

宣散结；鸡蛋味甘，性平，可滋阴润燥；粳米味甘，性平，可健脾益气，补后天之本。诸物

相合，共奏大补元气、通阳除痹之功。

第七节

眩

晕

眩是指眼花或眼前发黑，晕是指头晕甚或感觉自身或外界景物旋转。二者常同时并见，故统称眩晕。其轻者闭目可止；重者如坐车船，旋转不定，不能站立，或伴有恶心、呕吐、汗出、面色苍白，甚至昏倒。多因情志不遂，痰瘀阻塞清窍；或身体虚弱、肝肾不足、肝阳

上亢，清窍失养所致。

高血压、低血压、耳源性眩晕、美尼尔综合征、脑动脉硬化、椎—基底动脉供血不足、贫血、神经衰弱等病表现以眩晕为主要症状者，可参照本节食疗方用之。

一、膳食原则

1．眩晕的膳食原则是补虚泻实、调整阴阳。虚者当滋养肝肾、补益气血、38 填精生髓；

实者当平肝潜阳、清肝泻火、化痰行瘀。

2．宜清淡饮食；不宜烟、酒、腥味、油腻、辛辣、过咸的饮食。

二、辨证食疗

1．肝阳上亢

[证候] 眩晕，耳鸣，头目胀痛；面红目赤，烦躁易怒，肢麻震颤，失眠，多梦，健

忘；舌质红，苔薄黄，脉弦数。

[治法]平肝潜阳。

[食疗方]

(1)二花龙胆茶(《常见病的饮食疗法》)

原料组成：菊花、’槐花各6g，绿茶3g，龙胆草5So

制作及用法：将菊花、槐花、龙胆草、绿茶同放人保温杯中，用沸水冲泡，加盖焖10

分钟即成。可连续冲泡3—5次，代茶频频饮用。

·

方解：此茶剂中菊花平肝清热；槐花清热凉血，现代研究认为槐花有软化血管作用；龙

胆草清肝泻火；绿茶降火宁心。四味合用可清肝泻火，使火降亢平。适用于肝阳上亢、肝火

上炎引起的眩晕、目胀。

(2)猪脑天麻粥(《中华食物疗法大全》)

原料组成：猪脑1个，天麻10g，粳米250g。

制作及用法：猪脑、天麻人砂锅内，加入淘洗干净的粳米、清水适量煮成稀粥，以猪脑

熟为度。早、晚分食。

方解：天麻平肝熄风、潜阳定眩；猪脑滋肝益髓填精；粳米养胃和营。三味合用可平肝

潜阳、补脑定眩。适用于肝肾不足、风阳上扰之眩晕、耳鸣、健忘等症。

2．痰湿中阻

[证候] 眩晕，视物旋转，头重如裹；胸闷恶心，呕吐痰涎，脘腹痞满，纳少神疲；

舌体胖大，边有齿痕，苔白腻，脉滑。

[治法] 燥湿祛痰，健脾和胃。

[食疗方]

(”薏米杏仁粥(《疾病食疗删方》)

原料组成：薏苡仁50g，杏仁10g，白糖适量。

制作及用法：将薏苡仁淘洗干净，人锅加水适量，大火煮沸后改小火煮，至半熟时放人

杏仁，再煮10—15分钟，粥成加白糖适量即成。早、晚分次服用。

方解：此粥中薏米为药食佳品，长于健脾化痰、利水渗湿；杏仁可止咳化痰润肠。二味

同用能健脾化痰、祛湿升清，适用于痰湿中阻、清阳不升之眩晕。

(2)茯苓赤小豆粥(《疾病的食疗与验方》)

原料组成：茯苓15g，赤小豆30g，粳米60so

制作及用法：将茯苓、赤小豆洗净后与淘洗干净的粳米同入锅中，加水适量，大火煮

沸，改小火煮成稠粥即成。早、晚分次服食之。

方解：此药粥中茯苓长于利水渗湿、健脾补中；赤小豆健脾利湿；粳米养胃。共制成药

粥能健脾化湿、祛痰定眩，适用于脾虚而痰湿偏盛的眩晕。

3．气血不足

[证候l 头昏眼花，动则加剧，遇劳则发；神疲乏力，面色无华，唇甲淡白，心悸少

寐；舌质淡嫩，苔薄白，脉细弱。

[治法] 补养气血，健运脾胃。

[食疗方]

’

(1)大枣花生粥(《中国中医药报》1989年第20期)

原料组成：大枣10枚，花生米15g，粳米50So 40

制作及用法：将大枣、花生米洗净，与淘洗的粳米同人锅中，大火煮沸后改小火煮30 分钟即成。早、晚分次服用。

方解：大枣又称红枣，药食兼用，其味甘性温，有益气养血、健脾益胃之功；花生米益

气养血。二味合用可健脾益胃、气血双补，适用于气血不足之眩晕。

(2)川芎煲鸡蛋(《饮食疗法》)

原料组成：川芎6—10g，鸡蛋2个。

制作及用法：先将鸡蛋煮熟去壳后与洗净的川芎同人砂锅中，加水适量，文火煎煮30 分钟左右即成。吃蛋喝汤，可经常服用。

方解：川芎擅长养血活血，又可行气祛风止痛，且善于“上行头目”；鸡蛋味甘性平，能滋阴养血。二味同煲后能养血活血、行气止痛，适用于气血不足、气滞不通之头晕目眩、头痛之症。

4．肝肾阴虚

[证候] 头晕目眩，耳鸣如蝉，久发不已；伴健忘失眠，目干涩，视力减退，胁肋隐

痛，腰膝酸软，咽干口燥；舌质红，苔少或干，脉细数。

[治法] 滋补肝肾。

[食疗方]

(”杞豆汤(《中华药膳宝典》)

原料组成：黑大豆30g，枸杞子15So

制作及用法：将黑大豆洗净，放人砂锅内，加水适量，煨炖，豆熟后放入枸杞子，继续

炖5-6分钟即成。每日晚空腹服1次，连服半个月以上。

方解：黑大豆与枸杞子均为滋补肝肾的药食兼用之品，两者合用相辅相成，其滋补肝

肾、定眩晕功效更强，适用应于肝肾不足之眩晕。

(2)桑椹膏(《随息居饮食谱》)

原料组成：鲜桑椹1eog，冰糖适量。

·

制作及用法：将鲜桑椹洗净后放人温开水中浸泡，纱布榨汁，再人锅与冰糖熬成膏。

早、晚各服15So

方解：桑椹子既可补血又可养阴，对肝肾不足之眩晕有较好疗效。

第八节

不

寐

不寐，即一般所谓“失眠”，是因为素体亏虚，或饮食不节，或情志不遂所致以难以入

睡为特征的病症。轻者入睡困难，有寐而易醒，或醒后不能再人寐，亦有时寐时醒等，严重

者则整夜不能入寐。

神经官能症、更年期综合征等以失眠为主要临床表现时可以参考本节食疗方用之。

一、膳食原则

1．以补虚泻实、调整阴阳为主，佐以安神定志。虚者滋补肝肾、益气养血；实者宜清

．火化痰、消导和中；虚实夹杂者补泻兼施。

2．宜清淡饮食，多食富含营养、安神之品；不宜辛辣刺激、油腻、胀气之品，睡前忌

用兴奋之品。

二、辨证食疗

1，心脾两虚

[证候] 失眠多梦易醒，心悸健忘；头晕，神疲体倦，面色少华，饮食无味，纳呆；

舌质淡，苔薄白，脉细弱。

[治法] 补养心脾，安神益智。

[食疗方] 42

(1)百合龙眼粥(《中国药膳辨证治疗学》)

原料组成：百合15g，龙眼肉15g，小米100g，红糖适量。

制作及用法：将百合、龙眼肉洗净，加入淘洗干净的小米、水适量；共同煮粥，粥熟后

调入适量红糖即成。每天空腹服2-3次。

方解：此粥中龙眼肉健脾益气、养心安神；百合滋润清心安神；小米健脾养胃，共奏健

脾安神之功，适用于心脾亏虚之失眠、多梦、健忘等症。

(2)参龙炖猪心(《临床食疗配方》)

原料组成：丹参15g，龙眼肉12g，猪心1个。

制作及用法：将猪心洗净切片，与丹参、龙眼肉同放炖盅中，加水适量，隔水炖熟，适

当加人油、盐等调味之晶即成。每日1次，可经常服用。

方解：丹参益气健脾；龙眼肉健脾养心安神；猪心以脏补脏，补养心血，安神定志。三

味配合，共奏补养心脾之效，适用于心脾不足的不寐、心悸、怔忡之症。

2．阴虚火旺

[证候] 心烦不寐，心悸不安；五心烦热，口干津少，头晕，耳鸣，腰酸梦遗；舌红，少苔或无苔，脉细数。

[治法] 滋阴降火，养心安神。

[食疗方]

(1)桑椹百合膏(《中国药膳辨证治疗学》)

原料组成：桑椹500g，百合100g，蜂蜜300So

制作及用法：将桑椹、百合加水适量煎煮30分钟后取煎液，再加水煮30分钟取煎液，两次药液合并后以小火煎熬浓缩至黏稠时，加蜜煮至沸停火，待凉装瓶备用。每次1—2汤

匙，沸水冲化饮用，经常服用。

方解：此膏中桑椹甘酸寒，能滋阴补血；百合甘微寒，可清热安神；蜂蜜甘平，可滋润

补中。三味共奏滋阴清心安神之效，适用于阴虚火旺的心烦不眠之症。

(2)莲子心茶(《经验方》)

原料组成：莲子心2g，生甘草3S，绿茶2so

制作及用法：将莲子心、甘草、绿茶放入保温瓶中，开水冲泡15分钟即成。频频饮用，每日数次。

方解：莲子心苦寒，人心经，能清心安神；甘草甘平，能清热解毒，与莲子心相配，共

收清心安神之效。适用于心火内炽所致的烦躁不眠。

3．肝郁化火

．

[证候] 心烦失眠，急躁易怒，严重者彻夜不眠；伴胸闷胁痛，头痛，面红目赤，口

于苦，舌红苔黄，脉弦数。

[治法] 疏肝解郁，宁心安神。

[食疗方]

(”柴胡决明粥(《f临床食疗配方》)

原料组成：柴胡15g，决明子20g，菊花15g，冰糖15g，大米100So

制作及用法：将柴胡、决明子、菊花放砂锅内，加水煎煮后去渣取汁，与大米煮粥，粥

熟后加入冰糖至溶化。每日1剂，分2—3次服用。

方解：柴胡疏肝清热解郁；菊花辛甘微寒，可疏风清肝明目；决明子平肝潜阳、养阴明

日；大米健脾养胃。诸药合奏疏肝解郁、清热宁神之效，适用于肝郁化火所致之心烦失眠、急躁易怒之症。

(2)栀子仁粥(《寿亲养老新书》)

原料组成：栀子仁30g，粳米100g。

制作及用法：将栀子仁研成粉末，分作4等份备用。将粳米洗净，人锅内加水适量，煮

粥，待粥熟汁稠时，下栀子仁粉末1份，搅匀食之，每日2次。

方解：栀子味苦性寒，能泻火解毒；粳米健脾益气，防止栀子苦寒伤胃。本品用于虚烦 不得眠者。

4．心胆气虚

[证候] 不寐多梦，易于惊醒；胆怯恐惧，遇事易惊，或虚烦不寐，形体消瘦，面色

苍白，心悸神疲；舌质淡，苔薄白，脉细或弦弱。

．t治法] 益气镇惊，安神定志。

[食疗方l

(1)安神代茶饮(《慈禧光绪医方统义》)

