细胞消化（共7篇）
细胞消化 篇1
目前使用的猪瘟活疫苗主要是猪瘟兔化弱毒疫苗和猪瘟脾淋苗[1]。猪瘟细胞活疫苗是利用动物细胞大规模培养技术用猪瘟兔化弱毒株接种易感细胞培养, 收获细胞培养物, 加适宜稳定剂, 经冷冻真空干燥制成。猪瘟细胞活疫苗和兔源猪瘟活疫苗生产使用的种毒均是我国自己研发的猪瘟兔化弱毒株 (C株) [2]。
猪瘟细胞活疫苗在实际大规模细胞培养过程中遇到很多难题, 而其中在细胞消化过程中分散液的选择直接影响到细胞接毒后细胞毒收获液的效价, 因此细胞消化过程中一定要选择正确的分散液[3,4]。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 种毒
猪瘟兔化弱毒株 (C株) 由中国兽医药品监察所提供, 通过兔体继代, 采集定型热反应兔的脾脏作毒种 (简称脾毒) 。物品:5ml注射器、6号针头、250ml或500ml锥型瓶、120目铜沙网漏斗、眼科剪刀镊子、500ml大烧杯、大三角瓶 (500ml或1000ml) 、平皿 (中号) 、玻璃珠 (大些的) 、四层纱布漏斗、转瓶等。冻干毒:5瓶0.8g/瓶
1.1.2 犊牛睾丸
来源浙江金华
1.1.3 配液
乳汉 (欧) 液、7.5%碳酸氢钠溶液;2万U双抗溶液 (SP) 、磷酸盐缓冲溶液 (PBS溶液) 、0.25%胰酶溶液、EDTA胰酶 (0.02%~0.05%) 、0.4%酚红、血清 (NCS) 、原代细胞生长液、乳汉液+9%NCS+0.8%sp+0.5% (7.5%碳酸氢钠) 、维持液、乳汉液+2.0%NCS+0.8%SP+0.5% (7.5%碳酸氢钠) 、0.25%胰蛋白酶, 使用时调节pH值到8.0。
1.2 方法
1.2.1 细胞制备
操作:250ml瓶中取出牛睾丸—烧杯中洗一遍—平皿中去外皮—烧杯中洗两遍—睾丸中间一直线剪开, 用小剪刀将组织刮下—移至烧杯中洗两遍—剪碎后洗一遍—转至三角瓶中加入玻璃珠和适量的0.25%胰蛋白酶 (无需过多胰酶) —37℃水浴消化40-50min左右—弃去胰酶, 加入少量营养液摇动三角瓶 (此过程未用营养液洗去残留的胰酶) , 加入营养液通过四层纱布漏斗分散细胞至转瓶中 (一般每付牛睾丸分散两瓶细胞) —37℃温室、8.5r/h培养, 2~5d细胞生长至+++与++++之间时即可接毒。观察细胞时应尽量减少细胞瓶内液体的流动, 24h内不要观察细胞。
1.2.2 一接 (接毒比例0.3%)
操作:从冷库中取出预先冷冻的乳钵, 将半化开的脾毒称取所需重量置于乳钵中研磨、捣碎, 研磨后多加乳汉液, 继续研磨, 让组织中的毒得到充分释放。将种毒吸离心瓶中, 配平、2000r/min 20min离心。将脾毒上清按比例接入细胞瓶中, 继续培养。
1.2.3 一接一传 (带毒传代)
将分散液、PBS溶液放在37℃恒温水浴箱中预热。取细胞形态良好、分布均匀且长满单层的细胞瓶, 将瓶身用消毒液擦拭、瓶口用消毒酒精棉擦拭后在酒精灯外焰上烧1周, 打开瓶塞。将细胞瓶中原有的细胞生长液倒掉, 在火焰保护下向瓶内倒入适量PBS洗液, 转动细胞瓶, 使PBS洗液均匀漫过细胞面, 洗去细胞面上存留的血清和营养液, 然后倒掉PBS洗液。
向细胞瓶中加入适量细胞分散液, 水平方向转动细胞瓶, 使细胞分散液均匀漫过细胞面, 然后水平放置在桌面上, 进行下一瓶消化, 同时经常旋转细胞瓶并密切观察细胞面的变化, 当细胞面上出现肉眼可见毛玻璃样, 或出现针尖大小的缝隙, 或因细胞分散液在瓶内转动而出现细细的划痕时, 即可倒掉细胞分散液并尽量倒净, 将细胞瓶水平放在台案上, 待细胞面出现较大裂痕时, 细胞脱离瓶壁, 此时细胞在分散液的作用下仍继续消化。经漏钟连接营养液, 向瓶内加入含9%血清的细胞生长液, 将细胞摇下, 此时细胞停止消化。
按1:3分散率补足细胞生长液, 将细胞生长液充分混匀, 根据分散率均匀地分装在无菌的细胞培养瓶中, 塞好塞子, 加纸帽扎紧, 摇匀细胞生长液, 将细胞培养瓶放在转瓶机上, 转瓶机转速为8.5r/h, 置于37℃温室中继续培养。48h后镜检观察。
1.2.4 一传二接 (接毒比例不低于0.35%)
操作:从冷库中取出预先冷冻的乳钵, 将半化开的脾毒称取所需重量置于乳钵中研磨、捣碎, 研磨后多加乳汉液, 继续研磨, 让组织中的毒得到充分释放。将种毒吸离心瓶中, 配平、2000r/min 20min离心。将脾毒上清按比例接入细胞瓶中, 继续培养。
1.2.5 二接一收
5d后收获, 将细胞病毒液收于万瓶中, 每转瓶留30ml母液, 加维持液后继续培养, 4天一收, 二收、三收…直至细胞脱落或到八收左右弃去。
1.2.6 取样稀释检验
从收获的万瓶中取1ml样品, 分别稀释5万倍和10万倍, 且各检测5只常温正常且未受过毒兔子, 48h开始每6h测温并记录兔子体温, 直至96h。
2 结果 (见表1、表2)
3 讨论
(1) 从本试验细胞传代过程中如表1可以看出6种分散液消化现象中EDTA胰酶加0.4%酚红消化速度快, 且细胞呈单个, 未见团块;0.25%胰酶:EDTA胰酶=3:2 (一周前配, 刚化) 和0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1 (一周前配, 刚化) 消化速度慢, 未见片状脱落现象, 加液后都仍有团块。48h后观察细胞的生长情况, EDTA胰酶0.05%~0.02%和EDTA胰酶加0.4%酚红48h长满均匀致密的单层;0.25%胰酶:EDTA胰酶=3:2 (一周前配, 刚化) 细胞瓶上细胞非常稀, 弃去;0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1 (一周前配, 刚化) 48h细胞长满不到50%, 60h长满70%。
(2) 通过半成品检验结果表2得到用EDTA胰酶
0.05%~0.02%消化细胞的病毒收获液5万倍稀释检测兔子3只定型热, 2只轻热, 10万倍稀释检测2只定型热, 1只轻热, 2只无反应;用0.25%胰酶:EDTA胰酶=3:2 (现配) 化细胞的病毒收获液5万倍稀释检测兔子2只定型热, 1只轻热, 2只无反应, 10万倍稀释检测2只轻热, 3只无反应;用0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1 (现配) 消化细胞的病毒收获液5万倍稀释检测兔子2只轻热, 3只无反应, 10万倍稀释检测全被无反应;用0.25%胰酶:EDTA胰酶=4:1 (一周前配, 刚化) 消化细胞的病毒收获液5万倍和10万倍稀释检测兔子都无反应;用EDTA胰酶加0.4%酚红消化细胞的病毒收获液5万倍稀释检测兔子4只定型热, 1只轻热, 10万倍稀释检测3只定型热, 2只轻热。
注:++表示定型热;+表示轻热;—表示无反应
本试验中用EDTA胰酶加0.4%酚红消化细胞的病毒收获液检测兔子起温效果最好, 可见细胞消化中分散液对细胞消化的好坏及之后生长起着关键的作用。细胞生长的好坏就直接影响到细胞瓶接毒后细胞毒收获液的效价, 因此细胞消化过程中一定要选择正确的分散液。
参考文献
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[5]R.I.费雷什尼编.实用动物细胞培养液技术[M].-Animal Cell culture, a Proactical approach//潘孝珍等译.北京:世界图书出版公司, 1996.
