纤溶酶原激活物抑制物

纤溶酶原激活物抑制物（共6篇）

纤溶酶原激活物抑制物 篇1

动脉粥样硬化是动脉硬化中最常见的类型, 其主要累及大中型的肌弹力型动脉, 以主动脉、冠状动脉及脑动脉最为多见, 发生在冠状动脉上的动脉粥样硬化称为冠状动脉粥样硬化。

冠状动脉粥样硬化被认为是多因素共同作用的结果, 一种因素认为是中小型的损伤导致的平滑肌细胞增生和动脉粥样硬化[1];另一种因素认为是血栓纤维化或血栓形成后, 在某些促凝的情况下导致斑块破裂, 引起动脉狭窄[2]。目前有研究证实[3]纤溶酶原激活物抑制物 (PAI-1) 可以抑制尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA) 和组织型纤溶酶原激活物 (tPA) , 成为纤溶系统的重要抑制因子, 因此PAI-1与冠状动脉粥样硬化的相关性研究成为人们关注的焦点, 现就两者的相关性研究的进展情况进行综述。

1 PAI-1的基本特性

PAI-1是一种单链糖蛋白, 由379个氨基酸残基组成。其基因位于人类7号染色体上大小为12.3 kb。以活性态、底物态和潜在活性态3种形态存在。潜在活性态是大多PAI-1的体内存在形态, PAI-1在体内分布广泛, 脾脏和肝脏中的PAI-1的含量最高, 心脏和脑中PAI-1的含量较低, 血浆中PAI-1的含量极少, 只有3%~5%, 由于PAI-1具有清晨活性最高, 夜间活性最低的特点, 因此有人认为心梗易在清晨发生可能与此有关[4]。

2 PAI-1生物学特性

凝血系统和纤溶系统的动态平衡是血液正常流动的关键, 纤溶系统有纤溶酶、纤溶酶抑制物、PA、纤溶酶原和PAI等组成, 而PAI-1是纤溶系统调节活性的主要因子, 属于丝氨酸蛋白酶抑制物。PAI-1是纤溶酶原激活剂的抑制剂, 它的主要作用是促进血栓的形成, PAI-1和tPA形成复合物, 阻止纤溶酶原激活, 从而使纤维蛋白的降解减少, 发挥其促进血栓形成的生理作用。因此, 过多的PAI-1的释放将会导致血栓的发生, 许多研究表明, PAI-1是血栓发生的重要机制[5,6]。

3 PAI-1与冠状动脉粥样硬化的相关性

许多研究表明, PAI-1的含量与冠状动脉粥样硬化的发生和发展如高血压、肥胖、糖尿病等传统危险因素呈正相关。有研究证实, 冠心病患者的血浆PAI-1水平呈升高表现。PAI-1在冠心病合并高胰岛素血症患者冠状动脉粥样硬化的进展中也起着相当重要的作用[7]。有人对162例发生心肌梗塞前的患者进行研究, 也发现PAI-1的水平是升高的。因此认为[8], PAI-1可作为心梗第1次发作的独立危险因素。目前, 流行病学的研究亦表明血浆中高水平PAI-1可作为冠心病的独立危险因素。有报道, 发生粥样硬化的动脉管壁上PAI-1表达量增加, 且PAI-1表达量与动脉粥样硬化的严重程度具有明显相关性[9]。有人运用放射显影技术测定动脉粥样硬化中PAI-1的表达水平, 研究发现, 重度动脉粥样硬化PAI-1mRNA的水平较轻中度明显提高, 且差异有统计学意义[10]。另外, 据研究资料表明, 低纤溶水平在健康人有增加冠状动脉粥样硬化的风险, 血管壁中PAI-1mRNA主要在新生的内膜细胞表达增加, 说明PAI-1的基因表达增加主要与细胞增殖情况相关, 疾病早期, PAI-1主要在细胞外基质和内膜平滑肌细胞, 中期主要在纤维帽内平滑肌细胞, 所有的结果均表明, PAI-1与动脉粥样硬化的严重程度呈正相关[11,12,13]。

4 PAI-1的致病机制

目前认为PAI-1导致冠状动脉粥样硬化的机制主要有以下几个途径: (1) 纤溶系统的失衡:PAI-1是纤溶酶原激活物的抑制物, PAI-1的表达水平和活性的增加, 就会导致tPA的表达水平下降, 引起纤溶蛋白分解活性下降, 导致纤维蛋白沉积于血管壁, 长此以往, 微血栓的不断大量聚集, 最终引起冠状动脉粥样硬化的发生[14]。 (2) 管壁纤维化:由于PAI-1的持续高水平, 机体就会处于持续低纤溶, 成纤维细胞的入侵导致基质蛋白和胶原沉积, 最终使管壁纤维化和僵硬, 促进动脉粥样硬化的发生[15]。 (3) 基质沉积:高水平的PAI-1会使纤溶活性降低, 基质蛋白酶无法启动, 导致基质大量沉积, 内膜增厚, 引起管腔狭窄。

综上, PAI-1在冠状动脉粥样硬化的发生、发展过程中具有重要的作用, 血浆中PAI-1水平升高可促进动脉斑块和动脉血栓的形成, 可作为心血管疾病的独立危险因素, 因此, 可以通过降低血浆中PAI-1的活性和水平减少冠状动脉粥样硬化的发生, 减少和降低冠心病、心肌梗塞等心血管系统疾病的发生, 进而提高患者的生存质量。

纤溶酶原激活物抑制物 篇2

1对象与方法

1.1 研究对象

IgAN组:1997-2007年在包头医学院第一附属医院就诊的IgAN患者100例, 男性53例, 女性47例, 年龄18～45岁, 平均年龄31.4岁;均经肾穿刺免疫荧光证实为IgAN, 病理诊断符合肾活检病理诊断标准指导意见[1], 临床排除系统性红斑狼疮 (SLE) 、过敏性紫癜、慢性肝脏疾病等继发性IgAN, 病理分级符合Haas分级标准[2]。对照组:100例年龄、性别与IgAN患者组匹配的健康体检者及献血员, 尿检均无异常, 其中男性51例, 女性49例, 年龄22～32岁, 平均年龄27.0岁。两组人群系内蒙古地区无血缘关系的汉族人群。

