抑瘤作用

抑瘤作用（共6篇）

抑瘤作用 篇1

1 实验材料

动物:昆明种小鼠40只, 5～6周龄, 体重18～22g, 雌雄各半, 由黑龙江省肿瘤研究所提供, 合格证号:050621。瘤株:S180肉瘤瘤株及H22肝癌瘤株, 由黑龙江省肿瘤研究所提供。药品及试剂:硇砂提取液复方制剂 (由硇砂、瑞香狼毒、甘草等组成) 由鑫蟾中医药研究所提供, 含生药12g/ml, 4℃冰箱保存。5-Fu由上海旭东海普药业有限公司生产, 按25mg/kg给药。

2 实验方法

选择接种后7天生长良好的荷瘤小鼠颈椎脱臼处死, 固定板上, 消毒皮肤, 行无菌条件下剥取瘤块, 选取生长良好无坏死及液化的肿瘤组织, 剔除纤维包膜及坏死组织, 在无菌平皿中剪碎, 置组织研磨器中加入少量4℃生理盐水轻轻研磨成匀浆, 过滤制成瘤细胞悬液, 用生理盐水调细胞浓度至1×107, 台盼蓝染色, 光镜下瘤细胞计数, 活瘤细胞>90%。取小鼠80只, 常规消毒后, 接种肿瘤稀释液, 0.2ml/只于小鼠右腋下, 并于瘤生长24小时后随机分为8组, 每组10只:①模型组 (S180肉瘤及H22各1组) , 灌胃生理盐水0.2ml/10g·d-1;②5-Fu组 (S180肉瘤及H22各1组) , 腹腔注射0.1ml/10g·d-1, 并灌胃生理盐水0.2ml/10g·d-1;③每种瘤株各分硇砂抑瘤提取液复方高剂量组 (900mg/kg) 、低剂量组 (400mg/kg) , 各灌胃给药0.2ml/10g·d-1, 1次/d, 连续10天。停药24小时后, 脱臼处死, 取瘤称重, 计算抑瘤率。摘取胸腺、脾脏, 计算胸腺指数、脾脏指数, 统计学处理采用t检验。实验期间各组均采取自由进食水。

3 结果

3.1 各组小鼠一般情况

治疗后摄食、饮水均无明显变化, 各组小鼠均未出现意外死亡。

3.2 各组抑瘤率及平均瘤重的比较

见表1。

与模型组比较△P<0.05, △△P<0.01;与5-Fu组比较*P<0.05 (下同)

3.3 对小鼠免疫器官重量的影响

见表2。

4 结论

实验结果显示该药有较显著的抑瘤作用, 对小鼠的免疫器官未出现有显著意义的影响, 抑瘤作用随剂量的增加抑瘤作用呈增强趋势。但由于人肿瘤与动物肿瘤株之间的差异, 使单一的小鼠体内实验难以确切阐明药物的抗癌效果与机理, 其抗肿瘤作用还需进一步验证。

抑瘤作用 篇2

供血鹅:武汉市商品白鹅 (品种为太湖鹅) 10只, 26周龄, 体重3～5kg, 用5～10ml一次性消毒注射器抽取鹅翅翼内静脉新鲜血。实验时用细胞培养液制备成5种浓度梯度的鹅血稀释液, 浓度分别为20%、10%、5%、2.5%、1.25%。瘤株:肝癌细胞株MHCC97由我院中心实验室提供。主要试剂及仪器:甲基噻基四唑MTT (美国Sigma) 、二甲基亚砜DMSO (美国Sigma) 、RPMI1640细胞培养液 (Gibco) 、胎牛血清 (美国Sigma) 、0.25%胰酶、分析纯。Napco5410型CO2培养箱 (美国BIO-RAD公司) 、MicrolateReader 450酶标仪、96孔细胞培养板等。