细胞消化 篇2
关键词：滋养细胞疾病,化疗,消化道出血,护理
妊娠滋养细胞疾病是一组以胚胎外滋养层异常增生为特征的异质性疾病, 具有广泛的组织学形态和临床生物学行为[1]。 妊娠滋养细胞疾病好发于生育期妇女[2], 化疗作为治疗滋养细胞疾病的重要手段, 它给病人的生理及心理带来极大的痛苦[3]。我区自2006年2月—2009年1月共发生8例化疗伴消化道出血的病人, 经过医护人员的有效治疗及精心护理后治愈出院。现将护理体会报告如下。
1 临床资料
本组8例病人, 年龄22岁～38岁, 平均28岁;她们在化疗期间出现严重的口腔溃疡、骨髓抑制及消化道出血。其中1例病人上消化道出血严重, 出血共1 040 mL。本组病人经予护胃、止血、输注血制品等对症治疗, 施以有效的专科护理及基础护理措施后, 病人消化道出血症状消失, 治愈出院。
2 护理
2.1 消化道出血的护理
2.1.1 体位
病人取平卧位, 下肢抬高15°～30°, 以保证脑部血液供给。呕吐时头偏向一侧, 防止窒息或误吸, 同时清理口腔及呼吸道分泌物。保持呼吸道通畅, 给予氧气吸入氧流量2 L/min～4 L/min , 保证血氧饱和度大于96%。
2.1.2 加强病情观察
严密监测病人的意识、呼吸、脉搏、体温及血压变化, 准确判断、记录病人出血的性质及量, 如病人出现便血、尿量减少、血压下降等低血容性休克表现时, 及时与医生沟通并采取抢救措施。如病人出现烦躁不安, 可根据医嘱给予镇静剂。指导病人在出血期间绝对卧床休息直至出血停止。加强保暖, 迅速建立静脉通道, 及时补充血容量, 进行各种止血治疗及用药等抢救措施, 发生上消化道大出血时给予冰盐水漱口。
2.1.3 判断出血是否停止
病人血压、脉搏稳定在正常水平, 大便转黄色, 提示出血停止。如病人反复呕血, 呕吐物由咖啡色转为鲜红色, 红细胞计数与比容、血红蛋白测定不断下降, 网织红细胞计数持续增高等应警惕再次出血的可能。
2.2 心理护理
恶性滋养细胞疾病化疗病人多是生育期妇女, 的心理负担本来就很重, 她们担心恶性滋养细胞疾病的预后, 担心治疗后的生育问题及复发。而化疗伴消化道出血的病人, 焦虑、抑郁和恐惧益发明显[4]。医护人员在与之交谈时要注意保持温和的态度, 消除病人的恐惧心理[5], 告诉病人滋养细胞疾病是可以通过化疗而治愈的, 减少病人心理负担。及时与病人家属沟通, 了解病人的心理动向, 取得家属的支持及配合, 在治疗期间家属的陪护及安慰显得尤为重要。在病人发生消化道大出血时医护人员陪伴在病人身边, 可让其心理放松, 更利于病人配合治疗。
2.3 口腔护理
每天检查病人口腔情况, 每天3餐后予以1∶5朵贝氏液漱口, 减少口腔内细菌滋生的机会。做好口腔护理是预防口腔溃疡最好、最基本的方法。对已经发生口腔溃疡的病人, 每次漱口后用西瓜霜喷剂均匀涂抹在溃疡面上, 可以加速创面愈合, 减少痛苦。对严重口腔溃疡病人可给予制霉菌素溶液漱口。
2.4 饮食护理
对少量消化道出血病人可指导进食流质, 当病人出血量大时则指导禁食。病人发生口腔溃疡时往往因为疼痛而抗拒进食, 此时进软食既可减轻口腔疼痛, 也可补充足够的营养, 纠正营养失调状况。饮食宜清淡, 少食多餐, 忌辛辣及用牙签剔牙, 防止划破口腔黏膜。在病人禁食期间给予静脉高营养输液。
2.5 皮肤护理
每天用温水进行擦浴或淋浴, 注意腹股沟、腋下及臀裂部位的皮肤情况, 认真检查病人全身有无出现瘀斑, 皮下出血点等情况。指导病人选择柔软、宽松的内衣。保持床单位的整洁, 及时更换血污被褥及衣服。
2.6 防范与减少临床输血风险
严格落实输血两人核对制度, 全血和/或成分血应从血库取回后30 min内输入, 并在规定时间内输完。输血后的血袋在常温下保存24 h, 确认病人无输血反应后回收至血液科统一处理。
2.7 保护性隔离
病人造血功能障碍, 主要表现为白细胞和血小板的减少。病人免疫力低下, 保护性隔离非常重要。限制探视和陪侍人员, 每天消毒床单位1次, 血小板异常低值者绝对卧床休息。
3 小结
化疗滋养细胞疾病病人的治疗时间长且病因不明, 加之女性天生敏感, 不良的情绪波动不利于病人病情康复。护士可通过健康教育对病人进行信息传播和行为干预, 帮助病人树立战胜疾病的信心, 自愿采取有利于健康行为和生活方式的教育活动过程[6]。护士针对本组病人发生的化疗副作用, 配合恰当的对症治疗及有效的专科护理, 减轻了化疗给病人带来的痛苦, 治愈出院。
参考文献
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[5]丛冰, 周玉虹.3例前列腺癌放射125I粒子植入术的护理[J].护理学杂志, 2003, 18 (l1) :871.