1.2 标本收集及临床指标检测

DNA血样的收集:对照组及IgAN组 (肾穿当日) 均晨起空腹, 每人静脉取外周血2 mL, 枸橼酸钠抗凝, 置于EDTA管内, -40 ℃冰箱保存。抽血前均未用过影响血液流变学的药物, 如抗凝剂及其他降脂药和皮质醇类药物。IgAN的Haas分级标准:Ⅰ级为轻微性肾小球病变或轻度系膜增生性肾小球肾炎不伴有肾小球坏死;Ⅱ级为局灶节段性肾小球坏死无活动性细胞增生;Ⅲ级为局灶增生性肾小球坏死;Ⅳ级为弥漫增生性肾小球肾炎;Ⅴ级为肾穿刺活检显示有≥40 %肾小球坏死, 或有≥40 %肾小管萎缩。根据IgA肾病患者的病理检查是否伴有硬化分为两组 (硬化组和非硬化组) , 其中硬化组61例, 男34例, 女27例, 年龄21～48岁, 平均年龄34.8岁, 非硬化组39例, 男19例, 女20例, 年龄18～42岁, 平均年龄29.1岁。

1.3 分析方法

1.3.1 基因组DNA的抽提

冻存血室温融化, 取50 μL加入1 mL EP管中, 加双蒸水至1 mL, 混匀, 室温静置15 min。3 000 rpm离心1 min, 弃上清液。加裂解液60 μL, 振荡器上剧烈震荡, 沸水煮10 min, 冷却, 再剧烈振荡, 11 500 rpm高速离心4 min。上清液中含有模板DNA。

1.3.2 PAI-1基因多态性检测

采用等位基因特异聚合酶链反应 (allele specific polymerase chain reaction, ASPCR) 扩增目的基因片段。特异性引物按Teresa[3]的报道设计:共同下游反向引物P1:5′-TGC AGC CAG CCA CGT GAT TGT CTA G-3′, 上游正向4G引物P2:5′-GTC TGG ACA CGT GGG GA-3′、5G引物P3:5′-GTC TGG ACA CGT GGG GG-3′, 同时在4G、5G上游引物更远端设立对照正向引物作为内对照, 以证实4G、5G扩增的特异PCR片段非条件不适造成的非特异片段, P4:5′-AAG CTT TTA CCA TGG TAA CCC CTG GT-3′。

反应体系:每个样本DNA均同时进行3个体系PCR反应, 即P2P1、P3P1、P4P1, PCR扩增总体系为12.5 μL, 10×PCR buffer (含Mg2+) 1.25 μL, dNTP 2 μL (1.25 mmol/L) , 上、下游引物各0.5 μL (33 μg/mL) , 无菌水5.75 μL, Tag酶0.5 μL, 模板DNA 2 μL。PCR扩增条件:94 ℃预变性2 min, 94 ℃变性30 s, 61 ℃退火45 s, 72 ℃延伸60 s, 共35循环。最后72 ℃终末延伸10 min。

1.3.3 产物鉴定及分析

酶切:每个酶切体系为25 μL, 其中包括:PCR扩增反应产物12.5 μL, 10×Buffer 1.25 μL, dNTP 2 μL (1.25 mmol/L) , 上、下游引物各0.5 μL (33 μg/mL) , 无菌水5.75 μL, Tag酶0.5 μL, 模板DNA 2 μL, 混匀, 37 ℃水浴 5 h。电泳:应用2 %琼脂糖凝胶电泳, 电压100 V, 时间30 min, 在紫外透射自动成像分析仪上进行成像, 记录结果。

1.4 统计学分析

经遗传平衡检测证明, IgAN患者与对照组均符合Hardy-Weinberg平衡, 具有群体代表性。应用SPSS13.0统计软件进行分析。所有统计分析中, P<0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1 PAI-1基因型及等位基因频率与IgAN各种病理类型的关系

经χ2检验, 在肾脏病理分别表现为HassⅠ、Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ级的IgAN患者之间, PAI-1基因型及等位基因频率差异无统计学意义 (P>0.05) , 即PAI-1基因型频率和等位基因频率与IgAN的病理损害程度无关。见表1。

2.2 PAI-1基因型及等位基因频率与IgAN肾小球硬化的关系

2.2.1 IgAN肾小球硬化与病情的联系

硬化组与非硬化组的性别、血压、尿蛋白定量、肾功能的差异均无统计学意义, 但硬化组的平均年龄及病理分级显著高于非硬化组, 镜下血尿的比例也明显较非硬化组严重, 两组比较差异有统计学意义, 但是两组血尿的分级水平间差异无统计学意义。虽然进入终点事件的比例是相同的, 但两组相比差异还是具有统计学意义。见表2。

2.2.2 PAI-1基因型及等位基因频率与IgAN肾小球硬化的关系

PAI-1基因多态性在IgAN患者中的分布:非硬化组的4G/4G型、4G/5G型、5G/5G型基因频率分别为33.3 %、48.7 %和17.9 %, 硬化组分别为45.9 %、42.6 %和11.5 %。硬化组4G/4G基因型的频率显著高于非硬化组 (P<0.05) , 但硬化组4G等位基因频率 (67 %) 与非硬化组4G等位基因频率 (57 %) 相比差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表3。

3讨论

IgAN或Berger病最早于1968年由Berger和Hinglais提出[4], 在我国肾活检资料中约占原发性肾小球疾病的20 %～47 %[5,6], 历经30多年的研究, 目前认为该病是我国最常见的原发性肾小球疾病, 尤其在亚洲该病占原发肾小球疾病的近50 %[7], 以内蒙包头地区我科观察的情况为例, 大概占原发性肾小球疾病的30 %左右, 而且资料显示近10年有明显的上升趋势。其中约20 %～30 %的患者在起病后10～20年进展到终末期肾衰竭 (ESRD) , 在我国是引起终未期肾功能衰竭的重要原因之一。

目前的观点倾向于将IgAN视为一种具有同一免疫病理特征的、由一组疾病构成的症候群, 光镜下可见本病主要累及肾小球, 病理类型呈多样性, 可见轻微病变、局灶节段性病变、系膜毛细血管性病变、新月体性病变、硬化性病变甚至膜性病变, 但以系膜增生性病变为最常见。丁瑞等[8]报道, 在按病理Lee氏分级的两组患者中, 病理改变重的患者中4G/4G基因型频率显著高于病理改变轻的患者, 提示4G/4G基因型患者可能具有较高的PAI-1水平和活性, 从而加重4G/4G基因型患者肾脏纤维化。Suzuki等[9]研究结果显示, IgAN患者PAI-1基因4G/4G基因型在肾小球和肾小管间质的病理组织学进展方面比表现为4G/5G或5G/5G基因型的病理损伤更明显。我们的结果是在按肾脏病理Hass分级的IgAN患者之间PAI-1基因型及等位基因频率差异无统计学意义, 即PAI-1基因型频率和等位基因频率与IgAN的病理损害程度无关, 这可能与我们的病例选择角度及病理分级标准有关。

