心脏缺血再灌注（精选11篇）
心脏缺血再灌注 篇1
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂
超氧化物歧化酶检测试剂盒、丙二醛检测试剂盒、蛋白检测试剂盒、DH-140B型动物人工呼吸机、全自动生化测定仪、721型可见分光光度计。
1.2 动物分组与模型建立
成年清洁级雄性SD大鼠30只,重250~300 g,由南方大学医学院实验动物中心提供,随机分为三组:假手术组、模型组、川芎嗪治疗组,大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(30 mg/kg),经气管建立人工机械通气,呼吸频率65~70次/min。分离左侧股静脉插管用于药物的滴注。于胸骨左缘2~4肋间打开胸腔及心包膜,5-0号丝线缝扎冠状动脉,结扎30 min后,使缺血心肌恢复血流灌注,再灌注60 min后结束实验,取血离心后血清与左心室心尖部心肌组织保存于深低温冰箱。
1.3 生化指标测定
取血清由自动生化分析仪测定CK、AST、LDH水平。自冰箱取出取心尖部心肌组织制成匀浆,匀浆介质为p H 7.4、0.1 mmol/L、Tris-HCl,配成10%心肌组织匀浆液,3000 r/min,离心15 min,取上清液测MDA及SOD,MDA采用硫代巴比妥酸比色法,SOD测定用黄嘌呤氧化酶法。
1.4 统计学方法
数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,相关性采用Pearson相关性分析。所有操作以SPSS 11.5统计软件完成。
2 结果
与对照组比较,模型组血清CK、AST、LDH水平及心肌组织MDA、SOD水平升高(P<0.05);与治疗组比较,血清CK、AST、LDH水平升高(P<0.05),心肌组织MDA水平升高,SOD水平降低(P<0.05)(表1)。
与对照组比较,▲P<0.05;与模型组比较,■P<0.05
3 讨论
心肌缺血-再灌注损伤是指心肌组织缺血低氧性损伤不但发生于缺血当时,更主要的是发生于恢复血液灌注后[1],心肌缺血-再灌注损伤的发生机制复杂,目前认为大量氧自由基生成,引发强烈的脂质过氧化反应,是造成心肌细胞损伤的最主要机制[2],心肌缺血低氧期,由于产生大量黄嘌呤和次黄嘌呤,灌注期黄嘌呤氧化酶活性增加导致氧自由基大量生成[3]。在缺血低氧时,Ca2+进入线粒体增多[4],可使超氧化物歧化酶活性降低,使清除自由基能力下降,最终导致自由基增多。MDA是氧自由基产生的脂质过氧化物的中间代谢产物,常被作为反映氧自由基生成和造成损害的指标;SOD是心肌清除氧自由基所必需的酶,其活性反映缺血-再灌心肌抗氧化作用的程度。本实验中模型组的CK、AST、LDH明显升高,说明心脏缺血-再灌注后存在着心肌细胞损伤;在治疗组,CK、AST、LDH水平低于模型组,说明川芎嗪对缺血-再灌注损伤心脏具有保护作用;通过检测MDA、SOD心肌水平,在模型组MDA、SOD水平高于对照组,提示心肌在缺血-再灌注损伤时,心肌内细胞氧自由基生成增多,同时抗氧化系统激活,加快氧自由基的清除,保护缺血后再灌注心肌,也说明抑制自由基生成或清除氧自由是心肌损伤的原因之一。在治疗组,大鼠心肌组织SOD水平高于模型组,川芎嗪对抗氧化系统有激活作用或保护作用,并且降低了MDA水平。综上所述,川芎嗪对大鼠心肌缺血-再灌注引起的心功能降低具有明显的保护作用,其机制可能与抑制自由基生成或清除氧自由基作用有关,但其具体机制尚待进一步研究。
摘要：目的:探讨川芎嗪对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用。方法:SD大鼠30只,分为假手术组、模型组和川芎嗪治疗组,造模后分别于缺血30min、再灌注60min观察三组大鼠的血清CK、AST、LDH水平和心肌组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化。结果:模型组与对照组比较,CK、AST、LDH指标升高,心肌组织MDA含量和SOD活性升高,同治疗组相比,CK、AST、LDH水平升高,心肌组织MDA含量升高,SOD活性降低。结论:川芎嗪对大鼠心肌缺血-再灌注引起心肌损伤具有明显的保护作用,其机制可能与抑制自由基生成和清除氧自由基作用有关。
关键词：川芎嗪,心肌缺血-再灌注损伤,丙二醛,超氧化物歧化酶
参考文献
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[4]徐新春.钙超载与心肌缺血-再灌注损伤[J].心血管病学进展,2000,21(4):227.
