血细胞信号

2024-07-28

血细胞信号（共9篇）

血细胞信号篇1

0 引言

作为一种非常普遍的检测方法,血细胞分析在临床疾病的诊断及健康体检等方面发挥着重要的作用[1]。一般地,疾病会引起血液中红细胞、白细胞、血小板等血细胞数量变化,因此通过对血细胞的分类识别有助于临床上判断人体健康与否。目前国内外的血细胞分析仪大多采用库尔特原理采集原始信号,基本原理是悬浮在电解液中的血细胞随电解液通过小孔管时,会导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化,产生电位脉冲[2]。血细胞的大小和数目会引起脉冲信号的大小和次数的变化。针对血细胞信号多形态、非线性和非平稳的特点,一般需采用短时傅里叶变换(Short-time Fourier Transform,STFT),小波变换(Wavelet Transform,WT)或WignerVille分布等时频分析的方法,但这些方法分析非平稳信号均有各自的不足,短时傅里叶变换容易受到窗函数的影响,小波变换的结果在很大程度上取决于小波的选择,Wigner-Ville分布易受到交叉相干扰[3]。本研究采用由Huang提出的希尔伯特黄变换(Hilbert Huang Transform,HHT)方法提取血细胞信号特征向量,以避免上述种种不足[4],并采用隐马尔可夫模型对血细胞的特征向量进行分类识别,实现对正常人和病患者的血细胞信号分类识别。

1 希尔伯特黄变换

HHT由两大主要部分组成:第一部分为经验模态分解(Empirical Mode Decomposition,EMD),它是由Huang所创立的信号筛选方法[5];第二部分为Hilbert谱分析(Hilbert Spectrum Analysis,HSA)。EMD是HHT的核心算法,不同于其他的时频分析方法,HHT具有直接获得、自适应性等特点,分解的过程是基于原数据获得的后验基函数,这一点与小波变换有着很大的不同,同时也是相对于小波变换的巨大优势,因为不同的小波基函数对小波分析结果的好坏有很大的影响,由于对并不需要固定的基函数,针对不同的待处理信号可以自适应地分解出有限的多个本质模态函数(Intrinsic Mode Function,IMF)。这些IMF在经过Hilbert变换后得到瞬时频率,最终输出的Hilbert谱即为所有IMF瞬时频率的集合。

1.1 经验模态分解

经验模态分解是对原始信号不断筛选的过程,它假设任何信号都包含不同的简单本质模态函数,而且每个IMF必须满足以下两个要求:

整个数据当中,极大值的个数需要满足等于过零点的数或者最多只能相差一个;无论在整个数据的哪一点,分别由极大值和极小值形成的包络线的均值是零。

满足这两个条件就意味着每一个IMF代表一个与谐波函数极为相似的震荡模型,而又非仅仅如此,与具有固定振幅、频率的谐波分量相比,IMF在整个时间轴上振幅与频率都可以是变化的。为了获取IMF可以使用以下的方法:

(1)找出数据x(t)的所有局部极大值点和局部极小值点,t为时间,下同。

(2)采用B-spline或cubic B-spline算法[6]分别连接极大值和极小值点,由此就能得到数据的上下包络线emax(t)和emin(t)。

(3)计算极大值和极小值及平均值,将这些平均值接起来得到。

(4)检查h(t)=x(t)-z(t)是否满足IMF的要求,若不满足就将此h(t)替换成x(t)重复上述的计算,经过k次迭代后,直至产生一个符合要求的IMF:c1=h1k=h1(k-1)-m1-k。停止的标准是利用连续两次筛选结果的分量标准差(Standard Deviation,SD)定义的。当SDk小于一个预定值时停止,这个预定值通常是0.2~0.3之间。

(5)把r=x(t)-c1视为一个新的信号,重复以上过程依次得到c1,c2,⋯,不断重复直至残余量rn成为一个没有或只有一个极值的单调函数,再也提取不出任何一个IMF分量。

至此整个EMD过程结束,原信号可以表示为,不同的IMF分量包含不同的频段,第一个IMF包含的频率最高,而较低的频率则出现在随后的IMF中。IMF中频率是时变的,而且不同的IMF之间频段还可能发生混叠,不过在任意时间点,任意两个IMF都不可能包含相同的频率。

1.2 Hilbert变换

对每一个IMF进行Hilbert变换得到,由此可以得到一个解析函数,其瞬时幅值,瞬时相位,进而得到瞬时频率ωi(t)=[dθi(t)]/dt。对所有IMF执行Hilbert变化后,原始信号可以表示成以下解析信号的实部(Real Part,RP):

这里可能是单调函数或常数的残余量rn可以被忽略。

式(2)展示了一个幅值关于时间-频率平面的函数,这个关于时频分布的幅值被称作是Hilbert谱H(ω,t),进而又定义了边际谱h(ω)=∫0TH(ω,t)dt,Hilbert边际谱提供了信号在每个频率上整个时间段上幅值的累积,物理意义与傅里叶谱相似,但不同的是,相比较于傅里叶谱,Hilbert谱具有较低的能量泄露和更高的频率分辨率等优势[7]。

2 剔除EMD中产生的虚假IMF分量

在理想情况下,IMF是一种原始信号的完备、自适应并且正交性的表示方法,信号可以自适应地分成各个不同尺度具有物理意义的分量,可是根据实验经验的结果,有一个较为严重的问题,就是在分解过程中会出现端点效应,信号的起点和终点会出现失真,这些失真还会进一步地影响到信号内部,从而产生一些虚假的IFM分量,这一现象在低频分量中尤为明显[8],再加之由于采样频率不足、噪声干扰等一系列的影响,使得虚假分量这一问题不可避免。

由于这些不具有任何物理意义的虚假分量的存在,会严重影响后续的血细胞信号特征提取及识别,研究发现,在血细胞信号识别领域提取特征向量时如果没有将这些虚假分量剔除,识别正常人和病患者的血细胞信号时会出现敏感性大幅下降至不足60%,而特异性则会上升[9]到接近100%。这样的结果并不具有使用价值。而剔除了过多的IMF分量,会缺失部分低频分量,导致不能准确地反应信号的特征,识别准确率也会降低,因此选出有效的IMF分量显得尤为重要。

图1是一个由两个频率分量组成的信号,这个信号表示为s(t)=sin(2π⋅20⋅t)+sin(2π⋅40⋅t),0<t<1,图2为这个信号经过EMD分解后产生的IMF以及残余分量,显而易见的是前两个IMF就是原始信号固有的频率分量,分别对应原始信号的40 Hz和20 Hz分量,这就是真实有用的,剩余那些虚假的低频分量将会影响接下来的数据分析。为了剔除这些虚假分量,本文将用一种基于相关系数的简单高效的方法。由图2可以直观地感受到真实的IMF与原始信号有着较高的相关性,而虚假的IMF与原始信号的相关性较低,因此引入IMF分量与原始信号的相关系数来定量地描述相关性的大小,为了避免剔除一些幅值较低的真实IMF,在计算相关系数前有必要先对所有的IMF与原始信号做归一化处理。

4.1 隐马尔科夫模型(HMM)的数学模型

马尔可夫链模型描述的状态序列的每个状态都由这个状态之前的有限个状态决定,HMM是在此基础上扩展成为的一种双随机过程,HMM双随机过程包含一条描述隐含状态的马尔科夫链,另一个随机过程描述隐含状态与可观察值之间的统计对应关系。一个t时刻模型状态为qt(qt∈{S1,S2,…,SN}),观察值为Ot(Ot∈{V1,V2,…,VM})的经典HMM模型通常由五元参数λ=(N,M,π,A,B)表示,其中,N是模型的隐含状态数;M是每个状态对应可能观察值的数目;是状态转移概率矩阵,

是观察值概率矩阵,;π是初始状态的概率,π=(π1,π2,⋯,πN),πi=P(qi=Si),。

HMM需要解决3个基本问题[12]:已知模型参数和一给定的观测值,计算这一观测值在此模型下生成的概率;已知模型参数和某一观测值,寻找最有可能产生这一观测值的隐含状态;已知观测值及其对应的隐含状态,寻找最有可能的模型参数。针对这三个问题诞生了Forward算法,Viterbi算法以及Baum-Welch算法。