细胞消化 篇3
关键词：小鼠,成骨细胞,分化,ALP,钙化结节
成骨细胞(osteoblast,OB)主要由骨髓基质内的间充质干细胞在体内各种调控因素的调节下分化而来[1]。原代小鼠前体成骨细胞的体外分离培养是建立稳定细胞系的基础,是在细胞水平研究骨代谢和各种骨胳疾病分子机理的前题。自1964年PECK首次在体外分离培养小鼠前体成骨细胞以来,该项技术在不断发展和完善,目前人们已经成功地从禽类、啮齿类、哺乳类及人类等多种物种中分离培养了前体成骨细胞[2,3]。原代细胞分离方法主要有酶消化法和组织块法。由于组织块法分离的细胞数量有限,目前多用酶消化法。本研究优化消化酶,改进操作步骤,使原代前体成骨细胞的分离更简单,分离获得的细胞纯度更高、活性更强,为原代成骨细胞的体外分离培养提供更高效的方法。
1 材料和方法
1.1 实验动物和试剂
出生72 h以内的小鼠,来自西北农林科技大学实验动物中心。无血清alpha-MEM、胶原酶A(Collagense A)和分散酶(Dispase)购自Gibco公司。β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、茜素红购自Sigma公司,其它常用化学试剂购自天根生化科技有限公司。
1.2 原代前体成骨细胞的分离培养
在无血清的alpha-MEM中加0.1%w/w胶原酶A(Collagense A)和0.2%w/w的分散酶(Dispase)作为消化液,配好的消化液用0.22μm的滤膜过滤待用。
将出生72 h以内的小鼠,先放入70%的乙醇中2 s消毒,再放入PBS中清洗身体表面,然后用手术剪断颈,取出颅骨放于过滤后的消化液(1 m L/只),37℃120 rpm震荡15～20 min消化,将第一次消化的液体弃掉,重新加入消化液(1 m L/只),37℃120rpm震荡15～20 min,收集第二次到第五次的消化液,1000 rpm离心5 min,弃上清,然后将消化后的细胞用加有双抗(0.1 units/mL and 0.1μg/m L)和10%FBS的α-MEM培养基,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,2～3 d换培养液一次。细胞汇合后,弃去培养基,PBS轻轻洗一次,加1mL 0.25%Trypsin-EDTA,37℃温育3～5 min消化细胞,加适量培养基终止消化,1000 rpm离心3 min,弃上清培养基,加新培养基吹打混匀,分于新培养皿传代继续培养。
1.3 诱导分化前体成骨细胞
在全培养液中加入5 mmol/Lβ甘油磷酸钠、50μg/m L抗坏血酸和10 nmol/L地塞米松配成诱导培养基,将分离的原代前成骨细胞按1×104/m L的浓度分到培养皿中,当细胞培养至90%汇合时,换诱导培养基诱导其分化,2～3 d换诱导培养液一次,直到检测。
1.4 碱性磷酸酶活性测定
细胞开始加诱导培养基时即测定细胞中碱性磷酸酶活性,每隔2～3 d测定一次,每次测三个重复,计算其平均值和标准差。测定时参考M.J.COELHO等人的实验方法[4,7]。
1.5 碱性磷酸酶染色
当细胞诱导培养10 d以后,参考杨景山等人所述方法进行碱性磷酸酶染色[5,7]。
1.6 Von Kos s a染色
在细胞诱导培养15 d以后,参考Mc Gee-Russell SM所述方法对细胞进行Von Kossa染色[6,7]。
1.7 茜素红染色
当细胞诱导分化21 d后,进行茜素红染色。先去掉培养液,用无Ca Cl2和Mg Cl2的PBS将细胞洗两次,3.7%福尔马林固定10 min,用去离子水洗细胞一次,在培养皿中加pH值为4.1～4.3的2%茜素红染色液,10 min后在显微镜下观察,当有橙色出现时,去掉染色液,用去离子水洗30 min,然后照像。
2 结果
2.1 原代前体成骨细胞的生物学特征
用胶原酶A和分散酶消化下来的细胞在光学显微镜下关察,未贴壁的细胞呈圆形,接种后很快开始贴壁,培养12 h后,相差倒置显微镜下可见贴壁生长的细胞呈不规则梭形、三角形或多角形,活力旺盛的细胞呈半透明状,轮廓清晰,见图1.1,当细胞活力不好时细胞拉长,轮廓变得模糊。细胞核呈圆形或椭圆形,居中或偏于一侧,轮廓清晰,可见1～3个核仁,见图1.2。培养2～3 d细胞基本汇合,再继续培养,细胞可重叠生长。
注:1.消化后12 h:贴壁生长的OB,100×;2.汇合后重叠生长的OB,200×;3.ALP染色,200×;4.ALP染色,1×;5.Von Kossa染色钙化结节,4×;6.Von Kossa染色钙化结节,1×;7.茜素红染色钙化结节,4×;8茜素红染色钙化结节,1×
2.2 ALP活性测定和ALP染色的光镜观察
ALP的大量表达是前体成骨细胞分化为成骨细胞的重要标志之一。本试验加入诱导培养基后,开始测定ALP活性,由图2结果可知诱导10 d以后ALP表达增加较多,诱导13～16 d时ALP活性最高,16d以后ALP活性开始下降。诱导培养12 d时ALP染色结果显示细胞呈灰黑色,见图1.3、图1.4。细胞染色后颜色越深,表明ALP表达量越多。
2.3 钙化结节的光镜观察
在成骨细胞发育后期,细胞外基质矿化,细胞表面产生大量磷酸钙沉淀,形成钙化结节。这是成骨细胞成熟的重要标志。Von Kossa染色通过对磷酸钙沉淀中的磷酸根离子染色来验证钙化结节的存在。本实验在前体成骨细胞诱导培养21 d进行Von Kossa染色,看到了大量钙化结节形成,见图1.5、图1.6。茜素红染色是验证钙化结节存在的另一种方法。为了排除由于某些因素干扰所造成的Von Kossa染色实验的假阳性结果,本实验用茜素红染色的方法对磷酸钙沉淀中的钙离子染色,再次验证了细胞中大量钙化结节的存在,见图1.7、图1.8。
3 讨论
成骨细胞的离体培养已进行了40多年,方法不断改进。目前多采用胰蛋白酶和胶原酶消化剪碎的颅盖骨,分离得到前体成骨细胞的方法。该方法使用的胰蛋白酶作用于细胞会使细胞膜表面的蛋白受损,剪刀剪碎颅盖骨的过程也很容易使细胞被污染。因此本研究优化消化酶,采用胶原酶A和分散酶直接消化手术取下的颅盖骨,避免了胰蛋白酶对细胞的伤害,手术取下的颅盖骨也不需要剪碎,直接消化即可,这样减少了细胞污染环节,缩短了细胞应激时间。实验中将细胞消化液置于37℃水浴待用,其酶活性最好,消化得到的细胞数量最多,细胞没有团块,分散均匀。收集消化液和细胞的离心管预先放置于冰上,每次消化完成后将消化液和细胞收集于冰上预冷的离心管,5次消化完成后,将收集的所有消化液和细胞一次离心,这样缩短了操作过程需要的时间,使细胞应激减少,得到的细胞活力好。优化酶消化方法获得的细胞量大、均匀、活力好,成活率高。一般消化4只小鼠的颅盖骨可获得3×105个以上的细胞,足够培养于1个175 cm2的培养瓶,2～3 d后即可传代至3个175 cm2的培养瓶。光镜下形态观察、诱导培养后ALP活性测定、ALP染色和钙化结节染色,均表明细胞活性高且具有典型成骨特性。研究证明该方法获得的细胞可以作为研究骨代谢和骨疾病分子机理的原代前体成骨细胞实验材料[8]。因此本研究提供了一种更简便、高效的分离小鼠原代前体成骨细胞的方法。