心脏缺血再灌注 篇2
目的:研究脑缺血再灌注(CIR)后脑组织中蛋白酶激活受体-1(PAR-1)的表达及其与炎症反应的关系. 方法:40只雄性SD大鼠线栓法建立大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,再灌注后于3 、6 、12 h及1 、2 、3 、7 d取脑,免疫组化法和脑组织匀浆法检测PAR-1、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的.含量. 结果:缺血再灌注后脑组织PAR-1表达增加(P＜0.01),MDA含量增多(P＜0.01),SOD活性降低(P＜0.01);PAR-1表达与MDA含量正相关(r1=0.844,P＜0.05),与SOD含量负相关(r2=-0.901,P＜0.01). 结论:CIR后PAR-1表达增多可加重脑组织炎性反应.
作 者：周青珍 王华梅 吴家幂 ZHOU Qing-zhen WANG Hua-mei WU Jia-mi 作者单位：周青珍,ZHOU Qing-zhen(郧阳医学院附属东风医院神经内科,湖北,十堰,442000)王华梅,WANG Hua-mei(江宁医院神经内科,江苏,南京,211100)
吴家幂,WU Jia-mi(弋矶山医院神经内科,安徽,芜湖,241001)
刊 名：郧阳医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF YUNYANG MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)：2008 27(3) 分类号：Q26 关键词：大脑中动脉 栓塞 蛋白酶激活受体-1★ 高血压注意事项
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心脏缺血再灌注 篇3
【关键词】脑缺血再灌注；ICAM-1；P-selectin；炎症反应
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物：选用健康成年雄性SD大鼠，体重250～300g。
1.1.2主要试剂和药品：2%戊巴比妥钠-生理盐水；4%多聚甲醛-PBS；抗ICAM-1羊抗鼠抗体；免疫组化二抗试剂盒；防脱片剂。
1.1.3主要实验仪器：玻璃匀浆器、凝胶成像分析系统、电子天平、光学显微镜。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组
采用完全随机的原则，将大鼠分为四组，每组10只，分组如下：正常对照组、假手术组、模型1组、模型2组。
1.2.2线栓制备
取4-0单股尼龙丝线40mm，直径0.23mm。
1.2. 3大脑中动脉栓塞（MCAO）模型制作
参照Zea Lnoga等方法稍加改进，行右侧MCAO手术。于缺血2小时后拔出栓线，建立缺血再灌注模型。整个手术过程采用体表加热/制冷将肛温控制在36.5～37. 5℃范围内，同时将环境温度控制在25～30℃左右。
1.2.4神经症状行为学检测
依据Zea longa及Bederson等确定的5级评分方法进行神经功能评分。
1.2.5操作方法
正常组：与其它各组同时期常规饲养。假手术组：大鼠麻醉切开颈部皮肤后，仅分离CCA及ICA至PPA，不插线栓。模型组：将手术后造模成功，即神经功能评分在2～3分归入模型1组和模型2组，缺血2h后，按各组要求分别再灌注6h和24h。
1.2.6取材
各组动物在规定时间的手术观察完成后，于再灌注后各时间点以2%的戊巴比妥钠过度麻醉，迅速断头取脑，每组各取3例在冰盘上自大脑中动脉梗死区中心为起始点前后做约4mm厚的冠状切片，投入20%中性福尔马林固定液中固定，以做病理组织切片HE染色。
1.2.7指标检测与方法：缺血再灌注侧脑组织病理切片观察；ICAM-1、P -selectin的免疫组化染色。
1.2.8数据处理和统计学分析：采用SPSS（10.00版）统计软件包进行统计，所有数据采用平均数±标准差（M±SD）表示。各组组间差异采用单因素方差分析，继以LSD检验，以P<0.05作为具有显著性差异的标准。
2 结果
2.1局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO）大鼠行为学改变
①静止时不能充分伸展左前爪，行走时向左侧转圈或倾倒；②动物爬板实验时，总是落向左侧；③提尾实验时，左前肢内收，头弯向左上；④出现霍纳氏征。神经功能评分在2～3分。