纤溶酶原激活物抑制物 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年9月~2015年9月在湖州市中心医院确诊为急性肺损伤的患者44例。其中男32例,年龄16~74岁,平均(41.24±5.88)岁;女12例,年龄17~72岁,平均(40.83±5.65)岁。患者入组后根据电脑自动生成的随机数字表,从任意一行开始读取,入组患者读取数字后除以组别数,余数为1分为对照组,余数为0分为实验组,每组22例。对照组男15例,女7例;平均年龄(41.74±6.32)岁;呼吸道感染13例,车祸伤7例,挤压伤2例。实验组男17例,女5例;平均年龄(42.01±5.48)岁;呼吸道感染13例,车祸伤7例,挤压伤2例。两组性别组成、年龄分布和原发病等一般临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。诊断标准:诊断依据中华医学会呼吸病学分会制订的《急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的诊断标准(草案)》[6]中关于急性肺损伤的诊断标准,并经X胸片及实验室检查确诊。排除标准:①既往无肺部疾病;②妊娠及哺乳期妇女;③临床资料不全。

1.2 方法

对照组给予吸氧、呼吸循环支持、抗感染、维持水电解质平衡、限制晶体输入、治疗原发病等常规对症治疗;实验组患者在对照组治疗的基础上给予注射用乌司他丁(商品名:天普洛安,购自广东天普生化医药股份有限公司,国药准字H19990134)10万U溶于100 m L的0.9%氯化钠溶液中,2次/d,静滴。两组患者均连续治疗5 d。

1.3 观察指标

1.3.1 血清指标采集

治疗前后,分别采集空腹12 h后静脉血5 m L,置于含有2%EDTA的抗凝管中,3000 r/min离心15 min,分离血清,采用临床检验科全自动酶标仪(奥地利anthos2010),严格按照试剂盒说明书进行操作,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中PAI-1、t-PA、AT-Ⅲ的水平。

1.3.2 血气分析

治疗前后,分别采集股动脉血2 m L,血气分析采用雷度ABL80血气分析仪,对PO2及氧合指数进行检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析,计量资料采用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验,计数资料以百分率(%)表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后血清PAI-1、t-PA水平比较

与治疗前比较,两组患者治疗后血清PAI-1、tPA水平明显降低(P<0.05),且实验组患者治疗后血清PAI-1、t-PA水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

注:与本组治疗前比较,*P<0.05;与对照组治疗后比较,#P<0.05;PAI-1:血清纤溶酶原激活物抑制剂-1;t-PA:组织型纤溶酶原激活剂

2.2 两组治疗前后血清AT-Ⅲ水平比较

与治疗前比较,两组患者治疗后血清AT-Ⅲ水平均明显升高(P<0.05),且实验组患者治疗后血清AT-Ⅲ水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注:与本组治疗前比较,*P<0.05;与对照组治疗后比较,#P<0.05;AT-Ⅲ:抗凝血酶原Ⅲ

2.3 两组治疗前后血气分析结果比较

与治疗前比较,两组患者治疗后血气分析结果明显得到改善(P<0.05),且实验组患者治疗后动脉血PO2及氧合指数明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

注:与本组治疗前比较,*P<0.05;与对照组治疗后比较,#P<0.05;PO2:动脉血氧分压

3 讨论

急性肺损伤是由多种损伤原因导致的肺损害,其发展至严重阶段(氧合指数<200 g/L)被称为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。近年来,随着我国重症医学的不断发展,急性肺损伤的发病率及病死率不断上升,给患者带来很大的痛苦。急性肺损伤是一种渗出性病变,主要表现为进行性低氧血症和呼吸窘迫,其发生与严重感染、烧伤、严重创伤、急性重症胰腺炎等肺内外致病因素有关[7],急性肺损伤/ARDS的发病机制复杂,推测其因上述因素引发炎性反应介导的肺损伤,促进细胞程序性凋亡,使得凝血/纤溶系统失衡,氧化应激反应增强,导致肺泡液体清除异常的病理生理改变,出现肺水肿,引起气/血流比例失调和顽固的低氧血症[8]。PAI-1和t-PA的动态平衡决定了人体纤溶系统中的纤维活性。急性肺损伤患者纤溶功能检查发现t-PA与PAI-1抗原水平均增高[9],严重抑制t-PA活性,纤溶活性下降导致纤维蛋白在肺血管内外沉积,促进了肺透明膜和肺纤维化形成。因此监测t-PA、PAI的浓度有助于了解机体纤溶状况和病情进展。乌司他丁是提取自成年男性尿液中的糖蛋白,对于胰蛋白酶、粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、纤溶酶等均有较强的抑制作用,还能够抑制溶酶体释放,保持溶酶体膜稳定[10]。药理研究显示,乌司他丁能够减少氧自由基产生,降低促炎性细胞因子的生成释放,调节凝血功能和机体的免疫功能,抑制多种水解酶活性[11],在临床上主要应用于急性胰腺炎、急性弥散性血管内凝血、全身感染、全身炎症反应综合征等疾病的治疗。有研究认为[12],乌司他丁能有效治疗急性肺损伤,并且能缩短住院时间,显著改善预后效果,从而降低患者的病死率。所以,本研究通过观察患者治疗前后血清PAI-1、t-PA、AT-Ⅲ、动脉血PO2及氧合指数的变化,探讨乌司他丁对急性肺损伤患者的治疗效果及作用机制。

本研究结果发现,实验组患者的血清PAI-1、tPA水平与对照组比较明显降低(P<0.05),提示乌司他丁能够改善患者的纤溶系统功能,减轻病情。凝血/纤溶系统失衡是导致微血栓形成引起急性肺损伤发病的原因之一。PAI-1和t-PA是机体纤溶系统的关键物质,t-PA是一种丝氨酸蛋白酶,由血管内皮细胞产生并分泌,能够将纤溶酶原激活成为纤溶酶,启动纤溶系统,降低血液中纤维蛋白含量,发挥保持血液流动状态的作用[13];PAI-1是t-PA的抑制剂,来自于肺上皮细胞以及成纤维细胞,能够抑制t-PA活性,维持纤溶系统平衡[14]。当急性肺损伤发生时,肺组织血液处于高凝状态,影响纤溶系统功能,易形成肺血管微血栓,加重病情。曾有报道认为,急性肺损伤早期表现为PAI-1、t-PA升高,可以作为评估病情严重程度的监测指标[15]。