原料组成：龙齿(煅)10g，石菖蒲3g，绿茶1 g。

制作及用法：将龙齿人锅内，加水适量。先煎20分钟，再入石菖蒲、茶叶同煎10-15 分钟。去渣取汁，代茶经常饮用。

方解：龙齿重镇定惊安神；石菖蒲祛心窍之痰而安神。二者合用可镇惊定志安神，取汁

代茶经常饮用可治心胆气虚不足所致之失眠、多梦、惊悸之症。

(2)安神定志粥(《经验方》)

原料组成：远志肉20g，炒枣仁凹g，石莲肉20g，粳米删g。

制作及用法：将远志、枣仁人锅内，加水适量，煎煮去渣取汁，备用。将洗净的莲肉与

粳米加水适量煮粥，粥熟后再加入远志、枣仁之煮汁，搅匀，煮二沸即成。分次服食，每日 早、晚各1次。

方解：此粥中酸枣仁养血补肝、宁心安神；远志祛痰安神定志；石莲健脾养胃宁神；粳

米健脾养胃，共奏补肝养心、宁神定志之功，适用于肝血不足、心神不宁所致的不寐、多 梦、健忘之症。

第九节

头

痛

头痛是指由外感或内伤所致头部经脉拘急或失养，清窍不利所引起的以头部疼痛为特征 的一种病症。

外感发热性疾病的头痛、高血压性头痛、偏头痛、血管性头痛、紧张性头痛等均可参考 本食疗方用之。

一、膳食原则

1．以调神利窍、缓急止痛为基本原则。外感头痛以祛邪治疗为主，内伤头痛以扶正为

主，虚实夹杂者则补虚祛邪兼施。

2．实证头痛者饮食宜清淡，可多食米、面、蔬菜、水果类；虚证者可多食富含营养的

食物。忌烟、酒、虾类、多脂类食品。

二、辨证食疗

1．风邪头痛

[证候] 头痛剧烈，起病急骤，痛连项背；恶风发热，遇风尤剧，鼻塞目眩；舌质淡

红，苔薄白，脉浮。

[治法] 疏风止痛。

[食疗方]

(1)川菊蜜饮(《百病食疗》)

原料组成：川芎20g，白菊花15g，蜂蜜20g。

制作及用法：将川芎、白菊花分别洗干净，川芎切成薄片，与白菊花同人砂锅，加水适

量煎煮20分钟，滤汁取渣，趁温调入蜂蜜，搅匀即成。上、下午分次服用。

方解：川芎行气活血、祛风止痛，上行头目，擅治头痛；白菊花疏风止痛、清利头目。

二味合用可疏风清热止痛，适用于风热头痛。

(2)川芎白芷鱼头汤(《常见病症的辨证与食疗》)

原料组成：川芎6g，白芷60g，草鱼头250g，生姜6g。

制作及用法：将川芎、白芷洗净放人砂锅内，加水适量煎煮25分钟，去渣取汁，与鱼

头同煮，鱼熟后加人生姜再煮5分钟即成。每天1次，连服1周。

方解：川芎祛风止痛；白芷辛温散寒、疏风止痛；生姜散寒；草鱼头养胃补脑，“治虚

劳及风虚头痛”(《医林纂要》)。诸味配合能疏风散寒止痛，适用于风寒之头痛。

2．肝阳头痛

[证候l 头痛且胀，或抽掣而痛；头晕，目眩，心烦易怒，面红目赤，口苦胁痛；舌

质红，苔黄或少，脉弦数。

[治法] 平肝止痛。

[食疗方]

(1)天麻猪脑羹(《中国药膳辨证治疗学》)

原料组成：猪脑1个，天麻10g，石决明15so

制作及用法：将天麻切成薄片，与石决明、猪脑同人砂锅中，加水适量，以小火炖煮1

小时成稠厚羹汤，捞取出药渣即可。分2-3次服用，可常服。

方解：天麻甘平，可平肝熄风止痛；石决明平肝潜阳；猪脑补脑定眩。三者合用，共奏’

平肝阳、补脑髓、止头痛之功效。适用于肝阳头痛。

(2)菊桂决明饮(《中国药膳辨证治疗学》)

原料组成：菊花10g，生山楂片15g，决明子15g(捣破)，冰糖适量。

制作及用法：将菊花、山楂、决明子三味放人保温瓶中，以沸水冲泡30分 47 钟后加入冰

糖适量即成。可冲泡2—3次，代茶频频饮用，每日数次，可长期服用。

方解：菊花甘苦微寒，可清肝平肝、明目定眩；山楂活血化瘀、消食降脂；决明子平肝

明目。诸药共奏平肝阳之功，适用于肝阳上亢之头痛、目赤。

3．痰浊头痛

[证候] 头痛昏蒙重坠；胸脘痞闷，纳呆，呕恶咳唾痰涎，肢体困倦；舌胖大有齿痕，苔白腻，脉弦滑。

[治法] 化痰降逆。

[食疗方]

(1)川芎半夏炖猪肉(《临床食疗配方》)

原料组成：制半夏10g，川芎10g，炒扁豆20g，猪瘦肉60g，油、盐适量。

，制作及用法：将半夏、川芎、扁豆放人砂锅内，加水煎煮40分钟，去渣取汁，加入瘦

肉炖熟，再入盐、油调味即成。食肉饮汤，每日1次，可经常食用。

方解：半夏辛温，可燥湿化痰、降逆止呕；川芎活血行气止痛；扁豆健脾和胃祛湿；猪

瘦肉补养精血。诸味合用，共奏燥湿健脾化痰功效，适用于痰浊上扰的头痛、呕逆。

(2)半夏山药粥(《中国药膳辨证治疗学》)

原料组成：山药30g，清半夏6So

制作及用法：将山药研末，先煮半夏取汁一大碗，去渣，调人山药末，再煮数沸，酌加

白糖和匀即成。分2次空腹食用。可连服1周。

方解：此粥中半夏辛温，可燥湿化痰、降逆止呕；淮山药益胃健脾、补肺固肾。二者相

配燥润相济，共奏健脾燥湿化痰、降逆止呕之功。适用于脾肺不足、痰浊上扰之头痛、呕

恶、吐痰。

4．瘀血头痛

[证候] 头痛剧烈或刺痛，痛处固定不移，经久不愈；或头部有外伤史，面色晦滞，日轻夜重，唇色紫黯；舌质紫黯或有瘀斑、瘀点，苔薄白，脉细涩。

[治法] 活血化瘀，行气止痛。

[食疗方]

川芎红花茶(《中国药膳辨证治疗学》)

原料组成：川芎6s，红花3s，茶叶3so

制作及用法：将川芎切成薄片，与红花、茶叶同人保温杯中，以沸水冲泡，加盖焖15

-20分钟即成。可连续冲泡2～3次。代茶频频饮用。

方解：此茶中川芎辛香走窜，可活血行气，为止头痛之要药；红花活血化瘀；茶叶清利

头目。诸品配合能活血行气止痛，适用于瘀血阻滞之头痛经久不愈者。

(2)菊桂决明饮(《中国药膳辨证治疗学》)

原料组成：菊花10g，生山楂片15g，决明子15g(捣破)，冰糖适量。

制作及用法：将菊花、山楂、决明子三味放人保温瓶中，以沸水冲泡30分钟后加入冰

糖适量即成。可冲泡2—3次，代茶频频饮用，每日数次，可长期服用。

方解：菊花甘苦微寒，可清肝平肝、明目定眩；山楂活血化瘀、消食降脂；决明子平肝

明目。诸药共奏平肝阳之功，适用于肝阳上亢之头痛、目赤。

3．痰浊头痛

[证候] 头痛昏蒙重坠；胸脘痞闷，纳呆，呕恶咳唾痰涎，肢体困倦；舌胖大有齿痕，苔白腻，脉弦滑。

[治法] 化痰降逆。

[食疗方] 49

(1)川芎半夏炖猪肉(《临床食疗配方》)

原料组成：制半夏10g，川芎10g，炒扁豆20g，猪瘦肉60g，油、盐适量。

，制作及用法：将半夏、川芎、扁豆放人砂锅内，加水煎煮40分钟，去渣取汁，加入瘦

肉炖熟，再入盐、油调味即成。食肉饮汤，每日1次，可经常食用。

方解：半夏辛温，可燥湿化痰、降逆止呕；川芎活血行气止痛；扁豆健脾和胃祛湿；猪

瘦肉补养精血。诸味合用，共奏燥湿健脾化痰功效，适用于痰浊上扰的头痛、呕逆。

(2)半夏山药粥(《中国药膳辨证治疗学》)

原料组成：山药30g，清半夏6So

制作及用法：将山药研末，先煮半夏取汁一大碗，去渣，调人山药末，再煮数沸，酌加

白糖和匀即成。分2次空腹食用。可连服1周。

方解：此粥中半夏辛温，可燥湿化痰、降逆止呕；淮山药益胃健脾、补肺固肾。二者相

配燥润相济，共奏健脾燥湿化痰、降逆止呕之功。适用于脾肺不足、痰浊上扰之头痛、呕

恶、吐痰。

4．瘀血头痛

[证候] 头痛剧烈或刺痛，痛处固定不移，经久不愈；或头部有外伤史，面色晦滞，日轻夜重，唇色紫黯；舌质紫黯或有瘀斑、瘀点，苔薄白，脉细涩。

[治法] 活血化瘀，行气止痛。

[食疗方]

川芎红花茶(《中国药膳辨证治疗学》)

原料组成：川芎6s，红花3s，茶叶3so

生物信息学分析 篇6

摘要:利用生物信息学的方法从番茄的基因组中解析得到一个与拟南芥渗透胁迫相关的细胞分裂素受体类激酶HK1高度同源的基因,命名为LeHK1,并对它的序列结构、蛋白基序、启动子区的顺式元件和基因的遗传进化进行了分析。 结果显示,番茄基因LeHK1编码的蛋白具有组氨酸蛋白激酶的结构特征,而且在进化上与拟南芥的渗透胁迫感受基因AtHK1分属同一个类群。从基因顺式反应元件分析来看,番茄基因LeHK1具有多个响应不同环境信号如热、干旱、激素信号的顺式元件,预示这个基因在环境响应和植物生长发育过程中具有重要功能。

关键词:番茄; HK1; 基因和蛋白结构; 顺式反应元件; 遗传进化

中图分类号:Q75文献标识码:ADOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.001

Bioinformatics of A Cytokinin Receptor Like Kinase Gene in Tomato(Lycopersicum esculentum L.)

LI Ai-qin1, LI Li-bin2, LIU Guo-ming3

(1. High and New Technology Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan, Shandong 250100, China; 2. Vegetable Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan, Shandong250100, China; 3.Taitou Town Comprehensive Agricultural Servicce Station of Shouguang City, Shouguang , Shandong 262735,China)

Abstract:Through bioinformatic method and datamining, a tomato homolog of arabidopsis histidine kinase gene HK1 which encodes a cytokinin recepter like protein, was isolated and named LeHK1. The structure ofLeHK1 sequence and its putative coding protein, aslo its cis-elements in promoter regioin and phylogenetic relasionship with other plants HKs was analyzed. The results showed that LeHK1 possesed the character of histidine kinase, and it was clusteredin the same group with AtHK1. According to the result of cis-elements analysis,tomato HK1 has muptiple cis-elements responsive to different environmental factors such as heat, drought, and hormones. This suggests that LeHK1 may play key roles in response to stresses and development.