2.2脑缺血侧脑组织形态学改变
2.2.1大体标本观察
脑缺血再灌注模型组和治疗组：缺血再灌注6h见脑膜血管高度充血，冠状切面组织有肿胀；缺血再灌注24h见脑组织轻度变软，切面淡黄色灰暗，灰质与白质界限变模糊，脑室变形。正常和假手术组：脑组织无充血水肿及坏死。
2.2.2光镜下观察（病理组织切片HE染色）
（1） 低倍镜下情况：观察到模型组和治疗组大脑皮层缺血坏死区域都集中在颞叶皮质区，即MCA支配供血区。表明造模成功，MCAO手术模型恒定，缺血区域一致，为大脑中动脉供血区。
（2） 高倍镜下情况
正常组与假手术组：皮质区正常，未出现坏死灶，脑组织及血管内未见炎性细胞。局灶性脑缺血再灌注6h模型组：缺血皮质区神经元开始变性坏死，可见胞核固缩为三角形，结构及核仁消失。局灶性脑缺血再灌注24h模型组：缺血皮质区神经元溶解性坏死严重，可见大量空泡形成，血管周围也出现较多炎性细胞并形成围管现象。
2.3脑缺血再灌注大鼠ICAM-1和P-selectin表达情况
免疫组化结果显示ICAM-l阳性血管表达部位主要分布在缺血侧皮层，与梗死灶周围区相一致；P-selectin阳性血管表达部位主要分布在缺血侧皮层，与梗死灶周围区相一致。
3 讨论
脑缺血损伤与动物模型的选择制备本模型的优点是：缺血部位恒定，且可进行再灌注，模拟了人类永久性及短暂性局灶性脑缺血的不同状态；由于对缺血及再通时间能进行准确控制，因而便于分析神经元对缺血的敏感性和耐受性，便于评价再灌注作用以及治疗时间窗的选择【1】；勿需开颅，术中不会引起血压、体温、血气的异常变化，避免了开颅对颅内环境的影响。局灶性脑缺血再灌注早期（1～24小时）缺血皮质出现神经元变性坏死和炎性细胞聚集、粘附及浸润，脑组织坏死范围和程度随着病程进展，炎症反应的继续而扩大加重【2】。在脑缺血再灌注早期（6小时）脑组织中ICAM-1、P-选择素表达水平即明显增高，且增高趋势在炎症反应期（24h）随病程进展而上升。
参考文献：
[1] 谢红妹，朱玲.细胞间钻附分子-1在局部缺血再灌流脑损伤中作用的研究.上海医学.1999，22（2）：109
心脏缺血再灌注 篇4
1 材料与方法
1.1 大鼠心脏缺血再灌注模型的建立与实验分组
选择实验大鼠：雄性,体重200～250 g,均符合Sprague-Dawley清洁级。模型建立前记录大鼠的体重,然后用戊巴比妥钠进行注射麻醉,使用小动物呼吸机通过气管插管辅助呼吸,操作过程中时刻监视心电图的变化。在左侧胸腔处实行开胸,并打开心包,在左心右下缘1 mm附近,使用无损伤缝针穿过左冠状动脉的心肌表层,进行结扎,30 min后恢复血流,最后逐层缝合胸腔。大鼠恢复自主呼吸后去掉呼吸机,保温待其清醒。假手术组同样经历以上手术过程,但不进行结扎。选择术后存活大鼠进行后续实验,所有大鼠均在相同条件下饲养。
大鼠分组：(1)D组：术后用地尔硫卓干预组30只,选择1周、2周、4周三个时间点分别注射和口服地尔硫卓,每个时间点10只；(2)I/R组：心脏缺血再灌注组30只,在相同时间点注射和口服生理盐水作为对照；(3)S组：假手术组30只,同样时间注射和口服生理盐水。
1.2 地尔硫卓药物用量
参照中国《不稳定心绞痛治疗建议》中推荐的成人用量30～60 mg t.i.d./q.i.d.,同时参考国外试验用量360 mg/d[2]。本实验制定的D组大鼠用药量为：每天36 mg/200 g,进行冠状动脉结扎手术后对大鼠进行尾静脉注射地尔硫卓4.5 mg/4.5 ml,输液泵维持3 h,后该改为灌胃36 mg/4 ml·200g(36 mg地尔硫卓+4 ml生理盐水),给药1次/d直到实验结束。
1.3 超声心动图检测
在每个时间点处,1周、2周、4周三个时间点,进行超声心动图检测。先用适量戊巴比妥钠对大鼠进行注射麻醉,用二维图像引导做出M型曲线,并测量。每个时间点选取5个心动周期,分别记录各项指标值并计算平均值作为该指标的实验数据进行记录,同时进行图像录像。
超声检测指标包括：心率(HR)；左心室舒张末期内径(LVDd)和收缩末期内径(LVDs)；左心室舒张末期前壁厚度(AWT)和后壁厚度(PWT)；左心室舒张末期容积(LVEDV)和收缩末期容积(LVESV),计算公式：V=1.04×D3,其中D为内径；左心室重量(LVM)=[1.05×(LVDd+AWT+PWT)]3-LVDd3；左心室短轴缩短率(%FS)=(LVDd-LVDs)/LVDd×100%；每心搏量(SV)=LVEDV-LVESV；左心室射血分数(%EF)=SV/LVEDV×100%。
1.4 心肌炎症细胞检测