参考文献
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细胞消化 篇4
1 材料与方法
1.1 动物
出生1~3 d的Wistar大鼠,清洁级,由内蒙古大学实验动物中心提供[合格证编号:csxk(蒙)2002-0001]。
1.2 主要试剂
AngⅡ(Sigma)、DMEM高糖培养基(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、胰酶(碧云天生物技术公司)、MTT试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、小鼠抗波形蛋白单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、生物素标记兔抗大鼠Ig G(武汉博士德生物工程有限公司)、兔抗α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、生物素标记羊抗兔Ig G(武汉博士德生物工程有限公司)、通用型SP免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。
1.3 实验步骤
分别将20 m L含20%胎牛血清培养基标记为8 min组与10 min组。在无菌操作台内,将1只乳鼠(性别不限)用75%的酒精活体消毒,剪开乳鼠胸部皮肤及胸廓,暴露并剪下心,迅速置于装有无血清DMEM高糖培养基中,排出积血,剪掉上面1/3部分。再将此心移入下一个盛有无血清DMEM高糖培养基中,如此清洗3次,将心内残留的血洗净。随后将该心放入无菌小烧杯中,用无菌剪刀快速剪成约1 mm3并加入5 m L胶原酶Ⅱ洗涤后,将3 m L新的胶原酶Ⅱ与剪碎的乳鼠心肌组织块充分混合并消化,将1/2心肌组织块置于37℃水浴锅中消化8 min(8 min组),另1/2置于同等条件的37℃水浴锅中消化10 min(10 min组),然后弃去胶原酶Ⅱ,分别向心肌组织块中加入5 m L新的胶原酶Ⅱ,置于37℃水浴锅中再分别消化8 min、10 min,此时胶原酶Ⅱ中已含有大量被消化下来的心肌细胞与心肌成纤维细胞;收集细胞后,分别向心肌组织块中加入5 m L新的胶原酶Ⅱ,置于37℃水浴锅中再分别消化8 min、10 min,再次收集细胞;共收集6次含细胞的胶原酶Ⅱ,此时玻璃管中的心肌组织块已呈白色絮状。分别将8 min组与10 min组含细胞的胶原酶Ⅱ在常温下800转离心5 min,小心弃掉上清液,向两沉淀物中分别加入10 m L含10%胎牛血清的DMEM(H)培养基并使之变成悬浊液,用300目滤网将悬浊液过滤。制备细胞爬片(差速贴壁法):取一个24孔板,向每个孔中各加一个预先泡酸并高压灭菌的小盖玻片,分别向其中12个孔内加入8 min组的细胞悬浊液,另12个孔加入10 min组的细胞悬浊液,将此24孔板置于37℃孵箱中孵育70 min后置于倒置显微镜下观察,发现此时大部分细胞已贴壁。因心肌细胞贴壁需要时间较长,考虑此时贴壁的大部分是心肌成纤维细胞。将24孔板放于超净台内轻轻晃动,将孔内未贴壁的心肌细胞悬液吸出,并用无血清DMEM高糖培养基轻轻洗2遍,然后每孔内均加入1 m L含10%FBS的DMEM(H)培养基,继续置于37℃孵箱中孵育,原代心肌成纤维细胞的细胞爬片制备完毕。24孔板中绝大部分细胞均为心肌成纤维细胞。
1.4 鉴定细胞成活率
用300目滤网将细胞悬浊液过滤后,分别取900μL细胞悬浊液置于EP管中,分别加入100μL 0.4%台盼蓝染液,混匀后室温静置3~5 min,吸取10μL充入计数板内,在倒置显微镜下观察,正常活细胞为折光性强的圆形细胞,死亡细胞被染成蓝色,取3次计数的平均值计算总细胞存活率。总细胞成活率(%)=[(总细胞数-染色细胞数)/总细胞数]×100%。心肌成纤维细胞的成活率:差速贴壁结束后,将原代心肌成纤维细胞置于37℃孵箱培养,72 h后两组分别随机选一个孔的细胞,不清洗直接放入胰淀粉酶消化,将已经贴壁的细胞消化成细胞悬液,取900μL细胞悬液置于EP管中,加入100μL 0.4%台盼蓝染液,其它步骤同总细胞存活率。
1.5 HE染色鉴定心肌成纤维细胞的形态
将原代心肌成纤维细胞爬片放入孵箱孵育48 h,两组分别进行苏木素-伊红染色(HE染色)。于超净台内将细胞爬片分别用磷酸盐缓冲液洗两次,经4%多聚甲醛固定30 min,再磷酸盐缓冲液洗3次,每次5 min,用滤纸吸干剩余磷酸盐缓冲液。加入适量苏木素染色液,室温静置30 min,蒸馏水冲洗10 min,浸入95%乙醇5 s,用滤纸吸干乙醇,加入伊红染色液,室温染色30 min。70%乙醇洗2次,用滤纸吸干乙醇,室温晾干。倒置显微镜下观察细胞形态。
1.6 免疫组化鉴定心肌成纤维细胞的纯度
将原代心肌成纤维细胞爬片放入孵箱孵育48 h后,两组分别于无菌超净台取出爬片,经4%多聚甲醛固定,0.1%triton100室温孵育穿透,30%过氧化氢室温浸泡,滴加5%BSA封闭液,滴加适当稀释的一抗(抗Vimentin抗体或抗α-actin抗体),于4℃过夜;滴加二抗(生物素化山羊抗鼠Ig G)、链霉亲和素-生物素复合物,经二氨基联苯胺显色,室温显色,控制反应时间,经苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
1.7 鉴定心肌成纤维细胞的增殖能力
将300目滤网过滤后的细胞悬液放置70 min后在无菌超净台内吸出液体及漂浮的死细胞,用无血清DMEM高糖培养基轻轻洗2遍,分别加入5 m L含10%FBS的DMEM(H)培养基,置于37℃孵箱中孵育48 h待培养瓶内细胞80%融合后,将其分别接种于2个96孔板,24 h后加入AngⅡ,37℃孵育24 h,每孔依次加入10μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]染色液,4 h后每孔中分别加入150μL二甲基亚砜置于摇床15~30 min,待结晶溶解,于490 nm波长测定细胞吸光度。
1.8 统计学处理
采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量数据采用均数±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 总细胞成活率与原代心肌成纤维细胞成活率