4.2 血细胞信号分类识别

血细胞信号分类识别分训练和识别两阶段完成。训练阶段是为了获得健康人和病患者的HMM模型参数,由前文方法提取的特征向量TE即为HMM的观测值O,健康人和病患者分别对应着不同的观测值,获得模型参数正是Baum-Welch算法解决的问题,此算法采用最大似然估计方法,利用其递归思想,初始化模型参数后,不断地迭代修正模型参数,使得观测值在某一模型参数下概率P(O|λ)最大,这个概率在计算时通常用对数形式表示,而且随着迭代步数的增加,模型参数的初始取值并不会对训练结果造成过大的影响[13]。两个模型的迭代步骤和对数似然估计概率如图5所示,在经过迭代运算20步左右时,算法的收敛误差就已经极小了,考虑到此算法寻找的是局部极值点[14],多余的步骤已无必要。在这一阶段分别得到正常人和病患者的模型参数记作λ1,λ2。

在识别阶段,先对给定的血细胞信号经过处理提取特征向量,此特征向量视为观测值,分别输入到经由训练得到正常人和病患者的HMM模型中,再用Viterbi算法分别计算两种模型下的观测值的概率P(O|λi)(i=1,2),比较两个概率的大小,选取较大的那个对应的模型作为此观测值的识别结果。

4.3 识别结果及讨论

实验选取正常人与病患者这两类人群血细胞中的白细胞信号作为识别对象,白细胞信号由SYSMEX KX-21血细胞分析仪采集获得,样本中正常人的白细胞数量范围是4.0×109~10.0×109个/L,病患者则低于或高于这个范围。每一类人群样本各46例,取其中的23例信号作为HMM的训练样本,剩余的23例作为测试样本。识别指标用医学统计里的两个概念灵敏度和特异度衡量,灵敏感度即为在患病人群中,成功确诊患病的概率;而特异度即为在健康的人群中,成功排除患病的概率,综合准确率是所有正确识别的概率。

通过实验的仿真模拟,本文采用的方法对血细胞识别的综合准确率达89.13%,表现了通过经验模态分解并剔除虚假分量得到的IMF能量矩能够很好地描述血细胞信号的特征,同时HMM也能充分地挖掘出这些特征向量与对应状态之间的关系,虽然在训练时,使用局部极值点代替整体极值点,但经过多次迭代后,已足够接近整体极值点,关于这一步,采用遗传算法改进可能会得到更好的结果,进一步提高识别的准确率。

5 结语

本文结合HHT和HMM的优点,将非平稳的血细胞信号经验模态分解为多个IMF分量,选取其中与原信号相关系数较大的分量作为有效分量,分析提取出其关于时间能量的特征向量。而HMM模型又反映出特征向量的隐藏状态是正常人或病患者之间的联系,通过实验分析,获得了很有效的识别结果。

血细胞信号篇2

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细胞信号通路在胃癌中的进展篇3

1 Notch信号通路

Notch信号系统为一高度保守的传导机制系统, 通过调节多个细胞生长发育过程, 包括细胞增殖, 凋亡和分化, 已成为癌变过程中一个重要的信号转导通路。Notch信号途径由Notch、Notch配体和CSL等组成[4]。目前发现的哺乳动物Notch配体主要有Delta-like ligand I (DLLl) 、DLL3、Jaggedl、Jagged2及DLL4。Notch信号通过与配体结合而启动, 例如Notch受体细胞膜上的Jagged 1, 激活后, 有序地被基质金属蛋白酶和γ-分泌酶裂解。已裂解的Notch受体胞内段转移入细胞核, 成为转录因子[5]。在胃癌中, 幽门螺旋杆菌感染已被证明可诱导Notch信号激活[6]。进一步的实验表明, Notch信号诱导COX-2的表达, 由COX-2选择性抑制剂或RNA干扰引起的COX-2的阻滞, 可阻断其对癌细胞生长和侵润的刺激作用。Notch1受体的胞内结构已被证明通过直接结合COX-2启动子, 以增强COX-2表达[6]。这些结果表明, Notch信号通路在胃癌发生中是重要的, 并且已与COX-2转导途径存在串话作用。

现在, 对于Notch1在胃癌发生发展中的作用各家报道不一, 主要有促癌、抑癌两种作用。王依满等研究发现, 胃癌、癌旁浅表性胃炎、胃镜浅表性胃炎的Notch1阳性率水平相当, 均明显低于癌旁萎缩性胃炎的Notch1阳性表达率;Notch1在胃癌形成过程中的作用不能简单界定为促癌或抑癌, 其在胃癌形成的不同阶段可能发挥不同的作用[7]。

2 PTEN及PI3K/AKt信号通路

PTEN是一种重要的抑癌基因, 目前研究发现人类许多肿瘤均存在PTEN的失活, 同时PTEN失活也与这些肿瘤的发生、发展有关。PTEN蛋白对PI3K/Akt信号通路有负性调控作用[8]。PTEN可使Pl (3, 4, 5) P3生成PI (4, 5) P2拮抗PDK的活性而对PBK-Akt实现负调控。PTEN的表达与胃癌的发生、发展、预后都有着密切的关系, 他们对胃癌治疗、预后的作用以及在胃癌中的作用机制及有待我们进一步研究。

磷脂酰肌醇3-激酶是由具有调节功能的亚单位p85和具有催化功能的亚单位pll0组成[9]。P13K/Akt信号传导通路活化可以加快细胞周期进展, 在肿瘤的形成中起很大作用, 参与侵袭和转移的过程。周诗琼等研究发现胃癌组织中P13K蛋白的阳性表达率为85.29% (58/68) , Ak蛋白总的阳性表达率为89.71% (61/68) [10], 研究表明P13K蛋白的阳性表达率与胃癌Lauren分型无关, 但与癌细胞分化程度和淋巴结转移均显著相关。通过研究发现, Akt蛋白与胃癌细胞的分化程度相关, 而且可能与Akt蛋白的过度表达促进肿瘤的进展有关, 并且与淋巴结转移显著相关。通过对正常胃黏膜组织和早期胃癌、中晚期胃癌中Akt蛋白的阳性表达率的比较发现, 胃癌中Akt显著性升高, 表明Ak与胃癌程度有必然联系。

3 STAT-3、Wnt/β-catenin信号通路

信号转导和转录激活因子STAT3, 是一种存在于细胞质与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的双功能蛋白[11]。研究发现STAT3及其磷酸化形式 (p-STAT3) 在人类多种恶性肿瘤如乳腺癌、结直肠癌、胃癌等中均存在异常高表达或活性增强[12]。研究发现STAT3在胃癌组织中的表达明显高于正常胃组织, 低分化胃癌组STAT3的表达明显高于高-中分化组, 提示STAT3异常激活可能与胃癌的发生、发展和分化中有着重要关系[13]。STAT3参与了多种调控激活途径调节。经典的JAK-STAT途径的活化是STAT3的信号转导与转录激活重要途径。研究发现STAT3在很多种胃癌细胞系中为活化状态, 导致其下游靶基因survivin的表达明显升高, 使胃癌细胞表现出抗凋亡作用, 使用JAK激酶抑制剂或上调STAT3显性负性蛋白可使诱导癌细胞发生凋亡[14]。

Wnt信号传导通路可调节细胞的增殖和分化, 参与肿瘤的发生和发展[15], 亦有研究证实胃癌的发生与该途径活化异常有关[16]。此外, Katoh[17]还证明人类Wnt5B mRNA在弥散型胃癌中表达, 这些研究表明胃癌的发生发展可能相关于经典途径中Wnts蛋白的异常表达。

β-eatenin是Wnt信号通路中重要一份子。胃癌中存在的突变 (18%) 和杂合性丢失 (21%) 导致APC功能的缺失, 在理论上可能导致β-catenin的积累的产生[18]。β-catenin在肿瘤的异常表达定位与胃肿瘤的演进可能相关。