在每个时间点,提取各组大鼠心肌组织制作石蜡切片,并用HE染色,统计各种炎症细胞的数量并记录。
1.5 大鼠心肌细胞炎症因子检测
在每个时间点,提取各组大鼠心肌细胞内各种细胞炎症因子RNA,然后逆转录并进行PCR反应,检测各种细胞因此的含量。细胞炎症因子主要包括致炎因子：IL-1β(Interleukin 1β,白介素-1β)、IL-6(白介素-6)、TNF-α(Tumor necrosis factorα,肿瘤坏死因子-α),以及抗炎因子：IL-10(白介素-10)、TGF-β1(Transforming growth factor-β1,转化生长因子-β1)。
1.6 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差表示,采用χ2检验,当P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠超声心动图变化情况
术后1周和2周,各组大鼠超声心动图检测并没有显著性差异；术后第4周超声心动图检测,I/R组与S组和D组比较,左心室射血分数(EF)和左心室短轴缩短率(FS)均有明显下降,P<0.05,差异有统计学意义；左心室重量(LVM)I/R组也明显高于S组和D组,P<0.05,差异有统计学意义,证明I/R组心室增厚严重。详见表1。
注：P值为I/R组分别与S组和D组相比较的差异系数
2.2 各组大鼠术后第4周时心肌炎症细胞变化情况
术后第4周时,光镜下观察各组大鼠心肌组织切片并统计各种心肌炎症细胞的数目。S组心肌炎症细胞很少；I/R组炎症明显,中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润明显；D组经过地尔硫卓治疗,心肌炎症细胞明显减少；统计分析I/R组与S组和D组相比较炎症细胞明显较多,P<0.05,差异有统计学意义。详见表2。
注：P值为I/R组分别与S组和D组相比较的差异系数
2.3 各组大鼠术后心肌细胞炎症因子表达情况
结果显示致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α在缺血再灌注之后有明显的提高,术后1～2周达到峰值,在第4周稍微降低,但含量仍较高,使用地尔硫卓进行治疗之后,致炎因子表达明显降低,P<0.05,差异有统计学意义。I/R组与D组抗炎因子IL-10和TGF-β1表达水平相近,都没有高水平表达,因此I/R组表现出的炎症反应明显强于D组。详见表3。
心脏缺血再灌注引起心肌损伤主要是指心脏在短时间内出现供血中断后再恢复供血,使心肌出现损伤,且心肌损伤与胞内钙离子浓度升高有密切关系。心脏缺血再灌注后钙离子浓度升高可引起心肌炎症等心肌损伤的主要机制有以下几个方面：Ca2+浓度升高激活Ca2+依赖性蛋白酶、Ca2+依赖性核酸内切酶以及Ca2+依赖性磷脂酶,从而对细胞产生毒害作用,诱导心肌细胞细胞凋亡[3]；心脏缺血再灌注引起内皮细胞Ca2+浓度升高,直接对内皮细胞造成损伤,还可以增加内皮细胞中粘附因子的表达,促进血小板和炎症细胞与内皮细胞的粘附,诱导心肌出现炎症反应[4]。本实验结果显示,大鼠心脏缺血再灌注后心肌细胞出现不同程度的死亡,在第4周时心脏出现严重的功能性障碍,应用地尔硫卓进行治疗的D组大鼠心脏功能得到了有效改善。
光镜下观察各组大鼠在心脏缺血再灌注之后心肌细胞出现炎症情况发现,心肌细胞出现明显的中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润。文献报道[5],冠状动脉堵塞后,心肌组织缺血区会有大量白细胞的聚集,且再灌注后白细胞数目不但没有减少反而有增多的趋势。心肌组织缺血较轻的区域白细胞聚集数目也较少。研究表明,心脏缺血再灌注时心肌组织内白细胞的聚集机制可能与胞内钙离子浓度升高有关。
本实验中观察各组大鼠心肌细胞炎症因子表达情况,致炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达在心脏缺血再灌注之后有明显的提高,而抗炎因子IL-10和TGF-β1在缺血再灌注之后一直低水平表达,因此心肌细胞出现严重的炎症反应。TNF-α能够激活和聚集心肌细胞中白细胞,增强白细胞的吞噬能力,促进白细胞与内皮细胞的粘附作用,从而引起心肌炎症[6];IL-1β可激活炎症级联反应,活化中性粒细胞,上调粘附因子的表达,促进TNF-α介导的炎症反应；IL-6能够诱导T细胞的增殖与分化,促进中性粒细胞的分化[7]。IL-10和TGF-β1均具有免疫抑制作用,通过调节免疫细胞因子,抑制炎症反应[8]。