2实验方法

2.1 分组

设药物组 (含肿瘤细胞培养液和鹅血稀释液) ;阴性对照组 (含肿瘤细胞培养液) ;调零组 (含RPMI1640细胞培养液) 。

2.2 鹅血对肝癌细胞株的抑瘤作用

MTT显色法[1]。取呈对数生长的肿瘤细胞, 0.25%胰酶消化, 计数细胞用RPMI1640细胞培养液调整为肿瘤细胞1×105个/ml的肿瘤细胞培养液。取96孔细胞培养板铺板, 药物实验组 (20孔) 、阴性对照组 (4孔) 各加肿瘤细胞培养液180μl;调零孔则加RPMI1640细胞培养液180μl。放入CO2培养箱培养24小时后取出, 药物实验组的20孔分别加20%、10%、5%、2.5%、1.25%浓度的鹅血稀释液各20μl, 每浓度重复4孔;阴性对照组各孔加生理盐水20μl;调零孔加生理盐水20μl。培养72小时后各加MTT 20μl, 然后培养4小时, 翻板倒掉培养液, 加入分析纯DMSO180μl, 震荡器震荡10分钟。以调零孔调零, 酶标仪上用492nm波长比色, 测OD值, 同法检测肿瘤细胞, 重复实验3次。抑制率公式:抑制率=[1-药物OD均值/阴性组OD均值]×100%。

2.3 统计学方法

应用SPSS13.0软件对数据进行方差分析。

3结果

见表1。

与阴性对照组比较*P<0.05, **P<0.01

4讨论

祖国医学有关文献、典籍中均有鹅血药用性能的记载, 民间也有生食鹅血治疗肺、胃、淋巴等恶性肿瘤的经验。中医认为鹅血性平、味咸、无毒, 入心、肝、胃经;有解毒通膈、软坚化瘀、益气补虚、暖胃生津和治虚羸消渴之功效。其对升高病人白细胞、改善症状及延长生存期有一定的疗效。本文采用MTT法进行了鹅血对肝癌细胞株抑瘤作用的实验研究。结果表明鹅血对肝癌瘤株有较高的抑制作用, 抑制率均随浓度升高而增加, 呈明显量效关系。由此提示鹅血具有抗肝肿瘤作用, 其具体机制有待进一步研究。

参考文献

抑瘤作用 篇3

1材料和方法

1.1 主要试剂和培养液

1.1.1 完全培养液 (CM)

分离制备的A-NK和NA-NK细胞均采用RPMI-1640完全培养液培养。

1.1.2 重组IL-2

南京军事医学研究所研制10万IU/2 ml 所用25 cm2和75 cm2培养瓶和培养板均为美国Costar产品。

1.2 肿瘤细胞

恶性纤维肉瘤S180 (腹水型) , 由本实验室反复传代而建立, 皮下接种于昆明纯系小白鼠;

1.3 实验动物

昆明纯系小白鼠, 本研究所动物室传代和繁殖, 6～8周龄雌性, 平均体重16～18 g;严格按照国际标准进行饲养和实验操作。

1.4 小鼠脾细胞分离和制备A-NK和NA-NK细胞

按照Hegenaars 98年的方法, 无菌取鼠脾, 过200目钢网, 研磨成单细胞悬液, 将所得单细胞悬液加入尼龙毛柱中, 在37℃ 5%C02培养箱中孵育45 min, 以去除B细胞和单核巨噬细胞。用预温37℃的完全培养液轻轻冲洗尼龙毛柱, 收集未粘附尼龙毛的细胞, 用完全培养液调成2×106/ml, 置于塑料培养瓶中水平培养24 h后, 移去含未粘附塑料表面的细胞悬液 (此即NA-NK细胞) , 收集粘附于塑料表面的细胞 (即A-NK细胞) , 二者分别重悬于含50%自体条件培养基的完全培养液中, 继续培养扩增。

1.5 细胞体外扩增情况的观察

将A-NK或NA-NK细胞以1×106/ml的深度加入6孔板, 2 ml/孔, 设三个复孔, 定期换液, 每隔三天计数一次, 取三孔均值。

以0.4%台盼兰 (Trypan Blue) 活细胞计数法计数细胞数量, 以1:l比例将台盼兰与单个细胞悬液混和, 室温中放置2 min, 加入到细胞计数板中, 镜下观察细胞活力和进行细胞计数, 活细胞不着色, 死细胞染成兰色。

公式如下:

活细胞数 (个/ml) =计数的全部活细胞数×104×2×1/4×稀释倍数

1.6 肿瘤细胞动物接种

荷瘤小鼠待肿瘤长至1～3 cm (14 d左右) , 断颈处死。无菌条件下取出皮下肿瘤, 生理盐水冲洗后, 将肿瘤组织剪碎研磨, 过钢网滤过。离心 (1000rpm, 5 min) 去上清, 生理盐水稀释为单细胞悬液, 光镜下计数, 稀释至1×106个/ml。用l ml注射器吸取肿瘤细胞混悬液0.2 ml (2×105个细胞) , 注射至每只小鼠背部皮下, 待肿瘤可以触及, 进入实验。