4 展望

目前在胃癌中已发现多种信号转导通路的调节异常。这些细胞信号通路的激活或抑制导致多种胃癌恶性表型的发生发展, 包括细胞增殖力的增加, 细胞凋亡的逃逸和侵袭力的增强。然而这些信号通路在胃癌发生发展中的相对重要性以及激活时间, 仍没有研究透彻。阐明这些信号通路的激活时间及作用机制, 有助于抗胃癌药物的开发及临床前研究。新研究初步证据证实胃癌的发生发展中存在大量信号通路的串话作用, 但其发生机制仍不清楚。目前大部分靶向治疗药物一般仅能针对一个靶点发挥效应, 然而胃癌细胞中信号转导系统是一个复合的、多因素交错的网络体系, 因此多靶点联合用药将是胃癌分子靶向治疗的一个发展趋势。因此我们预测, 依据不同类型胃癌的信号通路紊乱的不同, 针对性地通过靶向治疗同时抑制多种信号通路可能会提高胃癌治疗的效果, 并且可能阻止胃癌化疗耐药性的发生及发展。

摘要：胃癌发生发展的过程是复杂的, 是环境和宿主多种因素多个步骤复杂相互作用的结果。细胞内信号转导通路的调节异常为肿瘤发生发展的重要机制之一。新近的研究表明, Notch、PTEN及PI3K/AKt、Wnt/β-catenin、转化生长因子-β/骨形态蛋白等通路在胃癌发生发展过程中所发挥的重要作用。了解他们的生物学意义及致病机制, 将为抗胃癌药物的开发提供理论依据。

血细胞信号篇4

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血细胞信号篇5

目前用于记录脑细胞信号的电极主要有两种:金属和玻璃。金属电极可用在活动物中, 记录脑细胞群体活动峰值及其工作情况;玻璃电极既可用于检测峰值, 也能检测单个细胞活动, 但却脆弱易碎。以往实验中曾用过碳纳米管探针, 但那种电极要么太厚会造成组织损伤;要么太短而限制了电极穿透深度, 无法探测到内部的神经元。

最新研制出的碳纳米管“鱼叉”只有一毫米长、几纳米宽, 可利用碳纳米管卓越的机电性能来捕获单个脑细胞的电信号。杜克大学神经生物学家理查德!穆尼和该校计算机科学与生物化学教授布鲁斯!唐纳德5年前开始合作, 研究用纳米材料来缩小机械并改良探针。他们先以电化技术处理过的钨丝为基础, 用自缠多壁碳纳米管延长它, 制成了一毫米长的小棒, 然后用聚焦离子束将纳米管磨锋利, 使其一端逐渐变细到只有一根碳纳米管粗细, 就像微小的“鱼叉”。杜克大学神经生物学家迈克尔!普拉特说:“这种碳纳米管‘鱼叉’结合了金属和玻璃电极的优点, 无论是在脑细胞内外, 它们都能记录良好, 非常灵活而且不会碎, 可以用来记录活动物的单个脑细胞信号。”

在穆尼的实验室, 他们把“鱼叉”分别刺入小鼠脑组织切片和麻醉小鼠大脑中来实验, 结果显示探针能传输脑信号, 而且有时比传统的玻璃电极效果更好, 信号中断的可能性更小。

新探针还能刺穿单个神经元, 记录单个细胞的信号, 而不是附近的一群神经元。唐纳德强调, 这被称为细胞内记录, 应是人们首次用碳纳米管在脑切片或完整脊椎动物大脑中记录单个神经元信号。

A tiny spear made of carbon nanotubes can probe the internal electrical activity of a single neuron, giving researchers a more refined look at how brain cells respond to signals from their neighboring cells.Probing the brain at this resolution could be vital to efforts to understand and map its function in new detail (see“Why Obama’s Brain-Mapping Project Matters”) .

The neuron“harpoons”are just 5 to 10 micrometers wide and can pierce a living cell to measure electrical changes associated with neuronal signaling.In dissected slices of still-active mouse brain tissue, researchers at Duke University were able to record from inside a single neuron at a time.

“To our knowledge, our paper shows the first intracellular recording with carbon nanotubes from vertebrate neurons, ”says Bruce Donald, a biochemist and computer scientist at Duke University and author on the study, which was published in PLoS ONE on Wednesday.

Carbon nanotubes have many desirable properties for brain recordings, says Donald:they are strong, they are compatible with body tissues, and they conduct electricity well.But previous devices built from carbon nanotubes have been too short or wide to be well suited for recording inside cells.The probes built by the Duke researchers, however, were around one millimeter long and lent themselves to monitoring electrical activity more precisely than typical glass or metal electrode setups.

The team was able to detect small changes in electrical activity in the cell—changes corresponding to the input signals the neuron was receiving from other neurons.An average cortical neuron can receive signals from around 10, 000 other neurons, says Richard Mooney, a neuroscientist at Duke University and an author on the study.“Individual y, those generate very small signals, ”he says.Together, the col ection of signals is computed by the receiving neuron as it decides whether or not to fire.

Intracellular recordings could be useful for mapping the functional connections between neurons, a goal of the recently launched BRAIN initiative (see“The Brain Activity Map”) .“By being able to look inside the cell and measure small voltage changes, you get access to the network that talks to that cell, ”say Mooney.

The researchers used a“clever technique”to build their device, says Takashi Kozai, a neural engineer who was not involved in the study.Starting at the tip of a tungsten wire, they built up a long needle-like probe made of tangled carbon nanotubes.Then they coated the probe with an insulating material and used a focused beam of ions to bombard the tip, removing the insulation from that area and shaving it to a fine point.

“With this technique, you can make[probes]as long as you want, ”says Kozai, who is also developing microscopic electrodes for recording neuron activity (see“A Carbon Microthread That Makes Contact with the Mind”) .The work“sets the stage for making even narrower devices, maybe on the order of 100 nanometers instead of microns, ”he says.

In addition to dissected brain slices, the team tested their thin electrode in anesthetized mice, although they were not able to obtain recordings from inside the brain cells of these animals.However, if future versions of the nanotube tip are even sharper, they may be able to better pierce cells in soft and spongy brains, says Kozai.If that’s possible, and if the device is stable in living brains over time, it could help researchers explore how the living brain learns and remembers.

血细胞信号篇6

1 ERK信号传导通路

ERK是丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 家族中的一员。MAPK是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 在所有的真核细胞中表达, 主要分布于细胞质[1]。MAPK包括4条传导通路, 分别是ERK通路、c-Jun N-末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK) 通路、p38丝裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogen-actived protein kinase, P38) 通路和胞外信号调控激酶5 (extracellular signal-regulated kinase 5, ERK5) 通路[2]。Ras/Raf/MEK/ERK是ERK通路中研究最为活跃的信号通路之一。细胞外的各种刺激因素, 如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等与细胞膜表面生长因子受体结合, 通过生长因子受体结合蛋白2 (growth factor receptor-bound protein 2, Grb2) 与生长因子受体结合, Grb2的亚单位SH3再与鸟嘌呤核苷酸交换因子Sos相互作用, 形成生长因子受体-Grb2-Sos复合物。该复合物被激活后导致Sos转移至细胞膜, 使Sos接近Ras, 从而诱导GDP脱离Ras, 形成有活性的GTP-Ras复合物。Ras有3种形式:Ki-ras、Ha-ras和N-ras。Ras与Raf-1的丝氨酸和苏氨酸氨基端结合, 从而将Raf-1从细胞质转移至细胞膜, 由细胞膜上的Raf-1激酶激活Raf-1[3]。Raf是一种MAPK激酶激酶 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase, MAPKKK) , 包括A-Raf、B-Raf和Raf-1 3种同工酶, 其作用是使丝氨酸和苏氨酸磷酸化并激活下游的底物MAPK激酶 (mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK) 。MEK作为MAPKK中的一员, 有MEK1和MEK2两个亚型, 能够使酪氨酸和苏氨酸残基磷酸化, 从而激活下游底物ERK1/2。ERK1/2被磷酸化后成为有活性的ERK1/2, 后者在细胞信号传导通路中起主要作用。ERK家族成员有8个亚型 (ERK1、2、3、4、5、6、7和8) [4], 其中对ERK1/2的研究最为清楚。ERK1/2由两种同工异构体组成, 分别为ERK1和ERK2, 两者在体外有相同的作用底物, 提示两者在功能上的重叠。激活后的ERK1/2不仅可以使胞浆蛋白磷酸化, 而且还可以激活细胞核内转录因子, 如c-Fos、c-Jun、Elk-1、c-Myc和转录激活因子2 (activating transcription factor 2, ATF2) 等[5]。各种转录因子被激活后可以参与细胞的分化、增殖、炎症和氧化应激等。