综上所述,心脏出现缺血再灌注之后,地尔硫卓可以有效抑制炎症细胞的活化和炎症因子的分泌,减轻心肌细胞炎症反应,改善心脏功能,为地尔硫卓临床治疗心脏缺血再灌注后心肌炎症提供了理论基础。
参考文献
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心脏缺血再灌注 篇5
【关键词】雌激素；肝脏缺血再灌注；保护
【中图分类号】R575.5【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0039-01
肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)常见于临床上入肝血流阻断肝切除术和肝移植。近年来，许多研究发现应用雌激素可以明显改善心、脑缺血再灌注损伤所带来的器官功能损害[1],那么雌激素在肝缺血再灌注损伤中是否发挥保护作用呢?本实验拟建立大鼠I/R模型，以研究雌激素在大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用。
1材料与方法
1.1材料与试剂选用清洁及健康雄性Wistar大鼠12只，月龄2.5个月左右，体重250～270g；雌性Wistar大鼠36只，月龄2～3个月，体重200～240g；17β-雌二醇，美国SIGMA公司提供。
1.2方法
1.2.1动物模型制作实验前12 h动物禁食，自由饮水。2％氯胺酮腹腔内注射麻醉(每100g体重注射0.5m1)，上腹正中切口进腹，入腹后离断肝周韧带，用小号血管夹分别夹闭左、中、右肝蒂，仅保留尾状叶作为门静脉与腔静脉血液回流通道。肝脏缺血90min后，放开血管夹，同时切除尾状叶。
1.2.2实验分组A组直接制作HIRI模型。B组及D组于肝缺血手术前10d切除双侧卵巢；C组也于肝缺血手术前10d作开腹手术，但不切除卵巢；B组和C组于术后每日均给予0.2 ml二甲基亚砜(DMS0)腹腔注射，D组在切除双侧卵巢后每日腹腔注射17β-雌二醇0.1mg/kg(溶于DMSO0.2 ml中)共10d，10d后制作HIRI模型。
1.2.3检测指标各组动物实验完成后下腔静脉取血4ml，测定其中ALT、AST、AKP水平。
1.2.4统计学处理实验数据以±s表示,组间比较采用方差分析。
2结果
各组大鼠血清中ALT、AST、AKP的含量见表1。
3讨论
缺血再灌注损伤是临床各科常需面临的一个问题。国内外有研究发现雌激素对脑、心、视网膜等脏器缺血再灌注损伤有一定的保护作用，而对肝脏缺血再灌注损伤的影响研究较少。本研究结果表明17β-雌二醇能降低肝脏缺血再灌注后血清转氨酶水平，提示雌激素对肝脏缺血再灌注损伤确有一定保护作用。但与假手术组相比，17β-雌二醇处理组转氨酶上升较明显，说明雌激素对肝脏缺血再灌注损伤虽有保护作用但并不能完全消除其所致肝脏损伤。关于雌激素对肝缺血再灌注损伤的保护机制，目前推测有以下几点：① 雌激素可通过非基因途径增加血管内皮源性NO合成酶的活性[2]，增加NO的合成与释放，而NO是目前所知最强的血管松弛因子之一，NO含量的升高，可使血管扩张，从而改善循环，减轻损伤；② 雌激素不仅可通过NO介导依赖机制减少超氧化物的产生[3]，其本身也具有抗氧化的特性，因此可从双方面减少I/R的损伤；③有研究表明，在I/R时，应用雌激素可明显增强微血管对乙酰胆碱和苯肾上腺素的应答，从而有助于再灌注期微血管功能的恢复[4]。
参考文献
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心肌缺血再灌注损伤机制探讨 篇6
心肌缺血再灌注损伤,概念于1960年由Jennings提出,是指在由心肌缺血发生再灌注后的一段时间内,心肌细胞受到2次损伤造成的一种病变,其过程可由多种触发物、媒介物效应器参与的复杂生物反应过程,涉及多种复杂细胞信号转导机制,并在诸多环节和多层次存在交互作用[2],对于影响急性心血管事件预后,其是主要因素之一。这种缺血再重新恢复血供后会造成心肌超微结构、功能、代谢及电生理方面的进一步损害,积极救治可延缓本病进程,但抢救不及时可导致患者发生不可逆的损伤,更为严重者可发生心功能不全、严重心律失常、甚至死亡。因此,现阶段关于本病的研究,特别是采取哪种措施来防止再灌注产生或如何来减轻损伤程度已经成为一个热点话题。目前报道的研究中认为本病发生与发展与氧化应激、心肌钙超载、心肌细胞凋亡、能量发生代谢障碍和细胞炎性因子等方面有着密切的关系。
增多的氧自由基