AT-Ⅲ是凝血酶及凝血相关因子蛋白酶的抑制剂,能够通过精氨酸-丝氨酸肽键与之结合,使酶形成复合物而灭活,发挥抗凝血作用[16]。AT-Ⅲ不仅具有抗凝作用,还具有抗炎作用。急性肺损伤发生时,血液处于高凝状态,大量消耗AT-Ⅲ抗凝,使得AT-Ⅲ水平下降[17]。有研究表明,急性肺损伤患者存在AT-Ⅲ水平的获得性缺乏,其水平下降程度与预后密切相关[18,19,20,21],表明乌司他丁能够提高患者抗凝系统功能,防止微小血栓形成,改善预后。

血气分析是临床用于诊断患者是否处于酸碱平衡失衡以及缺氧和缺氧程度等首选检验手段,在急性呼吸衰竭、外科手术、急慢性肺损伤等疾病发生发展过程中起至关重要的作用[22]。PO2正常值为10.64~13.3 k Pa(即80~100 mm Hg,1 mm Hg=0.133 k Pa),当患者机体PO2水平降低至60 mm Hg说明患者存在呼吸衰竭[23],<30 mm Hg时处于生命危险状态。氧合指数(Pa O2/Fi O2)参考值为400~500 mm Hg,其水平降低需要加大吸入氧浓度,水平<300 mm Hg提示肺呼吸功能障碍,因此PO2及氧合指数水平对急性肺损伤的治疗具有指导作用[24]。血气分析结果显示,与对照组比较,实验组患者动脉血的PO2及氧合指数明显升高(P<0.05),说明乌司他丁能够提高患者的治疗效果,这与乌司他丁改善凝血纤溶系统功能、抑制病情进展的作用密切相关。

本研究通过对44例急性肺损伤患者血清PAI-1、t-PA、AT-Ⅲ、动脉血PO2及氧合指数的检测结果进行分析,显示乌司他丁能够显著降低急性肺损伤患者血清PAI-1、t-PA水平,提高血清AT-Ⅲ水平、动脉血PO2及氧合指数,改善凝血纤溶系统功能,提高临床治疗效果,对临床有指导意义。接下来的研究将着重探讨乌司他丁治疗急性肺损伤的分子机制,进一步论证和分析本研究的结果。

摘要：目的 探讨乌司他丁对急性肺损伤患者血清纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的影响。方法 收集湖州市中心医院2014年9月2015年9月收治的急性肺损伤患者44例,将其随机分为对照组和实验组,每组各22例。对照组患者给予常规对症治疗,实验组在对照组的基础上给予乌司他丁治疗,治疗结束后,对所有患者的PAI-1、t-PA、抗凝血酶原Ⅲ(AT-Ⅲ)、动脉血氧分压(PO2)及氧合指数进行检测。结果治疗后,与对照组比较,实验组血清PAI-1、t-PA水平显著降低(P<0.05),血清AT-Ⅲ水平显著升高(P<0.05),动脉PO2及氧合指数显著上升(P<0.05)。结论 乌司他丁能够显著降低急性肺损伤患者血清PAI-1、tPA水平,提高血清AT-Ⅲ水平、动脉血PO2及氧合指数,改善凝血纤溶系统功能,提高治疗效果,对临床有指导意义。

纤溶酶原激活物抑制物 篇4

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准(1)纳入标准:符合急性脑梗死相关诊断标准者[4];发病时间未超过4.5h,且存在持续神经功能缺损超过1h;经CT检查未发生颅内出血;知情并自愿加入本研究者。(2)排除标准:纳入研究前近3个月内发生心肌梗死或脑卒中、头颅外伤;凝血功能异常者;合并有心、肾、肝等重要脏器功能严重异常者;48h内已使用肝素等抗凝治疗者。

1.2 一般资料

选取2015年1月—2016年2月巩义市人民医院收治的急性脑梗死患者70例,随机分为观察组与对照组,各35例。观察组中男20例,女15例;年龄44~83岁,平均年龄(62.3±5.6)岁;病程1.5~4.5h,平均病程(3.1±0.3)h。对照组中男21例,女14例;年龄45~84岁,平均年龄(63.2±5.6)岁;病程1.0~4.0h,平均病程(3.0±0.2)h。两组患者性别、年龄、病程比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组

对照组患者行常规治疗:给予阿司匹林抗凝、神经保护、改善脑细胞代谢、甘露醇脱水等治疗;制定不良反应防治措施预案。

1.3.2 观察组

观察组患者在对照组治疗基础上给予重组组织型纤溶酶原激活剂(德国勃林格殷格翰公司,批准文号S20110051)静脉溶栓治疗,最大剂量为90mg,标准使用剂量为0.9mg/kg,重组组织型纤溶酶原激活剂剂量的10%静脉注射,剩余90%使用0.9%氯化钠溶液稀释至0.2mg/ml后进行静脉滴注,于60min内滴注完毕。

1.4 观察指标

比较两组患者治疗前后神经功能、日常生活能力、不良反应发生情况。采用美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)[5]对两组治疗前、治疗1、7、14d后神经功能缺损程度进行评估,得分越高表明神经功能缺损越严重;采用Barthel指数(BI)[6]对两组患者治疗前、治疗后7、14、30d日常生活活动的功能状态进行评估,得分越高表明患者生活能力改善越为显著。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理,计量资料以±s表示,采用t检验;计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者治疗前后NIHSS评分比较

治疗前两组患者NIHSS评分比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗1、7、14d观察组患者NIHSS评分低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

2.2 两组患者治疗前后BI评分比较

治疗前两组患者BI评分比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后7、14、30d观察组患者BI评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

2.3 两组患者不良反应发生率比较两组患者不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05,见表3)。

3 讨论

急性脑梗死是多发于中老年人的心脑血管疾病类型,主要发病机制为脑部提供血液的动脉出现粥样硬化并形成血栓,致使血管腔狭窄甚至发生阻塞,进而导致脑供血不足,发生急性脑梗死,该病具有较高的致残率及病死率,严重影响患者生命健康及生存质量[7]。挽救缺血半暗带受损神经元、恢复缺血区血流灌注促使受损神经功能得到改善是有效治疗急性脑梗死的关键与目的。

