Th17细胞

Th17细胞（精选8篇）

Th17细胞 篇1

辅助性T细胞17(Th17)是近年发现的CD4+T细胞的新亚群,以分泌细胞因子白细胞介素17(IL-17)为特征[1,2]。IL-23对维持Th17细胞的扩增和存活起重要作用,IL-23/Th17轴在自身免疫性疾病中发挥着重要的作用[3]。近年来发现Th17细胞及其相关的细胞因子可能也参与了支气管哮喘(简称哮喘)的发病[4]。哮喘是以气道高反应性和黏膜慢性炎症为特征的变态反应性疾病,糖皮质激素是目前治疗哮喘最有效的药物,然而糖皮质激素对于哮喘中Th17细胞数量和功能的改变尚少见报道。本试验通过对BALB/c小鼠脾脏单个核细胞中Th17细胞比例、肺匀浆中Th17细胞相关细胞因子IL-17、IL-23水平及BALF中炎性细胞的检测,探讨地塞米松对哮喘小鼠中Th17细胞数量、相关细胞因子IL-17、IL-23水平及气道炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备

6~8周龄清洁级雌性BALB/c小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)36只,体重18~22 g。随机分为对照组、哮喘组和地塞米松组,每组12只。哮喘组分别于第1、7和14天腹腔注射1次0.2 m L致敏液[含鸡卵白蛋白(OVA)100μg、液态氢氧化铝0.1m L,Sigma公司],第21~26天每天雾化吸入1%OVA 40 min。地塞米松治疗组致敏方法同哮喘组,在第21~26天雾化吸入1%OVA激发前30 min腹腔注射地塞米松(1 mg/kg)。对照组则用生理盐水代替OVA腹腔注射及激发。

1.2 气道阻力检测

腹腔注射1%戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉小鼠,用深静脉穿刺针行气管插管,用4号半婴儿头皮针行尾静脉穿刺,连接含乙酰胆碱(Ach,浙江仙琚制药公司)溶液的注射器备用。将小鼠放入体描箱中,连接动物呼吸机(Ani Res2003型,北京鑫奥成有限公司),设置呼吸机频率为85次/min、吸呼比为1∶1。记录小鼠气道阻力(Re)基础值,然后记录注射30~240μg/kg不同剂量Ach时Re的变化。

1.3 小鼠肺组织病理改变

取3组小鼠的部分左肺组织固定于4%甲醛中,常规脱水、石蜡包埋及切片,HE染色后观察肺组织的病理特点。

1.4 BALF中细胞计数

在小鼠的环状软骨上用血管钳固定气管,结扎右侧支气管,向置入连接注射器的硅胶管中分3次缓慢注入生理盐水,每次注入量为0.4 m L,每次灌洗后立即回收置于离心管中并计量,BALF离心后细胞沉淀用PBS重悬后测定细胞总数,并涂片作Wright-Giemsa染色,镜下至少数200个细胞进行分类计数。

1.5 肺匀浆中IL-17和IL-23测定

小鼠右下叶肺组织制成匀浆液。用ELISA法测定IL-17(ADL公司)及IL-23(e Bioscience公司)含量,具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.6 Th17细胞的检测

用Medimachine系统(BD公司)制备小鼠脾脏单细胞悬液,调整细胞浓度约为107/m L。取100μL悬液加入氟波酯、离子霉素和布雷杆氏菌素A(均为Sigma公司产品),在37℃5%二氧化碳培养箱中刺激培养5小时。加入CD3-APC和CD8-FITC抗体(e Bioscience公司)染色,经固定、破膜后加IL-17A-PE抗体(e Bioscience公司),用流式细胞仪FACS Canto(BD公司)检测,运用FACS Diva Software应用软件收集10 000个细胞进行数据分析。设门于CD3阳性T淋巴细胞,依据同型对照设定标记,分析CD8-IL-17A+细胞(Th17细胞)占总CD3+T细胞比例。

1.7 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差表示,3组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用LSD法,以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 实验动物情况

哮喘组小鼠于雾化吸入1%OVA时出现倦怠、精神萎靡、安静少动,呼吸加深、加快、点头样喘息。地塞米松组小鼠上述症状明显减轻,而对照组小鼠精神状态好,毛色有光泽,体重增长相对较快。

2.2 气道阻力变化

结果见表1。3组小鼠基础Re无差异,以30μg/kg Ach激发时3组Re均无明显变化。以60μg/kg Ach激发时,哮喘组Re明显升高(P<0.01),地塞米松组和对照组无此反应。以120和240μg/kg Ach激发时,哮喘组和地塞米松组Re较对照组均明显升高(P<0.01),且地塞米松组Re显著低于哮喘组(P<0.01)。

注:1)与对照组比较,P<0.01;2)与哮喘组比较,P<0.01

2.3 肺组织病理特点

正常对照组小鼠细小支气管及肺泡结构正常,支气管纤毛排列整齐,支气管黏膜上皮完整,未见炎症细胞浸润。哮喘鼠可见细支气管上皮变性,支气管管壁增厚、管腔狭窄,支气管腔内大量黏液,气管壁黏膜及黏膜下可见的大量炎症细胞浸润(淋巴细胞、嗜酸细胞及中性粒细胞)。地塞米松组气道炎症较哮喘鼠减轻,气管壁黏膜有轻度炎症细胞浸润。见图1。

2.4 BALF中细胞计数

3组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞及中性粒细胞数比较见表2。由表2可见,哮喘组小鼠的BALF中细胞总数、嗜酸粒细胞数均高于对照组和地塞米松组(P<0.01),地塞米松组细胞总数及嗜酸性粒细胞计数较哮喘组明显减少(均P<0.01),但仍明显高于对照组。

注:1)与对照组比较,P<0.01;2)与哮喘组比较,P<0.01

2.5 脾脏Th17细胞比例

3组小鼠脾脏单个核细胞中Th17细胞比例检测结果见图2。哮喘组Th17细胞比例(3.99±1.37)%,地塞米松组为(2.74±0.88)%,对照组为(1.96±0.51)%,哮喘组Th17细胞比例高于对照组(P<0.01),地塞米松组Th17细胞比例则低于哮喘组(P<0.05)。

2.6 肺匀浆中IL-17和IL-23水平

结果见表3,哮喘组小鼠肺匀浆中细胞因子IL-17和IL-23水平均高于对照组和地塞米松组(P<0.01),而地塞米松组IL-17和IL-23水平低于哮喘组而高于对照组,差异均有显著性(P<0.01)。

注:1)与对照组比较,P<0.01;2)与哮喘组比较,P<0.01

3 讨论

CD4+T淋巴细胞在哮喘的变态反应性炎症中发挥核心作用,以往已发现的CD4+T细胞有Th1细胞、Th2细胞和调节性T细胞(Treg),Th17细胞是2005年发现的一种新型CD4+辅助性T细胞,其在介导炎性反应、自身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥等方面发挥重要作用。近来,Th17细胞在哮喘发病中的作用引起了人们的关注。

Th17细胞产生的细胞因子主要有IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性因子,孤独核受体(RORγt)是控制Th17细胞分化的关键转录因子[5]。研究认为,细胞因子TGF-β和IL-6共同作用启动了Th17细胞的分化[6],Th17自分泌产生的IL-21起促进自身分化的作用[7],IL-23在维持Th17的存活和增殖中起重要作用[3]。近来研究表明在哮喘中存在Th17细胞数量的增多[8]。

Th17细胞分泌的IL-17A(即通常所指的IL-17),是强大的促炎细胞因子,其主要生物学功能是促进多种细胞释放炎症因子而导致炎性反应,已发现哮喘患者的痰和BALF中IL-17A的表达均增加[9]。Th17细胞参与哮喘发病的具体作用机制尚不清楚。有研究表明,Th17细胞分泌的IL-17可诱导嗜酸粒细胞活化,活化的嗜酸粒细胞释放细胞因子和趋化因子CXCL1、CXCL8、CCL4而介导过敏性炎症[10]。