超氧物歧化酶(SOD)是重要的抗氧化酶在生物体内,广泛分布于如动物、植物、微生物等各种生物体内。它是生物体内清除自由基的首要物质,具有特殊的生理活性,可对因氧自由基对细胞造成的损害进行对抗与阻断,并使受损细胞得到及时修复,使因自由基造成的对细胞伤害得到复原,被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是机体内氧自由基的头号杀手,是氧自由基的自然天敌,其水平高低在体内的直接关系到机体的正常机能。
生物体内,自由基作用于脂质发生过氧化反应,氧化终产物为会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合的丙二醛,且具有细胞毒性,脂质氧化终产物丙二醛在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性。
当心肌细胞发生缺血时,氧气和ATP不能供应心肌足够的能量,此时就会导致心肌清除自由基的能力下降,这种过程是迅速的,当心肌细胞恢复灌注时,心肌中积累的氧自由基不能及时排除,就会攻击心肌细胞,最终造成心肌的损伤[3]。因此有文献报道,如果可以有效地清除再灌注前心脏中过量的氧自由基、提高氧自由基清除酶的活性、同时增强心肌的抗氧化能力,抑制心肌产生脂质过氧化物,就可以很好地减轻细胞膜损伤,最终达到抑制心肌缺血再灌注损伤的作用。国内学者经大鼠实验已经证实姜黄素可以明显减少心肌缺血再灌注大鼠血浆中丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶同工酶(LDH1)的含量[4],同时提高血清中的SOD活性,最终达到了减少心肌梗死面积的作用。
能量代谢障碍
缺氧是重要的病理过程,在机体缺氧时线粒体的能量生成减少,可供利用的ATP不足,此时为维持能量的供需平衡,机体启动一些自身固有的节能机制,积极地下调机体代谢活动的能量消耗。同时为保证重要生命活动的能量需求,机体能量利用发生重分配。
心肌缺血时,细胞氧化代谢减弱,糖酵解增加,能量代谢障碍,线粒体损伤,缺血再灌注后氧自由基生成、钙超载、微血管内皮细胞损伤和炎性反应等诸因素攻击心肌细胞,加重细胞代谢紊乱,造成不可逆转的损伤。此外短时的能量代谢障碍可导致心肌细胞基因表达异常,造成一些病理介质的释放,所以目前多数学者均认为心肌细胞内ATP水平的不足是导致心肌细胞发生凋亡甚至坏死的直接因素之一。
钙离子超负荷
细胞内钙超载是再灌注心肌损伤的重要机制之一。Na+-K+-ATP酶是真核生物细胞膜上的多功能蛋白多聚体,是维持细胞正常生理功能所必需的。它通过水解1个ATP,能转运3个Na+出细胞和2个K+进入细胞,所引起的电化学梯度是维持细胞静息电位和肌肉与神经组织的兴奋性所必需的,而且一些细胞膜转运功能和营养素的摄取等也是以这种离子梯度的存在为前提的。细胞内钙稳态主要是靠细胞膜Ca2+泵、Na+-Ca2+交换、肌浆网Ca2+摄取与释放以及线粒体能量依赖的Ca2+转运机制来维持的。
Ca2+超负荷的发生既是心肌受损的结果又是进一步损害的原因[5],细胞内钙超载是再灌注心肌损伤的重要机制之一。首先缺血再灌注期间氧自由基大量释放,细胞膜受损,细胞外钙大量涌入细胞内,能量代谢障碍致Ca2+外流减少,同时对细胞内钙水平调节能力减弱,细胞内发生明显的钙超载。其次线粒体、肌浆网受损,主动转运功能降低,细胞内过量的Ca2+无法转运贮存。再者,钙超负荷可使线粒体磷脂降解,细胞色素氧化酶系统失调,加重线粒体功能障碍,形成恶性循环。
细胞凋亡
缺血再灌注损伤与细胞凋亡也有着密切关系。细胞凋亡是生理性或某些因素诱发的程序化细胞死亡,是细胞在缺血再灌注损伤过程中的重要死亡形式。已有研究证实心肌细胞的凋亡是心肌缺血再灌注损伤的核心因素[6]。这个过程与可能由于其可以间接产生氧自由基,造成心肌发生氧化应激反应,从而导致心肌细胞膜上的脂质过氧化,促发了心肌细胞中病理介质信号传导系统激活[7],最终诱发心肌病理反应;其次还有研究显示,再灌注损伤也可以直接诱发心肌细胞DNA变异,诱发其凋亡[8],此外其他可能与攻击心肌细胞胞内蛋白,使具有抗氧化、抗炎症的酶活性蛋白质失活有关[9]。细胞凋亡的多少决定着缺血再灌注损伤的轻重,抑制心肌细胞凋亡,可以减轻心肌缺血再灌注损伤程度。
炎性因子