有研究表明,尽早消除血栓、恢复再灌注可有效避免脑组织发生不可逆性坏死,进而提高患者生存质量,因此患者越早接触溶栓治疗,其临床疗效越为显著,且发生出血的风险越低[8]。临床上多采用阿替普酶对急性脑梗死患者进行静脉溶栓治疗,用药后可有效促使血栓溶解,疏通阻塞血管,治疗效果显著。也有研究表明,重组组织型纤溶酶原激活剂作为一种糖蛋白,与纤维蛋白具有较高亲和性,并通过与纤维蛋白结合后发挥其活性作用,诱导纤溶酶原转化为纤溶酶,对阻塞血块进行有效溶解的同时,对整个凝血系统各组分的系统性作用较为轻微,不会发生出血倾向,因此重组组织型纤溶酶原激活剂用于静脉溶栓治疗急性脑梗死患者可取得显著疗效[9,10]。

本研究结果显示,治疗前两组患者NIHSS评分、BI评分比较,无统计学差异;治疗1、7、14d观察组患者NIHSS评分低于对照组,治疗后7、14、30d观察组患者BI评分高于对照组,有统计学差异,表明重组组织型纤溶酶原激活物可有效改善急性脑梗死患者神经功能及日常生活能力,对提高患者治疗效果及预后质量具有显著作用。两组患者不良反应发生率比较,无统计学差异,表明采用重组组织型纤溶酶原激活物静脉溶栓治疗急性脑梗死,不良反应发生率较低,具有较高的安全性。

综上所述,重组组织型纤溶酶原激活物静脉溶栓治疗急性脑梗死疗效显著,能有效改善患者神经缺损功能及日常生活能力,且不会增加不良反应发生率,安全有效,具有一定临床价值,值得推广应用。

参考文献

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纤溶酶原激活物抑制物 篇5

本研究通过检测Hpa与uPA在子宫内膜腺癌组织中的表达情况及其与子宫内膜腺癌的临床病理特征的关系,探讨其与子宫内膜癌的发生、发展和转移的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

标本随机选取中南大学湘雅医院2003～2007年妇科住院手术经病理证实的子宫内膜腺癌46例,患者术前均未进行任何化学药物治疗及放射治疗。患者年龄32～72岁(中位年龄52岁)。根据2000年国际妇科联盟(FIGO)手术病理-分期标准:Ⅰ期24例,Ⅱ期13例,Ⅲ期9例,Ⅲ期患者中淋巴结转移6例;病理分级G125例、G210例、G311例。另取因其他妇科疾病而手术切除或刮宫的子宫内膜标本54例作为对照组,其中正常子宫内膜16例,18例增生过长内膜,不典型增生子宫内膜20例。上述标本均经10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,5μm连续切片,分别做HE和SP免疫组织化学染色。

1.2 实验试剂

即用型兔抗人多克隆抗体Hpa(BA1630)、即用型兔抗人多克隆抗体uPA(BA0405)、鼠抗兔SP二抗试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司;EDTA缓冲修复液购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3 研究方法

1.3.1 实验方法

玻片经清洁处理后再经多聚赖氨酸处理,于无尘处干燥或烤干备用。所有标本经10%的福尔马林液固定,常规石蜡包埋连续切片,厚4μm,其中1张行HE染色复查诊断,1张备用,其余2张分别用于Hpa和uPA免疫组化研究,贴附于经多聚赖氨酸处理的载玻片上,防至烤箱60℃干烤4 h,取出进行SP法染色,中性树胶封片后显微镜下观察切片,摄像。

1.3.2 设立对照

本实验免疫组化组织切片检测结果,阳性对照参考武汉博士德生物技术有限公司提供的已知阳性切片,阴性空白对照以PBS缓冲液代替一抗。

1.4 结果判定

Hpa和uPA染色阳性为胞浆呈清晰棕黄色颗粒。切片在400倍显微镜下选定10个视野,计算阳性细胞的百分数。表达阳性判定:胞浆染色阳性的细胞百分数小于5为阴性,5%～24%为(+),25%～50%为(++),大于50%为(+++)。

1.5 统计学分析

统计学分析均采用SPSS 13.0软件处理,计数资料采用χ2检验或组间χ2检验,P<0.05为差异有显著性。等级资料采用秩和检验。

2 结果

2.1 乙酰肝素酶(Hpa)的检测

子宫内膜腺癌组织中Hpa主要表达在腺体细胞的胞浆和胞膜,在不典型增生和正常子宫内膜的表达部位在腺体的胞浆中,偶见间质着色。在子宫内膜癌组织中Hpa的表达阳性率(54%)明显高于正常内膜(13%)、增生过长内膜(17%)和不典型增生内膜(25%)。Hpa的表达在子宫内膜癌组与正常内膜、增生过长及不典型增生组之间差异存在显著性(P<0.05),而在正常内膜与增生过长、不典型增生组之间差异无显著性(P>0.05)。46例子宫内膜癌中,Hpa阳性表达率与临床分期、癌灶肌层浸润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05),与病理分级无明显相关性(P>0.05)。见表1和图1～4。

注:覮采用等级秩和检验法

2.2 尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的检测

uPA阳性细胞在各种子宫内膜组织中主要染色部位为细胞浆,血管内皮细胞、肿瘤基质细胞也有表达。结果显示uPA在子宫内膜癌组织中的表达(57%)明显高于正常内膜(13%),差异有显著性(P<0.005),在子宫内膜癌与增生过长内膜、不典型增生内膜间亦差异有显著性(P<0.05),而在正常内膜与增生过长、不典型增生组之间差异无显著性(P>0.05)。uPA与子宫内膜腺癌临床分期、癌灶肌层浸润深度、淋巴结转移密切相关(P<0.05),与病理分级无明显相关性(P>0.05)。见表2。

注:覮采用等级秩和检验法

2.3 乙酰肝素酶和尿激酶型纤溶酶原激活物在子宫内膜癌中的相关性

46例子宫内膜癌组织中有Hpa阳性病例中uPA阳性率为84%(21/25),其中有21例Hpa和uPA均为阳性表达,16例同时为阴性表达。配对四格表χ2检验显示:Hpa和uPA在子宫内膜癌中的表达无明显相关性(P>0.05)。见表2和图5～7。