8 min组与10 min组相比,差速贴壁前两组总的细胞存活率均大于93%,差异无统计学意义(P>0.05)。差速贴壁48~72 h后,10 min组原代心肌成纤维细胞达80%~90%融合,8 min组原代成纤维细胞只有60%~70%融合,10 min组优于8 min组(P<0.05)。见表1。
2.2 原代心肌成纤维细胞形态
原代心肌成纤维细胞在贴壁初期均呈圆形,折光性强,悬浮于培养基中,70 min后,大部分心肌成纤维细胞均已贴壁,只有少量的变为小梭形和三角形;24 h后,心肌成纤维细胞都变为三角形或长梭形,较大,排列紧密,胞浆透明,细胞核呈近圆形,细胞无自发搏动。苏木素-伊红染色后可见原代心肌成纤维细胞胞体较大,呈长梭形,细胞核呈蓝色,细胞质呈淡红色,核膜较为清晰,细胞质透明,细胞核较大,呈椭圆形,见图1a,图1b。原代心肌细胞细胞多为多角形,伸出伪足,核呈蓝色,细胞质呈淡红色,核膜清晰,见图1c。两种消化时间得到的心肌成纤维细胞在形态学上无明显差异。
图1a:消化时间为8 min的原代心肌成纤维细胞HE染色(400×);图1b:消化时间为10 min的原代心肌成纤维细胞HE染色(400×);图1c:消化时间为8 min的原代心肌细胞苏木素-伊红染色(100×)
2.3 心肌成纤维细胞的纯度
原代心肌成纤维细胞中Vimentin抗原表达呈阳性,细胞质呈棕黄色,胞核呈蓝色,见图2a、图2b。在原代心肌成纤维细胞中,心肌细胞的标志性抗原表达为阴性,细胞质未被染色,细胞核呈蓝色,见图2c。8 min组与10 min组培养的阳性细胞率均>95%。
图2a:消化时间为8 min的原代心肌成纤维细胞(400×);图2b:消化时间为10 min的原代心肌成纤维细胞(400×);图2c:消化时间为8 min的原代心肌成纤维细胞(400×)
2.4 心肌成纤维细胞的增殖能力
传代过程中8 min组心肌成纤维细胞大量死亡,增殖率低;10 min组的心肌成纤维细胞的增殖快,增殖能力高于8 min组(P<0.05)。
3 讨论
目前对于原代心肌成纤维细胞的研究日益增多,而原代心肌成纤维细胞的培养方法繁杂多样,各有特点。我们探讨了两种不同的消化时间对于原代心肌成纤维细胞的影响。分离原代心肌成纤维细胞的方法多采用酶消化法[2],在消化酶的应用上,可使用单一胰酶消化[3],也可用胰蛋白酶(0.05%)加胶原酶(0.1%)共同消化[4]。在用于消化心肌细胞的胶原蛋白酶中,Ⅱ型最常用,可分次消化,也可过夜消化。由于心组织中含有很多胶原,使用胶原酶对细胞间的胶原纤维具有很好的消化作用,而且作用缓和,对细胞损伤小,所以本实验采用单纯胶原酶Ⅱ消化法。传统差速贴壁时间多为60~90 min[5],60 min得到的心肌成纤维细胞量少,而80 min、90 min得到的心肌成纤维细胞纯度差,掺杂了大量的心肌细胞,因此本实验采用70 min差速贴壁,得到了量更多、纯度更高的心肌成纤维细胞。
本实验通过对比两种不同的消化时间对于原代心肌成纤维细胞的影响,发现两种消化时间培养的细胞在形态、纯度方面无明显差异,但在存活率与增殖能力方面有差异,探索出一套简便易行、产量大、纯度高、传代后质量高的原代心肌成纤维细胞的培养方法。
摘要：目的:通过对比不同消化时间对成纤维细胞原代培养的影响,探索一种更为简便、可靠的实验方法,为原代心肌成纤维细胞的基础研究提供依据。方法:使用Ⅱ型胶原酶多次消化法,采用两种不同的消化时间对乳鼠心肌组织进行消化,利用差速贴壁法分离心肌细胞及心肌成纤维细胞,37℃孵育,使用台盼兰染色、免疫组化、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]等方法分析其形态、纯度、增殖能力。结果:消化时间8 min组的细胞总存活率为(94.7±0.6)%,10 min组为(93.9±0.8)%,二者比较差异无统计学意义(P>0.05);心肌成纤维细胞存活率8 min组为(55.3±9.0)%,10 min组为(91.8±5.5)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);波形蛋白免疫组化,两组阳性细胞率均>95%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);增殖能力8min组为(5.33±0.80),10 min组为(61.15±5.20),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:两种消化时间获得的心肌成纤维细胞在形态上、纯度上无明显差异,在增殖能力和心肌成纤维细胞数量上,10 min组优于8min组。
关键词：心肌成纤维细胞,消化时间,免疫组化
参考文献
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[4]William EL,Sheehan KA,Wolska BM.Methods in cardiomyocyte isolation,culture,and gene transfer[J].J Mol Cell Cardiol,2011,51(3):288-298.
细胞消化 篇5
1 材料与方法
1.1 试验材料
2010年9月, 野生黄鳍鲷5尾购于深圳市盐田农贸市场, 该鱼为当地渔民用刺网在大鹏湾海区捕获所得, 体质量为215.0~265.0 g, 体长为17.5~19.5 cm。养殖黄鳍鲷5尾购于广州市番禺清河市场, 该鱼由番禺龙穴岛养殖区的池塘捕获上市, 体质量为205.0~275.0 g, 体长为17.3~20.8cm。10尾鱼均健康无病, 活动状态正常。根据鱼体特征可区分野生型和养殖型。
1.2 试验方法
迅速解剖试验用鱼, 取出整个消化道, 观察其形态特征、拍照并测量相关数据。取消化道组织, 取材部位为食道、胃、幽门盲囊和肠道。用Carnoy液固定24 h。常规石蜡包埋、切片, 切片厚5μm, AB-PAS染色, 中性树胶封片。在ZEISS显微镜下对消化道不同部位上皮中的粘液细胞着色情况进行观察, 取10个不同的视野对粘液细胞的类型和数量进行计算, 利用显微镜中的标尺, 用每个视野中的粘液细胞数除以此视野的面积即是1 mm2中的粘液细胞数量。采用Excel 2003和SPSS 18.0软件进行数据分析。
2 结果
2.1 消化道中粘液细胞的类型
根据试验中AB-PAS的染色结果, 参考尹苗等[5]对粘液细胞的分类方法, 野生与养殖黄鳍鲷消化道粘液细胞都可分为4种类型。Ⅰ型:AB-PAS染色呈红色, 含有PAS阳性的中性粘多糖;Ⅱ型:AB-PAS染色呈蓝色, 含有AB阳性的酸性粘多糖;Ⅲ型:AB-PAS染色呈紫红色, 主要含有PAS阳性的中性粘多糖, 同时含有少量AB阳性的酸性粘多糖;Ⅳ型:AB-PAS染色呈蓝紫色, 主要含有AB阳性的酸性粘多糖, 同时含有少量PAS阳性的中性粘多糖。
2.2 消化道中粘液细胞的分布