1.7 A-NK体内抗肿瘤实验

昆明小白鼠皮下接种Sl80恶性纤维肉瘤细胞1×105/只, 荷瘤3 d后分别给每个小鼠局部注射IL-2 1000pIU/只/天, 荷瘤5 d后将小白鼠随机分为四组, 每组10只, I组为空白对照, Ⅱ组为A-NK/IL-2尾静脉注射 (全身治疗) , Ⅲ组为NA-NK/IL-2局部注射, IV组为A-NK/IL-2局部注射组。治疗组效应细胞数为5×106/只/次。

1.8 统计学方法

依据数据性质的不同, 分别采用方差分析和t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 A-NK与NA-NK体外扩增情况 如表1所示。A-NK在第10天达到增殖高峰, NA-NK于第7天达到增殖高峰。A-NK细胞增加16.08倍, NA-NK细胞增加3.36倍。在整个培养过程中, A-NK扩增指数均高于NA-NK。

注:每个数值取三孔均值, 细胞数目以 (×106/ml) 表示

2.2 局部注射效应细胞的抗肿瘤作用和对照组相比, 局部注射组 (Ⅲ组和IV组) 有明显的抑制肿瘤生长的作用 (P<0.05) , 尾静脉注射组 (Ⅱ组) 治疗效果不明显 (P>0.05) , 其中A-NK比NA-NK的抑瘤效果更明显。

注:每组小鼠n=10;对照组为肿瘤局部注射同量的生理盐水注射液;肿瘤大小以$\overline{x}\pm s$表示;第21天的测量结果, *NA-NK局部注射组与对照组相比, P<0.05;$A-NK局部注射组与NA-NK局部注射组相比, P<0.05

3讨论

本次实验证明A-NK体外扩增指数高于NA-NK。A-NK细胞具有较高的体外增殖能力和细胞毒活性, 并且能够浸润到实体瘤内部杀伤肿瘤细胞, 是非常有潜力的理想的效应细胞。白细胞介素2 (IL-2) 是一种由133个氨基酸组成的糖蛋白, 通过T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞表面的受体而起作用。IL-2可增加杀伤性淋巴细胞毒性, 诱导淋巴因子激活的杀伤细胞的生成, 促进B细胞增生和分泌免疫球蛋白, 诱导其他细胞因子如白细胞介素1、白细胞介素6等的分泌[1]。本实验说明:局部应用A-NK/IL-2细胞比NA-NK/IL-2细胞有更强的抑瘤作用, A-NK局部注射是行之有效的给药途径, 并可减少IL-2全身应用产生的巨大副作用。以LAK/IL-2为基础的生物疗法对实体瘤的治疗效果很大程度上取决于LAK细胞在肿瘤部位的聚集能力。A-NK也不例外。A-NK细胞是外周血NK细胞的一小部分 (4%～30%) , 由于具有高水平的增殖能力和细胞毒性以及独特的功能特点, 现在已经日益受到研究人员的重视, 如何获得足量供常规治疗用的高细胞毒活性的免疫效应细胞是过继免疫疗法需要解决的重要问题之一。

参考文献

抑瘤作用 篇4

1.1 动物及瘤株

昆明种小鼠:雌雄兼备, 体重18～22g, 由浙江省医学科学院提供[合格证号:SYKX (浙) 2003-0001]。S180肉瘤细胞株;由浙江省医学科学院提供, 用昆明种小鼠传代保种。

1.2 药物与试剂

华蟾素片:安徽金蟾生化股份有限公司提供, 批号:081008;甲酯化叶绿素 (CPD4) 。光敏剂:浙江中医药大学肿瘤研究所提供。

1.3 主要仪器

细胞计数板:上海求精生化试剂有限公司;光动力肿瘤激光治疗机:由兵总南京旭飞光电有限公司提供 (型号:He-Ne 2000G型) 。

2实验方法

2.1 小鼠S180肉瘤模型的建立

在无菌条件下, 取接种10天生长良好的S180瘤源小鼠, 脱颈椎处死, 取腹水置无菌容器内, 加生理盐水稀释成1:3的瘤细胞混悬液, 置冰盒上保存。移液枪取混悬液20μl, 加生理盐水稀释, 加0.2%台盼兰染色后, 置于细胞计数板上, 放于低倍显微镜下观察, 死亡肿瘤细胞被台盼蓝染成蓝色, 而活细胞不染色, 计算活细胞数, 根据公式:细胞含量= (4大方格内的活细胞数/4) ×104=细胞数/ml, 调成瘤细胞浓度为1×107个瘤细胞/ml, 整个操作在冰盒上进行。取健康昆明小鼠36只, 在无菌条件下, 均皮下接种生长良好的S180细胞悬液0.2ml (约含瘤细胞数2×106个) 造成局灶性肿瘤模型。