IL-23是2000年发现的IL-12家族成员,是一种维持慢性炎症和抵抗胞内细菌感染的重要促炎因子[11],在炎症性疾病、自身免疫性疾病的发病以及抗肿瘤和抗感染等方面发挥重要作用。IL-23不仅能够促进Th17细胞分泌IL-17,还能够促进Th17细胞增殖和维持其存活,研究发现哮喘小鼠IL-23水平增高,其原因可能是当哮喘接触过敏原时,巨噬细胞和树突状细胞转变为激活状态,摄取和处理抗原,从而分泌大量的IL-23[12]。

本实验发现哮喘小鼠的Th17细胞比例显著高于对照组,Th17细胞相关细胞因子IL-17和IL-23亦明显增高,与文献报道一致[13]。哮喘发生的可能机制是高水平的IL-23促进了Th17细胞的分化和IL-17的产生,IL-17作用于相应的靶器官,促进其他细胞因子的产生,引起嗜酸粒细胞浸润而参与哮喘的发病。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的研究中也已发现,Th17细胞受到IL-23的驱动产生IL-17,能诱发小鼠发生EAE[14]。还有实验表明IL-23/Th17/IL-17轴在炎症性肠病的致病机制中发挥着相当重要的作用[15]。

糖皮质激素是目前控制哮喘气道炎症的最有效药物。糖皮质激素具有免疫抑制和抗炎作用,能使过敏性炎症反应的调节紊乱重新达到平衡。本实验发现通过地塞米松干预后,哮喘小鼠气道反应性降低、BALF中嗜酸粒细胞减少、气道黏膜炎症减轻。同时,还发现通过地塞米松干预后哮喘小鼠中Th17细胞数量、IL-17及IL-23水平较哮喘组明显下降,表明激素可能通过抑制IL-23的表达,从而对Th17的分化和增殖有抑制作用,并进一步减少IL-17的产生而阻止哮喘的发生。

Th17细胞的发现弥补了Th1/Th2介导的哮喘机制的不足。进一步了解Th17细胞的分化和调控过程,以及Th17细胞相关细胞因子IL-17和IL-23生物学功能等,深入研究糖皮质激素如何干预Th17细胞的数量和功能的变化,对于哮喘的研究具有重要意义。

摘要：目的 探讨地塞米松对支气管哮喘小鼠辅助性T细胞(Th)17表达的影响。方法 36只BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组和地塞米松组,每组12只。建立哮喘小鼠模型;采用肺功能仪测定气道呼气阻力(Re);HE染色观察肺组织炎症改变;收集BALF进行细胞计数;酶联免疫吸附法(ELISA)检测肺匀浆中IL-17和IL-23水平;流式细胞术检测脾脏单个核细胞中Th17细胞比例。结果 地塞米松组Re及气道炎症较哮喘组明显减轻;哮喘组IL-17和IL-23水平明显高于对照组,地塞米松组明显低于哮喘组;哮喘组Th17细胞显著高于对照组,地塞米松组则明显低于哮喘组。结论 地塞米松可下调哮喘小鼠中Th17细胞数量及相关细胞因子IL-17和IL-23水平,减轻哮喘小鼠的气道炎症。

关键词：哮喘,Th17细胞,IL-17,IL-23

Th17细胞 篇2

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2014.04.008

Study on the Balanced Regulation of Juanbi Granule on Th17/Treg Cells in Mice with Collagen-induced Arthritis

LIU Wei-chao，LI Ling-yu，WAN Chun-ping，LI Zhao-fu，ZHENG Xi，QI Yan，WU Jing-jin，PENG Jiang-yun

【ABSTRACT】 Objective：To study the balanced regulation of Juanbi Granule on Th17/Treg cells in mice with collagen-induced arthritis in order to explore its mechanism in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：The arthritis models were induced by the bovine type II collagen.20 DBA/1 mice were divided equally into the CIA group and the Juanbi granule group according to the clinical score.The arthritis clinical score method was used to observe the seriousness of the onset of arthritis in CIA mice；the flow cytometry was used to detect the subpopulation of the splenic lymphocytes （CD4，CD8，B220），and the Th17，Th1 cytokines and the expression of Treg cells in CD4+T cells.Results：Juanbi Granule could significantly reduce the clinical score of CIA mice with collagen-induced arthritis，but had no significant effect on the subpopulation of the splenic lymphocytes （CD4，CD8，B220）.Meanwhile，it down regulated the expression level of IL-17A in the CD4+T cells of CIA mice，promoting the expression of Treg cells in a certain extent.Conclusion：Regulating the balance of the Th17 cells and Treg cells and down-regulating the expression of the proinflammatory cytokine IL-17A may be one of its mechanisms in the treatment of rheumatoid arthritis.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；arthritis，collagen-induced；Juanbi Granule；Th17 cell；regulatory

T cells；mice

蠲痹颗粒是中医学家吴佩衡学术继承人、云南省名老中医吴生元教授基于扶阳理论总结出的治疗类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的效方，主要由附片、川芎、赤芍、桂枝、麻黄、薏苡仁、五加皮等组成，具有温经散寒、祛风除湿、通络止痛之功，主治寒湿痹阻之RA。最新研究表明，Treg、Th17细胞功能和分化过程具有共同之处却又相互对抗，其平衡失调影响着RA发生与转归[1-2]。

1 实验材料

5 参考文献

[1]Littman DR，Rudensky AY.Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation[J].Cell，2010，140（6）：845–858.

[2]Bettelli E，Carrier Y，Gao W.Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J].Nature，2006，441（7090）：235-238.

[3]万春平，彭江云，李兆福，等.蠲痹颗粒对胶原诱导性小鼠关节炎的抑制作用及机制研究[J].中药材，2013，36（9）：1505-1507.

[4]周茹，杨以阜，左建平.II型胶原诱导的小鼠关节炎动物模型的建立及影响因素[J].中国药理学通报，2006，22（12）：1532-1535.

[5]King C，Tangye SG， Mackay CR.T follicular helper （TFH）cells in normal and dysregulated immune responses[J].Annu Rev Immunol，2008，26：741-766.

收稿日期：2014-02-21；修回日期：2014-03-17

Th17细胞 篇3

1 Th17细胞概述

1.1 Th17细胞的分化

根据细胞的功能可将CD4+T细胞分为Th1、Th2辅助细胞以及T调节细胞三个亚群[2]。初始CD4+T细胞接受抗原刺激后, 在不同的条件下可分化成不同亚型的T细胞, 执行不同的功能。最近研究发现一种名为Th17细胞的细胞亚群高水平分泌IL-17[3], 其特征是释放IL-17A、IL-17F, 在含有感染的病原细菌和真菌的黏膜表面比较丰富。研究发现经T细胞抗原受体 (TCR) 活化的CD4+T细胞在转化生长因子β (TGF-β) 作用下表达转录因子维甲酸受体相关孤儿受体γt (RORγt) 和叉头蛋白3 (Foxp3) , 由于微环境中细胞因子的种类和浓度不同, 此阶段的CD4+T细胞既可分化为Th17细胞也可分化为Treg细胞[4]。

最早发现Th17细胞分化TGF-β和IL-6/IL-21, TGF-β单独存在不能诱导Th17的分化但TGF-β是Th17分化的关键因子之一。对缺乏IL-6的小鼠使用抗CD25抗体治疗后结果发现仍有Th17细胞产生, 由此可推断在Th17细胞产生过程中除了IL-6外还有其他因素起作用。有研究证明IL-21能够在体外代替IL-6, 但其作用不如IL-6强烈[5];除此之外还发现IL-1β与IL-6可协同诱导实验小鼠Th17细胞的分化[6]。

RORγt在Th17细胞分化过程中起着至关重要的作用, 是Th17细胞的特异性转录因子, 将编码RORγt的逆转录病毒导入初始T细胞中能诱导IL-17的产生, 而RORγt缺陷的小鼠体内Th17细胞数量显著降低。除此之外, RORα也与Th17细胞的表达有关, 缺乏RORα可减少IL-17在体内外的表达。Th17细胞的分化有赖于RORγt和RORα的联合作用, 若二者同时缺陷将阻碍Th17细胞的产生。因此, RORγt和RORα这两种谱系特异性核受体能共同调节Th17细胞的分化[7]。