黄鳍鲷消化道中不同部位的粘液细胞类型不同, 数量也存在差异。养殖黄鳍鲷消化道各部位粘液细胞的总量均比野生黄鳍鲷多, 前肠和后肠差异显著 (P<0.05) , 其他部位差异均不显著 (P>0.05) 。
2.2.1 食道中粘液细胞的分布
黄鳍鲷食道的粘膜上皮为复层扁平上皮, 表层为一层扁平细胞, 其下为一层大而高的杯状细胞和粘液细胞。AB-PAS染色结果显示其粘液细胞呈红色、蓝色、紫红色、蓝紫色4种颜色, 红色和蓝色居多 (图版Ⅰ-1~2) , 由此可知黄鳍鲷食道中有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型粘液细胞且Ⅰ、Ⅱ型居多, 含中性粘多糖和酸性粘多糖。野生鱼食道中Ⅰ和Ⅲ型粘液细胞分别比养殖鱼多14.71%和22.26%, Ⅱ和Ⅳ型粘液细胞分别比养殖鱼少9.42%和11.16%, 且差异均不显著 (P>0.05) 。
2.2.2 胃中粘液细胞的分布
黄鳍鲷胃粘膜上皮为单层柱状上皮, 无杯状细胞, 贲门部和胃体部胃腺发达, 幽门部无胃腺。AB-PAS染色显示野生与养殖黄鳍鲷贲门部和胃体部的粘液细胞都呈红色和蓝色2种颜色 (图版Ⅰ-3~6) , 说明其贲门部和胃体部的粘液细胞有Ⅰ、Ⅱ型2种。Ⅱ型粘液细胞均位于胃腺的开口处, 在上皮下形成一条规则的蓝细胞线;幽门部染色结果只含有Ⅰ型粘液细胞且细胞分界不清, 在粘膜上皮层形成连续的浅红色边缘 (图版Ⅰ-7~8) , 导致无法计数。结果表明黄鳍鲷胃部含中性粘多糖和酸性粘多糖。
2.2.3 幽门盲囊和肠道中粘液细胞的分布
黄鳍鲷幽门盲囊粘膜上皮为单层柱状上皮, 其间嵌有杯状细胞和其他粘液分泌细胞。AB-PAS染色结果表明粘液细胞有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型且Ⅱ型最多 (图版Ⅰ-9~10) , 含中性粘多糖和酸性粘多糖。野生鱼幽门盲囊中Ⅰ型粘液细胞比养殖鱼多28.63%, Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型粘液细胞分别比养殖鱼少5.93%、42.87%和2.85%, 且差异均不显著 (P>0.05) 。黄鳍鲷小肠上皮为单层柱状上皮, 其间散布较多杯状细胞和粘液细胞。通过AB-PAS染色可知其粘液细胞有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型且Ⅱ型最多 (图版Ⅰ-11~16) , 含中性粘多糖和酸性粘多糖。野生与养殖鱼小肠中粘液细胞总数都是中肠>后肠>前肠。黄鳍鲷直肠粘膜上皮为单层柱状上皮, 杯状细胞和粘液细胞丰富。AB-PAS染色显示粘液细胞呈红色、蓝色、紫红色、蓝紫色4种颜色, 蓝色最多 (图版Ⅰ-17~18) , 可知黄鳍鲷直肠与小肠相同, 其粘液细胞有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型且Ⅱ型最多, 含中性粘多糖和酸性粘多糖。野生鱼直肠中4种粘液细胞的数量均少于养殖鱼。直肠中粘液细胞多于小肠。野生与养殖黄鳍鲷消化道各部位中粘液细胞的数量见表1。
细胞个数·mm-2
注:相同部位同一型粘液细胞上标字母相同表示差异不显著, 不同表示差异显著 (P<0.05) Note:Values with same superscripts within the same section and type indicate no significant difference, while those with different superscripts indicate significant difference (P<0.05) .
3 讨论
3.1 鱼类消化道粘液细胞的分类
利用PAS染色方法可显示不同糖类的技术, KITZAN和SWEENY[6]通过光镜及电镜对非洲肺鱼 (Protopterus annectens) 上皮的粘液细胞进行观察, 根据PAS反应的不同程度将粘液细胞分为亮红色、淡红色及深红色3种类型。SIBBING和URIBE[7]通过多种染色方法相结合对鲤 (Cyprinus carpio) 粘液细胞进行观察, 结果显示鲤上皮中含有囊状、梨状和杯状3种形态的粘液细胞, 且这3种粘液细胞的化学成分不同。尹苗等[8]认为粘液细胞在不同的发育时期其形态有所不同, 囊状细胞为发育的早期, 梨状细胞为发育的中期, 而杯状细胞为成熟期。这种分类方法在科学性和合理性上都存在很多不足。袁金铎等[9]通过阿尔辛蓝和希夫试剂联合染色法研究了短盖巨脂鲤 (Colossoma brachypomum) 的粘液细胞, 将粘液细胞的分型做了更详细的描述。尹苗等[5]利用AB-PAS染色方法研究了鲤粘液细胞的类型, 结果将鲤粘液细胞分成红色、蓝色、紫红色和蓝紫色4种类型。这种分类方法得到了很多学者的赞同, 王吉等[10]对匀斑裸胸鳝 (Gymnothorax reevesii) 及王永波等[11]对波纹唇鱼 (Cheilinus undulates) 消化道内粘液细胞的分类都与之一致。笔者也参考此分类方法对黄鳍鲷消化道上皮中的粘液细胞进行了分类研究。
3.2 消化道粘液细胞分布与其功能的关系
对于鱼类粘液细胞在消化道中的分布, 国内外都进行了许多研究[12,13]。不同鱼类的粘液细胞在消化道中的分布类型和数量都不同, 同种鱼类的粘液细胞在消化道不同部位的分布类型和数量也不同, 这与粘液细胞在消化道中的不同功能有着必然的联系。
黄鳍鲷食道上皮中以Ⅱ型粘液细胞含量最多, Ⅰ型次之, 这些细胞在扁平细胞下紧密排列, 所分泌的粘液物质在食物通过食道时起润滑作用, 防止食物对食道上皮的机械损伤[14]。一般说来, 食道上皮中粘液细胞的数量肉食性鱼类<杂食性鱼类<草食性鱼类[15]。黄鳍鲷食道上皮中粘液细胞分泌的水解酶等溶菌抗菌类物质可以杀灭随着摄食食物带进的病原微生物[16], 从而减少因摄食不卫生带来的病害死亡等问题。野生黄鳍鲷食道中Ⅰ、Ⅲ型粘液细胞多于养殖黄鳍鲷, Ⅱ、Ⅳ型粘液细胞少于养殖鱼, Ⅱ、Ⅳ型粘液细胞能分泌更多的酸性粘多糖来维持食道内的酸性环境, 因为酸性粘液物质可以增加粘液的粘性, 对食道内的食物起到润滑作用, 这都有利于食物顺利地从食道转移到胃里。
黄鳍鲷整个胃部上皮含有大量粘液细胞, AB-PAS染色显示为Ⅰ型粘液细胞, 含中性粘多糖, 可以中和胃中过量的酸性胃液, 平衡p H值, 对高浓度酸性胃容物起到一定的缓冲作用[17], 并且胃中的中性粘液物质与碱性磷酸酶共同作用有帮助消化的功能[12]。胃是糖类和脂肪酸吸收的主要部位, 中性粘液物质可以将较大的食物消化成较小的食物, 使食物中的大分子物质、二糖及短链脂肪酸都能在短时间内更快地吸收进入血液以供给鱼类能量所需[18]。同时, 中性粘液物质不易被酸性胃液破坏, 在整个胃粘膜上皮形成一层具有保护作用的粘膜, 对于防止胃酸和胃蛋白酶对上皮细胞的侵蚀起到重要作用[19]。贲门部和胃体部胃腺开口处都有一层Ⅱ型粘液细胞, 分泌酸性粘多糖, 这与冯晓燕等[18]对许氏平鲉 (Sebastes schlegeli) 的研究结果一致。在黄鳍鲷贲门部和胃体部胃腺的开口处含有酸性粘液物质, 何敏等[20]认为胃中酸性粘液物质可以与胃蛋白酶形成复合物, 起到促进胃蛋白酶原的分泌和稳定酶的作用。