Key words: Lycopersicum esculentum; HK1; gene and protein strtuctre ; cis-element; phylogeny

组氨酸蛋白激酶家族在植物乙烯、细胞分裂素和光信号响应过程中具有重要功能,参与和调节植物生长发育和对环境因子响应的众多过程。组氨酸蛋白激酶基因在模式植物拟南芥和水稻中得到了广泛和深入的研究[1-12], 但是在西红柿中的研究,尤其是对与细胞分裂素信号相关的组氨酸激酶基因的研究还很不充分。现有研究表明,细胞分裂素受体类蛋白在植物生长发育和逆境响应过程中具有极其重要的功能[1-3,5-15]。番茄作为世界上种植面积最大、也是我国最重要的蔬菜之一,在农业生产和人们的生活中具有不可替代的作用。因此,研究番茄细胞分裂素受体类蛋白基因对于改良番茄的抗逆性,以适应全球气候变暖和水资源日益匮乏,以及由于各种人为原因造成的土壤盐渍化等局面,力求生产更多的蔬菜,满足人们的生活需求具有重要意义。拟南芥渗透胁迫感受基因AtHK1(细胞分裂素受体类蛋白基因)已被克隆并得到功能验证[1,7],其直系同源基因在杨树、长春花中都已得到克隆和研究[13,16], 但在西红柿中还未见报道。因此,本研究拟利用拟南芥基因AtHK1的信息来解析番茄的同源基因序列。

1材料和方法

利用拟南芥的渗透胁迫感受基因AtHK1序列在Genbank中搜索相应的番茄基因组序列[17],根据内含子的边界特征解析得到编码区序列,利用编码区和基因组序列进行结构展示[18],并对预测编码的蛋白进行结构特征分析[19]和亚细胞定位预测[20]。根据基因组序列得到上游启动子区的序列,并对启动子序列中的顺式反应元件进行预测分析[21]。遗传进化分析利用MEGA4.1来进行,采用Bootstrap test-Neighbor Joining 方法,重复500次运算。

2结果与分析

2.1番茄LeHK1的序列和结构特征

本研究通过比较基因组学和生物信息学的方法从番茄基因组中得到一个与拟南芥HK1同源的基因组序列,命名为LeHK1。其预测编码的蛋白与拟南芥HK1的序列一致性为60.81%。LeHK1基因组序列长为5 261 bp,编码区为3 738 bp,预测编码一个含有1 245个氨基酸残基,分子量为138.86 kD的蛋白(表1)。这个基因位于番茄2号染色体的BAC克隆AC215474中,含有13个外显子,其外显子和内含子的结构如图1所示。

2.2 番茄LeHK1的进化分析

番茄LeHK1与拟南芥细胞分裂素受体相关的蛋白基因家族的进化分析表明(图2),LeHK1与AtHK1的关系最近, 推测与AtHK1有类似的功能,在渗透胁迫反应过程中具有重要作用。另外,LeHK1类基因在苔藓、杨树、长春花中都已得到克隆,而且在进化上分为同一个类群。长春花的CIHK1基因受冷胁迫诱导[16],因此,推测LeHK1可能在冷胁迫响应中也具有某种功能。功能性失活和获得研究表明,AtHK1能够正向调节植物对干旱、盐的响应和ABA的信号转导[1,2,7]。基因芯片分析的结果显示,突变体athk1中多个受逆境/ABA诱导表达的基因表达明显下降,这包括AREB1、ANAC和DREB2A及其调控的下游基因[1]。这说明,AtHK1基因作用于AREB1、ANAC和DREB2A的上游,可以通过依赖和不依赖ABA的信号途径正向调节逆境响应。另外,研究表明AtHK1在植物生长和种子成熟中也具有重要功能[1,7]。

2.3番茄LeHK1基因的顺式反应元件

通过分析启动子及其上游序列的顺式反应元件可以预测基因的功能。因此,本研究在得到LeHK1的基因组序列以后,取起始密码子上游2 000 bp的序列进行顺式元件分析,结果见表2。在LeHK1起始密码子上游2 000 bp的范围内共有10类顺式反应元件,包括赤霉素响应元件GARE和TATC-box,热激响应元件HSE,能和Myb蛋白结合的干旱诱导的顺式反应元件mybs,富含TC的逆境响应元件,昼夜节律响应元件,胚乳特异表达的顺式元件Skn-1,与防卫反应有关的顺式元件W-box和EIRE,还有Box-W1。这些结果表明,LeHK1基因可能不仅能够响应某些激素、热等非生物因子,而且与防卫反应和种子发育也有关系,值得深入探讨。

2.4番茄LeHK1蛋白的结构预测

为了研究LeHK1的功能,在解析得到它的编码序列后,对其预测编码的蛋白进行了结构分析。结果显示,LeHK1蛋白含有磷酸结合结构域、反应调节结构域、组氨酸激酶结构域、跨膜螺旋结构域和潜在的豆蔻酰化位点。这说明LeHK1蛋白具有组氨酸激酶的结构特征,而且有可能被豆蔻酰化。蛋白豆蔻酰化有利于与细胞膜的结合。亚细胞定位预测表明,LeHK1蛋白可能定位在细胞膜上,这与结构分析的结果相一致。

3讨论

细胞分裂素受体类激酶在植物逆境响应和生长发育过程具有重要功能。本研究解析的番茄基因LeHK1编码的蛋白具有组氨酸蛋白激酶的结构特征,而且在进化上与拟南芥的渗透胁迫感受基因HK1分属同一个类群,二者蛋白序列一致性达60.81%,而且亚细胞定位预测的结果表明LeHK1蛋白可能定位在细胞膜上。从这些分析结果来看,番茄基因LeHK1应为细胞分裂素受体类激酶基因,可能与拟南芥的渗透胁迫感受基因AtHK1具有相同或者相似的功能。另外,从基因顺式反应元件分析来看,番茄基因LeHK1 具有多个能响应不同环境信号如热、干旱、昼夜节律、病原物侵染,以及激素信号如赤霉素等的顺式反应元件,可对多种信号作出响应,预示这个基因在环境信号响应和植物生长发育过程中具有重要功能。至于番茄基因LeHK1对各种环境和激素信号的响应模式,在逆境响应和生长发育中的具体功能以及与细胞分裂素信号的关系需要深入探讨。本研究为进一歩研究番茄LeHK1基因的功能奠定了基础。

参考文献:

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[9] Pareek A, Singh A, Kumar M, et al. Whole-genome analysis of oryza sativa reveals similar architecture of two-component signaling machinery with arabidopsis[J].Plant Physiology, 2006,142(2):380-397.

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生物信息学分析 篇7

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper motif,bZIP)转录因子家族是真核生物中分布最广泛、结构最保守,研究最多的一类转录因子家族。bZIP转录因子能够通过与位于ABA(脱落酸)诱导基因上游启动子区域的ABRE(ABA-responsive element)应答元件结合参与ABA信号转导进而响应植物逆境胁迫[6,7]。如拟南芥AtABI5转录因子,是ABA介导的种子萌发和幼苗生长过程中重要的调控因子,受ABA、干旱和高盐胁迫诱导而大量表达,对植物抗逆性起关键作用[8]。与AtABI5相似,水稻(Oryza sativa L.)OsA-BI5转录因子能抑制种子萌发和萌发后幼苗的生长,可以与G-box元件结合从而激活抗逆基因的转录表达[9]。大豆(Glycine max)中超过1/3的bZIP基因家族成员参与ABA、盐、干旱和冷害胁迫响应中的一种或多种的防御反应[10]。番茄(Lycopersicon esculintum M.)在遭受低温侵害时,LebZIP1基因响应胁迫能够被诱导表达[11]。刚毛柽柳(Tamarix hispida W.)ThbZ-IP1基因的表达受NaCl、PEG、NaHCO3和CdCl2胁迫诱导[12]。

玉米(Zea mays L.)是重要的粮饲作物。然而,干旱、土壤盐渍化和低温等逆境胁迫严重影响了玉米的产量和品质。bZIP转录因子对植物逆境基因表达调控具有重要作用,迄今为止,其在拟南芥和水稻中的抗逆性研究较为深入,但在玉米中的研究却相对较少[13,14,15,16,17,18]。因此,本研究以玉米为试材,对其中的一个bZIP转录因子进行相关的生物信息学分析,为玉米bZIP转录因子在逆境胁迫中的功能及玉米抗逆育种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米bZIP转录因子序列登录号为DAA42014.1,来自于National Center for Biotechnology Information(NCBI)中GenBank数据库。

1.2 玉米bZIP转录因子的生物信息学分析

选择相应的生物信息学数据库及生物学软件对玉米bZIP转录因子进行详细的生物信息学分析:利用Protparam分析理化性质(http://www.expasy.org/tools/protparam.html);运行TM-HMM Server v.2.0在线分析软件寻找该玉米bZIP转录因子中的跨膜结构域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);进入Protscale数据库完成亲水性/疏水性分析(http://www.expasy.org/tools/protscale.html);采用SOPMA服务器对其二级结构进行预测(http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html);使用PSORT对该玉米bZIP转录因子的亚细胞定位进行预测(http://psort.hgc.jp/form.html);通过SignalP4.1预测其可能存在的信号肽位置(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);利用NCBI中的CD-search功能搜索该玉米bZIP转录因子的保守结构域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html);操作NetPhos 2.0Serve在线分析工具预测其磷酸化位点(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/);运用Protfun 2.0Server软件分类蛋白质功能(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)。

2 结果与分析

2.1 玉米bZIP转录因子理化性质预测

采用Protparam对玉米bZIP转录因子进行基本的理化性质的预测和分析。结果表明:该玉米bZIP转录因子分子式为C2931H4600N830O942S31,相对分子质量为67.531 6kDa;理论等电点(pI)为5.93;带负电残基(Asp+Glu)总数为62,正电残基(Arg+Lys)为51,为酸性蛋白;亲水性系数为-0.380,说明该蛋白是亲水性蛋白;不稳定系数为68.17,属于不稳定蛋白,这可能是其功能不明确的原因之一。说明该玉米bZIP转录因子为具有一定亲水能力,不稳定的酸性蛋白,其氨基酸组成详见表1。

由表1可知,该玉米bZIP转录因子含Ser(S)最多,占15.4%;其次为Ala(A),占10.2%;不含Pyl(O)、Sec(U)、Asx(B)、Glx(Z)和Xaa(X)氨基酸。

2.2 玉米bZIP转录因子跨膜结构域分析

跨膜结构域是一般由20个左右疏水氨基酸残基形成的α螺旋,它位于细胞膜上起着“锚定”作用。跨膜结构域的分析对于解析蛋白质的结构、功能、分类以及作用部位均有重要的意义。运行TMHMM Server分析玉米bZIP转录因子中可能存在的跨膜结构域,参数设置为默认值,结果表明该转录因子不存在跨膜结构域,并不进行跨膜转运,属于非跨膜类蛋白,位于膜外区的可能性最大(可能性=1.1)。

2.3 玉米bZIP转录因子疏水性/亲水性预测和分析

蛋白质的疏水性/亲水性预测目的在于通过分析不同肽段的亲/疏水区域,为蛋白的二级结构、结构域及功能域的划分提供理论参考。进入Protscale数据库采用Kyte&Doolittle算法对玉米bZIP转录因子的疏水性/亲水进行预测。结果如图1所示,该蛋白的亲水性最高值为-3.500,疏水性最高值为1.578,且亲水性氨基酸残基均匀的分布在整条肽链上,并明显多于疏水性氨基酸残基,因此推测玉米bZIP转录因子是亲水性蛋白质,这一结论与由一级结构分析得出的结果相吻合。

2.4 玉米bZIP转录因子的二级结构预测

蛋白质的二级结构是指多肽链借助于氢键排列成有规律的、重复的构象,主要包括有α-螺旋、β-折叠、β-转角等。研究二级结构对于认识蛋白质的空间构象具有重大的生物学意义。利用SOPMA服务器对玉米bZIP转录因子的二级结构进行预测分析,结果如图2所示,该二级结构由4种形式组成,即由无规则卷曲(Random coil),占50.71%;α-螺旋(Alpha helix),占34.07%;延伸链(Extended strand),占9.89%;β-折叠构成的β-片层(Beta turn),占1.90%。该结果表明玉米bZIP转录因子的二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主,同时在随机卷曲之间包含有部分延伸链,而β-转角和β-折叠则相对较少,并不均匀地分布