2.2 动物分组及疗法

小鼠接种次日, 随机分成以下4组:模型组、华蟾素组、PDT组、华蟾素+PDT组, 每组9只。 (1) 模型组:从瘤体接种次日起, 每日以生理盐水灌胃。 (2) 华蟾素组、华蟾素+PDT组:按小鼠体重0.45mg/g·d-1华蟾素灌胃给药, 每天1次, 连续给药5天后停药。 (3) PDT组和华蟾素+PDT组:待小鼠皮下肿瘤结节直径长至4～6mm时 (约为瘤体接种后第5天) , 给予光动力疗法 (PDT) 治疗。方法:将5g脂肪酸融化, 冷却到30～37℃, 在避光状态下, 和光敏剂按70:1的比例混合, 光敏剂约72mg, 搅拌均匀, 吸入1ml针筒内。按小鼠体重0.005ml/g (其中CPD4含量为0.07mg/g) 肛门直肠给药。分别在给药后6和24小时后进行肿瘤部位激光垂直照射, 激光光斑直径1cm, 功率密度为300～400mw/cm2, 15分钟/次。第1次照光后48小时颈椎脱臼处死, 分离肿瘤组织, 称重, 计算抑瘤率 (%) = (1-阳性对照组瘤重/阴性对照组瘤重) ×100%。

2.3 统计学方法

采用SPSS10.0统计软件, 进行单因素方差分析, 各组间采用SNK (Student-Newman-Keuls) 检验。

3实验结果 见表1。

与模型组比较*P<0.05;与华蟾素组比较△P<0.05

4讨论

华蟾素是我国传统中药材中华大蟾蜍全皮提取加工制成的水溶性制剂, 其主要成分含吲哚生物碱、还原糖、氨基酸以及蟾蜍毒素、蟾蜍色胺等, 其具有抗肿瘤、抗病毒、强心、麻醉、止痛、促进骨髓增生、增强机体免疫力及放射增敏的作用[1,2], 蟾皮水溶性成分对动物移植性肿瘤有较强的抑制作用。华蟾素抗肿瘤具有多途径, 多靶点的特点, 加强联合用药, 更能起到增效减毒, 充分发挥传统中药在抗肿瘤方面的独特作用[3,4]。

PDT是治疗肿瘤的一项新技术, 由于体内肿瘤组织对光敏剂的吸收率高于正常组织, 在特定波长的激光束照射下会发生光动力反应, 杀死肿瘤细胞。与肿瘤常规治疗方法手术、化疗和放疗相比, PDT治疗选择性较强。近年来, 对PDT联合抗肿瘤药物进行了一定的研究, 张晓明[5]等研究发现, 光动力疗法联合顺铂治疗大鼠C6脑胶质瘤后, 血瘤屏障中毛细血管内皮细胞上的P糖蛋白 (P-gp) 阳性表达率降低, 促进药物通过血瘤屏障, 为临床治疗脑胶质瘤提供新的途径和方法。此外, 光激活的金丝桃素可能通过抑制血管细胞黏附因子-1 (VCAM-1) 和基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) , 降低肿瘤突破基质屏障的能力, 抑制肿瘤新生血管形成, 从而制约胶质瘤生长和侵袭[6]。临床研究也发现PDT加化疗药物 (复方喃氟啶加丝裂霉素) 治疗进展期贲门癌病人, 疗效明显高于单纯PDT组或单纯化疗组[7]。

本实验研究以小鼠S180细胞瘤株作为模型, 其是国内广泛用于基础研究和药物筛选中动物肿瘤造模的一个细胞株, 具有较好的代表性, 是抗肿瘤药物初步研究中应用较多的细胞模型。实验表明华蟾素联合PDT治疗能明显抑制肿瘤生长, 在抑制肿瘤生长方面与华蟾素具有协同作用, 但具体作用机制及该疗法对小鼠肝肾功能的影响有待进一步研究。本实验为今后华蟾素结合PDT治疗肿瘤的临床应用提供了理论基础。

参考文献

[1]刘云霞, 匡唐洪, 蒋沈君.华蟾素注射液改善晚期癌症患者生活质量的临床观察.中国中医药科技, 2005, 12 (1) :45.