黄鳍鲷幽门盲囊组织结构与小肠的相似, 一般认为能分泌与肠壁相同的分泌物, 是用来扩大肠道的吸收表面积的[21]。所以, 幽门盲囊和小肠一样都含有4种粘液细胞, 且以Ⅱ型为主, 此结果与勾效伟等[22]对平鲷 (Rhabdosargus sarba) 的研究结论一致。这可能是因为幽门盲囊和小肠是蛋白质消化和吸收的主要场所, 同时要不断地润滑未消化的物质向后推进到后肠, 所以要求有较高的酸性粘多糖含量。野生黄鳍鲷幽门盲囊和小肠中粘液细胞总数少于养殖黄鳍鲷, 其原因和胃相似, 更多的粘液细胞可以帮助养殖鱼更好地消化吸收足量的人工饲料。
黄鳍鲷直肠上皮中粘液细胞分布情况与小肠相似, 其数量多于小肠。原因可能与直肠的生理功能有着紧密的联系, 细菌等病原体易侵入与肛门相连的直肠, 粘液中所分泌的免疫性物质可有效地杀死病原体, 同时, 大量的粘液物质可以帮助直肠顺利地形成和排出粪便[23]。野生黄鳍鲷直肠中粘液细胞总量少于养殖黄鳍鲷。原因可能是养殖鱼所摄食的食物要多于野生鱼, 其食物残渣和粪便也要多于野生鱼, 所以粘液细胞数量要更多。
细胞消化 篇6
贵州小型猪是我国主要的实验用小型猪品种之一,是国内重要的小型猪动物模型来源,其实验动物化研究已有30余年的历史,但目前未见到关于贵州小型猪胃肠道内分泌细胞的研究报道。试验应用改良Pascual 双重银染法显示贵州小型猪消化道黏膜的嗜银细胞、内分泌细胞的分布规律及形态学特点,为利用贵州小型猪动物模型进行有关消化道内分泌细胞形态和功能的研究提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 动物
成年健康贵州小型猪,由贵阳中医学院实验动物中心提供。
1.2 试剂
10%甲醛、硝酸银0.05 g、无水亚硫酸钠5 g、对苯二酚1 g,所有试剂均按常规方法配制。
1.3 取材
随机抽取成年健康贵州小型猪6头,麻醉处死,立即取出整个消化道(从食管至直肠),用生理盐水冲洗干净后分别取食管、胃贲门、胃体、胃幽门、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠各段组织,每段长度约为0.5 cm,用10%甲醛固定,常规石蜡包埋,制成厚为6 μm的切片。
1.4 染色
按照改良的Pascual双重银染法进行染色,切片下行至纯化水;加0.5%硝酸银于60 ℃染色2 h;纯化水冲洗3 min;加Bodian液(配制方法:无水亚硫酸钠5 g,对苯二酚1 g,双蒸水100 mL)于60 ℃还原5 min;纯化水冲洗3 min;加0.5%硝酸银于60 ℃再染色10 min;纯化水冲洗3 min;加Bodian液于60 ℃再还原5 min;上行脱水,透明,封片。
1.5 切片观察及细胞计数
应用BioMias图像分析系统观察切片。在40倍物镜下,每张切片选取20个视野,分别计数每个视野内的嗜银细胞。
1.6 数据统计
试验数据用Duncan’s多重比较的方法进行统计学分析。
2 结果
2.1 嗜银细胞的分布及形态
在光镜下,贵州小型猪消化道除食管未见嗜银细胞外,其余各段均有嗜银细胞分布。嗜银细胞被染成棕黑色或黑色,细胞分泌的颗粒呈黑色,主要位于基底部,背景细胞呈黄色。胃贲门部的嗜银细胞多分布于贲门腺颈部和体部,锥体形的细胞顶端常伸至腺腔(见161页彩图1A),圆形或卵圆形的细胞常位于腺细胞之间,有些细胞可见长突起指向腺泡之间的结缔组织内(见161页彩图1B)。胃体的嗜银细胞大多分布于胃底腺底部、体部上皮细胞之间, 细胞呈卵圆形、锥形、梭形或不规则形,部分细胞突起指向腺泡腔,有的则指向腺泡上皮细胞基底部(见161页彩图1C)。胃幽门部的嗜银细胞多位于幽门腺,细胞呈圆形或锥体形,锥体形细胞顶端伸达腺腔,也可见突起伸向腺细胞基底部(见161页彩图1D)。十二指肠的嗜银细胞主要位于小肠腺深处,梭形和圆形的细胞位于腺上皮基底部,梭形细胞的突起指向腺细胞基底部,而锥体形细胞一端突起指向腺腔,一端突起指向腺泡间结缔组织(见161页彩图1E)。空肠的嗜银细胞主要位于小肠腺底部上皮细胞之间,呈圆形或锥体形,锥体形细胞突起指向邻近细胞或腺泡腔(见161页彩图1F)。回肠的嗜银细胞多呈锥体形,位于小肠腺上皮细胞之间,其突起指向腺泡腔、临近的嗜银细胞或腺泡间结缔组织(见161页彩图1G)。盲肠的嗜银细胞位于大肠腺上皮细胞之间,多呈锥体形,突起指向腺泡腔(见161页彩图1H)或大肠腺上皮细胞基底部(见161页彩图1I)。在结肠,锥体形的嗜银细胞位于大肠腺上皮细胞之间,顶端到达腺泡腔,卵圆形的细胞位于上皮细胞基底部或固有层结缔组织内(见161页彩图1J)。直肠的嗜银细胞位于上皮细胞之间,锥体形细胞顶端指向腺泡腔(见161页彩图1K),卵圆形的细胞位于腺细胞基底部(见161页彩图1L)。
2.2 消化道各段嗜银细胞的分布密度
对贵州小型猪消化道嗜银细胞计数,所得数据用SPSS16.0软件包进行Duncan’s多重比较,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著,结果见表1。
注:数据肩标含相同字母表示差异不显著(P>0.05),小写字母完全不同表示差异显著(P<0.05),大写字母完全不同表示差异极显著(P<0.01)。
3 讨论
与小动物相比,在包括消化道形态和功能在内的许多生物特性方面,贵州小型猪与人类更为相似,被认为是复制人类疾病模型的理想动物之一。比如O.Rolandsson等[2]利用贵州小型猪成功复制具有人类Ⅰ型糖尿病末期特征的小型猪糖尿病模型;席守民等[3]采用高脂高糖饲料成功使贵州小型猪出现明显的高血糖症和高脂血症, 并可用此来建立Ⅱ型糖尿病动物模型;田宇瑛等[4]用冰乙酸给五指山小型猪灌胃成功复制小型猪胃溃疡模型。试验对贵州小型猪消化道嗜银细胞的分布和形态进行观察,旨在从形态学角度初步探讨其消化道嗜银细胞和胃肠道消化吸收功能的关系,并为进一步利用小型猪开展消化道相关形态和功能研究积累数据。
消化道嗜银细胞主要为EC细胞,能分泌5-HT和SP等物质,其分布与形态和胃肠功能密切相关[5]。在贵州小型猪食管黏膜上未见到嗜银细胞,这与家兔、褐家鼠等动物一致[6,7];胃肠道嗜银细胞数以胃体处最多,至胃体以下呈下降趋势,到直肠又稍有增加,其中胃黏膜中嗜银细胞的分布以胃体最多,贲门次之,幽门最少,此结果与家兔、褐家鼠等哺乳动物的分布规律不一致。关于小肠嗜银细胞的分布规律,目前认为主要有3种情况:1)内分泌细胞的数量在十二指肠最多,向尾端有一个降低的趋势,形成1条从小肠头向尾端倾斜的密度分布曲线;2)内分泌细胞在小肠中段数量极少,而在头尾两端, 即十二指肠和回肠数量较多,形成1个U形的密度分布曲线;3)内分泌细胞在小肠有一系列高低变动的波浪形的分布曲线[8]。贵州小型猪小肠黏膜嗜银细胞以十二指肠最多,空肠次之,回肠最少,其分布规律属于第1种情况。这一分布规律提示,贵州小型猪小肠消化吸收过程可能主要在十二指肠和空肠进行。