注:χ2=1.000,P>0.05。

3 讨论

子宫内膜癌以来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见,具有侵犯肌层和远处蔓延的潜能。癌症成为致命的疾病,不仅在于癌细胞的生长失去控制,而且也因其具有的侵蚀和转移能力。瘤细胞要发生转移,就必须同时破坏构成细胞外基质(ECM)的两种主要成分:结构蛋白和蛋白多糖。硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)作为细胞外基质(ECM)、基底膜(BM)和血管壁的主要成分之一,其降解对于肿瘤的侵袭和转移具有重要的促进作用。近来发现的乙酰肝素酶(Hpa)是一种能裂解ECM内蛋白多糖主要成分HSPG的内源性糖苷内切酶,研究表明抑制Hpa后可明显抑制肿瘤细胞的扩散与转移[2,3]。VLODAVSKY等[4]认为乙酰肝素酶通过直接、间接两种方式发挥促血管生成作用:(1)直接作用,乙酰肝素酶可直接作用于内皮细胞以生芽方式促进血管生成;(2)间接作用,通过血管内皮细胞释放HS-bFGF复合物和产生HS降解片段以促进bFGF活性来间接诱导血管生成反应。最近NADIR等[5]发现乙酰肝素酶在凝血系统的调节中也具有一定的作用。

本研究采用免疫组化的方法检测正常子宫内膜、增生过长子宫内膜、不典型增生子宫内膜及子宫内膜腺癌中Hpa的表达,结果显示,Hpa在四组中均有不同程度的表达。Hpa在子宫内膜癌组织中的表达以强阳性为主,其阳性表达率明显高于正常子宫内膜、增生过长内膜以及不典型增生子宫内膜中的表达,差异有显著性。提示Hpa可能与子宫内膜癌的发生有关。本研究Hpa与子宫内膜癌临床病理参数的相关性分析发现,随着肿瘤浸润深度的增加,Hpa在癌组织中表达的阳性率明显增高。结果表明Hpa的表达与患者的临床分期﹑肿瘤浸润深度﹑淋巴结转移密切相关,与WATANABE等[6]研究结果相符,提示Hpa可能在内膜癌的浸润和转移中起作用。国内外文献报道[7,8,9,10]乙酰肝素酶的高表达与多种恶性肿瘤的侵袭转移有关,如:胃癌、肺癌、卵巢癌和膀胱癌等。

本研究结果显示Hpa的表达与患者的病理分化程度无关,与临床上肿瘤的转移和分化程度有关的观点相矛盾,也与WATANABE等[6]研究结果不符,考虑可能一方面是子宫内膜癌的发生﹑发展是多基因﹑多阶段和多过程的相互作用的结果;另一方面本试验样本量偏少,实验方法和试剂的不同,在一定程度上均会影响实验的结果。

本实验uPA与子宫内膜癌临床病理因素的相关性分析发现,uPA的表达与患者的临床分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关。Ⅲ期患者内膜癌组织中uPA阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ期患者,差异有显著性(P<0.05)。这与MEMARZADEHS等[11]和GERSTEIN等[12]研究结果相一致。uPA激活纤溶酶降解细胞外基质中纤维连接蛋白、层黏蛋白和胶原等成分从而促进肿瘤的浸润转移[13]。最新研究MOREAU等[14]认为uPA系统在肿瘤调控中可能存在一个β-catenin(β链接素)调控机制,从而加强了癌细胞的侵袭能力。

Hpa和uPA是两种不同的酶类,均与肿瘤的侵袭和转移密切相关,两者都是通过降解细胞外基质成分促进肿瘤的转移,Hpa同时又可以通过降解细胞外基质导致结合在细胞外基质上的uPA的释放有关[15]。本实验两者相关性结果显示两者在内膜癌组织中的表达均升高,但无明显相关性,可能由于两者受多种因素的共同调节,其相关性和相互作用机制还有待于进一步的研究。

纤溶酶原激活物抑制物 篇6

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

纯种德国牧羊犬14只,雄性,体质35～40 kg。

1.1.2 主要试剂

质粒pSecTag 2B、感受态细胞E.Coli JM109、中国仓鼠卵巢细胞系由亚能生物技术(深圳)有限公司提供;限制性内切酶Hind III、Kpn I、BamHI和Xho I购自宝生物工程有限公司;VentDNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司;羊抗人t PA多克隆抗体、兔抗羊多克隆抗体、牛血清白蛋白、t PA ELISA检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供;全氟丙烷气体(Halocarbon-218)由广东佛山捷锐公司提供。

1.1.3 主要仪器

超声波发生器系宁波新芝生物科技有限公司产品;治疗性超声仪(US-700)系德国产品。

1.2 方法

1.2.1 基因质粒的构建和表达

根据3个EST序列及t PA基因序列设计3对引物将t PA的3段序列从3个EST克隆质粒中扩增出来,并且在3对引物末端分别引入酶切位点。分别用含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基扩增培养3个EST克隆菌株,提取3个EST克隆质粒作为PCR扩增模板并扩增3条t PA片断,回收扩增产物并测序鉴定。质粒pSec Tag 2B和3条t PA片断t PA-1、t PA-2、t PA-3分别经Hind III和Xho I、Hind III和Kpn I、Kpn I和BamHI、BamHI和Xho I双酶切消化,经QIAGEN PCR Product Purification Kit纯化,T4 DNA连接酶14℃连接过夜,将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞,经含氨苄青霉素LB平板挑出抗性菌落,PCR检测重组质粒,提取重组质粒测序鉴定(如图1)。重组质粒经磷酸钙共沉淀法转染至CHO细胞,用间接免疫荧光法检测t PA表达。

1.2.2 一步法制备载基因白蛋白纳米粒

100 mg牛血清白蛋白加入5 m L双蒸水溶解,用0.1 NHCl调整pH值至5.5。将已构建的1 mg t PA质粒加入上述白蛋白溶液中,孵育30 min后在超声场的存在下缓慢滴入乙醇(乙醇∶水=2∶1),直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5%的戊二醛溶液30μL,适当搅拌,室温下静置2 h。减压使残余的乙醇挥发,所得溶液17 000 r/min离心30 min以除去游离的白蛋白和多余的交联剂。沉淀用双蒸水重悬并用超声波(条件:180 W,固定频率20 kHz,30 s)分散成乳胶状,4℃下储存备用。取部分制备扫描电镜标本观察纳米粒形态、做包封率检测和凝胶阻滞实验,并用Zetasizer 3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。

1.2.3 氧-氟丙烷蔗糖白蛋白超声微泡的制备方法

无菌制备含10%蔗糖的5%(g/m)牛血清白蛋白液体10 m L;并置于有盖50 m L塑料离心管中,依次用氧气和氟碳气体饱和液体(流量:6 m L/min),约10 min,超声波发生器处理1 min(条件:180 W,固定频率20 kHz);将制备的微泡4℃下密闭保存备用。取部分显微镜观察微泡形态、测量大小并计数;Zetasizer 3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。