2 ERK信号传导通路与脑缺血

2.1 脑缺血后ERK1/2的变化

正常非缺血脑组织中磷酸化的ERK表达量很少。许多研究发现, 包括体外缺血模型和体内的局灶性及全脑缺血模型, 缺血后P-ERK1/2均发生改变。Li等[6]在大鼠一侧短暂性大脑中动脉闭塞 (middle cerebral artery occlusion, MCAO) 模型的研究中发现, 缺血90 min再灌注1~3 h, P-ERK1/2在缺血半暗带区和梗死灶区明显升高, 在缺血90 min再灌注1 h达高峰, 并且P-ERK1/2在缺血半暗带区的表达比梗死灶区更强。Shackelford等[7]在大鼠短暂性全脑缺血模型研究显示, 缺血期间P-ERK1/2降低, 而在缺血10 min再灌注15 min后升高, 提示急性脑缺血再灌注早期P-ERK1/2可能参与缺血再灌注损伤。Li和Shackelford的研究均表明, 脑缺血后总ERK1/2蛋白水平无显著变化[6,7], 脑缺血再灌注引起神经元死亡或存活是通过对ERK1/2磷酸化水平调节, 而不是通过对总ERK1/2蛋白水平的调节, 也就是说磷酸化ERK1/2的水平代表了ERK1/2的活性, 因此, ERK1/2磷酸化水平与脑缺血过程中细胞死亡和存活相关。Alessandrini 等[8]在小鼠MCAO动物模型的研究中发现, 缺血前使用MEK1特异性抑制剂PD98059, 可以使脑梗死体积在缺血90 min再灌注22 h减少至55%, 缺血90 min再灌注72 h减少至36%, P-ERK1/2在梗死区域表达下降, 同时c-fos表达升高, 这一研究提示在局灶性脑缺血模型中, 抑制MEK1/ERK信号通路可能通过增强转录因子c-fos的表达而减轻缺血后脑损伤, 提示抑制ERK信号传导通路可以减轻缺血性脑损伤。然而, 也有学者报道, 在大鼠短暂性前脑缺血的模型中, 缺血前给予MEK特异性抑制剂PD98059并不能减轻缺血后神经细胞的死亡[9]。上述研究结果的不同, 一方面可能与选择的模型不同有关;另一方面也可能与ERK在脑缺血中作用的多样性有关。

2.2 ERK信号传导通路介导脑缺血后细胞损伤

脑缺血后ERK被激活, 激活后ERK在脑缺血中作用是多方面的, 既参与脑缺血后神经损伤过程, 也参与了脑缺血后神经修复, 以下分别从这两个方面作进一步的探讨。

2.2.1 ERK信号传导通路通过炎症介导缺血后脑损伤

现在普遍认为脑细胞能够产生细胞因子和趋化因子, 并能够表达黏附分子, 从而参与炎症反应。脑缺血4~6 h后, 中性粒细胞黏附于缺血区毛细血管, 趋化并聚集于缺血脑组织, 释放促炎反应因子。其中与脑缺血密切相关的炎症细胞因子有白介素-1 (interleukin-1, IL-1) 、白介素-6 (interleukin-6, IL-6) 、白介素-10 (interleukin-10, IL-10) 、白介素-20 (interleukin-20, IL-20) 、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 和转化生长因子β (transforming growth factor-β, TGF-β) [10]。Vikman等[11]在大鼠一侧大脑中动脉缺血1 h再灌注24 h的研究中发现, 缺血侧大脑中动脉P-ERK1/2及其下游Elk-1 (ets like transcription factor-1, Elk-1) 的表达比对侧的大脑中动脉明显增加。在缺血侧大脑中动脉炎症细胞因子 (IL-6、TNF-α和IL-1β) 的mRNA表达也比对侧大脑中动脉增加。作者没有对脑缺血后P-ERK1/2及炎症细胞因子的升高与脑缺血损伤的关系作进一步的分析探讨。Wang等[12]在小鼠MCAO模型中, 应用MEK1/2抑制剂U0126, P-ERK1/2在梗死区表达下降, ERK下游底物Elk-1磷酸化减少, 导致IL-1β mRNA的表达下降, 加入MEK1/2特异性抑制剂U0126组的动物其缺血区梗死体积比单纯短暂性大脑中动脉缺血组减小, 提示P-ERK与炎症密切相关, 下调P-ERK1/2可以减少炎症因子的产生, 减少缺血性脑梗死体积。Huang等[13]研究发现, 脑缺血后IL-1和IL-6的升高可以促使血管内皮细胞表达细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) 、P-选择素、E-选择素, 介导中性粒细胞聚集于缺血区, 从而导致脑组织损伤。虽然缺血区脑组织中出现的炎症细胞因子有IL-1α、IL-1β和TNF-α等, 但大多数实验主要集中于研究IL-1β与ERK在脑缺血中作用, 其它炎症细胞因子与ERK在脑缺血中的关系还不清楚。

2.2.2 ERK信号传导通路介导脑缺血后氧化应激损伤

反应性氧族 (reactive oxygen species, ROS) 是指氧的部分还原代谢产物, 包括超氧化物阴离子 (O-2) 、羟自由基 (OH-) 、过氧化氢 (H2O2) 等。机体进行有氧代谢时可以产生活性氧。在正常的情况下, 体内氧自由基的产生与清除是平衡的。脑缺血后, 由于缺血区脑组织线粒体和胞浆促氧化酶的作用以及抗氧化酶的消耗, 导致ROS的产生增加。脑缺血后ROS的增加是导致神经细胞损伤及迟发性神经细胞死亡的重要原因。ROS不但可以通过激活ERK的上游c-Raf-1激活ERK, 而且可以通过抑制磷酸酯酶间接增加P-ERK的含量。HT22细胞由于缺乏谷氨酸受体而产生大量ROS, 从而被广泛用于研究谷氨酸诱导氧化应激。Xiao等[14]在小鼠海马区衍生的HT22细胞培养模型中给予格尔德霉素, 可以减轻由于氧化应激导致的DNA损伤, 同时c-Raf-1水平下降, 提示这种神经保护作用可能是通过抑制ERK上游c-Raf-1实现的。Ho等[15]通过对HT22细胞培养的研究发现, HT22细胞在氧化应激期间, ERK1/2相关的磷酸酯酶活性被抑制, P-ERK1/2的水平升高, 细胞损伤增加;加入抗氧化剂后可以增加磷酸酯酶的活性, 降低P-ERK1/2的水平, 从而减轻由于ROS所介导的细胞损伤。在体内模型的研究中, 进一步证实ROS可以通过增加P-ERK1/2水平而加重细胞损伤。在小鼠短暂性MCAO模型研究中, Noshita等[16]发现过表达超氧化物歧化酶的转基因小鼠在大脑中动脉缺血60 min后, 其梗死区域P-ERK1/2的表达比野生型小鼠明显降低, 同时其细胞凋亡相关的DNA片段也比野生型小鼠明显减少, 说明超氧化物歧化酶可能有减轻细胞凋亡的作用, 其机制可能与抑制ERK1/2磷酸化有关。由于细胞对损伤反应的多样性, 损伤和修复包括多种机制, 各种信号通路之间的关系错综复杂。Zimmermann等[17]在乳腺癌细胞培养中发现Akt可以使Raf激酶丝氨酸-259位点磷酸化, 从而抑制Raf/MEK/ERK信号通路。在脑缺血中, Akt信号传导通路可能通过Ros抑制ERK信号传导通路而起神经保护作用。

2.3 ERK信号传导通路通过减轻细胞钙超载介导脑缺血后细胞存活

脑缺血时能量代谢障碍, 细胞膜上Na+/K+泵不能维持细胞内外正常的离子梯度, 细胞膜电位发生改变而导致细胞外Ca2+大量进入细胞内, 形成钙超载。Franceschini等[18]在大鼠皮层神经元氧葡萄糖剥夺 (oxygen-glucose-deprivation, OGD) 模型中, 加入MEK抑制剂U0126可以增加细胞质内Ca2+, 并且可以加重神经元损伤;在该模型中加入谷氨酸受体拮抗剂MK-801可以达到同样的效果, 推测ERK信号传导通路可能通过谷氨酸受体调节细胞内Ca2+浓度。Bickler等[19]在海马神经元OGD模型研究中发现, 在OGD之前给予0.5%~1.5%浓度的异氟烷预处理可以明显减轻神经元死亡, 预处理组可以通过短暂性升高细胞内Ca2+浓度而增加P-ERK的水平, 加入MEK的抑制剂U0126可以阻断异氟烷的神经保护作用, 提示ERK和Ca2+可能存在一个相互调节机制。ERK可能通过减轻脑缺血过程中细胞内Ca2+超载而起神经保护作用。