于整个多肽链上。N-末端以无规则卷曲的形式存在,C-末端以延伸链的形式存在。

2.5 玉米bZIP转录因子的亚细胞定位

蛋白亚细胞定位是研究蛋白质功能很重要的方面,本研究应用Psort数据库对玉米bZIP转录因子的亚细胞定位进行预测。由表2可知,该转录因子分布于细胞核上的可能性较大(可信度为0.88),并在细胞核上行使功能,可能为核蛋白。

2.6 玉米bZIP转录因子的信号肽预测与分析

信号肽一般由15~25个氨基酸所组成,它能够指导新合成的蛋白进行跨膜转移。采用SignalP 4.1软件分析该玉米bZIP转录因子的信号肽部分(见图3)。由图3可知,C值(剪切位点值)为0.108,说明在该转录因子中未发现可能的信号肽序列,可见,该玉米bZIP转录因子并不是分泌型蛋白,不可能在细胞中发生迁移。结合之前的亚细胞定位以及跨膜结构域分析结果,说明该玉米bZIP转录因子极有可能是一种核蛋白,在细胞核上合成后,直接在细胞核上行使功能。

2.7 玉米bZIP转录因子保守结构域分析

保守结构域是指在生物进化过程中结构和功能均高度保守的一类结构域。使用NCBI-CDD数据库分析该玉米bZIP转录因子中的保守结构域。结果如图4所示,该转录因子含有一个bZIP超级家族(bZIP super family)和Zein-binding超级家族(Zein-binding super family),这些结构域从植物到人类均高度保守(拟南芥、水稻、线虫、斑马鱼),主要参与包括植物生长、花发育、种子成熟、衰老、光信号、损伤、病菌防御以及对各种环境胁迫的响应在内的多种生物学过程。

2.8 玉米bZIP转录因子磷酸化位点预测

利用NetPhos 2.0预测该玉米bZIP转录因子的磷酸化位点,结果如图5所示,整条肽链共有57个氨基酸磷酸化位点(>0.5),其中有45处丝氨酸(Ser)磷酸化位点,在该转录因子中占主导地位,9处苏氨酸(Thr)磷酸化位点和3处酪氨酸(Tyr)磷酸化位点。可以推测,该玉米bZIP转录因子可能是通过可逆的磷酸化反应对逆境胁迫进行感知和应答的。

2.9 玉米bZIP转录因子功能分类预测

用CBS的ProtFun软件预测玉米bZIP转录因子的功能,结果如图6所示,该转录因子为酶蛋白,具有信号转导功能的概率最高为0.227,可能参与信号转导(Signal_transducer),根据酶的分类,很可能属于裂解酶。因此可以做推断:该蛋白是一个与信号转导有关的裂解酶蛋白。

3 结论与讨论

玉米是一种重要的粮饲作物,总产量居全球第一。我国是世界第二大玉米生产国,确保我国玉米生产持续稳定发展事关国家粮食安全战略部署。然而,干旱、高盐和低温等逆境胁迫严重影响了玉米的分布和产量。因此,作为植物中最大、最保守的转录因子之一的bZIP转录因子在玉米中的研究就显得尤为重要。

近年来,随着生物信息学的迅猛发展,各种分子生物学数据库提供了大量的核苷酸和氨基酸序列,利用生物信息学方法通过对这些已有的核苷酸和氨基酸序列的数据库进行分析和计算,搜索目标序列独特的结构特征(如保守结构域、功能修饰位点、亚细胞的定位信号等),对目标基因的功能进行初步的预测,已成为发现新基因和预测蛋白质结构最快捷有效的方法。

生物信息学分析 篇8

SGT( Small glutamine - rich tetratricopeptide repeat ( TPR) - containing protein) 蛋白于1998年被发现,存在两个同源性约60% 的异构体SGTA和SGTB,目前研究主要集中于SGTA。已发现多种能与SGTA蛋白发生相互作用的蛋白,包括HIV - 1编码的病毒蛋白U、肌肉生长抑制素、雄激素受体、生长激素受体等, 提示SGTA参与多种不同生物学过程,如病毒装配和释放、细胞分裂和凋亡、细胞内隔区和共分子伴侣功能[1]。近年来多项研究报道了SGTA表达改变与多种肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、非霍金斯淋巴瘤等的发生发展及 预后的相 关性,但均未阐 明其作用 机制[2,3,4,5,6]。本研究首次运用生物信息学方法对SGTA基因和蛋白的结构特点及其潜在相互作用的基因和蛋白进行预测分析,为探索其在相关肿瘤形成和发展中的机制提供理论基础和研究思路。

1材料与方法

1.1材料

人SGTA基因的结构和基因组定位信息来自NCBI的Gen Bank数据库,SGTA基因SNPs位点信息来自NCBI的SNP数据库,SGTA蛋白氨基酸序列信息来自Gene Cards数据库和Ensembl数据库。

1.2方法

SGTA基因与其他基因之间的相互作用网络构建采用Gene MANIA数据库; SGTA蛋白理化性质分析采用Prot Param软件,亚细胞定位预测采用PSORT工具,二级结构分析采用SOPMA软件,蛋白结构域分析采用Inter Pro Scan软件,蛋白翻译后修饰位点分析采用Net Phos K 1. 0和Phospho Site Plus数据库; SGTA与其他蛋白之间的相互作用网络构建采用STRING交互式数据库; 氨基酸序列多重比对和分子进化树绘制采用Clustal2. 1软件。各数据库软件参数如无特别说明均取默认值。

2结果与分析

2.1基因结构、SNP分析

人SGTA基因位于19号染色体( 19p13. 3) ,全长28 658 bp,含有12个外显子,mRNA全长2 358 bp,基因编码序列( coding DNA sequence,CDS) 在mRNA的148 bp ~ 1 089 bp区域。SGTA基因有5种可变剪接形式,其中,唯有含313个氨基酸的产物被共识编码序列数据库注释表征( 数据库id为CCDS12094) ( 表1) 。通过对NCBI的SNP数据库搜索,发现SGTA基因编码区共有78个SNP位点,其中同义突变46个,错义突变31个,无义突变1个( 表2) 。

注解: * 无义突变 。Note : * nonsense mutation.

2.2基因相互作用

应用Gene MANIA搜索与SGTA基因存在相互作用的其他基因信息,所构建的基因相互作用网络如图1。

2.3蛋白质理化性质和亚细胞定位分析

SGTA蛋白 ( id: CCDS12094 ) 含有313个氨基酸,分子量为34 063 Da,理论等电点预测为4. 79,为酸性蛋白。在哺乳动物网织红细胞内半衰期为30 h, 不稳定系数为53. 98( > 40考虑为不稳定) ,分类为不稳定蛋白质。脂肪系数为75. 91,总平均亲水性 ( GRAVY) 为 - 0. 490,表明该蛋白是个亲水蛋白。据亚细胞定位分析,SGTA蛋白定位于细胞核的可能性较大( 47. 8% ) ,其次分别为胞外( 21. 7% ) 和细胞浆 ( 17. 4% ) 。

2.4蛋白质二级结构和结构域分析

SGTA蛋白氨基 酸序列中 α - 螺旋 ( H ) 为57. 83% ,随机卷曲 ( C ) 为28. 43% ,β - 转角 ( T) 为7. 35% ,延伸链( E) 为6. 39% ( 图2) 。结构域分析表明,SGTA蛋白属于TPR超家族,序列中间存在高度保守的由3个串联重复的TPR基序( 91 ~ 124、125 ~ 158、159 ~ 192) 所构成的结构域 ( 图3 ) ,通常介导SGTA与其他蛋白质的相互作用。此外,C - 末端有一段富含谷氨酰胺的序列( 275 ~ 287) ,介导多肽内疏水氨基酸的相互作用,而N - 末端参与介导分子自身的二聚化。

2.5蛋白质翻译后修饰预测

分别采用Net Phos K 1. 0和Phospho Site Plus分析SGTA蛋白的激酶磷酸化修饰位点,并将其中Phospho Site Plus的严谨性参数设置为高,两种方法预测结果的交集为: Thr81、Ser266、Ser305为潜在的激酶磷酸化修饰位点( 表3) 。此外,Phospho Site Plus还预测SGTA蛋白存在多个泛素化修饰位点,包括Lys95、

2.6蛋白质相互作用分析

利用STRING交互式数据库搜索蛋白质相互作用信息,置信度设置为高( 0. 700) ,数量限制在10个蛋白以内,所构建的蛋白质相互作用网络如图4。

2.7多序列比对分析

对多个物种SGTA蛋白的氨基酸序列进行相似性比较,人与其他12个物种包括黑猩猩、猕猴、牛、 犬、大鼠、小鼠、鸡、热带瓜蟾、斑马鱼、线虫、果蝇、酿酒酵母的 相似性分 别为100% 、99% 、96% 、95% 、 89% 、89% 、81% 、74% 、68% 、47% 、30% 和33% 。基Lys103、Lys116、Lys137、Lys160、Lys174、Lys183、 Lys184、Lys196、Lys200、Lys205等。于多重序列比对绘制分子进化树( 图5 ) ,人与黑猩猩进化距离最小,与其他脊椎动物也有很接近的进化来源,进化距离最远的是果蝇和酵母

3讨论

最早发现的大鼠SGTA是从体外酵母双杂交体系中筛选得到的能与自主性细小病毒非结构蛋白NS1( nonstructural protein 1) 结合的一种蛋白,因其中部TPR基序和C - 末端一段富含谷氨酰胺序列( glutamine rich) 的结构特征而得名。随后从人、线虫、酵母等不同生物体均发现了SGTA同源物[7]。与大鼠和小鼠类似,人SGTA在机体各组织中广泛表达,提示其可能是一个管家基因。人SGTA基因位于基因密度最高的第19号染色体,该染色体Cp G岛分布频率高、重复序列密度高以及重排率高等特点预示SGTA在生物进化中具有重要意义。目前Ensembl等数据库收录了SGTA基因的5种可变剪接形式,但研究预测,SGTA基因可能存在38种不同剪接体,对应约30种不同的蛋白质产物; 另有研究揭示,表观分子量分别为36 k Da、38 k Da、39 k Da的三种不同SGTA蛋白可能在细胞分裂过程中发挥不同的作用[8]。SGTA基因的这种表达调控多样性也体现在其基因内含有多个SNP位点并存在拷贝数变异( copy number variants,CNV) 。SGTA基因共含有1 704个SNP位点, 但绝大部分分布于内含子区,编码区78个SNPs引起的突变中同义突变占半数以上,提示SGTA基因的SNP在生物进化中具有一定的选择作用。值得注意的是,SGTA基因的rs1640262位点SNP与多囊卵巢综合征的发病率存在关联性,其机制可能与细胞凋亡及雄激素受体信号调节有关[9]。但最近也有研究表明,SGTA在人原始卵泡与初级卵泡之间的表达差异与是否患有多囊卵巢综合征无关[10]。因此,对于SGTA基因内含子区的SNP位点与不同的选择性剪接方式之间的关系以及由此产生的不同产物的活性等的研究仍需进行大量工作。同时,相对于SNP而言, CNV影响的基因片段范围更广,而且CNV也被认为可能与癌症等恶性疾病的发生机制密切联系。因此, 对于SGTA基因的SNP和CNV与癌症的关联性研究将有助于阐明其在肿瘤形成中的重要意义。