[2]韩鸿彬, 陈嘉勇.华蟾素抗肿瘤作用及其机制的研究进展.中国肿瘤生物治疗杂志, 2005, 12 (2) :160.

[3]左小东, 崔永安, 秦叙逵, 等.华蟾素抗肿瘤作用的临床研究进展.临床肿瘤学杂志, 2003, 8 (3) :232.

[4]韩鸿彬, 陈嘉勇.华蟾素抗肿瘤作用及其机制的研究进展.中国肿瘤生物治疗杂志, 2005, 12 (2) :160.

[5]张晓明, 孙捷, 胡韶山.光动力疗法联合顺铂治疗脑胶质瘤对血瘤屏障毛细血管内皮P-糖蛋白表达的影响.中国激光医学杂志, 2010, 19 (2) :69.

[6]胡韶山, 戴绍春, 詹奇, 等.金丝桃素光动力效应对大鼠C6胶质瘤抑制作用及其对血管细胞黏附因子-1和基质金属蛋白酶-9的影响.中国激光医学杂志, 2010, 19 (1) :1.

抑瘤作用 篇5

1 仪器与试药

UV-1700型分光光度计(日本岛津);BP211D电子天平(德国赛多司);烘箱;水浴锅;真空泵;超净工作台(CJ-1);自动酶标仪(CliniBio)EC,倒置显微镜(OLYPUS)Japan。鹅不食草(采于吉林长白县,经长春中医药大学邓明鲁教授鉴定为菊科植物鹅不食草);芹菜素对照品(含量测定用,中国药品生物制品鉴定所);昆明种小白鼠,购自长春生物制品研究所;小鼠S180肉瘤由中国医学科学院药物研究所引进;其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1 鹅不食草总黄酮的提取与精制

2.1.1 正交实验优化总黄酮提取条件

称取鹅不食草药材500 g,采用乙醇回流提取法提取总黄酮,为了寻求醇提的最佳工艺条件,采用4因素3水平依正交实验表L9(34)进行正交实验。考察因素为:提取溶剂、提取次数、提取时间以及溶剂用量等四因素。因素水平表见表1。

2.1.2 鹅不食草总黄酮的分离纯化

称取500 g鹅不食草按正交实验确定的最佳工艺提取,减压回收乙醇,水浴锅(60℃)上浓缩干燥,干品加蒸馏水溶解上DM-301大孔树脂,收集80%乙醇洗脱部分,减压回收乙醇,水浴锅(60℃)上浓缩干燥,干品加蒸馏水溶解,石油醚(60℃～90℃)回流萃取3次,弃去石油醚层。水层加氯仿回流提取3次,合并3次提取液合并3次提取液,减压回收氯仿,蒸干。干品加无水乙醇溶解,将无水乙醇溶液加于处理好的聚酰胺中,蒸干无水乙醇,干品加样于聚酰胺柱上,收集80%乙醇洗脱液,60℃水浴蒸干,干品即为鹅不食草总黄酮精制品。

2.2 鹅不食草总黄酮的含量测定[5]

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取芹菜素对照品10.31 mg,置50 ml的容量瓶中,加80%甲醇溶解并定容至刻度,备用。

2.2.2 样品溶液的制备

精密称取鹅不食草正交实验所得样品与总黄酮精制品各20 mg,置100 ml容量瓶中,加80%甲醇80 ml,密塞,超声20 min,取出,放冷后用80%甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,精密吸取续滤液0.1 ml置10 ml量瓶中用80%的甲醇定容至刻度,摇匀,作为样品溶液。

2.2.3 测定波长的选择

对照品溶液和供试品溶液在200～400nm进行扫描,发现均在270 nm处有最大吸收峰,故选择测定波长为270 nm。

2.2.4 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml,置10 ml容量瓶中,加80%甲醇稀释至刻度,摇匀,以80%甲醇为空白对照,于272nm测定吸光度,以芹菜素溶液浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:A=75.681C-0.0758,r=0.9995(n=5)。结果表明芹菜素在2.1～10.5 μg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.5 样品含量测定