间充质干细胞迁移中的信号通路篇7

1 PI-3K/AKT (磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶) 信号通路

PI-3K/AKT信号传递途径在维持细胞生存方面起重要作用, 并且一道构成细胞对外应激反应过程中的促进细胞生长、抑制细胞凋亡和维持细胞重要功能的信号传递链。已证实, 其在多种细胞系, 如巨噬细胞、神经细胞、肝细胞等参与葡萄糖转运、糖元及蛋白质合成与分解等多种代谢过程的调节。磷酸肌醇3-激酶信号转导途径是SDF-1-介导的定向造血干细胞和初级骨髓CD34+细胞迁移[2]。通过遗传学改良过的BMSC过度的表达, 显现出更多的迁移优点并能被的迁移[3], 用PI3k/Akt的抑制剂LY294002和wortmannin可以使SDF-1α和b FGF诱导MSCs迁移减弱[4]。

2 MAPK/ERK1/2信号通路

丝分裂原活化蛋白激酶MAPK途径是典型的细胞生长调控信号通路, 与细胞增殖、分化、凋亡等有密切的关系。有丝分裂原 (细胞分裂剂) 激活蛋白细胞外信号调节激酶1/2的信号途径与调控迁移的多种基因的表达相关[5]。有研究表明, 在大鼠缺血/再灌注损伤后, 肠上皮细胞中则有可能激活MAPK/ERK1/2信号系统实现其修复。同时也有研究表明ERK1/2可间接诱导动员SDF-1细胞[6]。但是很少有研究显示MAPK/ERK1/2与MSC迁移的相关性。Yun等[7]证实了血栓素A2能模仿U46619强烈地刺激h ADSCs的迁移。其机制主要通过激活细胞外信号调节激酶和p38促分裂原活化蛋白激酶。如果细胞用MAPK/ERK激酶抑制剂U0126或p38 MAP抑制剂SB202190预处理后将阻止MSC迁移。同样的, 通过细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059和p38 MAPKSDF-1α, 或通过SB203580抑制TNF-α的趋化性等使SDF-1α诱导的鼠的BMSCs迁移减弱[8]。在由SDF-1和肿瘤细胞培养基介导时, 人的骨髓间充质干细胞在可能存在MEK抑制剂PD98059时其迁移能力明显减弱[9]。用预处理MEK的抑制剂U0126时, 能抑制LPA诱导h ADSCs的迁移[10]。然而, 其它的研究则表明MAPK/ERK1/2在MSC的迁移中作用不大。用SB203580或PD98059预处理后很少影响人的MSCs的迁移[11]。在鼠用MAPK/ERK的抑制剂PD98095时, BMSCs的迁移中SDF-1和TNF-α不受影响[12]。在定向造血干细胞、初级骨髓CD34+细胞、上皮样癌细胞, PI3K/Akt在SDF-1介导的细胞迁移中是必要的, 而非ERK1/2[13]。

3 Wnt3a信号通路

Wnt信号是与一些癌细胞的转移有关的[14], 经典的Wnt信号途径调控了胚胎的神经干细胞的增殖与分化, 而对于出生后神经干细胞的作用并不十分明确。在中脑中检测到Wnt家族成员分泌的糖蛋白表达, 它们调节前体细胞的扩增和神经元的分化, 表明在脑的发育中, Wnt信号可通过促进细胞周期来扩增前体的数量。在体外神经干细胞的培养过程中, 加入有活性的Wnt3a蛋白可减少神经球的形成, 促进神经干细胞向神经元及神经胶质细胞的分化, Kasai等[15]研究也有类似的结果。Wnt3a通过β-catenin (β连接素) 信号通路促进鼠MSCs迁移和创伤愈合, 而Wnt3a抗体信号减弱MSCs的迁移。同时有研究表明阻断Wnt信号的表达, 在体内的神经细胞和胶质纤维酸性蛋白标记阳性的星形胶质细胞表现为增殖受到抑制, 在体外增殖几乎完全消失。国内学者董立华等[16]在用黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞过程中检测wnt l较诱导前增高, 提示Wntl对MSCs神经元样细胞分化可能起促进作用。最近的研究表明Wnt信号通路在小鼠骨髓间充质干细胞的增殖和分化中, 通过调节细胞周期蛋白D1来实现间充质干细胞的增殖。但是在上调Wnt3通路刺激小鼠骨髓间充质时, 其靶基因的膜型金属蛋白酶-1 (MT1-MMP) 示表达清楚。在Wnt3通路活化时MMP-2、MMP-9也下调, 相反通过抑制β-catenin来抑制Wnt信号通路, 可上调MT1-MMP的表达。

4 Jak/STAT信号通路

1992年发现的Jak/STAT信号通路涉及免疫、细胞增殖、分化、凋亡、炎症、肿瘤等多种病理生理过程。在大鼠心肌缺血再灌模型中, 白介素、肿瘤坏死因子等通过Jak/STAT通路, 在核内与靶基因启动子中的特异性的DNA序列激活诱导靶基因表达, 综合其各方力量, 最终发挥多种生物学效应, 决定损伤的严重程度。在炎症反应中, Jak信号传导子及转录激活子信号是最初显示的下游区干扰素信号[17]。Jak信号传导子及转录激活子信号通路在果蝇中激活对细胞迁移是必需的[18]。MSC迁移是适应SDF-1刺激导致Jak2/STAT3通路激活的结果, 用该通路的抑制剂WP1006和Jak2/STAT3通路抑制剂, MSC的迁移受抑制19]。活化的Jak2/STAT3通路激活黏着斑激酶和桩蛋白, 导致肌动蛋白细丝和细胞骨架重组来促进MSC的迁移。

5 Rho A-Rho激酶

Rho家族鸟苷小分子三磷酸酶 (small GTPaes of Rho famly Rho GTPases与细胞骨架结构、形态、极性、细胞黏附、迁移、信号转导和细胞分化等多种生物学行为有密切关系。Rho GTPases是多种细胞 (包括造血祖细胞) 迁移的调控因子[20]。除与其他信号通路具有某些相似性外, Rho GTPases还在MSC的迁移中扮演着不同的角色。Lee等[21]证明LPA诱导人脂肪间充质干细胞 (h ADSCs) 的迁移需要激活Rho A, 用Rho激酶的抑制剂Y27632预处理细胞能明显地抑制迁移反应。另一方面, Jaganathan等[22]证实用溶血磷脂酸 (LPA) 处理人的BMSCs, 能活化的细胞内的Rho和增加肌动蛋白张力丝, 导致MSCs的迁移减弱。用LPA能抑制Rho而间接影响MSCs的迁移。将c DNA编码的构建活化型 (c DNA encoding con.stitutively active) Rho A (Rho AVl4) 微注射到MSCs后, 发现MSCs的应力纤维数量增加, 细胞黏附能力增强, 细胞骨架的变化情况与采用溶血磷脂酸 (LPA) 处理Ms Cs的结果非常类似。而将c DNA编码的Rho A抑制剂C3转移酶 (transferase) 微注射到Ms Cs后, 则细胞骨架网络结构松散。在MSCs向血浆迁移的研究中, 预先用LPA处理MSCs会抑制细胞的迁移, 而用Rho的抑制剂C2I-C3处理细胞后, 则能削弱LPA诱导的迁移抑制, 导致Mscs迁移能力增强, 趋化性增加了3到10倍[23]。由此可见, Rho A活性的变化对MSCs的迁移起着重要的调节作用。