软件预测人SGTA蛋白的亚细胞定位在细胞核的可能性略大于胞外和胞浆,这一结果与其组织表达的广泛性和参与生物学途径的多样性等特点一致。 例如,SGTA与热休克蛋白90β ( heat shock protein 90β,Hsp90β) 相互作用定位于Hela细胞的胞浆,细胞发生凋亡时该相互作用被阻断,SGTA转而定位至核内[11]。又如,SGTA调节雄激素受体( androgen receptor,AR) 信号途径的作用机制之一是SGTA能够同时与AR及细胞骨架的微管蛋白结合从而阻止AR入核[12]。而SGTA蛋白参与多种生物学途径的基础是其结构中部TPR基序构成的保守结构域。TPR基序是一个高度保守的包含34个氨基酸残基的多肽重复序列,该基序最初发现于细胞分裂周期蛋白23。 每一个TPR基序含有两个反向平行的 α 螺旋,串联重复的TPR基序形成一个右手螺旋结构,这个右手螺旋的中间构成一个具有双亲性的通道,能够容纳与之极性互补的靶蛋白的部分区域,因而含有TPR基序的结构域在多蛋白复合体形成中可作为蛋白质之间相互作用的支架,从而广泛参与各种不同细胞生物学过程。含有TRP基序的蛋白普遍存在于生物体内,在细胞内的亚定位亦涉及到胞浆、胞核、线粒体、 过氧化物酶体和溶酶体等多处区域[13]。

磷酸化是蛋白质功能调节的重要机制之一。两种预测方法交互分析表明,SGTA有3个可信度较高的潜在激酶磷酸化位点,涉及的激酶包括糖原合成酶激酶3( Glycogen synthase kinase 3,GSK3A) 、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5 ( cyclin - dependent kinase 5,CDK5 ) 、DNA依赖性蛋白激酶 ( DNA - dependent protein kinase,DNA - PK) 和蛋白激酶B ( protein kinase B,PKB) 亚型Akt1。其中,Ser305磷酸化修饰已被证实能够促进其与血小板衍生生长因子受体 α 之间的相互作用[14]。丝氨酸/苏氨酸激酶GSK3除作为糖原代谢的关键酶外,也能够调节细胞分裂、增殖、 能动性和细胞生存等,在多种病理情况如癌症、糖尿病和神经性疾病中发挥作用[15]。CDK5是脑发育所必需的激酶,参与神经元成熟、迁移和可塑性过程,调节突触小泡的外排途径,与感官信号如疼痛感的传递有关[16]。有报道提示SGTA参与脑中枢神经系统的发育[17],作用机制可能与其Thr81作为GSK3A或CDK5的潜在底物有关。DNA - PK作为DNA损伤的分子感应器,在被激活后作用于底物如组蛋白H1、 p53、c - jun、Hsp90等启动细胞修复系统。 因此推测,在应激状态下,DNA - PK磷酸化SGTA蛋白能够导致其共分子伴侣活性受到调节,以利于热休克蛋白发挥细胞防御机制。此外,泛素化修饰作为另一种重要的蛋白质翻译后修饰,其作用除介导蛋白质特异性高效降解外,还直接影响蛋白质的活性和定位,调控基因表达、细胞增殖、分化、凋亡和自噬、DNA损伤修复及免疫应答等细胞活动[18]。本研究分析发现SGTA蛋白存在多个潜在的泛素化修饰位点,不仅提示三种功能表现不同、表观分子量不同的SGTA有可能是不同形式的蛋白翻译后修饰的结果; 同时也预示这种泛素化修饰作用可能是SGTA蛋白广泛参与不同生物过程的分子机制之一。

在Gene MANIA基因相互作用网络中SGTA基因与HSPA4、DNAJC5、UBL4A基因之间存在相互作用, 而在STRING蛋白相互作用网络中SGTA蛋白与这三个基因编码的蛋白也存在相互作用。HSPA4编码的蛋白即 热休克蛋 白70 ( heat shock protein 70, Hsp70) ,DNAJC5编码的蛋白为J蛋白家族成员CSP ( cysteine string protein) ,这两者与SGTA蛋白的相互作用已证实可调节Hsp70的ATP酶活性。UBL4A编码的蛋白为泛素样蛋白4A,是凋亡相关蛋白BAT3 ( HLA - B - associated transcript 3) 多蛋白复合体的成分之一,参与调控末端锚定蛋白向内质网的转运[19]。 相互作用网络分析结果与上述SGTA保守结构域及翻译后修饰预测结果相一致,进一步提示,从泛素化修饰与细胞周期的角度研究SGTA蛋白的功能是阐明其在肿瘤形成和发展中作用机制的重要思路之一。 此外,序列比对和进化分析结果显示,SGTA是一种进化保守蛋白质。因此,在不同动物或细胞模型上获得的相关结果对于人SGTA蛋白的作用机制研究具有良好的参考价值。

4结论

生物信息学分析 篇9

1 材料和方法

1.1 序列来源

从NCBI网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的GenBank中下载山羊等14个物种的77条Agouti基因,见表1。

1.2 分析方法

先利用BioEdit 软件对77个不同序列的Agouti基因编码区进行比对分析,选取完整编码区序列(长度为435 bp )进行比较后,利用 DanSP 4.20软件对其进行遗传多样性分析,生成单倍型,并计算遗传距离,再利用MEGA4.0软件的UPGMA方法进行聚类分析,构建聚类图。

2 结果与分析

2.1 不同物种Agouti基因核苷酸多样性

2.1.1 多态位点

在所分析的共有片段为435 bp的77条序列中,发现93个多态位点,占21.38%。其中单一多态位点16个,占3.69%;简约多态位点77个,占17.70%。不同物种内的多态位点数也各不相同,髯羊、山羊、绵羊、牛、野猪、马、犬、狒狒、黑猩猩、人、兔、家猫、鼠和猕猴的多态位点数分别为2,9,6,8,38,48,48,53,54,59,63,41,94,99个(见表2),占0.46%、2.07%、1.38%、1.84%、8.74%、11.03%、11.03%、12.18%、12.41%、13.56%、14.48%、9.42%、21.61%、22.76%,其中鼠和猕猴的

Agouti基因核苷酸变异较大,说明鼠和猕猴的Agouti基因多态性都比较丰富。

2.1.2 单倍型及其多样性

根据序列比对,在77条Agouti基因序列中发现30种单倍型。各物种的单倍型多样性大小不一(见表3),该基因单倍型多样性检测结果表明种群间Agouti基因遗传变异丰富。通过DanSP4.20软件分析,所有物种平均核苷酸差异数(K)为22.536 8,核苷酸多样性为0.139 1。其中鼠的平均核苷酸差异数和核苷酸多样性最高,其次是山羊和猕猴,表明鼠的Agouti基因存在较丰富的遗传多样性。

2.1.3 物种间核苷酸歧异度(Dxy)、净遗传距离(Da)和遗传分化(Gst)

各种群间核苷酸歧异度在0.012 4～0.244 7之间,净遗传距离在0.006 9～0.192 9之间,遗传分化在0.033 7～1.000 0之间(见表4),不同物种间核苷酸歧异度、净遗传距离和遗传分化的变化范围都很大,其中人和黑猩猩以及绵羊和山羊间的核苷酸歧异度、净遗传距离均最小,说明人与黑猩猩、绵羊和山羊的亲缘关系较近,而鼠与其他物种间的核苷酸歧异度和净遗传距离均最大。这说明鼠与本研究中其他物种间的亲缘关系较远,基本上与NCBI上的动物学分类相符合。

2.2 不同物种Agouti氨基酸多样性

2.2.1 密码子偏爱性

所截选的不同物种Agouti基因序列编码区中密码子有效值(ENC)为41.841 (<61),偏爱指标(CBI)为0.571 (>0),经χ2检验,计算得到未校正的χ2值为0.792,说明Agouti基因对密码子有较强的偏爱性[2]。

2.2.2 同义替换和非同义替换

不同物种77条 Agouti基因序列编码区中同义替换平均位点数为37.68个,非同义替换平均位点数为112.32个。 不同物种同义替换位点数(SS)为35.28～39.17个(见表 5),同义替换核苷酸多样性均值[π(s)]为0.291 47。非同义替换位点数(NSS)为110.83～114.72个,非同义替换核苷酸多样性均值[π(a)]为0.089 09。绵羊的非同义替换位点数较其他物种多,说明绵羊Agouti基因编码区的非同义替换较其他物种高。

注:上三角为净遗传距离,下三角为核苷酸歧异度和遗传分化(括号内)。

2.3 不同物种Agouti基因遗传分化分析

根据不同物种之间的遗传分化(Gst),用MEGA4.0 软件的UPGMA方法构建不同物种分子聚类图见图1。

由图1可见,人与猩猩的亲缘关系最近,绵羊、山羊、牛的亲缘关系较近,鼠与其他物种的亲缘关系最远,基本上与NCBI上的动物学分类相符合。

3 讨论

3.1 不同物种的遗传分化和系统发育

由试验结果可知,不同物种间的核苷酸歧异度、净遗传距离和单倍型间的遗传距离均较大,说明不同物种间遗传分化已经十分明显。从图1中可以看出,人先和黑猩猩聚在一起,然后再跟其他物种聚在一起,说明人与黑猩猩的亲缘关系最近;绵羊最先跟牛聚在一起,依次与山羊、家猫和野猪聚在一起,与动物学分类有些不符(绵羊与野猪的亲缘关系应该比家猫近),这可能与所选物种的Agouti基因序列较短、样本数量较少有关。

3.2 同义和非同义替换及密码子偏爱性

同义替换不受自然选择的控制,而非同义的替代速率则远远低于同义替代,且其发生的速率与基因密切相关,这被认为是净化选择的结果[3]。在有些基因中,非同义替代速率远远高于同义替代,这是达尔文的正向选择造成的[3]。本研究中发现,所选物种的Agouti基因的非同义替换位点数均明显高于同义替换位点数,说明所分析的这两个种群在进化过程中可能受到正选择的影响。在蛋白质编码过程中,不同物种或同一物种的不同基因在密码子的使用上均存在明显的偏爱性,即密码子偏爱性现象[4]。本试验发现,Agouti基因的某些密码子的使用表现出较强的偏爱性。目前,对密码子使用的偏爱性尤其是在进化中的作用还没有合理的解释,有待今后进一步研究。

3.3 突变位点的分析

本试验结果表明,物种间的Agouti基因有93个突变位点,这些突变位点是否与不同物种动物的毛发颜色的变化有关还需要进一步研究,在某些物种内发现仅生成1种单倍型,除了Agouti基因编码区在物种内较保守的原因外,可能还与这些物种样本含量太小有关。

摘要：为了研究不同物种Agouti基因的遗传多样性,试验采用生物信息学方法比较分析了山羊、绵羊、牛、髯羊、野猪、马、犬、狒狒、黑猩猩、人、兔、家猫、鼠和猕猴Agouti基因编码区(CDS)的遗传多样性。结果表明:来自14个物种的77条基因序列中检测到93个多态位点,共生成30种单倍型,物种间及物种内Agouti基因序列编码区存在较丰富的遗传多样性。

关键词：物种,Agouti基因,遗传多样性

参考文献

[1]VOISEY J,VAN DAAL A.Agouti:from mouse to man,from skin tofat[J].Pigment Cell Res,2002,15(1):10-18.

[2]WRIGHT F.The effective number of condons’used in a gene[J].Gene,1990,87(1):23-29.

[3]李易.基因进化的同义与非同义替代计算及统计检验的比较分析[J].曲靖师范学院学报,2006,25(6):1-8.