Du等[8]发现mi RNA在Th17细胞的分化以及自身免疫性疾病的发生发展中发挥着十分重要的作用。他们通过利用过度表达和干扰工具改变多发性硬化 (MS) 和实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 小鼠体内的mi RNA-326表达水平, 发现在mi RNA-326过度表达的EAE小鼠的中枢神经系统中Th17细胞浸润数量明显增加, 他们还证明了mi RNA-326可通过结合Ets-1 (一种已知的Th17细胞分化抑制因子) 基因的m RNA从而抑制其翻译阻止Est-1的合成, 最终促进Th17细胞的分化。

IL-23属IL-12细胞因子家族, 主要由树突状细胞 (dendritic cell, DC) 产生。最初认为IL-23是启动Th17细胞分化的细胞因子, 随后发现该细胞因子不能诱导初始CD4+T细胞分化为Th17细胞。初始CD4+T细胞不表达IL-23R, 当接受TGF-β和IL-6刺激后才表达IL-23R, 使得细胞能够对IL-23作出反应[9]。IL-22的表达受IL-23与IL-23R协同作用诱导, 而且还可进一步上调IL-23R表达, 进而维持Th17细胞的稳定和增殖。

1.2 Th17细胞的功能

Th17细胞在体内的作用机制十分复杂, 其发挥免疫调节作用的主要效应因子是IL-17A。IL-17A有强烈的致炎性、增强细胞的渗透性以及促进其他炎症细胞因子及趋化因子的产生等多种作用, 并且在上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞等多种细胞上都有丰富的IL-17受体 (IL-17RA) 。Das Sarma等[10]在实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 小鼠实验中发现EAE组小鼠中枢神经系统中IL-7RA的表达明显强于对照组, 由此可以说明IL-17A在自身免疫疾病中发挥了确切的致炎性作用。另有研究显示, Th17的功能活性可随着所在局部环境其他细胞因子的变化而变化, 既可以发挥致病性也可以发挥保护性作用。

IL-17是由Th17细胞特异性分泌的一组细胞因子, 该细胞因子家族包括IL-17A、B、C、D、E、F 6个家族成员。已知IL-17在体内外均是强效的炎症因子, 具有多种生物学活性, 可诱导促炎因子 (如IL-6、TNF) 、化学因子 (如KC、MCP-1和MIP-2) 和基质金属蛋白酶等增进组织炎症产生。IL-17细胞因子家族生物学功能并不完全相同, IL-17A和IL-17F是重要的促炎症因子, 它们分别以同型二聚体或异型二聚体存在, 是固有免疫和适应性免疫细胞的效应细胞因子。IL-17A和IL-17F可诱导促炎因子 (TNF、IL-1、IL-6、G-CSF和GM-CSF) 编码基因的表达, 参与炎症发展和宿主防御细菌感染。IL-17A还可通过SCF、G-CSF介导粒细胞生成进而促进粒细胞至炎症区域发挥作用, 而固有免疫细胞和上皮细胞可产生IL-17F, 其诱导促炎因子的能力相对IL-17A较弱[11]。IL-17E与IL-17A同源性只有15%~20%, IL-17E是由黏膜上皮细胞和多种免疫细胞分泌产生, 转基因超表达的IL-17E可以促进嗜酸性粒细胞增多, 并可激活NKT、Th2和Th9细胞, 诱导Th2细胞因子 (IL-4、IL-5和IL-13) 及IL-9的产生, 抑制Th1和Thl7细胞反应[12]。因此, IL-17E与IL-17A、IL-17F的生物学功能有显著差异, 而IL-17B、IL-17C和IL-17D有类似于IL-17A诱导炎症介质表达的功能, 但它们的免疫学性质尚待进一步研究。

2 Th17细胞对IBD的作用机制

活动性溃疡性结肠炎 (UC) 和活动性克罗恩病 (CD) 是人类IBD的主要表现形式, 目前IBD的发病机制仍不明确。已有许多研究表明黏膜免疫系统的功能紊乱在IBD的发病机制中发挥了重要的作用, 在肠道各种类型炎症性细胞中, 黏膜CD4+T细胞在慢性炎症的持续和效应阶段通过释放前体炎症细胞因子从而起主导作用。黏膜免疫系统的功能紊乱是IBD形成的关键因素, 而黏膜免疫的异常应答与肠道微生物群的改变以及黏膜上皮屏障的异常密切相关。通过IBD的实验研究显示在启动免疫发病机制过程中CD4+细胞群起着举足轻重的作用, 而CD4+细胞群主要依赖各类促炎细胞因子的分泌 (如IL-12、IL-17、IL-23等) 才能发挥这种功能[13]。Th17细胞是CD4+T细胞群分泌的一个新的亚群, 伴随着Th17细胞及其相关细胞因子的发现, 对IBD的研究也随之有了一些新的认识与新的研究方向。

2.1 IL-17与IBD

随着对Th17细胞分化的深入研究, 一些其他的调节因子也逐渐被发现, 例如类维生素A受体RORα通过Th17细胞产生IL-17A和IL-17F在IBD的发生发展中也起着重要作用[14], 干扰素调节因子4 (IRF4) 能选择性的调节细胞因子 (包括IL-17A) 在IBD中的表达[15]。

Neurath等[16]研究发现UC、CD患者炎症性肠黏膜中Th17细胞及IL-17水平高于正常人及缺血性结肠炎患者, 与这项研究结果相一致的是, IL-17A及IL-17F RNA在IBD炎症性肠黏膜中的表达水平相对于正常对照组更为突出。

Kobayashi等[17]也发现Th17细胞及与其相关的促炎细胞因子在UC、CD患者体内会表达水平更高, 而且正常对照组及非活动期患者结肠黏膜局部及血清中Th17/IL-17的含量相对于活动期的UC和CD患者均明显降低, 由此可推断Th17细胞及其分泌的IL-17在IBD中发挥着至关重要的作用。

有学者探讨了Th17细胞的分布, Th17细胞相关细胞因子的表达 (IL-17, IL-21和IL-22) , 及其与IBD患者的疾病活性的相关性。研究方法是通过实验应用ELISA检测40例UC、20例CD患者和20名健康对照者血清IL-17, IL-21和IL-22的水平。Th17细胞和结肠组织中Th17细胞相关细胞因子表达的分布由一个标准的免疫程序进行评估。用皮尔森和Spearman相关分析法分析Th17细胞相关的细胞因子和疾病活动性指数、内窥镜和组织学分级、CRP和PLT水平的表达之间的相关性。结果发现Th17细胞和Th17细胞相关的细胞因子 (IL-17, IL-21和IL-22) 在活动性IBD患者肠黏膜中分布增加并且可能在疾病的活动性和黏膜损伤中起重要作用[18]。

2.2 IL-21、IL-22与IBD

除了IL-17, Th17细胞分泌的IL-21和IL-22在IBD的致病过程中也发挥着一定作用。研究显示, IL-21能够刺激病变局部肠黏膜上的IL-21R诱导产生巨噬细胞炎症蛋白合成体-3α (MIP-3α) , 从而介导炎性反应促进Th17细胞分化及分泌IL-17, 最终导致炎症的发生及加重[19]。在IL-21缺乏的小鼠实验中, 病变局部肠黏膜IL-17的含量明显减少。有研究表明在UC和CD患者病变的肠黏膜固有层内IL-21的表达显著增高, 其可通过刺激人成纤维细胞分泌一种基质金属蛋白酶并作用于肠道黏膜从而破坏消化道。通过特异性IL-21R融合蛋白抑制IL-21的活性也可明显减少由Th17细胞所介导的肠道炎性反应的发生[20]。这说明在Th17介导的肠道炎性反应中IL-21发挥着重要的调节作用。

Zenewicz等[21]研究发现, IL-22在炎症过程中具有双重调节作用, 其既有致炎性又能使实验小鼠免受IBD的损害。IL-22的这种双重调节机制可能与CD4+T细胞及NK细胞的调节作用有关, 可根据所在炎症环境的不同对机体组织做出促炎性和保护性反应。其促炎性表现为IL-22可通过刺激肠成纤维细胞产生炎症因子、趋化因子, 增强TNF-α、IL-8的表达从而增强肠道炎症效应;另外, IL-22还可上调NF-κB水平增强其在肠黏膜的炎症效应。保护性反应体现在IL-22能通过维持上皮屏障的完整性和杯状细胞高分泌抗微生物肽从而在炎性反应中起保护作用[22]。