1.2.4 载基因白蛋白纳米微泡靶向超声造影剂制备

将一次制备的白蛋白纳米粒(含1 mg质粒)加至5m L白蛋白微泡中,加入50%戊二醛10μL溶液4℃下孵育2 h进行交联(戊二醛溶液终浓度为0.1%)。用生理盐水洗涤、离心、分层,离心速度200 r/min,1min,取上浮泡沫悬液即得载基因的白蛋白纳米微泡靶向超声造影剂(载体)。调整微泡浓度使10 m L靶向造影剂中含微泡0.8×109～1.8×109/m L,基因质粒含量为2 mg。4℃下保存备用。

1.2.5 载t PA基因白蛋白纳米微泡靶向超声治疗方法

实验组(n=7)于三尖瓣膜置换术后胸壁表面二维超声观察心脏显影。经静脉注入载t PA基因白蛋白纳米微泡剂10 m L,并观察到心脏显影明显增强后经胸前壁正对心脏前壁右室流出道局部超声照射30 min,并观察到将微泡击碎(二维超声观察),超声频率1 MHz,强度1.5 W/cm2。对照组(n=7)于常规体外循环下行三尖瓣机械瓣膜置换术后静脉输入10m L生理盐水并超声照射(条件同前)。术后给予抗生素预防伤口感染,常规饮食,各组均无抗凝治疗。动物于术前和观察结束后(4周)分别取血液检测D-二聚体含量并用ELISA法检测血t PA含量。

1.2.6 病理和免疫组织化学观察

观察期4周结束或动物死亡后,取其心脏,沿血流方向打开心腔观察血栓形成情况;取心房和心室肌壁尤其是左室前壁右室流出道局部靶向治疗处心肌组织,10%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,做HE染色和免疫组织化学间接法染色,观察病理改变、检测t PA抗原表达和转基因效果。免疫组织化学一抗为羊抗人t PA多克隆抗体;二抗为兔抗羊多克隆抗体,操作方法按试剂说明书进行,阳性反应细胞为细胞浆内黄褐色颗粒状沉淀。另取肝脏、肾脏和肺脏用上述方法检测,观察基因药物的组织分布和毒性。

1.3 统计学方法

用SPSS 13.0软件进行统计学分析,数据进行正态性检验后以均数±标准差表示,采用两组独立样本t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 p SecTag2B-tPA重组质粒的构建与表达

转染CHO细胞后免疫荧光反应结果如图2所示,加入荧光素标记t PA抗体后被转染的CHO细胞胞浆呈强阳性反应;未加荧光素标记t PA抗体被转染的CHO细胞胞浆呈阴性反应;一抗用荧光素标记β-catenin抗体取代后反应为阴性。

2.2 载tPA基因白蛋白纳米粒粒径、形态和包封率的测定

扫描电镜结果显示,白蛋白纳米粒球形、大小较均匀且分散良好。Zetasizer 3000仪粒度分析显示,白蛋白粒径大小呈正态分布,平均粒径为132.0 nm,最大粒径为152.4 nm,最小粒径为49.1 nm。多分散指数平均0.33(图3)。表面Zeta平均(31.32±41.42)m V。样品的包封率用紫外分光光度计进行检测,测量加入的总的质粒DNA含量。将包裹基因后的纳米溶液离心并测量上清液中游离质粒DNA,包封率(%)=(W总-W游)/W总×100%(W总:总的加入量;W游:上清液中质粒DNA测得量)。测定结果显示包封率平均为73.58%,符合实验要求。

2.3 凝胶阻滞分析和DNaseⅠ保护实验

0.9%琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示,第1加样孔为分子量标记(Marker)。第2加样孔为质粒DNA,未经纳米粒包裹,可见明显条带。第3加样孔为经白蛋白纳米包裹后的质粒DNA,完全阻滞于加样孔中未能移动(DNA:白蛋白为1/100)。第4加样孔为质粒DNA经白蛋白纳米粒包裹并用DNaseⅠ消化后降解,电泳亦未见条带显现,表明纳米粒对质粒DNA具有保护作用。

2.4 超声微泡形态的物理特征

普通光学显微镜显示制备的糖蛋白超声微泡圆球形囊泡状,大小较一致,分散良好,直径最小0.9μm,最大9.8μm,95%以上微泡直径2～5μm,可满足微血管超声造影需求。含10%蔗糖的白蛋白微泡经4℃保存30 d形态学上未发生改变,且对热稳定性良好(40℃,30 min)。与白蛋白纳米粒交联后上述性状亦未发生明显变化(图5)。

2.5 超声显像和靶向治疗

实验组经静脉注入载t PA基因白蛋白纳米微泡剂10 m L,超声显像心脏靶组织,观察到与注射前相比相关脏器显影明显增强。经超声波治疗30 min后组织显像回复至注射前水平。对照组未见治疗前后超声影像变化(图6)。

2.6 术后各组动物状况

术后各组动物均观察28 d(4周)。对照组7只,其中1只于术后19 d死亡。观察期死亡动物的主要症状为食欲差、体重明显减轻、咳痰和呼吸困难等,心功能衰竭是主要死亡原因。实验组7只,存活时间均达到观察期4周,动物的一般情况良好,术后1周左右出现轻度食欲差和体重减轻,经治疗和调理后恢复正常。

2.7 心脏和其他脏器的病理学改变

大体:各组死亡和观察结束后处死的动物心脏心包膜局部均可见轻度黏连。沿血流方向切开心脏,见三尖瓣机械瓣膜缝合良好,无瓣周漏现象。对照组包括观察第19天死亡1只在内共7只动物机械瓣膜心房和心室表面有不同程度的血栓形成,血栓形成率为100%,死亡动物心脏血栓形成最为明显,从瓣环与瓣叶交界处开始沿瓣膜房室两面向瓣中央发展,阻碍瓣膜活动,并向上发展填充右房;向下发展,沿右室至肺动脉。实验组经靶向转染t PA质粒,7只动物心脏瓣膜表面及心腔内均未见血栓形成(图7、8),4周血栓抑制率100%,各组心肌肉眼上无明显改变。镜下:对照组心腔和瓣膜表面血栓均为混合性血栓,偶伴有轻度感染可见有炎症浸润和局部血栓溶解。死亡动物见轻度肺水肿和间质性肺炎性改变;肝、肾等有不同程度淤血,肝细胞周围型脂肪变性,肾近曲小管上皮细胞轻度水变性。实验组心脏和相应脏器未见明显异常。两组经超声处理的心肌组织心肌细胞体积轻度增大,细胞浆深染,细胞核增大。部分细胞胞浆可见空泡;其余未见明显异常。