生物信息学分析 篇10

肽聚糖识别蛋白是一类存在于大多数动物体内 ( 在线虫与植物中没有发现[1]) 的模式识别蛋白,从昆虫到哺乳动物高度保守,通过识别细菌细胞壁中的肽聚糖( PGN) 帮助宿主抵御病原微生物。昆虫没有适应性免疫系统,先天免疫系统是其抵御外源微生物入侵的唯一途径。昆虫通过模式识别受体( pattern recognition receptors,PRRs ) 如肽聚糖 识别蛋白 ( PGRPs) 识别病原生物表面的病原相关分子模式 ( pathogen - associated molecular pattern,PAMP) ,实现对外来病原体的识别,进而启动先天免疫系统,激活Toll、IMD( Immune Deficicency) 、JAK - STAT等途径来产生抗菌肽等免疫分子达到清除病原物的目的[2]。昆虫PGRPs根据其分子量大小被划分为长型( PGRP L) 和短型( PGRP - S) 两种形式,PGRP - S分子量20 k D左右,多为胞外蛋白; PGRP - L分子量可以达到90 k D,可以是胞内蛋白、胞外蛋白或膜镶嵌蛋白。

PGRPs在结构上有一个大约165个氨基酸构成的PGN结合区,叫作PGRP结构域,该结构域和乙酰胞壁酸丙氨酸酰胺酶相似,并且与噬菌体T7溶菌酶有大约30% 的相似性,噬菌体T7溶菌酶具有酰胺酶活性,能够裂解PGN,因此有些PGRPs具有酰胺酶活性,能够打断糖链上N - 乙酰胞壁酸与L - 丙氨酸之间的酰胺键,从而裂解肽聚糖[3]。

新疆准噶尔盆地荒漠自然环境条件极端恶劣,植被稀疏,干旱少雨,在这样严酷的环境中生存着许多荒漠昆虫,它们适应极端环境的策略多种多样,不但耐受着荒漠极端环境的变化,而且也防御着生境中微生物[4]( 细菌、放线菌和真菌) 的感染。新疆荒漠鞘翅目拟步甲科昆虫种类丰富,已知有177种,分别隶属于17族55属[5]。但目前对新疆荒漠昆虫的免疫调控机理研究还十分有限,有关荒漠拟步甲科昆虫免疫防御机制尚未见报道。本课题组通过构建细菌诱导光滑鳖甲幼虫抑制差减c DNA文库,从中筛选得到了PGRP的表达序列标签,利用RACE法扩增得到PGRP全长序列。本研究对光滑鳖甲PGRP基因的c DNA序列进行结构与功能的信息学分析,以期为进一步揭示该基因在光滑鳖甲免疫防御体系中的功能提供一定的理论和实验依据。

1材料与方法

1.1序列来源

肽聚糖识别蛋白( PGRP) 基因来源于作者实验室对光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白基因Ap PGRP - FD1进行克隆测序得到的序列( Gen Bank,基因登录号: KP261086) 。

1.2方法

1.2.1PGRP理化性质分析

使用在线 程序ORFfinder ( http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov / projects / gorf / ) 预测Ap PGRP - FD1基因的开放阅读框; 使用在线软件Protparam ( http: / /web. expasy. org /protparam/) 和Prptscale( http: / / web. expasy. org / protscale / ) 预测Ap PGRP - FD1基因编码蛋白理化性质及其亲疏水性; 使用在线软件Signal IP 4. 1 ( http: / / www. cbs. dtu. dk / services / Signal P - 4. 1 / ) 、TMHMM Server V 2. 0 ( http: / / cbs. dtu. dk / services / TMHMM / ) 分析蛋白质的信号肽位点及跨膜区。

1.2.2结构及功能预测

利用Interpro ( http: / /www. ebi. ac. uk /interpro / scan. html) 在线分析软件预测蛋白质中包含的结构域; 利用PSORT Ⅱ( http: / /psort. hgc. jp /form2. html) 在线分析网站分析蛋白质在细胞内的定位; 利用PREDICTP - ROTEIN ( https: / / www. predictprotein. org / home )与SWISS-MEDEL ( http: / / swissmodel. expasy. org / interactive) 在线软件预测蛋白的二级结构与三级结构。

1.2.3系统发育树

从NCBI数据库下载10个物种的肽聚糖识别蛋白序列,包括赤拟谷盗( Tribolium castaneum) 、黄粉虫 ( Tenebrio molitor ) 、黑腹果蝇 ( Drosophila melanogaster) 、骚扰阿蚊 ( Armigeres subalbatus) 、家蚕 ( Bombyx mori ) 、蛴 ( Holotrichia diomphalia ) 、粉纹夜蛾 ( Trichoplusia ni) 、家蝇 ( Musca domestica) 、拟果蝇 ( Drosophila simulans) 、飞蝗( Locusta migratoria) ,利用MEGA 5. 05软件构建系统进化树。

2结果与分析

2.1氨基酸组成与理化性质分析

ORF finder结果显示Ap PGRP - FD1基因的编码区有591 bp( 图1) ,推测编码196个氨基酸( 图2 ) ; 该编码蛋白的分子量为21. 882 k D,理论等电点为6. 64,含酸性氨基酸( DE) 9. 2% ,含碱性氨基酸( KR) 8. 7% ,亲水性氨基酸 ( AILFWV) 、极性氨基酸 ( NCQSTY) 和带电氨基酸 ( RKHYCDE ) 的比例分别为35. 7% 、26. 6% 和27. 2% ; 在溶液中不稳定指数为33. 48,低于40,表明该蛋白可能为稳定蛋白质。

2.2疏水性和亲水性的预测与分析

利用Protprotscale在线预测Ap PGRP - FD1氨基酸序列的亲疏水性,氨基酸分值越低亲水性越强,分值越高疏水性越强[6]。Ap PGRP - FD1基因编码的蛋白多肽链第117位具有最强的亲水性( - 4. 500) ,第4位具有最强的疏水性( 4. 500) ( 图3) 。多肽链大部分区域为亲水性,因而整个多肽链表现为亲水性。该结果与Prot Param分析结果一致。

2.3信号肽

信号肽是指在新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移( 定位) 的N - 末端的氨基酸序列( 有时不一定在N端) ,信号序列通常为15 ~ 60个氨基酸长度。Signal IP4. 1结果显示该编码蛋白存在信号肽序列,其切割位点位于20 ~ 21位氨基酸之间( 图4) , 基本可以判定该编码蛋白为分泌型蛋白。

2.4亚细胞定位

PSORTⅡ预测Ap PGRP - FD1编码产物在昆虫体内的分布状况,从分析结果可知( 表1) 其分布在胞外的可能性 为66. 7% ,分布在内 质网的可 能性为22. 2% ,分布在分泌性囊泡的可能性为11. 1% 。推断此编码蛋白主要在胞外发挥作用,与信号肽分析结果一致。

2.5蛋白质编码产物功能预测

利用Protfun[7]程序预测光滑鳖甲Ap PGRP - FD1编码产物的功能,从分析结果( 图5) 可知此蛋白最有可能在信号转导、胁迫应答和免疫应答三方面发挥功能,其可能性分别为0. 272、0. 223和0. 123,推测此蛋白能够响应胁迫及免疫反应,主要发挥信号转导功能。

2.6结构域分析

Interpro Scan分析结果显示编码蛋白包含一个PGRP保守结构域和一个 Ⅱ 型酰胺酶结构域( 图6 ) 。 推断此蛋白至少有两种功能: ( 1 ) 与肽聚糖结合在信号通路中发挥作用; ( 2 ) 通过切割N - 乙酰胞壁酸与L - 丙氨酸之间的酰胺键裂解肽聚糖 。

2.7二级结构和三级结构预测

Predictprotein用以预测组成Ap PGRP - FD1多肽链二级结构,从分析结果可知 α 螺旋( H) 、β 折叠 ( E) 和无规则 卷曲 ( L) 的比例是26. 53: 13. 78: 56. 69; 其中无规卷曲占比例较大,β 折叠较少 ( 图7) 。利用Swiss - Modeling对PGRP的氨基酸序列进行蛋白质三维结构的同源建模( 图8) ,可见结构中有较多的 α 螺旋和无规则卷曲,与二级结构预测结果基本吻合。有些具有酰胺酶活性的PGRPs具有Zn+依赖性,需与Zn+结合才能发挥作用,肽聚糖识别蛋白Ap PGRP - FD1域中有两个保守的His和一个Cys与Zn+结合,增强PGRPs的酰胺酶活性。

2.8系统发育树

用MEGA 5. 05软件的Neighbor - Joining法构建11个物种的肽聚糖识别蛋白氨基酸序列系统发育树 。 结果见图9 , Ap PGRP - FD1与同为拟步甲科的赤拟谷盗 ( Triboloum castaneum ) 、 黄粉虫 ( Tenebrio molitor ) 的亲缘关系最近 。

3讨论

肽聚糖识别蛋白( Peptidoglycan recognition proteins,PGRPs) 是昆虫免疫应答的关键因子,在识别外源微生物时具有重要作用。昆虫的天然免疫应答包括免疫识别、免疫信号的调理放大和传导以及转录激活产生效应分子等几个基本的过程[8]。其中,免疫识别是昆虫实现有效防御的关键阶段,只有对入侵病原微生物和异物进行有效识别,才能激活和调动机体的各种免疫反应和抗菌效应。目前,在昆虫中发现的如肽聚糖识别蛋白、脂多糖结合蛋白( Lipopolysaccharide - binding protein,LPS - BP) 、革兰氏阴性菌结合蛋白( Gram - negative bacteria - binding proteins,GNBP) 、β - 1,3 - 葡聚糖识别蛋白( β - 1,3 - glucan recognition protein,βGRP) 等模式识别受体 ( PRRs) ,可识别外源微生物的肽聚糖、脂多糖、磷壁酸、β - 1,3 - 葡聚糖等 病原相关 分子模式 ( PAMPs )[9]。当PAMPs被昆虫的免疫受体捕获后,就会激发包括体液免疫和细胞免疫在内的一系列免疫应答反应。其中,肽聚糖识别蛋白主要激发体液免疫应答反应,是国内外学者研究昆虫免疫调控关键因子的热点之一。

自家蚕Bombyx mori的肽聚糖识别蛋白被鉴定以来[10],已从果蝇、大鼠、小鼠和人体内等成功克隆出约40多种PGRPs同源基因。Xiumei Wei等从大竹蛏体内克隆得到Sg PGRP - S1和Sg PGRP - S2基因[11]; 刘辉等通过构建金黄色葡萄球菌感染文昌鱼的差减文库,筛选到文昌鱼PGRPs[12]。PGRPs基因从昆虫到哺乳动物具有高度的保守性,C - 末端包含一个与细菌Ⅱ型酰胺酶同源的PGRP结构域,表明PGRPs和原核肽聚 糖 Ⅱ 型裂解酶 在进化上 的同源性[13]。

昆虫的PGRPs主要产生于脂肪体和血淋巴,主要有三方面功能: ( 1) 识别和结合细菌的肽聚糖,继而激活Toll和Imd信号通路,诱导产生抗菌肽; 同时可激活酚氧化酶原( PPO) 而产生黑化作用,例如果蝇的PGRP - SA能激活Toll信号通路[14]; PGRP - LE能激活Imd信号通路和激活PPO[15,16]; PGRP - SB1能激活Imd信号通路[17]; PGRP - LA能调控Imd信号通路[18]; 烟草天蛾M. sexta PGRP1能激活PPO[19]; ( 2) 具有杀菌酰胺酶活性[20],作用于肽聚糖而直接杀灭细菌,如PGRP - SC1B、Cf PGRP - S1能明显抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长[12]; ( 3) 具有调理素的作用,能诱导凝集和促进吞噬作用[21]。

目前报道的有关PGRPs结构和功能方面的文献都是基于对一些基本的模式生物( 如果蝇、人、小鼠) 的研究[22,23],对于其他生物体内有关PGRPs的结构和功能则报道较少,而有关荒漠拟步甲科昆虫的研究尚未见报道。本研究对荒漠昆虫光滑鳖甲Ap PGRP - FD1的分析表明,该蛋白主要定位于胞外,概率为66. 7% ; 包含一个保守的PGRP结构域和一个Ⅱ型酰胺酶结构域,提示该蛋白至少具有两种功能: ( 1) 识别和结合细菌的肽聚糖,激活Toll信号通路和Imd信号通路,诱导产生抗菌肽; ( 2) 具有酰胺酶活性,裂解肽聚糖直接杀灭细菌。本研究采用生物信息学方法分析了光滑鳖甲PGRP的理化特性和结构,不仅丰富了肽聚糖识别蛋白家族基因信息,同时为进一步研究荒漠昆虫的免疫调控机理奠定了一定的理论基础。