2.3 IL-23与IBD

目前在大量小鼠自身免疫性疾病和炎症性疾病模型 (如EAE、胶原蛋白诱导性关节炎及肠炎等) 建立的发病机制中已经证实IL-23在IBD大发生发展中起着关键性作用[23]。IL-23是由p19及IL-12亚基p40聚合而成, 相对于UC和健康对照组, IL-23 p19在CD患者体内的表达明显增加, 并且发现上皮内T淋巴细胞 (IEL) 、NK细胞的活化和细胞毒性的增加与IL-23增强有关, 增强了Th17细胞的分化及IL-17A的表达[24]。这就表明IL-23与IBD的发生发展存在密切关系。

Th17细胞的增殖分化受多种细胞因子影响。早期研究表明在缺乏IL-23基因的小鼠体内无法生成Th17, 由此可见在Th17分化过程中IL-23具有重要作用[25]。近年研究显示IL-23是Th17细胞分化的主要促动因子可强烈刺激Th17细胞释放IL-17, 从而构成IL-23/IL-17炎症轴, 拥有强大的促炎作用[26]。到目前为止有大量研究证实IL-23可促使肠道T细胞的增殖, 促进Th17细胞的聚集还可加强表达IL-17A+、IFN-γ+T细胞群的出现, 对促进Th1、Th17相关因子的合成发挥着重要作用[27]。结合Th17细胞的分化机制可推断尽管IL-23可能并非Th17细胞分化的必需因子, 但其可促进分泌大量的IL-17, 是Th17细胞存活繁殖的重要因子, 最终导致IBD发生、发展。

3 小结

Th17细胞 篇4

1资料与方法

1.1一般资料选取2015年1-12月于深圳市南山医院门诊就诊的已确诊为支气管哮喘的患者30例(含吸入糖皮质激素者),排除标准:(1)在抽血前3个月内未使用口服或静脉糖皮质激素者;(2)合并肺部其他疾病者;(3)合并严重心肝肾脏等其他系统疾病者。另择同期于深圳市南山医院进行健康体检的职工30例作为正常对照组,分别抽取两组受试者2 m L×3支EDTA抗凝血。两组一般年龄和性别比较差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性,见表1。本研究经本医院伦理委员会批准同意且患者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1血浆及外周血单个核细胞(PBMC)的准备取两组受试者的抗凝血6 m L,其中2 mL离心后,取上层血浆,置-80℃冰箱保存备用,其余部分用PBS液1∶3稀释备用。将淋巴细胞分离液加入离心管内,将稀释好的外周抗凝血缓慢加在上层,2000 r/min×30 min离心,用吸管轻轻将PBMC层细胞缓慢吸出,用PBS缓冲液低温离心洗涤PBMC 3次。查看细胞活力,确保活力大于95%,用含有10%胎牛血清的RDMI 1640培养基重悬细胞备用。

1.2.2 PBMC Th17细胞的标记在PBMC培养基中分别加入莫能霉素、离子霉素及PMA,孵箱内培养6 h,取出细胞进行标记,分别标记CD4-FITC,IL-17-PE,CD25-APC,每种标记均设置阴性同型对照,相关试剂均购自e Bioscience USA公司,按照说明书操作。

1.2.3外周血Treg细胞的标记直接取收集的外周血进行CD4、CD25表面抗原的标记,标记好的细胞破膜后进行Foxp3及其同型对照的标记,每种标记均设置阴性同型对照,相关试剂均购自e Bioscience USA公司,按照说明书操作。

1.2.4流式细胞术分析标记好的PBMC流式细胞仪为美国Beckman-Coulter公司产品,以前向角(FS)和侧向角(SS)散点图设门区分PBMC,对门内CD4+的T淋巴细胞进行分析,每管收集1×104个细胞,分析CD25+Foxp3+细胞和IL-17+细胞在CD4+细胞中的比例。使用EXPO32 ADC Analysis软件分析结果。

1.2.5随诊要求支气管哮喘患者在慢性持续期随诊时,要求完成ACQ评分,在评分前需由经治医生详细讲解表格内容。

1.3统计学处理使用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计学分析,计量资料以(±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验,相关分析比较采用线性相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1外周血Th17/Treg细胞检测结果支气管哮喘急性发作期患者外周血Th17比例较正常对照组明显升高,在恢复后即处于慢性持续期时较急性发作期明显下降;Treg在急性发作期明显下降,而在慢性持续期时又明显上升,比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.2慢性持续期支气管哮喘患者ACQ评分与Th17/Treg相关性分析Th17、Th17/Treg与ACQ评分均呈正相关(r1=0.445,P1=0.014;r2=0.468,P2=0.009),Treg与ACQ评分呈负相关(r=-0.407,P=0.026),Th17与Treg之间无明显相关性(r=-0.339,P=0.067)。

3讨论

支气管哮喘发病机制比较复杂,目前尚未完全明确,经典理论认为气道的炎症机制是其中最主要的机制,T细胞介导的免疫失衡在其中起到了关键作用,辅助性T细胞1型(Th1)/辅助性T细胞2型(Th2)细胞失衡已明确在支气管哮喘发病起重要作用,但目前很多研究证实支气管哮喘的发病机制不能用单纯的Th1/Th2细胞失衡来解释[2,3]。研究证实Th17、调节性T细胞及其代表性细胞因子IL-17、IL-10等在免疫系统疾病的发病机制中起到重要作用,如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等疾病[4,5]。文献[6-7]指出在儿童哮喘中,也存在Th17/Treg的平衡失调,本研究以成人支气管哮喘为研究对象,主要研究支气管哮喘外周血是否存在Th17/Treg免疫失衡,及其与疾病严重程度之间的关系。

首先笔者发现在成人支气管哮喘患者急性发作期间Th17比例较正常对照组明显升高,而Treg细胞比例明显下降,这与之前在儿童哮喘中的研究结果一致,本研究还发现在支气管哮喘缓解期,上述异常升高或下降的指标均趋向正常。这说明Th17/Treg免疫失衡在支气管哮喘的急性发作中起到了关键的作用。

Th17细胞通过免疫调节在支气管哮喘的炎症反应中起到重要作用。首先通过分泌IL-17,诱导上调IL-8的分泌,从而引起中粒细胞在气管内的聚集,并介导气管的炎症反应。Cheung等[8]的研究表明,Th17细胞还可以通过分泌IL-17作用于嗜酸性粒细胞,刺激嗜酸性粒细胞释放化学介质,增强炎症反应。有研究表明在重症哮喘的肺泡灌洗液及血浆中,儿童哮喘患者的外周血中均可检测到升高的Th17细胞和IL-17细胞因子,在动物实验中,有研究表明IL-17R缺失的小鼠不能被OVA激发成哮喘[9,10]。各种致敏原用不同方法诱导的哮喘动物模型中,大多提示IL-17具有重要作用[11]。本文研究结果表明在成人支气管哮喘疾病中,Th17细胞比例明显升高,且与疾病的严重程度之间存在着正相关,与前人的研究结果一致。

Treg细胞是机体重要的免疫调节机制,可以负反馈调节T细胞活化引起的免疫反应,从而使其不会因过度免疫对机体造成损伤。国内外许多研究证实在儿童哮喘和哮喘重症患者外周血中的CD4+CD25+Treg细胞的数量和功能均受到抑制,主要表现为哮喘患者体内的Treg细胞的FoxP 3 mR NA表达下降,且分泌IL-10和TGF-β水平显著下降[6,12]。因此推测Treg细胞可能参与哮喘气道炎症的发生。本研究结果亦表明在成人支气管哮喘患者体内也存在CD4+CD25+Fox P3+Treg数量的下降,与国内外的研究结果一致,并证实Treg细胞的抑制与疾病的严重程度之间存在相关性。