炎性反应也是心肌缺血再灌注损伤中重要的一环。有文献报道:当心肌发生缺血再灌注损伤时[10],可以导致心肌组织表面的内皮结构受损,而内皮结构的受损则容易促使中性粒细胞黏附于心肌血管内皮,中性粒细胞是体内重要的炎症促发因子,其在血管内皮黏附后可以诱发白介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)以及白介素6(IL-6)等释放,这些炎性细胞因子可反作用于心肌细胞,使得白细胞黏附、聚集于心肌表面,同时阻塞心肌毛细血管,产生血管活性物质,引起微循环障碍,活性氧类增加,释放细胞毒性物质,从而导致组织急性损伤[11]。
综上所述,心肌缺血再灌注损伤的主要机制已逐步明确,但其是一个错综复杂,涉及基因、分子、细胞、组织等多层面、多因素的科学问题,有待我们进一步研究探讨,这对改善心肌缺血再灌注损伤的预后及降低心血管疾病的死亡率有着重要的现实意义。
摘要：心血管疾病严重威胁着人类的健康。心肌缺血再灌注损伤可造成心肌超微结构、功能、代谢及电生理方面等一系列不可逆性损害,进而导致患者并发严重的心功能不全或心律失常,甚至可导致患者死亡。因此,有必要采取相应措施来防止再灌注损伤的产生,探讨其损伤机制有着重要的现实意义。
肾缺血再灌注损伤的研究进展 篇7
1 氧自由基与脂质过氧化
自由基是指电子轨道上有不配对电子的原子、分子, 包括氧自由基 (OFR) 系列如超氧阴离子 (O2-) 、羟自由基 (·OH) 、过羟自由基等和脂质自由基系列如烷自由基、烷基自由基、脂质过氧化物自由基等。氧自由基的形成可分为外源性和内源性。外源性主要是指能进行氧化还原反应循环的酮类、硝基类等物质。此外, 药物氧化、吸烟、电离、光照、热辐射冲击和氧化谷肤甘肤的物质、环境污染等外源性因素均能在细胞内形成自由基。内源性主要是指生物体内代谢过程中产生的自由基。正常状态下生物体的能量主要来自电子传递系统。在电子传递过程中, 分子氧完全还原成水的同时释放能量, 如果还原不完全则形成氧自由基。人体摄取的氧是接受线粒体内细胞色素体系传递的电子, 大部分接受四个电子还原成水, 其中仅有1%-2%的氧接受一个电子后漏出 (称为单价泄漏) 形成氧自由基。此时产生的氧自由基很少, 且组织细胞内的超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT) 、谷肤甘肤过氧化氢酶 (GSH--Px) 和髓过氧化物酶等能迅速清除氧自由基, 故组织细胞内不会出现氧自由基的堆积[5]。动物实验己经证实, 在细胞缺血的极早期, 细胞氧化磷酸化能力减弱, ATP合成减少, 离子泵功能部分失效, 特别是Na+-K+-ATP酶功能减弱, 使大量Na+内流, K+外流, 细胞膜电位下降, 产生去极化, 从而造成电压依赖性Ca2+通道开放, 大量Ca2+内流, 细胞缺血同时导致兴奋性氨基酸如 (谷氨酸、天冬氨酸等) 在细胞间隙的大量蓄积, 而后者又加剧Ca2+内流和细胞膜去极化, 导致细胞内Ca2+超载, 氧自由基增多, 其具体机理为: (1) 缺血后的肾脏血管内皮细胞以及中性粒细胞是产生氧自由基的主要细胞, 而在细胞中线粒体又是产生氧自由基的主要部位, 其中黄嘌呤氧化酶所催化的反应是氧自由基的主要来源。在电子传递链中复合物I脱氢酶 (NADH脱氢酶) 和复合物I I I (辅酶Q-细胞色素C还原酶) 是氧自由基产生的主要位点。肾缺血时由于缺乏相关的原料物质和氧气, 线粒体氧化磷酸化脱藕联, 辅酶Q循环中不稳定的中间产物半醌阴离子可以快速而且非酶性催化地将单电子直接传递给O2, 致使经单电子还原生成超氧阴离子 (O2-) 增多, 而经接受4个电子与4个氢离子还原生成水减少, 同时在这种病理条件下, 细胞内PH值降低, O2-更容易岐化成H2O2。同时肾脏组织中存在着黄嘌呤氧化酶, 它在细胞内以黄嘌呤脱氢酶 (D型) 的形式合成, 正常情况下D型占总活性的90%以上, 次黄嘌呤在分子氧的参与下经黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸和大量的氧自由基[6~7]。而此时, 肾脏组织细胞内的SOD, CAT, GSH-PX等氧自由基清除剂由于在缺血缺氧状态下生成减少、活力下降, 不能有效的清除氧自由基, 导致肾脏组织内氧自由基的大量堆积。 (2) 细胞内的Ca2+增高, 激活磷脂酶C和A2, 分解膜磷脂产生大量花生四烯酸 (AA) , 后者进一步分解, 不饱和脂肪酸经前列腺素合成酶催化生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸烟酰胺腺嘌呤二核昔酸, 此过程中生成大量氧自由基;细胞内Ca2+超载, 激活Ca2+依赖的蛋白激酶, 使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶, 同时肾缺血时ATP的降解产物次黄嘌呤和黄嘌呤增多。