6 SMAD信号通路

转化生长因子β (Transforming growth factor-β, TGF-β) 通路是由Tb R (配体结合陷阱) 的可溶性蛋白调节SMADs受体的磷酸化构成[24]。Tang等[25]证实, 人的BMSCs通过活化TGF-β1诱导细胞通过骨吸收迁移, 这个过程通过SMAD信号通路介导。用其抑制剂和TGF-β1基因敲除鼠模型中, 破坏骨的再吸收, Tb RI信号使活化的TGF-β1释放, 诱导BMSCs的迁移。同时用干扰RNAs和转基因老鼠模型, 显示Tb RI下游的信号分子SMAD2、SMAD3和SMAD4是TGF-β1诱导MSC的迁移所必需。因此TGF-β-Tb RI-SMAD通路是与MSC的迁移有关的新的信号通路。

综上所述, 在间充质干细胞移植的迁移中, 信号传导是一个非常复杂的网络。一方面, 由于细胞内部的信号网络比较复杂;另一方面, 调控机制也非常复杂, 存在自身信号转导通路中的环节调控与其它信号转导通路的交叉对话。尽管其调控机制十分复杂, 且目前对其确切的调控机制尚不十分清楚, 但只有清楚的了解各信号通路的具体机制及其中的关系, 才能通过干预其开关机制、调控蛋白的活化时间和强度等对细胞因子信号转导进行准确调节, 从而提高间充质干细胞移植在创伤愈合、组织修复和再生中的作用, 为间充质干细胞的移植治疗奠定坚实的理论基础, 并为将来的理论研究及临床治疗提供新的思路与途径。

摘要：间充质干细胞因具有多向分化, 来源广泛、取材容易和便于自体移植等特点, 是一种理想的组织工程干细胞。国内外有关其用于治疗的研究已取得了一定的进展, 但是其具体的作用机制仍不是很清楚。近来有关其信号通路的研究较多, 本文就其中有关间充质干细胞迁移的相关通路, 如PI-3K/AKT信号通路、MAPK/ERK1/2信号通路、Wnt3a信号通路、Jak/STAT信号通路、RhoA-Rho kinase信号通路、SMAD信号通路, 进行综述, 以便更全面的理解间充质干细胞迁移的机制。

血细胞信号篇8

1 体外诱导软骨细胞凋亡模型

1.1 硝普钠

硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)是一种具有强烈的血管舒张作用的无机盐类,以往临床上多采取静脉注射用于急性高血压的紧急处理。同时,SNP作为一氧化氮(nitric oxide,NO)的供体,可以释放外源性的NO,在OA及类风湿关节炎滑膜及软骨组织中,由一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)诱导产生的NO含量可明显升高,并伴有软骨细胞凋亡、蛋白聚糖和胶原合成降低、基质金属蛋白酶活性增高及关节软骨炎症表现[4]。目前,利用SNP诱导软骨细胞凋亡被广泛运用于OA疾病的基础研究。Wu等[5]报道利用SNP诱导兔软骨细胞凋亡,24h后检测软骨细胞核碎裂、固缩,通过流式检测凋亡率明显增高,线粒体膜电位降低,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3活性增强。Chen等[6]运用SNP刺激兔关节软骨细胞后,通过扫描电镜观察软骨细胞皱缩,呈圆形态,细胞溶解或分离,流式细胞检测凋亡明显增加,线粒体膜电位降低,检测培养基上清液前列腺素E2表达水平升高。我们之前的研究亦运用SNP诱导大鼠软骨细胞凋亡,软骨细胞活力明显降低,可诱导软骨细胞进行骨架改建,iNOS及caspase-3蛋白表达升高,是较为理想的软骨细胞凋亡诱导剂[7]。同时需注意,SNP溶液相对不稳定,储存时间过长或见光容易分解,影响药物活性,遂建议避光保存,并尽可能新鲜配置使用。

1.2 白介素(interleukin,IL)-1β

IL-1β作为关节软骨退变过程中最直接的促炎细胞因子,可促进前列腺素E的合成,刺激NO、过氧化物及过氧亚硝基等多种活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,进而促进基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)高表达,抑制组织金属蛋白酶抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成,诱导软骨细胞凋亡,常作为构建体外及体内OA模型的诱导剂[8]。Zheng等[9]报道应用IL-1β(10ng/mL)体外诱导大鼠软骨细胞凋亡,24h后检测细胞活力明显降低,且胞核固缩及裂解现象明显,蛋白印迹检测软骨细胞MMP-13含量升高,同时TIMP-1、Bcl-2及Bcl-xl含量降低。Kimura等[10]运用IL-1β体外可刺激牛科鼻部软骨中蛋白多糖和胶原蛋白的释放,促进关节软骨细胞MMP-13的产生,同时IL-1β可促进软骨细胞NO的表达,诱导软骨细胞凋亡病理改变。Ju等[11]报道利用IL-1β刺激兔关节软骨细胞后出现DNA碎裂,软骨细胞凋亡比例明显升高,同时caspase-3活性增强。

1.3 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α

TNF-α是OA关节软骨退变发生过程中重要的介质,可促进关节滑膜及软骨细胞中细胞因子及趋化因子的表达,诱导软骨细胞产生MMPs,使得软骨中Ⅱ型胶原及蛋白聚糖含量降低[12]。多项研究证实TNF-α可促进软骨细胞凋亡,并与caspase家族成员密切相关。Guo等[13]运用酶免疫分析法测量外科手术构建OA模型兔血清中TNF-α含量,结果显示TNF-α含量较正常对照组明显增高,同时软骨组织中caspase-3及caspase-8表达与TNF-α含量呈现正相关系。Guo等[14]报道分别运用IL-1β(10ng/mL)及TNF-α(5ng/mL)刺激人关节软骨细胞,可提高内质网(endoplasmic reticulum,ER)未折叠蛋白反应,促进ER应激介导的凋亡途径,导致软骨细胞凋亡,且该反应与ER应激诱导剂引起的效能相当。Lee等[15]报道体外运用TNF-α联合环己酰亚胺诱导大鼠软骨细胞死亡,包括细胞凋亡、自噬性细胞死亡及坏死性凋亡三种形式,环己酰亚胺作为细胞转化抑制剂可以激活软骨细胞,结果表明在两种诱导剂同时作用时,软骨细胞活力明显降低,单独TNF-α或环己酰亚胺均不能导致细胞活力降低,同时可以刺激细胞色素c从线粒体释放到胞质,并通过流式细胞检测凋亡率明显增加,且细胞核固缩、碎裂表现明显,软骨细胞中caspase-3和caspase-7表达增高。

1.4 Fas抗体

Fas也称CD95,属于肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体超家族,是一种与细胞凋亡密切相关的跨膜蛋白分子。相关研究表明,OA关节软骨中Fas表达较正常软骨明显升高,且Fas表达集中在软骨病变区域内,Fas抗体与细胞表面Fas结合后可诱导软骨细胞凋亡,并激活相关凋亡信号通路[16]。Ryu等[17]运用CD95抗体刺激小鼠软骨细胞凋亡呈现浓度依赖性,高浓度(0.5或1mg/mL)CD95抗体方可诱导软骨细胞凋亡,且缺氧诱导因子可加剧CD95抗体诱导软骨细胞凋亡的能力。

1.5 地塞米松

Tu等[18]利用地塞米松(25μg/mL)刺激人软骨细胞凋亡,24h后显示软骨细胞活性及增殖能力降低,流式细胞检查凋亡软骨细胞明显增多,且Fas调节的死亡信号通路是地塞米松诱导软骨细胞凋亡中重要的途径,实时荧光定量核酸扩增及细胞免疫荧光检测显示caspase-3及Fas含量明显升高。

1.6 前列腺素(prostaglandin,PG)E2

PGE2是骨及软骨组织中维持细胞功能的重要调节因素,同时在正常关节软骨新陈代谢及OA疾病的发病机理中发挥重要的作用。相关研究表明,PGE2是关节生长板软骨细胞中DNA合成及硫酸盐渗入最有效的细胞因子,在OA关节滑膜组织中检测PGE2表达明显增高,可诱导软骨细胞凋亡改变[19]。Miwa等[20]报道利用PGE2体外刺激牛科软骨细胞,结果显示PGE2抑制软骨细胞活力,促使细胞DNA碎裂,进一步证实PGE2诱导凋亡机制并不是通过NO途径产生,而是通过激活软骨细胞环腺苷酸,从而提高细胞内的环腺苷酸水平来诱导软骨细胞凋亡。

1.7 双氧水(H2O2)