由此可见,Th17及Treg细胞在支气管哮喘体内均有数量的异常,但是它们之间是否存在有相关性呢?本研究也对支气管哮喘患者在哮喘慢性持续期的两个指标之间进行了相关性分析,结果表明两者之间并不存在明显的相关性,该结果与之前在儿童哮喘体内的发现并不一致,考虑因为支气管哮喘是一个复杂的免疫疾病,各种细胞和细胞因子之间作用错综复杂,仅仅几个细胞亚群或细胞因子来解释其免疫失衡远远不够[13]。

本研究的结果表明,在支气管哮喘患者外周血中确实存在Th17及Treg细胞的免疫紊乱,可能为支气管哮喘的治疗提供新的靶点。

摘要：目的:探讨Th17/调节性T细胞(Treg细胞)在支气管哮喘患者外周血中的表达及意义。方法:收集30例正常对照组,30例确诊支气管哮喘患者(哮喘组)在急性发作期及缓解期外周血,分别检测Th17/Treg细胞的表达情况。结果:支气管哮喘患者急性发作期间Th17较正常对照组明显升高,而Treg细胞比例明显下降,支气管哮喘缓解期上述异常指标均趋于正常,但比正常对照组仍有明显改变(P<0.05)。Th17、Th17/Treg与支气管哮喘患者ACQ评分呈正相关(P<0.05),Treg与ACQ评分呈负相关(P<0.05),但Th17和Treg之间无明显相关性(P>0.05)。结论:在支气管哮喘患者体内的存在Th17及Treg细胞的平衡失调,可能参与疾病的进展,成为免疫调节治疗的靶点。

Th17细胞 篇5

1 资料与方法

1.1 对象

收集2009年1月至9月我院住院和门诊HT患者, 从中随机抽取74例, 其中男6例, 女68例, 年龄14~61岁, 平均 (36±12.2) 岁, 所有患者均经手术病理或穿刺活检证实;选取年龄、性别与患者匹配的健康志愿者22例, 其中男4例, 女18例, 年龄25~56岁, 平均 (38±9.6) 岁。

1.2 仪器

超声检查使用LOGIQ 9型彩色多普勒超声诊断仪 (美国GE公司) , 探头频率12 MHz。常规测量甲状腺两侧叶各径线及峡部厚度, 观察甲状腺轮廓及内部回声, 应用彩色多普勒血流成像 (CDFI) 技术观察甲状腺内血流信号分布情况, 并测量双侧甲状腺上动脉收缩期峰值流速 (PSV) 、舒张末期流速 (EDV) 及阻力指数 (RI) 。

主要试剂:人淋巴细胞分离液 (天津灏洋生物制剂公司) , 总RNA抽提试剂 (Invitrogen公司) , 逆转录试剂盒 (TOYOBO公司) , SYBR预混合液Ex Taq、PMD18T-A克隆试剂盒 (Ta KaRa公司) 。

1.3 方法

1.3.1 检测指标

甲状腺形态及内部回声改变, 甲状腺各径线大小, CDFI观察其血流信号分布状况, PBMC中白细胞介素17 (IL-17) 和RORγt的mRNA水平及诊断HT常用指标TGAb、TMAb、TSH的水平。

1.3.2 标本处理

用肝素抗凝管收集健康志愿者、HT患者外周血2 ml, PBS以1∶1稀释, 混匀, 沿管壁轻缓移入放有等体积Ficoll-泛影葡胺 (人淋巴细胞分离液) 离心管, 1 500 r·min-1离心15 min, 离心半径10 cm, 吸取分层液的云雾层, PBS洗涤后收集细胞加总RNA抽提试剂, 置于-70℃保存。

1.3.3 总RNA提取和c DNA的合成

异硫青酸胍-酚-氯仿法提总RNA:-70℃冰箱取出冻存的细胞, 室温融化加入预冷的200μl氯仿, 振荡15 s。室温放置10 min后4℃、12 000×g离心15 min。吸上层水相400μl至新EP管中, 加500μl异丙醇, 轻混匀。室温放置10 min后4℃、12 000×g离心10 min, 可见管底半透明胶状物质, 即RNA。去上清, 以1 ml体积分数为75%的乙醇 (DEPC水配制) 洗涤RNA。4℃、7 500×g离心5 min后, 去乙醇洗剂, 风干RNA。溶解RNA于10μl DEPC水中。核酸检测仪检测所提取RNA的A260/280。按逆转录试剂盒说明书合成c DNA:RNA 8μl, 胸腺嘧啶核苷酸链1μl, 脱氧核糖核苷三磷酸 (10 mmol) 2μl, 5倍逆转录缓冲液4μl, 逆转录试剂Rever Tra Ace (100 U·μl-1) 1μl, RNA酶抑制剂1μl, 焦磷酰胺二乙酯3μl, 总量20μl, 反应条件:42℃20 min, 99℃5 min, 4℃5 min。

1.3.4 检测质粒的构建

根据Gen Bank中目的基因序列, 用Premier 5.0软件设计目的基因检测引物, 由上海生工生物工程技术公司合成。以上述制备的c DNA为模板, 选取下列最佳的特异性扩增条件: (1) 反应体系:10倍PCR反应缓冲液2μl, 脱氧核糖核苷三磷酸1.6μl;上下游引物各0.3μl (10 pmon·L-1) ;c DNA模板1.0μl, Taq DNA聚合酶 (5 U·μl-1) 0.2μl;氯化镁 (25 mmol) 0.8μl;双蒸水13.8μl。 (2) 反应条件:94℃预变性5 min, 1个循环;94℃30 s, 62℃ (T-bet/IL-17) /63℃ (RORγt) /56℃ (IFN-γ, β-actin) , 72℃30 s, 35个循环。

1.3.5 RORγt、IL-17、β-actin基因重组质粒标准品制备

将上述产物进行TA克隆, 转化DH5α感受态, 阳性筛选, 构建好的标准质粒PMD18-RORγt、PMD18-IL-17、PMD18-β-actin经上海生工生物工程技术公司测序, 结果正确。将含有目的基因的质粒测定浓度, 并计算质粒拷贝数, 稀释成108~1045个梯度浓度的标准品备用。

1.3.6 Rotor-Gene 6000定量PCR仪检测目的基因表达

采用实时荧光定量PCR (QRT-PCR) 检测RORγt、IL-17 mRNA的表达水平。所有样本的检测值都用β-actin进行校准。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件分析, 所有数据以±s表示, 采用非参数Mann-Whitney检验, P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1甲状腺大小、形态变化

68例 (92%) HT患者甲状腺各径线值均增大, 其中峡部明显增厚者13例 (18%) (见图1) ;6例 (8%) 患者甲状腺体积径线略缩小;甲状腺形态不规则, 边界多清晰。健康对照组甲状腺未见明显增大。

2.2 甲状腺内部回声表现

(1) 内部回声呈弥漫性减低者最为多见 (62例, 84%) , 部分患者可见线状高回声分隔, 腺体呈不规则网络状改变; (2) 内部回声呈局限性不规则减低者较少 (12例, 16%) ; (3) 腺体内见结节形成者18例, 单个结节者15例 (图2) , 两个及以上结节者3例;结节回声以低回声为主, 境界多欠清晰, 结节外腺组织回声减低。健康对照组甲状腺内回声较均匀, 未发现结节回声。

2.3 甲状腺血流表现

以腺体内血流信号呈轻或中度增多 (图3) 为多见 (47例, 64%) , 信号明显增多者较少见 (4例, 5%) , 15例 (20%) 血流信号在正常范围, 另有8例 (11%) 患者甲状腺内部血流信号减少。频谱多普勒显示腺体内血流多呈持续性、平坦静脉血流或低阻动脉血流频谱。甲状腺上动脉峰值流速为 (45±7.9) cm·s-1, 高于正常水平 (22~33 cm·s-1) 。

2.4 HT患者和健康对照者PBMC中RORγt、IL-17mRNA表达水平的比较

HT患者RORγt、IL-17 mRNA的表达水平显著高于健康对照者 (P<0.01, 图4) 。

2.5 诊断符合率

HT常用诊断指标检测阳性 (具有1个指标阳性即判为阳性) 55例, 阴性19例, 漏诊率为26%, 高于Th17细胞水平检测的漏诊率 (阳性66例, 阴性8例, 漏诊率11%) , 侧面说明Th17细胞水平检测具有较高的诊断符合率。