4结论

光滑鳖甲Ap PGRP - FD1基因含有完整的开放阅读框( 591 bp) ,编码196个氨基酸。编码蛋白质分子量为21. 882 k D,理论等电点为6. 64,包含一个由20个氨基酸组成的信号肽,无跨膜区,属亲水蛋白, 分泌到胞外发挥作用,具有能够与肽聚糖结合的保守的PGRP结构域和一个Ⅱ型酰胺酶结构域; 二级结构以无规则卷曲为主,折叠较少。

摘要：[目的]预测光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白的结构与功能。[方法]采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析,同时构建其编码产物的系统进化树。[结果]此蛋白的理论分子量为21.882 k D,包含一个由20个氨基酸组成的信号肽,属亲水蛋白,分泌到胞外发挥作用,可能具有信号转导和响应胁迫与免疫反应的功能,与赤拟谷盗的同源性最高,具有能够与肽聚糖结合的保守的PGRP结构域和一个Ⅱ型酰胺酶结构域。[结论]光滑鳖甲肽聚糖识别蛋白Ap PGRP-FD1基因克隆成功,生物信息学分析及结合蛋白质结构与功能预测可为深入研究ApPGRP-FD1提供理论指导。

生物信息学分析 篇11

关键词 巴西橡胶树 ；HbPRX2 ；生物信息学 ；基因克隆

中图分类号 S794.1

Cloning and Bioinformatic Analysis of a Peroxidase Gene in Rubber Tree（Hevea brasiliensis Muell. Arg）

DENG Yujie YU Haiyang ZHANG Yu WANG Meng

（Hainan University，Haikou，Hainan 570228）

Abstract Peroxidase is the enzyme of catalytic oxidation of substrates using hydrogen peroxide as electron acceptor. In this study，one peroxidase gene full length cDNA was amplified in the leaf in rubber tree clone CATAS7-33-97，designated as HbPRX2， It was 1 179 bp in length，containing a 1 005 bp ORF which encodes 335 amino acid residues，a 145 bp 3'untranslation region and a 29 bp 5'untranslation region. The molecular mass of the putative protein is 34.85 kDa with its theoretical pI of 4.98. The deduced amino acid sequence had the specific domains of plant peroxidase like super-family domain peroxidase4. It shares 63.22%，32.37%，33.73% and 37.80% identities with Hevea brasiliensis HbPRX1，HbPRX42，Arabidopsis AtPER42 and rice OsPRX33，respectively. The bioinformatic analysis showed that HbPRX2 protein is a hydrophilous protein which have an secretion pathway signal. It was a stable protein with transmembrane region at 7-24，36-55，130-151，and 278-301 amino acid and signal Peptide at 29-30 amino acid， respectively. This study provides a fundamental knowledge of further study the structure and functions of HbPRX2.

Key words Hevea brasiliensis ；HbPRX2 ；bioinformatics ；gene cloning

ClassIII型过氧化物酶（Peorxidaes，EC1.11.1.7）是一类以血红素为辅基的酶，在生物中广泛存在，具有多种不同的生物功能[1-2]，主要催化过氧化氢对多种有机物和无机物的氧化作用，包括酚类、生长素、木质素前体和次生代谢产物[3-4]。它是多基因家族成员，在水稻中有138个成员[5]，在拟南芥有73个成员[6]，同时它也是糖蛋白，位于植物液泡和细胞壁中[7]。过氧化物酶蛋白的分子量约为30-45 ku，由大概300个氨基酸残基组成，其中存在酸碱催化域和血红素结合区域[常含8个半胱氨酸（构成4个二硫键桥）]，2个钙离子结合区，在ASp99和Argl23还有一个盐桥，2-6个糖基化位点，一个原高铁血红素。目前，除了水稻和拟南芥等模式植物外[8-10]，已在甘蔗[11]、大豆[12]中克隆了过氧化酶基因。巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）是天然橡胶的主要来源，橡胶树的乙烯利刺激割制[13]、病原菌侵害和环境危害[14]等都会引起橡胶树胶乳活性氧的产生，导致黄色体破裂。过氧化物酶作为活性分子的主要生物淬灭剂，有助于保护橡胶树免受活性氧的危害。因此，克隆巴西橡胶树胶乳中的过氧化物酶基因并研究其结构和功能对天然橡胶产业的良性发展具有重要的理论价值和实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

以定植在海南大学农学院教学基地的巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97的叶片为材料。

1.1.2 质粒、菌种和试剂盒

克隆载体pMD18-T Vector、大肠杆菌DH5α感受态、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶等购自中国大连Takara公司；凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、PCR Master Mix，pfu Master Mix等均购自天根生化科技（北京）有限公司；反转录试剂盒购自美国Fermentas公司；其他生化试剂和常规试剂均为国产分析纯；所有引物合成及测序均由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 叶片RNA的提取

RNA提取参照马瑞丰等[15]的方法。RNA质量检测：取1 μL RNA样品用RNase-Free ddH2O稀释至500 μL，用紫外分光光度计测定其OD230、OD260、OD280的吸收值，并根据OD260/OD230、OD260/OD280计算总RNA溶液的浓度及纯度。用甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.2.2 反转录

用RNA反转录试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，Fermentas）进行反转录。在0.2 mL的Eppendorf管中依次加入总RNA 1 μL，QT引物1 μL，以1 ‰ DEPC处理水补足12 μL，混匀，瞬时离心；随后于70 ℃中孵育5 min，冰上冷却，瞬时离心；依次加入5×reaction buffer 4 μL，RiboLockTM Ribonuclease Inhibitor（20 u/μL）1 μL，10 mmol/L dNTP mix 2 μL，轻轻混匀，瞬时离心；在37 ℃中孵育5 min；随后加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase（200 u/μL）1 μL，于42 ℃中孵育60 min；最后以70 ℃加热10 min终止反应，冰上冷却，稀释5倍，于-20 ℃保存。

1.2.3 橡胶树叶片过氧化物酶基因序列的克隆

根据在NCBI上搜索的橡胶树EST序列，设计过氧化物酶基因特异引物（表1）。

在0.2 mL的离心管中分别加入以下成分：反转录液1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，PrxS1或PrxS2 1 μL，PrxA1或PrxA2 1 μL，ddH2O 7 μL，总体积20 μL。混匀后，在DNA Thermo Cycler T1上进行PCR反应，反应程序：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1 %的琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的片段，用凝胶回收纯化试剂盒回收并克隆至pMD18-T载体，送交测序。

1.2.4 基因结构生物信息学分析

采用DNAMAN7.0软件进行DNA和蛋白序列比对，用DNAstar软件进行ORF筛选，用NCBI Blast软件和PROSITE软件进行结构域分析，用ProtParam分析理化性质，用ProtScale分析亲水性，用SignalP分析信号肽，用TMpred和TMHMM分析跨膜结构域，用PSORT、Mitoprot和TargetP分析细胞定位。

2 结果与分析

2.1 RNA的提取

甲醛变性凝胶电泳结果发现，28S rRNA、18S rRNA分带清晰，且28S rRNA的量约是18S rRNA的2倍，说明所提取的总RNA完整性好，几乎无降解（图1-A）。取1 μL橡胶树叶片总RNA稀释至500 μL后进行紫外分光光度计检测，其OD260/OD280为2.06，表明RNA样品几乎没有蛋白质污染，而OD260/OD230为2.1，表明几乎没有酚和多糖类物质的污染，符合下一步反转录和基因扩增要求。

以反转录的cDNA为模板，利用特异引物进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增出了约1 200 bp的条带（图1-B），与预测片段大小基本一致。将扩增的DNA片段回收后，与PMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，筛选重组子进行测序。测序结果表明所克隆的cDNA全长1 179 bp，命名为HbPRX2。

2.2 HbPRX2序列分析

HbPRX2基因全长1 179 bp，5’端29 bp，3’端145 bp，阅读框1 005 bp，编码335个氨基酸。推导的氨基酸理论分子量为34.85 u，等电点为4.98（图2）。分子式为C1513H2394N420O500S12，总原子数4 839。图3和表2是根据橡胶树HbPRX2的cDNA序列推导的氨基酸序列与其他植物中的过氧化物酶基因所编码的蛋白质氨基酸序列相似性比较结果。从中可以看出，HbPRX2推导的氨基酸含有HbPRX2蛋白特征性的PEROXIDASE_4结构域。HbPRX2基因与巴西橡胶树HbPRX1、HbPRX42、拟南芥AtPER42和水稻的OsPRX33的过氧化物酶蛋白序列相似性分别为63.22 %、32.37 %、33.73 %和37.80 %。

2.3 HbPRX2生物信息学分析

2.3.1 HbPRX2蛋白结构域功能分析

植物的过氧化物酶大多含有一个特征性结构域：PEROXIDASE_4， PS50873。Class III型过氧化物酶位于细胞外空间或者植物的液泡中，参与过氧化氢的解毒活动、生长素代谢、木质素生物合成和胁迫反应，含有4个保守的二硫化物桥和2个保守的钙离子结合位点。从图4可以看出HbPRX2蛋白具有特征性PEROXIDASE_4结构域，并与其它过氧化物酶成员高度保守，属于过氧化物酶家族成员（图4）。

2.3.2 HbPRX2蛋白的信号肽分析

根据SignalP-4.1工具在线分析结果，HbPRX2蛋白在29-30氨基酸处具有一个信号肽结构（图5）。

2.3.3 HbPRX2蛋白的亲水性分析

利用ProtScale预测巴西橡胶树HbPRX2蛋白氨基酸序列的亲水性/疏水性（图6）。依据氨基酸分值越低亲水性越强、分值越高疏水性越强的规律，可以看出，多肽链第20位具有最高的分值3.600和最强的疏水性；第257位具有最低的分值-1.733和最强的亲水性。橡胶树HbPRX2的整条多肽链表现为亲水性。

2.3.4 HbPRX2蛋白的跨膜结构域分析

根据TMHMM和TMpred网站分析，超过500分的才被认为显著。从图7中可以看出HbPRX2蛋白有4个跨膜螺旋，分别位于7-24、36-55、130-151和278-301氨基酸残基处，分数为3812，达到500分的显著值，故可推测HbPRX2含有跨膜结构域（图7）。

2.3.5 HbPRX2蛋白的细胞定位分析

根据TargetP 1.1分析， HbPRX2蛋白在叶绿体中的可能性为0.018，在分泌信号途径中的可能性为0.905，在其他部位的可能性为0.009（表3），推测该蛋白含有信号肽，属于分泌信号途径，可靠性级别为1；经Mitoprot分析可知，其在线粒体外的几率为0.4163；运用PSORT分析细胞定位，证明其在外部的确定性为0.82，在溶酶体和内质网的确定性为0.100（表4）。

3 讨论与结论

血红素结合的过氧化物酶（EC1.11.1.）用过氧化氢作为电子受体实行各种合成和降解功能[10]。血红素过氧化物酶广泛分布于细菌、真菌、植物和脊椎动物中。根据结构特性，它们可划分为植物和动物2个大型超家族。植物过氧化物酶超家族可分为3类：第I类是原核来源的过氧化物酶，包括植物抗坏血酸过氧化物酶，它们在高等植物叶绿体和细胞质的过氧化氢去除过程中发挥了关键作用，如酵母细胞色素c过氧化物酶（EC1.11.1.5）；第II类是分泌真菌过氧化物酶——真菌木质酶，木质酶催化降解木质素的第一步是通过催化C（α）C（β）丙基侧链裂解木质素；第III类是经典分泌植物过氧化物酶——植物过氧化物酶（EC1.11.1.7）。植物中含有大量的过氧化物酶同工酶，其中一些在细胞栓化过程中起着催化细胞壁上的木栓质芳香残留沉积的作用，有些是参与伤信号的防御反应，其他都参与生长素的代谢和木质素的生物合成[16-17]。