取样品溶液,在270 nm处测定吸光度,将吸光度带入标准曲线,线性回归法计算鹅不食草总黄酮含量。

2.3 鹅不食草总黄酮的抑瘤作用实验

取荷瘤传代鼠脱颈椎处死,固定于板上。用酒精消毒动物皮肤,切开皮肤,选择肿瘤生长良好、无坏死或液化的瘤组织,加入无菌氯化钠溶液,用组织匀浆器制成含3000万/ml左右的细胞悬液,于小鼠腋窝皮下接种0.2 ml/只,接种部位皮肤先用碘酊及酒精消毒。每个瘤株,每次试验接种36只小鼠,接种后次日随机分组,每组12只。试验组:按2.2项下制备鹅不食草总黄酮精制品,按小鼠体重计算每千克体质量给药200 mg;试验对照组:氯化钠溶液;阳性药组:环磷酰胺,按小鼠体重计算每千克体质量给药20 mg。小鼠灌胃给药,1次/d,给药15 d后处死,称体重,摘瘤称重,计算抑瘤率,公式如下:

瘤重抑制率$=(1-\frac{\text{给}\text{药}\text{组}\text{平}\text{均}\text{瘤}\text{重}(\text{Τ})}{\text{对}\text{照}\text{组}\text{平}\text{均}\text{瘤}\text{重}(\text{C})})\times 100\%$

3 结果

3.1 乙醇回流提取法正交实验结果

实验结果见表2和表3。从直观分析可知,以总黄酮量为指标进行分析时,因素A、B对结果均有影响,因素C差异有统计学意义,最终确定以总黄酮量为指标进行测定时,鹅不食草总黄酮的最佳提取工艺为A2B1C2D1,即:70%乙醇提取2次,每次2 h,溶剂用量为8倍量。

3.2 鹅不食草总黄酮精制品的含量

对鹅不食草总黄酮精制品进行比色法检测,实验结果表明,鹅不食草总黄酮精制品含量为76.2%。

3.3 鹅不食草总黄酮的抑瘤效果

鹅不食草总黄酮精制品对S180实体瘤抑瘤作用进行试验,实验结果见表4。

4 讨论

采用正交实验法对鹅不食草总黄酮的乙醇提取工艺进行了优选,文献记载[2]鹅不食草总黄酮有效部位中含有一定量的芹菜素,故作者选择了以芹菜素为标准物测定总黄酮。并以总黄酮含量为指标对醇提工艺进行了优化,结果表明其有效部位的最佳提取工艺为:70%乙醇提取2次,2 h/次,溶剂量为8倍量。按此结果提取鹅不食草总黄酮的提取效果最好,且该工艺具有节省能源,成本低,简便易行等特点。

鹅不食草总黄酮粗提物经过大孔树脂、有机溶剂萃取、聚酰胺色谱等方法处理后,总黄酮含量明显提高,达到75%以上,使总黄酮有效部位的含量达到可以考察其药理活性的要求(一般要求有效部位含量达到50%以上方可探讨其药理活性),说明此精制工艺合理可行。

首次定量测定了鹅不食草总黄酮对S180实体瘤抑瘤活性,实验结果证实其对S180实体瘤抑瘤的抑制作用较为明显。此结果为该植物的开发、利用提供了科学依据和物质基础。

参考文献

[1]刘宇.鹅不食草的化学成分及生物活性研究进展.湖北中医杂志,2005,27(5):52-53·

[2]Wu Jin-Bin,Chun Yui-To,Ebizuka Yutaka,et al.Biologically Ac-tive Constituents of Centipeda minima:Sesquiterpenes of Potential Anti-allergy Activity.Chem Pharm Bull,1991,39(12):3272-3275·

[3]Yu H.W.,Wright C.W.,Cai Y,et al.Antiprotozoal Activities of Centipeda minima.Phytochemistry Research,1994,8:436-438·

[4]Ferdinand Bohlmann,Chen Zhongliang.New Guaianolides From Centipeda minima.KeXue TongBao,1984,29(7):900-903·

抑瘤作用 篇6

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物

人参须超微粉水提液由本课题组经多次预实验后,确定提取方法如下:取人参须,粉碎,用贝利微粉机进行微粉化,加15倍20℃~25℃蒸馏水浸泡30min,过滤,保留滤液(滤液1);滤渣再加15倍20℃~25℃蒸馏水浸泡30min,过滤,保留滤液(滤液2);滤渣加10倍蒸馏水,用盐酸调p H到1;加热反应2h,放冷,加氢氧化钠调p H到7;过滤,得滤液(滤液3)。