3 讨论

HT是一长期缓慢进展的病理过程, 起病隐匿, 缺乏典型或特异性临床表现, 且常与其他甲状腺疾病并存。在临床诊断中, 一般以自身抗体作为诊断指标, 但在某些病人体内这些指标为阴性, 漏诊率较高。因此寻找新的检测手段以提高HT患者检出率, 具有重要的临床意义。

最近研究发现一类区别于Th1、Th2的新的CD4+T细胞亚群———Th17细胞, 主要分泌IL-17。近几年来, Th17细胞及其细胞因子成为广大研究者研究的焦点。有研究发现, IL-17水平在类风湿性关节炎、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓炎、炎症性肠病、银屑病等自身免疫性疾病患者血中升高[2,3,4,5]。虽然很多细胞可以分泌IL-17, 但其主要是由Th17分泌的。因此甲状腺组织中浸润的较多IL-17淋巴细胞即Th17细胞。IL-17作为一种强促炎因子, 能招募大量炎症细胞, 并促进这些炎症细胞释放炎症因子, 扩大反应链从而加剧炎症, 引起甲状腺组织的破坏。RORγt是Th17细胞特异性的转录因子[6], 它的升高也证明Th17细胞的大量浸润。更有研究发现, IL-17水平在自身免疫性甲状腺疾病者血中升高, 但在HT患者血中升高更加明显[7], 因此对诊断该疾病又有了新的介入点。本研究结果显示, HT患者Th17细胞及相关因子表达水平明显升高, 这与以前的研究成果[8]相符。因此, Th17水平可以作为HT诊断指标之一。

HT患者超声表现为甲状腺弥漫性增大, 其病理基础是以淋巴细胞为主的炎症细胞大量浸润, 如前述, 甲状腺组织中浸润的较多IL-17淋巴细胞即Th17细胞, 可见甲状腺弥漫性增大与Th17细胞水平是有关联的。同时, HT患者多普勒表现HT腺体内血流大多呈轻-中度增多, 经以往研究证实, IL-17可导致血管翳的形成及促肿瘤生成血管等, 本研究中HT患者血中Th17细胞水平显著升高, 其与TSH共同导致HT患者多普勒血流呈轻-中度增多。因此, HT患者B超表现与其外周血PBMC中Th17细胞特异性转录因子及相关因子水平之间有一定的关联性。鉴于HT患者B超表现及Th17具有一定关联性, 两者联合检测可以提高诊断率。有研究证明, Th17的表达水平随HT病情加重而逐渐增高[9]。因此, Th17可以作为判断病情严重程度的另一标准。

本研究证实, Th17细胞诊断HT较其诊断常用指标漏诊率较低, 因此, 在临床上, 综合常用指标、B超表现及Th17细胞水平检测, 可提高HT的确诊率。

摘要：目的:通过检测桥本甲状腺炎 (HT) 患者外周血单个核细胞 (PBMC) Th17特异性转录因子等的mRNA水平及观察患者B超表现, 并与健康者对照, 为HT的诊断提供新思路。方法:用超声检查观察74例确诊HT患者甲状腺形态及内部回声改变, 测量甲状腺各径线大小, 彩色多普勒血流成像 (CDFI) 技术观察其血流信号分布状况;应用实时荧光定量PCR (QRT-PCR) 技术检测患者及健康对照者PBMC中白细胞介素17 (IL-17) 和视黄醛酸相关孤儿核受体 (RORγt) 的mRNA水平。结果:92%的HT患者甲状腺呈弥漫性增大, 以前后径及峡部增厚为特征, 内部回声以弥漫性减低为主, 血流信号多表现为轻中度增多。HT患者PBMC中IL-17和RORγt mRNA的表达水平均明显高于健康对照者 (P<0.01) 。结论:甲状腺B超检查联合外周血Th17及RORγt检测, 可以提高HT的检出率。

关键词：视黄醛酸相关孤儿核受体,白细胞介素17,超声,桥本甲状腺炎

参考文献

[1]宿士智, 于进, 李忠华.结节性甲状腺肿合并甲状腺微小癌41例分析[J].东南大学学报:医学版, 2013, 32 (3) :330-332.

[2]PARK H, LI Z, YANG X O, et al.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17[J].Nat Immunol, 2005, 6 (11) :1133-1141.

[3]CHEN Y, LANGRISH C L, MCKENZIE B, et al.Anti-IL-23therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis[J].J Clin Invest, 2006, 116 (5) :1317-1326.

[4]BRTTELLI E, SULLIVAN B, SZABO S J, et al.Loss of T-bet, but not STAT1, prevents the development of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Exp Med, 2004 (200) :79-87.

[5]NEURATH M F, WEIGMANN B, FINOTTO S, et al.The transcription factor T-bet regulates mucosal T cell activation in experimental colitis and Crohn's disease[J].J Exp Med, 2002, 195 (9) :1129-1143.

[6]IVANOV I I, MCKENZIE B S, ZHOU L, et al.The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+T helper cells[J].Cell, 2006, 126 (6) :1121-1133.

[7]陈紫君, 刘纯, 李强, 等.Th17细胞及相关细胞因子在自身免疫性甲状腺疾病中的变化及意义[J].免疫学杂志, 2011, 27 (9) :785-788.

[8]宋进展, 吴汉妮, 钱伟.慢性淋巴细胞性甲状腺炎患者外周血Th17的检测及意义[J].细胞与分子免疫学杂志, 2009, 25 (10) :927-928.

Th17细胞 篇6

笔者自2013年以来将抗痨丸与抗结核西药联合应用于结核病的治疗,以期探讨该治疗措施对于患者Th17及Tr平衡状态的影响,从而为临床实践提供理论依据。

1临床资料

诊断标准: 参照中华医学会制订的《肺结核诊治指南》 中的诊断标准进行。

纳入标准: 1) 年龄18 ~ 75岁; 2) 符合诊断标准,且结核分枝杆菌测试( + ) 者; 3) 患者意识清楚,知晓研究内容,签署知情同意书; 4) 经医院伦理委员会批准同意。

排除标准: 1) 有其他严重肺部疾患者如慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺部感染等; 2) 有高血压、糖尿病等严重躯体疾患及精神疾患者; 3) 有其他病毒感染者; 4) 妊娠期及哺乳期妇女; 5) 对治疗药物过敏者; 6) 依从性差,中途退出者。

根据上述标准,2013年1月—2014年1月将本科收治的106例肺结核患者作为研究对象,纳入研究。根据临床前瞻性研究原则,将所有患者随机分为两组,即: 抗痨丸结合抗结核西药治疗组( 简称观察组) 以及单纯抗结核西药治疗组 ( 简称对照组) ,每组53例。观察组患者中男28例,女25例; 年龄21 ~ 73岁,平均( 42. 8 ± 4. 9) 岁; 对照组患者中男30例,女23例; 年龄20 ~ 73岁,平均( 42. 2 ± 4. 5) 岁。所有患者均经结核菌及胸片检查无异常,两组患者一般资料比较,差异不具有统计学意义( P > 0. 05) ,具有可比性。

2方法

2.1干预治疗

对照组: 仅给予患者抗结核的一般治疗措施,主要包括抗结核化疗措施,具体为予以异烟肼0. 6 g/d静脉滴注; 利福平( 0. 45 ~ 0. 60) g/d、吡嗪酰胺( 1. 0 ~ 1. 5) g/d、乙胺丁醇0. 75 g/d,强化治疗3个月,而后行7个月巩固治疗,上述药物1次/d,口服。观察组: 在对照组治疗措施的基础上,予以抗痨丸( 广州白云山陈李济药厂,规格0. 2 g/粒) 进行治疗,8粒/次,3次/d,3个月为1个疗程。

2.2观察指标及检测方法

免疫细胞检测: 将所有患者取空腹静脉血,将其置于抗凝管中,采用流式细胞仪( 美国BDBiosciences公司) 对CD4、 CD8、CD3三色单抗试剂进行检测,按照说明书步骤进行,对CD4 T细胞数进行计数。根据Tr及Th 17悬浮液,再进行两者含量测定的基础上,计算两者比例。