由于能诱导软骨细胞产生ROS,改变线粒体膜通透性,使细胞色素c从线粒体释放到胞质,H2O2常被用作软骨细胞凋亡的诱导剂。Na等[21]报道运用H2O2(500μM/L)诱导鼠软骨细胞凋亡,出现软骨细胞活力降低,线粒体膜电位下降,软骨细胞蛋白Bcl-xL/Bax比例降低,caspase-3活性增加等软骨细胞凋亡表现。

1.8 重组腺病毒载体(recombinant adenovirus vectors,RAAV)

RAAV是TNF家族中一种Ⅱ型跨膜蛋白,OA关节软骨中RAAV表达与软骨细胞凋亡比例及软骨退变程度相关。Lee等[22]首次报道运用RAAV体外刺激软骨细胞凋亡,检测软骨细胞活力及线粒体膜电位降低,使线粒体中细胞色素c释放,细胞核固缩及DNA碎裂,并激活DNA聚合酶活性,刺激caspase-3和Bax高表达及Bcl-2低表达,证实RAAV体外具有诱导软骨细胞凋亡的作用。

1.9 碱性磷酸钙晶体

碱性磷酸钙晶体由磷酸八钙、磷酸三钙、碳酸磷灰石及羟磷灰石组成。在重度OA关节软骨中发现碱性磷酸钙晶体在基质小囊中沉积,且与OA病情严重程度密切相关,碱性磷酸钙晶体可随着软骨退变或原位合成过程从软骨下骨中释放出来[23]。Ea等[24]报道运用碱性磷酸钙晶体体外诱导牛科软骨细胞凋亡,该过程与IL-1β、TNF-α及NO途径完全独立,需要与软骨细胞接触后形成内吞及溶酶体内晶体降解作用,且膜联蛋白-5过表达可以明显加剧碱性磷酸钙晶体促凋亡效能。

1.1 0 多氯联苯

多氯联苯为持久性有机污染物,广泛分布在室外空气、海水及河道的沉积物中,并在许多不同水平的食物链中被发现,其化学特性及毒性作用与其结构特性密切相关。相关研究表明多氯联苯可刺激关节软骨IL-6及TNF-α分泌,诱导软骨细胞凋亡及关节软骨退变,与OA疾病的发生、发展关系密切[25]。Abella等[26]报道运用多氯联苯体外诱导软骨细胞凋亡,结果显示软骨细胞活力明显降低,caspase-3蛋白表达增高及Bcl-2/Bax蛋白比例降低,通过脂质过氧化作用检测软骨细胞抗氧化能力降低,产生氧化应激反应,引起线粒体DNA损伤。Lee等[27]利用多氯联苯体外刺激兔关节软骨细胞,显示细胞活力随时间及剂量关系呈现不同程度的降低,检测细胞caspase-3表达升高,TUNEL染色及ELISA检测DNA碎裂显示凋亡比例明显增加,多氯联苯通过促进软骨细胞ROS及NO产生,诱导软骨细胞凋亡,加剧关节软骨退变。

1.1 1 晚期糖基化终末产物(advanced glycation end prod-ucts,AGEs)

AGEs是促进关节软骨退变及软骨细胞凋亡的重要递质,可与关节软骨胶原分子直接交联,导致关节僵硬及组织脆性增加,其在关节软骨中的异常表达被视为与年龄相关性最为密切的变化[28]。Yang等[29]报道体外运用AGEs(200μg/mL)诱导兔软骨细胞凋亡,发现AGEs通过上调软骨细胞ROS,促进细胞色素c从线粒体释放到胞质,激活caspase-3活性,降低线粒体膜电位及抑制三磷酸腺苷产生,促进凋亡改变,可用于体外软骨细胞凋亡模型的构建。

1.12阿霉素及衣霉素

阿霉素作为软骨细胞凋亡的诱导剂,主要通过激活caspase的活性,促进DNA碎裂引起,衣霉素则被视为ER激动剂诱导软骨细胞凋亡。Kumagai等[30]报道运用阿霉素体外刺激兔软骨细胞,其最显著的特征是可在数分钟内减少软骨细胞的横截面积,刺激凋亡软骨细胞体积减小,并伴有caspase-3及caspase-7活性增强,诱导软骨细胞凋亡。Lin等[31]运用衣霉素(2μg/mL)诱导鼠软骨细胞凋亡,可降低细胞活力及线粒体膜电位,caspase-3、caspase-9、Bax蛋白及mRNA表达增加,衣霉素通过调节ER诱导软骨细胞凋亡。

2 软骨细胞凋亡介导的信号通路

2.1 胞内磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase,PI3K-Akt)信号通路

Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可以被细胞外因子以PI3K依赖的方式磷酸化或激活。PI3K-Akt是一条经典的抗软骨细胞凋亡通路,当细胞外信号刺激PI3K-Akt发生磷酸化后,可促进软骨细胞中凋亡因子Bcl-2释放,抑制Bax活性,并有利于蛋白聚糖合成及软骨细胞成活,达到抗凋亡效能。因此,PI3K-Akt信号通路可有效地抑制由线粒体途径诱导的软骨细胞凋亡。Wang等[32]报道紫草素通过激活PI3K-Akt信号通路,降低caspase-3活性,抑制细胞色素c释放,达到抗IL-1β诱导的软骨细胞凋亡效果。Huang等[33]报道人参皂苷抗凋亡作用是通过活化PI3K-Akt信号通路,抑制软骨细胞caspase-3释放完成。Zheng等[9]报道通过激活PI3K-Akt信号通路,烟碱可中和由IL-1β诱导的软骨细胞凋亡作用。

2.2 P38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路

P38MAPK属于应力激酶家族成员,易被促炎细胞因子及渗透性改变、营养缺失、机械性负荷增加、低氧张力等环境因素激活。同时激活的P38可使转录因子磷酸化,从而转导信号进入原子核,改变基因表达。NO、IL-1β及TNF-α可诱导软骨细胞中P38MAPK磷酸化,参与调节软骨细胞表型及增殖,促进软骨细胞肥大、钙化、骨架重塑及凋亡改变,刺激软骨细胞MMPs合成及炎性细胞因子产生,介导软骨细胞凋亡信号途径。Sakata等[34]报道通过抑制NO诱导的软骨细胞P38 MAPK磷酸化,下调MMP-3、MMP-13及caspase-3表达,十二碳五烯酸可抑制软骨细胞凋亡。Wei等[16]报道抑制P38 MAPK活化可作为OA潜在的治疗靶点,达到保持关节软骨细胞功能结构,抑制软骨细胞凋亡及促进增殖效能。

2.3 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路

JNK是分子量为54kD、位于细胞质中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,又称为应激活化蛋白激酶(Stress-activated kinases,SAPK),是MAPK家族中重要成员之一。JNK信号通路可被细胞应激反应(如电离辐射、热休克及氧化损伤)、细胞因子(如NO、TNF-α、TGF-β及IL-1β)及生长因子(如表皮生长因子)激活而形成磷酸化JNK,参与细胞分化与增殖,维持细胞形态及骨架构建,并可直接激活胞质内靶蛋白(如Bax及Bim),从而介导由线粒体途径引起的细胞凋亡。Sylvester等[35]研究表明IL-1通过激活JNK信号通路,一方面可上调MMP-13在关节软骨细胞中表达,导致关节退变及软骨细胞凋亡发生,另一方面可活化转录活化因子-2,促进环氧合酶(cyclooxygenase,COX)-2基因的转录,诱导软骨细胞炎症及凋亡。Lee等[15]报道JNK信号通路参与了TNF-α介导的软骨细胞凋亡,通过上调软骨细胞caspase-3及caspase-7活性,使磷酸化JNK表达增高,该过程可被JNK抑制剂逆转。