2.8 心肌tPA抗原表达

超声靶向转染后4周可见局部心肌细胞表达t PA抗原阳性,这些心肌细胞呈散在分布,体积轻度增大,胞浆横纹减少,呈棕褐色细颗粒状,部分间质细胞和小血管壁可见弱的阳性反应(图9)。

2.9 血D-二聚体和tPA含量

靶向转基因前和术后4周血D-二聚体和t PA含量检测结果如附表所示,实验组于转基因后4周血液2项反应纤溶活性的指标均较转基因前、对照组术前和术后显著增高;实验组术前与对照组术前和术后相比差异均无统计学意义。

注:覮与对照组术前、术后及实验组术前比较,P<0.01

3 讨论

t PA是纤溶系统主要激活因子,是机体重要的抗凝成分。它由血管内皮细胞合成,在各种刺激尤其是纤维蛋白的作用下释放入血,作用于血浆素原使其转换为血浆素促进纤维蛋白降解[2]。人重组t PA作为生物制剂已应用于冠心病急性心肌梗死、脑栓死、肺梗死等的溶栓治疗[6]并取得了显著疗效,但由于价格昂贵未能广泛应用。这些研究成果使笔者设想构建真核t PA基因表达质粒并选择适当的载体将其转导机体细胞获得有效和持续t PA的产生,以达到长期抗凝和防止血栓形成的目标。笔者实验体系里,以3个EST克隆质粒为模板分别扩增3条t PA片断并将之克隆于质粒pSecTag 2B中构建成pSecTag 2B-t PA重组质粒,扩增后体外转染CHO细胞获得了t PA的高效表达。

白蛋白是近年来研究较多的一种纳米材料,它的生物相容性好,生物可降解,无免疫源性和细胞毒性,基因转移效率较高。它有精确的纳米结构、表面与内部可携带分子的特性,使之成为一种很好的DNA导入细胞的载体[7]。白蛋白纳米粒携载基因的方式包括表面静电吸附和物理包裹两种方式,具体在结合过程中采取哪种方式取决于载基因纳米粒的制备方法[8]。一步法是在白蛋白形成纳米粒前先与基因质粒混合,这种方法将基因物理包裹于白蛋白纳米粒中。其主要优点是携带被转基因量较高;药物缓释和转基因时间较长;具有较好的酶保护和防止体内DNA酶降解作用;容易设计成靶向载体,应用于体内研究或制备成纳米药物应用更具优越性。二步法:先制备白蛋白纳米粒并调整介质酸碱度使之表面含有较多正电荷,借助静电吸附原理将富含负电荷的质粒DNA吸附于表面携带。主要特点是制备过程温和简易,不易破坏DNA;纳米粒径均一,容易调整粒径大小,但载药量相对小,不释控,无酶保护作用,设计靶向载体较为复杂。笔者实验采取一步法制备载t PA基因质粒白蛋白纳米粒,扫描电镜和粒度分析结果显示,粒径132.0 nm左右,大小较均匀,分散性好;包封率73.58%;凝胶电泳分析显示具有较好的DNA酶保护作用,符合实验要求。

基因导入体内的方式多为将目的基因直接注射于靶组织,如心血管疾病多采用心肌内直接注射或心导管注入质粒DNA或腺病毒载体。笔者实验室曾构建了高表达t PA基因质粒并用外科涤纶缝线作为载体制备了基因缝线,直接缝合于心肌组织[9];用壳聚糖做原料制备了纳米t PA基因载体并直接注射于心肌均获得t PA的有效表达[10]。但这种方法存在有创性,限制其临床应用。自超声造影剂应用以来,在利用微泡增强超声显像的同时,还发现微泡具有靶向运载作用,可以靶向传输基因或药物,达到治疗疾病的目的,并可能建立一种安全、有效、无创的超声介导靶向传输系统[11]。超声靶向治疗的基本原理:声场内的超声波破坏微泡造影剂后,其产生的空化或机械效应可使靶细胞膜轻度可逆性损害和通透性增加,并致直径≤7 mm的微血管破裂,内皮细胞间隙增宽。靶基因可通过破裂的微血管和内皮细胞间隙到达组织细胞内。同时,利用超声波在特定时间和空间内击碎靶组织内的微泡,从而使细胞对基因或药物的摄入增强,达到在靶器官定向治疗的目的并降低了携带基因或药物的全身不良反应和毒性[12]。

目前,以白蛋白作为液膜的微泡研究较多,它具有无毒性、易于制备等优点,缺点是稳定性较差。有学者在制备超声微泡过程中在白蛋白液体中加入一定量(40%)蔗糖,结果发现微泡的热稳定性增强且存放时间明显延长,从未含蔗糖的16 d延长至含40%蔗糖的半年以上[12]。笔者实验体系中,发现40%的蔗糖白蛋白液体黏滞性强,制备时超声较困难且所需能量较大,容易导致微泡液温度增高;另外,高含量蔗糖的输入机体难以接受。为此,实验选择10%的蔗糖构成糖蛋白,不但避免上述情况发生且微泡的稳定性良好。惰性气体氟碳是目前最常用的制备超声微泡时使用的气体。有学者发现含全氟碳的微泡如果同时加入少量氧气会进一步增加微泡在血液中的稳定性,取得更强的心肌显影效果。根据超声微泡这些特性和靶向原理,实验使用蛋白交联剂戊二醛将构建的白蛋白纳米t PA基因质粒连接到制备的蔗糖白蛋白超声微泡表面,在超声场的存在下,将t PA基因质粒靶向导入心肌组织,获得了t PA基因的有效表达并有效预防了狗三尖瓣机械瓣膜置换术血栓的形成。在获得心肌靶组织表达t PA增强的同时,检测到血t PA含量增加以及D-二聚体含量增高,反应了t PA抗凝活性明显增强。

笔者的初步研究结果发现,采用超声触发破坏微泡造影剂的方式,可使载有基因质粒的白蛋白纳米粒靶向定位释放和靶基因的表达增强,这种方法是一种简易有效的靶向纳米基因转移新技术。虽然该方法使目的基因在体内实现高效、稳定、可调控的表达还有待进一步深入研究,但随着分子生物学和超声医学技术的不断发展,将为人类疾病防治的研究提供一种新的途径。

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