2. 3统计学方法所有数据均采用SPSS18. 0统计学软件进行整理与分析,计数资料采用 χ2检验; 计量资料采用t检验,分别采取不同的检验方法,以P < 0. 05表示有统计学意义。

3结果

3. 1疗效标准治愈: 症状消失,痰菌( - ) ,X线示病变被完全吸收或者无活动性,空洞闭合; 显效: 症状显著减轻,痰菌( - ) ,X线示病变明显吸收; 好转: 部分症状减轻,痰菌 ( + / - ) ,X线示病变有所吸收; 无效: 上述指标未见改善, 甚或加重。

3.2两组患者临床疗效的比较见表1。

与对照组比较* P < 0. 05

由表1可见,加用抗痨丸组的临床总有效率为90. 57% , 常规抗结核治疗组总有效率为73. 58% ,两组间差异显著, 有统计学意义( P < 0. 05) 。

3. 2两组患者治疗前后CD4T细胞总数以及Tr、Th17在其中的比例变化结果见表2。

与对照组比较* P < 0. 05

4讨论

肺结核归属于中医学“虚劳”、“痨瘵”范畴,具有较强的传染性,治疗亦有一定的难度。目前,西医临床获得普遍认可的化疗方案为利福平 + 异烟肼 + 乙胺丁醇 + 吡嗪酰胺,可较好的杀灭结核杆菌,并防止耐药突变菌,但该措施不良反应较重,且患者及家属多承受较大的经济与心理压力,故而, 探索其有效治疗措施,是现今需要解决的难题之一。

中医学在几千年的发展中,通过历代医家的不断积累与总结,在结核病的治疗中确定了“杀其虫,以绝其根本,补其虚,以复其真元”的治疗原则,本研究中选用的“抗痨丸”即以此立方,方中矮地茶、百部、白芨、桑白皮等,具有抗痨杀虫、活血通络、散瘀生新之疗效[3],同时,现代药理学研究亦表明: 抗痨丸可有效提高机体免疫力,改善肺结核患者的临床症状,加快空洞的吸收闭合[4]。本文研究结果发现,观察组患者有效率为90. 57% ,优于对照组有效率73. 58% ,差异具统计学意义( P < 0. 05) ,与前述结果相契合。

既往研究指出,当机体出现疾患时,Th17以及Tr之间的平衡状态被破坏[5,6],在疾病的发展与预后评价之中,二者的平衡状态尤为重要。本研究显示,较之正常人群,结核患者的Th17细胞数量降低,然而,随着治疗,观察组的Th17呈现上升的趋势,CD4T细胞总数亦有所增加,而Tr则降低, 逐渐呈现趋向于平衡状态。

Th17细胞 篇7

1 资料与方法

1.1一般资料

以湖北医药学院附属东风总医院(以下简称“我院”)2010年1月~2014年10月皮肤科门诊、住院及会诊的24例蕈样肉芽肿患者作为治疗组,其中男13例,女11例;年龄28~75岁,平均(49.4±1.9)岁;病程8个月~30年,平均(8.6±0.2)年。 所有纳入研究的患者均行常规组织病理及免疫病理检查,并符合《中国临床皮肤病学》[1]蕈样肉芽肿诊断标准,并且近半年均未接受系统药物治疗, 无合并其他皮肤病或系统性疾病。对照组24名来自我院体检中心的健康人群, 均为随机抽查,男女各12名,年龄25~64岁,平均(43.2±2.1)岁。所有入组人员均行血常规、肝肾功能、尿常规、心电图等检查。 两组患者年龄、常规检查比较差异无统计学意义(P > 0.05),具有可比性。

1.2 主要仪器和试剂

人IL-17、IL-23和IL-6 ELISA试剂盒购于美国e Bioscience公司 ; 酶标仪为美国产Eh800型Bio Tek酶标仪,离心机Eppendorf 5810由德国Eppendorf公司生产;超低温(-80℃)冰箱由日本Sanyo公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1实验标本的收集及储存清晨空腹状态下,取治疗组和对照组患者肘静脉血5 m L, 置于含有酶抑制剂的抗凝管中,以3000 r/min低温离心15 min,分离血浆保存于-80℃冰箱中。

1.3.2采用ELISA法检测血清标本中人IL-17、IL-23和IL-6的含量试剂配制和操作步骤严格按说明书进行,分别设置空白孔、标准品孔和待测样品孔,显色后用酶标仪在450 nm处检测A值,建立标准曲线,计算出样本含量。 所有检测指标均同次复验。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析, 计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血液项目检测结果比较

治疗组和对照组患者的血常规、血生化等血液检测结果比较差异无统计学意义(P > 0.05),见表1。

注:WBC:白细胞;Cr:肌酐;ALT:谷丙转氨酶

2.2 两组血清中 IL-17、IL-23 和 IL-6 的表达情况比较

治疗组患者外周血中IL-17、IL-23和IL-6的含量水平均显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P < 0.05)。 见表2。

注 : 与对照组 , * P < 0.05;IL-17: 白 17;IL-23: 白 素 23; IL-6: 白 6

3 讨论

蕈样肉芽肿首先由1806年法国的Alibert医生报道,是皮肤T细胞淋巴瘤的最常见类型,男女比例为1.6~2.0∶1,病程呈慢性渐进性[9]。 临床上根据皮损改变分为红斑期、斑块期及肿瘤期三期。 蕈样肉芽肿的预后与临床分期、皮损的严重程度及是否系统受累密切相关,因此,明确蕈样肉芽肿的发病机制,早期诊断、早期治疗对改善病情预后尤其重要。

传统的CD4+T细胞分为Th1和Th2细胞亚群 ,Th17细胞是一种新的CD4+T细胞亚群 , 具有独特的发育分化调节机制, 在IL-23的刺激诱导下可促进CD4+T细胞分化为Th17细胞 ,使其分泌IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-6、TNF-α 及CXCL1、CXCL8等趋化因子[2,9,10,11]。 Chong等[12]应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术对正常健康人群 、银屑病患者 、早期及晚期蕈样肉芽肿患者外周血Th1、Th2及Th17细胞亚群细胞因子做比较,结果提示早期及晚期蕈样肉芽肿表达高水平IL-17,Krejsgaard等[13]研究认为,与正常人比较,IL-17受体在皮肤T细胞淋巴瘤的表达增加,而IL-17F与皮肤T细胞淋巴瘤的皮损严重程度及疾病进程相关,这与Ciree等[4]的研究结果相符,Doherty[15]的研究提示IL-23在蕈样肉芽肿患者表皮角质形成细胞及真皮淋巴细胞过表达,以上结果提示IL-17细胞因子参与蕈样肉芽肿的发病过程。

Th17细胞 篇8

1资料与方法

1.1一般资料选取2013年1月-2015年1月本院皮肤性病科白癜风患者192例作为研究对象, 采用随机数字表法将其分为研究组与对照组。研究组96例, 其中男46例, 女50例;年龄1~60岁, 平均 (32.15±10.25) 岁;病程1个月~20年, 平均 (4.25±1.02) 年;疾病分型:局限型40例, 散在型46例, 泛发型10例;疾病分期:稳定期46例, 进展期50例;皮损面积0.5 cm×3 cm~4 cm×13 cm, 平均 (18.54±5.12) cm2。对照组96例, 其中男48例, 女48例, 年龄1~60岁, 平均 (32.09±10.33) 岁;病程2个月~21年, 平均 (4.33±1.07) 年;疾病分型:局限型38例, 散在型46例, 泛发型12例;疾病分期:稳定期50例, 进展期46例;皮损面积0.5 cm×4 cm~4 cm×14 cm, 平均 (18.49±5.09) cm2;两组性别、年龄、病程、疾病分型、疾病分期及皮损面积等一般资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2诊断、纳入及排除标准

1.2.1诊断标准参照《白癜风临床分型及疗效标准》中关于白癜风的诊断标准: (1) 后天发病, 原因不明的色素脱失白斑, 呈乳白色, 形态大小各异; (2) 白斑分布可局限于某部位或散在、泛发全身, 并沿皮神经节支配区分布; (3) 根据病情程度将其分为稳定期与进展期。原白斑范围未见扩大, 未见新白斑皮损出现者为稳定期, 白斑范围逐渐扩大, 边界模糊, 新白斑皮损出现者为进展期; (4) 病程缓慢, 无自觉临床症状。 (5) 排除其他病因造成的色素脱失或色素减退造成的白斑[3]。