2.4 核因子(nuclear factor,NF)-κB信号通路

NF-κB是一类广泛存在于机体细胞中的多显性核转录因子,广泛参与调节细胞增殖与分化、细胞周期及细胞凋亡等过程,是Rel基因家族重要成员。在静息状态下,无活性的NF-κB以潜在状态分布于细胞浆中,它与抑制因子结合成为异源多聚体P50-P60-IκBα(IκBβ)。当细胞受到细胞因子等因素刺激时,IκBα从三聚体中游离出来,P50亚基上的易位信号及P56亚基上DNA结合位点被充分暴露,使异二聚物显示出NF-κB活性,并易位入细胞核,激活Bcl-2及p53等靶基因,参与构成细胞凋亡机制[36]。Qin等[37]报道IL-1β体外诱导的软骨细胞凋亡模型中,NF-κB被激活后可刺激软骨细胞中TNF-α、iNOS及COX-2产生,参与调节软骨细胞炎症及凋亡过程。Lee等[27]报道多氯联苯可通过刺激软骨细胞ROS及NO产生,激活NF-κB过程,从而诱导软骨细胞凋亡。

2.5 酪氨酸激酶/信号转导子和转录激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信号通路

与众多细胞因子及生长因子信号转导有关的JAK/STAT通路,密切参与了细胞炎症、氧化应激、细胞增殖、分化及凋亡等病理过程。JAK/STAT信号转导过程概括为:细胞膜上的细胞因子受体在细胞膜上与相应配体结合后,诱导受体二聚化并调节与之偶联的JAKs,在胞质内的JAKs及其受体酪氨酸残基上依次发生交互磷酸化,并与周围氨基酸序列结合形成“停泊位点”,STATs通过SH2结构域将STAT蛋白补位到该特异位点,从而激活STAT。活化后的STAT与受体解离,形成同源二聚体或异源二聚体转位入细胞核,与DNA上特定靶序列结合,调控基因的转录及诱导表达[38]。Greene等[39]报道IL-1β联合抑瘤素作用于人关节软骨细胞,其诱导凋亡途径是通过激活JAK/STAT信号通路完成,并刺激软骨细胞MMP-13高表达。Lim等[40]利用IL-1β通过激活JAK/STAT信号通路诱导软骨细胞凋亡及MMP-13表达增高,该过程可被类黄酮药物作用逆转。

血细胞信号篇9

1材料与方法

1.1动物模型

成年健康雄性Wistar大鼠90只,体重220~ 250 g,无特定病原体级,青岛市药品检验所实验动物中心提供[SCXK(鲁)20100010]。随机选择15只为对照组,其余75只应用线栓法[8]经左侧颈外 - 颈内动脉插线建立大脑中动脉阻塞模型。动物术前禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉动物,仰卧位固定、无菌操作。将术后2 h死亡的15只大鼠剔除,改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score,m NSS)7~12分为模型成功的标志[9]。将成功的60只动物模型随机分为模型组、治疗组、脂多糖组及U0126组,每组15只。对照组动物除不插线进入颅内外,其余操作同实验组。

1.2干预措施

1.2.1胡黄连苷组将胡黄连苷Ⅱ(天津奎青有限公司)用生理盐水配制成1%溶液,在缺血后2 h腹腔注射20 mg/kg。

1.2.2脂多糖将炎症诱导剂脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(北京索莱宝科技有限公司) 用生理盐水溶液配制成1%溶液,在缺血后2 h腹腔注射LPS 20 mg/kg和胡黄连苷Ⅱ 20 mg/kg[10,11,12]。

1.2.3U0126组将ERK1/2通路抑制剂U0126Et OH(美国Selleck公司)用10%二甲基亚砜配制成1%溶液,在缺血后2h腹腔注射U0126-Et OH 20mg/kg和胡黄连苷Ⅱ 20 mg/kg[10,11,12]。

1.2.4模型组和对照组同步腹腔注射等体积的生理盐水。

1.3评价指标

1.3.1行为测试各组治疗前(造模后2 h)和治疗后(给药后24 h)应用m NSS评分评定动物神经行为功能,最高18分,评分越高说明动物神经行为功能损伤越重,反之则较轻微。

1.3.2原位末端标记法 (terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick end labeling,TUNEL) 染色治疗后每组随机选取5只动物,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,经心脏灌注生理盐水200 ml,完整取脑, 切取缺血部位脑组织100 mg提取总蛋白。其余脑组织置4%多聚甲醛后固定2 h,蒸馏水浸泡4 h。常规脱水、透明、包埋,连续冠状切片5μm,贴片。石蜡切片常规脱蜡水化 , 按TUNEL凋亡检测试剂盒 (KGA7025-50assays,北京凯基生物公司)说明书进行操作,3、3'- 二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)显色,苏木素复染。光镜下胞核有棕色颗粒者为凋亡细胞。阴性对照样本不加末端脱氧核苷转移酶,不出现阳性着色。400倍显微镜下,每张切片随机观察皮质区4个不重叠视野,细胞计数,取其均值。以凋亡细胞指数(凋亡细胞指数 = 凋亡细胞数 / 细胞总数)表示损伤程度。

1.3.3 Western blot检测取缺血部位脑组织100 mg, 加细胞裂解液(上海碧云天生物技术研究所)1 ml, 4℃冰浴中研磨,置于4℃摇床30~60 min充分裂解, 4℃、12 000 r/min离心15 min,去沉淀组织留上清液, 二辛可宁酸(bicin chonininc acid,BCA)法测定蛋白浓度。取蛋白样品20μg,应用烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,半干法转膜,含吐温 -20℃ 的三羟甲基氨基甲烷氯化钠缓冲液(tris-buffered saline containing tween-20,TBST)室温封闭1 h,兔抗鼠磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(phosphorylation extracellular signal-regulated kinase,p ERK 1/2)单克隆抗体(1∶2 000)一抗4℃孵育过夜,TBST洗膜10 min×3次,用HRP标记的羊抗兔二抗(1︰ 10 000)(美国Abcam公司)室温孵育1 h,TBST洗膜10 min×3次。Vilber Fusion FX7化学发光多色荧光成像系统(法国Vilber公司)曝光显影,Quantity one软件分析各条带灰度值。计算目的蛋白相对值, 目的蛋白相对值 =p ERK1/2灰度值 /ERK1/2灰度值。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,多组间比较用析因分析及最小显著差数法,以P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1神经行为功能

对照组动物活动正常,造模动物表现不同程度的神经行为功能障碍。治疗组和U0126组的m NSS评分较治疗前显著下降(t =5.668和4.081,P <0.05)。模型组和LPS组治疗前后的m NSS评分比较,差异无统计学意义(t =1.819和0.276,P >0.05)。治疗后,治疗组m NSS评分较模型组和LPS组显著下降(t =5.143和6.276,P <0.01);U0126组m NSS评分较模型组和LPS组亦显著下降(t =2.368和2.812,P <0.05)。模型组与LPS组,治疗组与U0126组比较,差异无统计学意义(t =2.004和1.143,P >0.05)。

2.2细胞凋亡

TUNEL染色显示,各组大鼠神经细胞有不同程度的凋亡,胡黄连苷组和U0126组表达显著低于模型组(t =3.124和5.231,P >0.05)。对照组大鼠皮质区神经细胞凋亡数量较少;模型组大鼠皮质区凋亡细胞明显增多。胡黄连苷组大鼠皮质区出现少量凋亡细胞,各时间比较差异无统计学意义(t =1.043、 0.932和1.817,P >0.05)。LPS组大鼠凋亡细胞比治疗前略有下降(t =2.967,P <0.01),但凋亡细胞仍然较多。U0126组大鼠皮质区出现少量凋亡细胞,其程度最接近对照组,两者比较差异无统计学意义(t = 0.936,P >0.05)。见图1。

2.3Westernblot检测

胡黄连苷组和U0126组神经细胞p ERK1/2蛋白表达显著低于模型组(P =3.025和2.436,P <0.05)。对照组p ERK1/2蛋白表达较治疗前略高(t =2.012, P >0.05)。治疗后,模型组p ERK1/2蛋白表达显著高于其他各组(t =3.162、5.103、4.925和6.124,P <0.01)。胡黄连苷组p ERK1/2较治疗前略有提高(t =1.893, P >0.05),但与模型组比较显著降低(t =4.171,P < 0.01)。治疗后,LPS组p ERK1/2表达仍高于胡黄连苷组和U0126组(t =5.362和4.324,P <0.01);U0126组p ERK1/2水平较低。模型组与LPS组各时间p ERK1/2表达较高,模型组显著高于其他组(t =3.76、 3.893、4.176和6.132,P <0.01);LPS组p ERK1/2表达也显著高于其他组(t =4.126、3.675、4.539和7.316, P <0.01)。见图2。

3讨论

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