在橡胶树愈伤组织中也检测到了过氧化物酶[18]，并在橡胶树树皮中克隆了一个50 ku的过氧化物酶[19]，在细胞悬浮液中通过生化方法鉴定了一个过氧化物酶[20]。本研究中，笔者发现HbPRX2蛋白与巴西橡胶树HbPRX1、HbPRX42、拟南芥AtPER42和水稻的OsPRX33的过氧化物酶蛋白相似性分别为63.22 %、32.37 %、33.73 %和37.80 %。

植物的过氧化物酶大多含有一个特征性结构域：PEROXIDASE_4， PS50873。所有的过氧化物酶都有非朊基血红素基团，以过氧化氢为受体参与多种氧化反应[21-22]。HbPRX2蛋白具有特征性PEROXIDASE_4结构域，并与其它过氧化物酶成员高度保守，属于过氧化物酶家族成员。生物信息学分析表明，橡胶树HbPRX2蛋白定位于分泌途径中，属于亲水性蛋白，性质稳定，在7-24、36-55、130-151和278-301氨基酸处具有跨膜结构域，在29-30氨基酸处具有信号肽结构。可为下一步深入研究其功能及原核表达、亚细胞定位等提供参考。

从橡胶树中克隆了橡胶树过氧化物酶基因HbPRX2，其含有特征性的过氧化物酶结构域，为深入研究HbPRX2的结构与功能奠定基础。

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生物信息学分析 篇12

希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsanum Sacc.)可以侵染菜心、小油菜、结球甘蓝、羽衣甘蓝、大白菜、萝卜等多种十字花科蔬菜植物引起炭疽病[1,2,3]。在我国，由该菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心上最常见和发生最严重的病害之一[4]。国内外对该病菌的研究主要集中在病菌的生物学特性、生防菌筛选以及遗传转化等方面[5,6]，同时，随着该基因组序列的释放，林春花[7]等人对其开展了MAPK途径相关基因的找寻及信号通路简图的绘制工作。利用根癌农杆菌介导的转化技术随机插入突变基因的方法鉴定该病菌的致病基因，及直接重复重组介导的基因打靶等技术已经实现[8,9]。一些实验室已经建立了希金斯炭疽菌转化子的突变体库，为进一步对这些转化子基因功能研究提供了便利[10,11]。

植物病原菌在侵染植物过程中，有众多细胞信号转导途径参与其中，从而完成对外界环境刺激、内部信号传递以及应对反应处置等。而将外界信号传递到细胞内部的G蛋白(鸟嘌呤核苷酸结合蛋白)信号途径所发挥的作用最大，而这一途径中的G蛋白信号调控因子(Regulators of G-protein Signaling,RGS)，其主要功能在于通过促进G蛋白α亚基(Gα)耦连的GTP水解，使Gα和Gβγ亚基发生重新聚合，导致G蛋白失活而实现快速关闭上述信号途径[12]。基于此，学术界从结构特征、定位情况以及功能等方面对真菌RGS的研究开展了大量工作[13]。诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[14]、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)[15]、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)[16]、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)[17]、玉米赤霉菌(Gibberella zeae)[18]等众多真菌中含有的RGS数量得以明确，而对于C.higginsanum RGS尚未见报道。本研究基于S.cerevisiae S288c中4个典型RGS氨基酸序列，通过在炭疽菌属蛋白质数据库中进行Blastp比对分析，以及通过关键词搜索，获得与酿酒酵母RGS同源的C.higginsanum序列，并通过保守结构域分析、跨膜区结构分析、疏水性分析、信号肽分析、二级结构预测以及亚细胞定位等生物信息学分析，以期明确该菌中所存在的RGS数量、理化性质、结构特征以及定位情况，为进一步开展该菌RGS的功能研究提供重要的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

根据S.cerevisiae S288c中含有的4个RGS(Sst2、Rgs2、Rax1和Mdm1)氨基酸序列，利用炭疽菌属蛋白质数据库在线Blastp比对[19]，所有参数均选择默认值，获得C.higginsanum中所含有的β典型RGS，同时，通过输入“Regulators of G-protein signaling”、“RGS”关键词，在上述数据库中进行检索RGS;另外，利用NCBI明确该菌中RGS蛋白质登录号信息。

1.2 方法

1.2.1 保守结构域预测及跨膜区结构预测

利用SMART网站在线分析C.higginsanum中所含RGS所具有的保守结构域特征。同时，对C.higginsanum中所含RGS的跨膜区结构预测，利用TMHMM Server v.2.0在线分析实现[20]。

1.2.2 蛋白质二级结构

采用PHD[21]在线分析实现。

1.2.3 蛋白质疏水性预测

利用Protscale程序[22]在线分析实现。

1.2.4 蛋白质信号肽预测

利用Signal P 3.0 Server[20]在线分析实现。

1.2.5 亚细胞定位分析

利用Prot Comp v9.0[23]在线分析实现。

2 结果与分析

2.1 希金斯炭疽菌5个RGS均具有典型的保守域

RGS,G蛋白信号调节结构域;DEP，发现于Dishevelled、Egl-10和Pleckstrin的结构域;PAC，位于PAS基序的C-端的结构域;PX,PhoX同源结构域。数字表示氨基酸长度。

RGS,regulator G protein signaling domain,DEP,domain found in Dishevelled,Egl-10 and Pleckstrin,PAC,motif C-terminal to PAS motifs,PX,PhoX homologous domain.The number indicates the length of amino acids.

通过Blastp比对分析，共获得5条与S.cerevisiae RGS同源序列，其中与Rax1同源的序列ID为CH063＿02487.1，与sst2同源的序列ID为CH063＿07890.1、CH063＿03308.1，与Mmd1同源的序列ID为CH063＿10930.1、CH063＿10852.1，并未发现与Rgs2同源的序列(表1);同时，通过关键词搜索，也获得了6条序列，其ID分别为CH063＿00940.1、CH063＿02487.1、CH063＿15195.1、CH063＿07890.1、CH063＿03696.1、CH063＿10930.1(表1)。随后，利用SMART在线分析，结果显示，上述8条序列中仅有5条具有典型的RGS保守域结构，同时，还具有诸如DEP、PAC、PX、PXA等保守结构域(图1)。这与A.nidulans、C.neoformans、G.zeae、M.oryzae中所含有RGS的结构相似[14]，根据上述5条序列所含氨基酸的大小进行排序，分别将其命名为ChRGS1、ChRGS2、ChRGS3、ChRGS4、ChRGS5(表1)。

通过TMHMM Server v.2.0分析，ChRGS1含有1个跨膜区结构(图2)，所在位置为258-280，而其他4个RGS则不具有跨膜区结构，该结果与SMART在线分析结果一致。

outside表示位于膜外，inside表示位于膜内，transmembane表示跨膜区结构域。

Outside indicates the location of membrane outside,and inside indicates the location of membrane inside,transmembane indicates the transmembrane domain.

2.2 二级结构预测

将5个典型RGS氨基酸序列分别输入PHD蛋白质二级结构预测网站，获得二级结构信息(图3)。同时，对上述RGS的二级结构的组成情况进行分析，结果表明，5个RGS均含有α螺旋结构，所含比例也较高，而对于β转角结构，除ChRGS1、ChRGS2不含有β转角外，其他3个尽管也含有该结构，但其比例均较低(图3F)。

2.3 蛋白质疏水性预测

利用Protscale程序对5个典型RGS进行疏水性分析，结果显示，ChRGS1中位于142位的谷氨酰胺(Q)，其亲水性最强，为-2.295，而位于270位的甘氨酸(G)，其亲水性最弱(疏水性最强，下同)，为2.274;ChRGS2中位于284位的天冬酰胺(N)，其亲水性最强，为-2.111，而位于18位的亮氨酸(L)，其亲水性最弱，为1.184;ChRGS3中位于69位的精氨酸(R)，其亲水性最强，为-1.616，而位于34位的亮氨酸(L)，其亲水性最弱，为1.232;ChRGS4中位于271、272位的组氨酸(H)、甘氨酸(G)，其亲水性最强，为-3.079，而位于423位的缬氨酸(V)，其亲水性最弱，为1.363;ChRGS5中位于997位的丝氨酸(S)，其亲水性最强，为-2.468，而位于97位的缬氨酸(V)，其亲水性最弱，为1.984(表2，图4)。

A、B、C、D、E分别为ChRGS1、ChRGS2、ChRGS3、ChRGS4、ChRGS5的二级结构情况，F为上述5个RGS所含有的β转角(Beta strand)、α螺旋(Alpha helix)以及无规卷曲(Disordered)在各自二级结构中所占比例情况。

A,B,C,D,E,indicates secondary structure of ChRGS1,ChRGS2,ChRGS3,ChRGS4,ChRGS5,respectively.F indicates the proportion of secondary structure including the Beta strand,Alpha helix and Disordered.

对上述5个RGS的疏水性、亲水性数值进行统计分析，结果显示，ChRGS1、ChRGS2、ChRGS3、ChRGS4、ChRGS5的，亲水性氨基酸残基数值总和分别为-149.74、-199.378、-238.728、-754.579、-611.468，而疏水性氨基酸残基总和分别为55.679、28.096、34.882、66.71、125.62(表2)，上述结果表明，希金斯炭疽菌中5个典型RGS尽管在“亲水性最强氨基酸残基位置、数值”、“疏水性最强氨基酸残基位置、数值”、“疏水性氨基酸残基数值总和”以及“亲水性氨基酸残基数值总和”等结果并不相同，但是均为亲水性蛋白，这与通过GRA-VY计算所得结果一致(数据未显示)。

A、B、C、D、E分别为ChRGS1、ChRGS2、ChRGS3、ChRGS4、ChRGS5的疏水性情况。

A,B,C,D,E:Indicates the hydrophobic of ChRGS1,ChRGS2,ChRGS3,ChRGS4,ChRGS5,respectively.

A、B分别为通过NN和HMM预测ChRGS2具有信号肽情况。

A,B:Indicates the predicted signal peptide of ChRGS2 by NN and HMM,respectively.

2.4 信号肽特征

经过Singnal P 3.0分析，仅ChRGS2经隐马可夫模型(HMM)分析，含有信号肽序列，位置在24-25，最大切割概率为0.864，而经神经网络方法(NN)预测则不具有信号肽序列(图5);其他RGS则未发现有明显的信号肽序列(数据未显示)。

2.5 亚细胞定位分析

通过TMHMM分析，结果表明，5个典型的RGS亚细胞定位情况不尽相同，具体而言，ChRGS2、ChRGS4以及ChRGS5均定位于细胞核中，而ChRGS1定位于高尔基体上，ChRGS3定位于线粒体上(表3)。

3 讨论

C.higginsanum可以侵染菜心、白菜等众多十字花科蔬菜引起炭疽病，给生产上造成巨大的经济损失。深入解析该病菌致病因子，有助于为开发防治该病害的药剂提供重要的理论意义。同时，植物病原菌的RGS作为G蛋白信号转导过程中重要的调节因子，对其开展深入研究具有重要的意义。前人已经明确M.oryzae、F.verticillioides、G.zeae[16,17,18]等众多危害农业生产的致病真菌含有RGS的情况，并对其进行了功能研究，并已明确真菌中的RGS多与菌丝生长发育过程中的有性生殖调控以及侵染过程中的次生代谢产物、色素合成等过程有关[14]。然而，对于C.higginsanum RGS所具有的功能尚不清楚，本研究基于生物信息学分析，明确该菌所含RGS情况，为进一步开展该调控因子所具有的功能研究具有重要的意义。

4 结论