1.2.2纳入标准符合白癜风的诊断标准, 皮损≥2处, 受累面积<20%体表面积, 对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2.3排除标准合并自发色素再生史, 合并严重心肺功能不全, 严重肝肾功能衰竭, 免疫功能低下, 采用免疫抑制剂药物治疗, 采用皮质类固醇激素治疗, 合并糖尿病、高血压、慢性内科疾病, 妊娠期与哺乳期妇女, 对卡介苗多糖核酸、紫外线过敏, 合并精神性疾病患者。

1.3方法

1.3.1治疗方法对照组采用308 nm准分子激光皮肤光疗仪 (美国XTRACAL7000公司) 照射治疗, 调节参数:工作气体为氯化氙, 波长308 nm, 光斑直径10/20/25 mm, 单脉冲能量150 m J/cm2, 脉宽60 ns, 频率200 Hz, 再根据皮损反应适当调整照射剂量, 治疗2次/周, 1周为1个疗程, 总疗程10周, 共20次。研究组在对照组基础上采用卡介苗多糖核酸 (商品名:治疗用卡介苗, 生产企业:成都生物制品研究所有限责任公司, 批准文号:国药准字S19983036, 规格:1 m L/支) 治疗, 2 m L肌注, 每2天1次, 总疗程10周。

1.3.2检测方法治疗前后采集新鲜抗凝外周血5 m L, 采用2000 r/min密度梯度离心15 min, 分离淋巴细胞, 采用PBS缓冲液漂洗, 采用含胎牛血清BPMI1640培养液重悬, 滴加50μg/L佛波酯、500μg/L离子霉素与0.67 mg/L莫能霉素于37℃孵育4 h, PBS缓冲液漂洗, 滴加1μg CD4-FITC抗体, 4℃孵育0.5 h, PBS缓冲液漂洗, 滴加250μL破膜固定液, 4℃孵育20 min, 采用1 m L破膜液漂洗2次, 分为3管, 分别加入IL-17-PE 1μg, 室温避光孵育0.5 h, 破膜液漂洗2次, 采用流式细胞仪检测外周血Th17细胞亚群变化。

1.4观察指标比较两组临床疗效及不良反应 (疼痛性红斑、眼睑水肿、局部瘙痒等) 发生情况, 比较两组不同疾病分期临床疗效的差异, 比较两组患者治疗前后外周血Th17细胞亚群的变化。

1.5疗效判定标准参照中国中西医结合皮肤性病学会关于《白癜风临床疗效评定标准》评定白癜风的临床疗效, 其中白斑彻底消退, 100%皮损面积恢复正常肤色者评估为治愈;部分白斑消退, 白斑范围逐渐缩小, 50%~99%皮损面积恢复正常肤色者评定为显效;部分白斑消退, 白斑范围逐渐缩小, 10%~49%皮损面积恢复正常肤色者评定为有效;小部分白斑消退, 白斑范围逐渐缩小, 0~9%皮损面积恢复正常肤色, 或白斑范围逐渐扩大者评定为无效, 总有效率=治愈率+显效率+有效率。

1.6统计学处理本研究数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料以率 (%) 表示, 比较采用字2检验, 以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1两组临床疗效比较治疗后, 研究组治疗总有效率明显高于对照组, 比较差异有统计学意义 (字2=9.26, P<0.05) , 见表1。

例 (%)

2.2两组不同疾病分期临床疗效比较治疗10周时, 研究组进展期患者治疗总有效率明显高于同组稳定期患者, 比较差异有统计学意义 (字2=9.38, P<0.05) ;对照组进展期患者治疗总有效率明显高于同组稳定期患者, 比较差异有统计学意义 (字2=5.34, P<0.05) , 见表2。

2.3两组治疗前后外周血Th17细胞亚群比较治疗前, 两组外周血Th17细胞亚群比例比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) ;治疗后, 观察组外周血Th17细胞亚群比例明显低于治疗前及对照组, 比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表3。

*与同组治疗前比较, t=40.24, P<0.05

2.4两组不良反应发生情况比较两组不良反应发生率比较, 差异无统计学意义 (字2=0.00, P>0.05) , 见表4。

3讨论

白癜风是由于皮肤色素代谢障碍导致的疾病, 该病治疗难度较大, 治疗疗程较长。白癜风的发生机制与以下因素具有密切的关系: (1) 自身免疫系统; (2) 皮肤黏膜色素细胞脱失; (3) 内分泌系统; (4) 铜离子、酪氨酸相对缺乏; (5) 遗传; (6) 药物、精神刺激、手术刀伤、烫伤、砸伤、擦伤、碰撞等; (7) 环境因素。白癜风治疗原则主要为促进皮损处色素沉着与白斑范围逐渐缩小, 改善外观及皮肤对光照的耐受程度[4]。白癜风治疗主要采用局部整体相结合、中西医相结合的治疗方案, 其中主要包括手术治疗与非手术治疗。白癜风的非手术治疗方案包括窄谱中波紫外线 (NB-UVB) 、比较光化学疗法 (PUVA) 及糖皮质激素治疗等[5]。308 nm准分子激光具有促进黑素细胞增殖、黏附与迁移的作用, 可促进白癜风皮损边缘、毛囊处黑素细胞增殖, 诱导黑素新生细胞迁移至白斑部位, 促进皮损处色素沉着与白斑范围逐渐缩小, 308 nm准分子激光照射疗法有助于抑制皮肤抗原提呈细胞, 降低朗格汉斯细胞功能与数量, 抑制免疫功能, 促进角朊细胞合成白介素, 增强网状内皮细胞及其补体的吞噬功能, 调节机体免疫效应[6]。大量文献证实, 308 nm准分子激光治疗白癜风患者的起效时间短、疗效佳、不良反应较低, 可明显改善白癜风儿童与白癜风成人患者的病情活动程度, 且治疗依从性高, 可明显改善白癜风儿童与成人患者的生活质量[7]。卡介苗多糖核酸是卡介苗多糖核酸类提取物, 其通过激活巨噬细胞, 可增强T、B细胞介导的体液免疫与细胞免疫功能[8]。经临床研究与实验研究证实, 卡介苗多糖核酸对Th17相关因子具有重要的调节作用[9]。Th17细胞亚群及其相关因子在介导免疫细胞因子释放, 促进免疫性疾病中具有重要的意义[10]。但关于卡介苗多糖核酸与308 nm准分子激光对白癜风患者外周血Th17细胞亚群的影响研究尚少。

本研究结果显示, 卡介苗多糖核酸与308 nm准分子激光结合治疗的总有效率由单纯308 nm准分子激光治疗的66.67%提高至85.42%, 提示卡介苗多糖核酸在白癜风患者的治疗中具有重要的价值。卡介苗多糖核酸与308 nm准分子激光结合疗法或单纯308 nm准分子激光疗法对患者进展期治疗总有效率更高, 提示308 nm准分子激光疗法对进展期白癜风患者的临床疗效更佳, 可能由于: (1) 308 nm准分子激光属于中波紫外线, 可直接诱导与间接诱导T淋巴细胞的凋亡, 且每周1次308 nm准分子激光照射治疗的效果较为理想; (2) 进展期黑素细胞损伤尚未完全, 且仍暴露部分的黑素细胞, 而稳定期色素脱失完全, 病程较长, 其对308 nm准分子激光照射治疗敏感性均造成一定的负面影响[11,12]。卡介苗多糖核酸与308 nm准分子激光结合治疗, 患者外周血Th17细胞亚群比例由单纯308 nm准分子激光治疗的 (3.85±0.49) %降低至 (1.48±0.15) %, 揭示了卡介苗多糖核酸通过显著下调白癜风患者外周血Th17细胞亚群比例, 从而发挥免疫调节的作用, 间接反映了卡介苗多糖核酸通过改善机体免疫功能, 从而达到治疗白癜风的目的[13]。最后, 卡介苗多糖核酸与308 nm准分子激光结合治疗并不增加白癜风患者的不良反应发生风险, 与相关研究报道结果一致[14,15]。