研究表明,胃肠道内分泌细胞的形态与激素分泌方式密切相关,其激素主要通过3种方式作用于靶细胞:激素直接释放入血液,通过血液循环运送至靶细胞而起作用称内分泌作用;激素通过细胞间隙弥散至临近细胞称旁分泌作用;激素分泌颗粒直接分泌入肠腔或腺泡腔称腔分泌作用[9]。本试验观察到贵州小型猪的消化道内可见大量的圆形、椭圆形、锥体形或梭形嗜银细胞。有的嗜银细胞突起伸向固有层结缔组织内,提示此类细胞将分泌的激素释放入血液,完成内分泌功能;部分锥体形嗜银细胞的长突起伸向肠腔或腺泡腔,且突起附近有嗜银颗粒,从形态学的角度证实此类嗜银细胞可能从内分泌细胞的顶端释放到肠腔或腺腔内,行使腔分泌的功能;而有些嗜银细胞的突起指向临近的上皮细胞,此类细胞可能将分泌的激素释放入组织间隙,完成旁分泌功能。此外,部分嗜银细胞可见多个突起,一端伸达腺泡腔,另一端指向临近细胞或固有层的结缔组织内,说明此类细胞具有2种或2种以上的分泌方式。综上所述,贵州小型猪胃肠道嗜银细胞形态多样,这可能是决定其激素分泌与作用方式的结构基础之一。
参考文献
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细胞消化 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
本次研究所选择的对象为2007年至2010年期间，本院收治的120患有消化系统疾病的患者，其年龄跨度在34～80岁，平均年龄为42岁，其中男性78例，女性42例。根据每个病患消化系统功能的分级的不同，将其分为Ⅱ级42例，Ⅲ级138例，Ⅳ级56例。所有病例均需进行消化系统的全面检查，全组所有患者被随机的分为加用间充质干细胞治疗的观察组以及传统不加间充质干细胞治疗的对照组。由于患者的身体素质、年龄、营养状况均无太大差异，不对该研究造成大的影响，因而病例间具有可比性。
1.2 治疗方法
所有120例患者在进行研究之前以及之后都要进行一系列的评估，其中包括呼吸系统功能分级的评估，心肺衰竭的评估，UCG的检查等。观察组和治疗组都要进行硝酸酯剂、阿司匹林、血管紧张素转换酶抑制剂、强心剂、β受体阻滞剂、利尿剂等常规治疗。观察组加用间充质干细胞进行治疗。两组患者都要进行历时53d左右的疗程进行全面的观察与治疗，最后通过两组患者的各项指标的变动情况进行具体的分析比对。如对于观察组内的肝脏疾病的患者使用间质干细胞时，要从患者的髋后上棘抽取骨髓，然后体外进行分离和提纯，进而通过肝动脉置管移植入肝脏。采用已经分化了的功能性间质干细胞，能够促进受体内的源性肝细胞增殖，使其分泌更多的生长因子，比如碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子等。间质干细胞还可以直接诱导肝星状细胞尽快凋零，并且对其激活状态进行抑制。间质干细胞在体内还可以分泌抗纤维化物质，如基质金属蛋白酶、粒细胞集落刺激因子等，可以抑制肝纤维化的生成。研究中还发现，间质干细胞能够明显减少肝组织内的胶原沉积和羟脯氨酸含量，降低血清Ⅲ型前胶原氨基末端肽，从而有效的改善患者的肝功能，提高其生活的质量。
1.3 疗效判定
在治疗的前后都分别用同一型号的心功能检测机对心功能的各项指标进行监测。采用心脏超声波测定左心室的舒张以及收缩末期的容积变化情况、还有其收缩与舒张的时间进行比对，根据NYHA[2]的不同分级，对患者进行治疗后的恢复情况进行评估。
1.4 统计学方法
该研究主要通过采用统计软件包对不同组别的患者的情况进行综合的分析与比对，进而采用二次回归成像法以及χ2值可行性检验法对离散的资料进行检验，最后再用函数的形式加以反应。
2 结果
一共120例病患在进行了长达6个月的治疗后，达到缓解的有14例，占17.2%。达到部分缓解的有26例，占55.3%，无变化的有20例，占24.1%，恶化的有4例，占5.1%。治疗的总有效率达72.3%。在治疗之后的随访阶段，随访时间最短为6个月，最长为2年。在六个月内病患的生产率为100%。治疗前后的恢复情况见表1。
3 讨论
注：*与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05)
间质干细胞按其来源可以分为成体干细胞和胚胎干细胞，研究显示，组织器官的特异性与转移性的间质干细胞可以增殖、分化为该组织器官的成熟细胞，因而可以修补损伤的器官。临床上主要开展了自体的细胞移植和异体的干细胞移植两种[2]，本文主要探讨的是自体细胞的移植。
因为近几年来的一系列的研究显示了间质干细胞的分化与增殖可以帮助损伤的器官进行恢复的作用，因此，使用间质干细胞对于消化系统的治疗应该比传统的治疗疗效更好。这与研究的结论是一致的。由于间质干细胞能够促进消化系统的新陈代谢，因而在临床上它对于陈旧性胃、肠、肝的功能不全等应该都有较好的疗效。间质干细胞还有对抗肾上腺素、去甲肾上腺素的作用，并且能够更好的降低血管的阻隔力，这对于促进消化系统的血液循环，促进系统的代谢，增加系统血流量，减低心脏工作负荷等方面都有着重要的意义[1,3]。除此之外，间质干细胞还能够降低消化系统能量的消耗，降低系统工作的耗氧量，从而在根本上改善消化系统的氧供给平衡[4]。
本文对患有消化系统疾病的患者通过是否应用间质干细胞进行分组，进而进行临床对照研究。其结果显示，加用间质干细胞的观察组比使用传统疗法的对照组疗效明显，并且不良反应较少。由此可以给我们的医务工作者一个提示，在今后的临床治疗中可以积极的应用间质干细胞来针对消化系统功能不全的患者进行治疗。综上所述，在患有消化系统疾病的患者的治疗中，加用间质干细胞进行移植治疗的患者，有更好的疗效，并且移植间质干细胞后，患者的不良反应减少，非常适合在临床中推广应用。
摘要：目的 研究利用间治疗消化系统疾病的临床表现、病理分析、治疗手段以及预后的影响因素。方法 将120例有消化系统疾病的患者随机的分为两组,每组60例。观察组采用常规药物治疗加用间充质干细胞进行治疗,对照组采用常规治疗。结果 观察组在加用了间充质干细胞后,消化系统的功能有明显的提升,治疗后的生命体征的指标变化较对照组提高更大。观察组总有效率显著高于对照组(P<0.05)。结论 加用间充质干细胞治疗消化系统疾病比只采用常规的药物治疗疗效更好,并且能够明显改善患者的消化系统的功能,改善患者的生活质量。
关键词：间充质干细胞,消化系统,应用
参考文献
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