合并滤液1、2和3,浓缩至100%(相当于1g生药/m L)作为实验用药。在做实验的时候,用生理盐水稀释至所需的浓度进行实验。

1.1.2 动物及瘤株

清洁级昆明种小鼠18~22g,雌雄各半,由广东医学院实验动物中心提供;小鼠S180瘤株、艾氏腹水癌由中山医科大学肿瘤研究所提供,本课题组传代培养。

1.1.3 试剂

5-FU注射液,由上海旭东海普药业有限公司生产(批号:060706);氯化钠注射液,由石家庄四药有限公司生产(批号:060605402);FA2104S电子天平,由上海精科天平厂生产。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤细胞悬浮液的制备与接种

按文献[6]的方法进行,在无菌条件下抽取第7天生长良好的S180肿瘤腹水,用台盼兰染色计数,采用肿瘤细胞数>95%的移植液,并用无菌生理盐水稀释成1×107个/m L浓度的肿瘤细胞悬浮液,然后无菌接种(0.2m L/只)于小鼠右腋下,接种后随机分成生理盐水组、环磷酰胺组(50mg/kg)、人参须超微粉水提液组GFP2(2g/kg)、人参须超微粉水提液组GFP1(1g/kg)、人参须超微粉水提液组GFP0.5(0.5g/kg)共5组,每组小鼠分别按0.2m L/10g体重灌胃给药,连续给药10d,第12天处死,称体重,解剖取肉瘤、肝脏、脾脏和胸腺,用FA2104S电子天平称重,计算每组平均瘤重和肿瘤生长抑制率[2,3]。计算肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数。脏器指数=脏器重量/体重。

1.2.2 人参须超微粉提取成分对荷艾氏腹水癌小鼠生命延长的影响

小鼠移植瘤接种方法:选择腹腔接种艾氏腹水癌细胞后8d的小鼠,抽取含瘤腹水,用生理盐水配制成1.5×107/m L瘤液,在无菌条件下于小鼠腹腔接种0.2m L瘤细胞悬液液,瘤细胞悬液做细菌培养。实验第1天,检查瘤细胞培养情况,未见污染,动物随机分成7组。每日腹腔注射给药1次,共10d。给药结束后停药,每日观察记录小鼠一般药理反应及死亡情况,对未见瘤株生长的动物给予剔除。根据下式计算生命延长率:

生命延长率=(用药组生存时间-对照组生存时间)/对照组生存时间×100%

1.2.3 人参须超微粉提取成分的LD50测定

参照药理试验方法学[7]分为预试验和正式试验。预试验找到大致剂量范围后,进行正式试验。正式实验将小鼠随机分成6组,每组10只,雌雄各5只。药物浓度按等比递增,一次性经口给药,给药前禁食6h,给药后立即观察动物反应情况。在24h内多次观察,以后每天观察1次以上,连续观察14d。记录动物毒性反应情况和死亡动物分布,死亡动物及时进行尸检,记录病情变化。具体指标参照药理试验方法学要求,结果用改良Karber方法计算LD50值。

1.3 统计学处理

实验结果用(±s)表示,采用SPSS11.0软件进行方差检验。

2 结果

2.1 人参须超微粉水提液对荷瘤小鼠的抑瘤作用

(±s)

注:与NS组比较,*P<0.05,**P<0.01。

从表1结果可见,环磷酰胺组(50mg/kg)、人参须超微粉水提液组(2g/kg)、人参须超微粉水提液组(1g/kg)、人参须超微粉水提液组(0.5g/kg)均对S180实体瘤小鼠有显著的抑瘤作用,抑瘤率分别为44.4%、36.1%、43.7%、39.4%。

2.2 人参须超微粉水提液对荷艾氏腹水癌小鼠生命延长作用

(±s,n=10)

注:与NS组比较,*P<0.05,**P<0.01。

表2的结果表明,人参须超微粉水提液对荷艾氏腹水瘤的小鼠生命有延长作用,3个剂量组的人参须超微粉水提液对荷艾氏腹水瘤的小鼠生命率分别为28.0%、38.3%(P<0.05)和33.6%(P<0.05)。

2.3 人参须超微粉水提液对荷瘤小鼠白细胞数/肝肾功能的影响

(±s,n=10)

注:与NS组比较,*P<0.05,**P<0.01。

从表3结果可见,环磷酰胺对S180实体瘤小鼠胸腺、肝脏、脾脏和白细胞数均有明显的抑制作用(与对照组比较P<0.05),而人参须超微粉水提液组(2g/kg)、人参须超微粉水提液组(1g/kg)、人参须超微粉水提液组(0.5g/kg)对小鼠胸腺、肝脏,脾脏的抑制作用无显著性差异(与对照组比较P﹥0.05)。

2.4 LD50测定结果

本研究过程中,人参须超微粉提取成分对昆明小鼠的半数致死量(LD50)在药物最大浓度、最大给药容积时均未能测出,单纯靠增加给药容积很难测出药物的LD50。灌胃浓度达40g/kg,小鼠无异常表现,药物毒性较低,可知灌胃给药的LD50>5g/kg[1]时,认为毒性较低,无需再继续测定。据文献[74]报道阳性药环磷酰胺对小鼠腹腔注射给药的半数致死量(LD50)为472mg/kg,因此,人参须超微粉提取成分的急性毒性要小于环磷酰胺。

3 讨论

世界卫生组织提出的当前癌症治疗的5大手段:手术治疗、放疗、化疗、生物治疗和中医药治疗。在世界药物研究趋势由化学合成药物转向天然药物的今天,人参由于它们的独特功能和较低的毒性,在临床应用中逐步显示出广阔的前景。人参作为传统中药,已有很多的实验研究表明其对多种肿瘤的生长都有明显的抑制作用。但是,人参的高昂费用对肿瘤患者是一个巨大的负担,因此,我们课题组设想从廉价的人参须中提取出有效成分进行体内、体外的抗肿瘤作用。

这次实验的药材全部采用了超微粉化的处理。所谓超微粉的制备,就是细胞级的微粉碎,是指以生物细胞破壁为目的的粉体作业,它不以粉体细度为目的,而是追求细胞破壁率。当然,细胞破壁率越高,一般粉体细度越细。课题组的早期实验证明,经过超微粉处理后的中药微粒不但可以保持原材药的特性,而且由于“粒径”极大地缩小,细胞壁或细胞膜被打破,有效成分的释出量、释出速度也大为提高,更由于低温、封闭式、细胞级和100%粉碎(无药渣)的结果,保留了药材的全部有效成分;另外,药材的粒径缩小,表面积扩大,易于吸收,均可保证其质量的提高。中药超微粉化后,既可以保持原药材的特性,又能提高质量和生物利用度,当然就可以节约大量药材。从现有的文献报道结果可以看出,一般均能节约药材用量30%~80%,缩小用药体积50%~70%。这样经过超微粉技术处理后的人参须就可以获得更多的抗肿瘤有效成分[8,9]。

这次实验的研究表明,环磷酰胺(50mg/kg)对小鼠移殖性肿瘤S180有明显的抑制作用,抑瘤率为44.4%,但环磷酰胺对荷瘤小鼠的免疫器官胸腺、脾脏、白细胞数都有明显的抑制作用,所以其虽然对多种肿瘤都有较好的疗效,但其较大的副作用也限制了它的使用。人参须超微粉水提液组(2g/kg)、人参须超微粉水提液组(1g/kg)、人参须超微粉水提液组(0.5g/kg)对小鼠移殖性肿瘤S180也有一定的抑制作用,抑瘤率分别为36.1%、43.7%、39.4%,虽然抑瘤率比不上环磷酰胺,但从血白细胞数、脾脏指数、胸腺指数的观察中可见人参须超微粉提取有效成分的各个实验剂量对荷瘤小鼠的白细胞数均未有明显影响,即有效抗肿瘤剂量时并未影响血中白细胞数,说明其可能对骨髓无抑制作用,这是该药的明显优点,因为目前临床上常用的抗肿瘤药物中,90%以上都具有不同程度的骨髓抑制作用,都会降低白细胞数,使患者的免疫功能下降,严重者不得不终止治疗。

本实验结果表明,人参须超微粉水提液对动物移植瘤具有抗癌活性,对小鼠的毒性较低,对荷瘤小鼠白细胞数没有明显影响,是值得开发的新药或先导药物。

摘要：目的:观察人参须超微粉水提液的体内抗肿瘤活性及其急性毒性。方法:建立荷瘤小鼠动物模型,采用荷瘤小鼠瘤重、抑瘤率观察人参须超微粉水提液对小鼠移植性淋巴肉瘤抑制作用,并观察人参须超微粉水提液对艾氏腹水癌小鼠的生命延长率。结果:人参须超微粉水提液对小鼠移植性淋巴肉瘤有抑制作用,对荷艾氏腹水癌小鼠的生命有延长作用。结论:人参须超微粉水提液具有一定的体内抗肿瘤活性,对小鼠的毒性作用较低。

关键词：人参须,超微粉,小鼠移植性肿瘤,急性毒性

参考文献

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