在黄嘌呤氧化酶作用下, 次黄嘌呤转变为黄嘌呤进而转变为尿酸。这两步反应中, 都以O2为电子受体产生大量O2-和H2O2。 (3) 再灌注时由于细胞中线粒体破坏殆尽, 不能利用氧进行有氧氧化产生ATP, 血液再灌注突然带入的氧一方面在黄嘌呤氧化酶的作用下产生O2-, 另一方面使缺血期因氧耗竭而停滞的烷自由基向脂质过氧化物自由基反应得以延续, 产生新的自由基, 进一步攻击不饱和脂肪酸[8]。此外, 再灌注带入的Ca2+可提高黄嘌呤氧化酶的活性, 促进O2-迅速转化为·OH, 重新激发自由基连锁反应, 造成更多的损害。自由基具有很高的化学活性, 可快速攻击其他化合物的分子并产生更多的自由基, 自由基破坏膜结构中蛋白成分、引起膜脂质过氧化, 导致膜损伤、线粒体功能障碍、溶酶体破裂、细胞溶解和组织水肿等一系列损害作用, 称之为自由基连锁反应。近年来大量研究证实, 自由基连锁反应是导致肾缺血再灌注损伤的主要原因[9], 其具体损伤机制可概括为: (1) 对生物膜的损害。生物膜包括细胞膜、线粒体膜和溶酶体膜等, 内含有丰富的多不饱和脂肪酸, 氧自由基因为具有极强的氧化活性, 极易攻击多不饱和脂肪酸生成多种脂质过氧化物, 导致生物膜多不饱和脂肪酸蛋白质比例失调, 生物膜的流动性下降和通透性增高[10~11], 进而造成生物膜的功能障碍。细胞膜受损后细胞肿胀, 细胞完整性破坏, 功能部分或全部丧失。线粒体膜受氧自由基攻击后发生肿胀、溶解、ATP合成障碍。溶酶体受攻击后出现溶酶体溶解破裂, 引起细胞自溶。由于线粒体是产生氧自由基的主要细胞器, 所以线粒体膜较细胞膜和溶酶体膜受损更严重。 (2) 自由基增加引起的核酸损伤 (Oxydative DNA Lesions, ODL) , 可以导致DNA链的断裂、交联导致细胞正常功能受损, 最终细胞死亡。其可能的方式为:自由基攻击核酸碱基, 造成碱基的化学修饰;攻击核糖与碱基之间的糖苷键, 形成无嘌呤无嘧啶位点;攻击核糖与磷酸基团之间的磷酸键, 形成带有3'-OH末端或3'-磷酸末端的DNA断裂片段:攻击核糖, 形成3'-磷酸糖基末端;氧自由基可以导致DNA链间或DNA与蛋白质之间产生交联。 (3) 氧自由基可诱发细胞凋亡, 其途径可能有以下两条:氧自由基可导致细胞内线粒体、内质网膜Ca2+迁移和质膜Ca2+-ATP酶活性下降或失活而导致细胞浆内Ca2+浓度升高。激活Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶, 导致DNA链的断裂。从而触发细胞凋亡。氧自由基可以影响与细胞凋亡有关的基因表达[12,13]。
2 Ca2+超载 (Calcium Overload)
细胞内Ca2+作为第二信使、代谢调节因子和膜稳定剂参与细胞膜生物电和胞内生化过程, 对修复基因转录核蛋白磷酸化和细胞凋亡过程均有影响, 在细胞正常机能活动中起重要作用。生理情况下, 细胞内的游离Ca2+浓度很低, 只有细胞外的1/10, 这依赖于细胞膜对Ca2+相对无通透性及细胞对Ca2+的主动排出来维持, 后一过程需消耗能量。多种转运系统参与了细胞的调节, 现己证实肾小管上皮细胞膜和细胞质内均存在钙的转运系统, 早期研究证实肾缺血再灌注损伤时可出现大量Ca2+内流, 且Ca2+内流的出现主要发生在恢复再灌注时。肾缺血后, 肾小管上皮细胞内Ca2+浓度明显升高, 从而使细胞内磷脂酶活力增加, 更多磷脂酶分解为游离脂肪酸, 另外Ca2+浓度增加使Ca2+-ATP酶活力增加, 从而消耗了更多ATP, Ca2+本身又可通过氧自由基途径造成组织损伤。缺血后再灌注期细胞内钙的变化与氧自由基的产生不同, 再灌注早期比缺血期有所减少, 这可能是与使Ca2+-ATP酶的活性一定程度恢复有关, 再灌注后期逐渐增高, 这可能是由于细胞膜结构的破坏所致。细胞内Ca2+超载的原因有以下几点: (1) 当肾缺血、缺氧时, 细胞氧化磷酸化能力减弱, ATP合成减少, 离子泵失效, 特别是Na+-K+泵功能的降低, 使大量的Na+内流, K+外流, 细胞膜电位下降产生去极化, 从而造成电压依赖性钙离子通道开放, 大量Ca2+内流; (2) 细胞缺血时, 由于K+和蛋白激酶C等作用, 兴奋性氨基酸、内皮素和NO等物质释放增多, 可使受体依赖性Ca2+通道开放, 也使大量Ca2+内流; (3) 胞内Ca2+增加, 可激活磷脂酶, 产生甘油二醋、前列腺素、三磷酸肌醇等物质, 协同兴奋性氨基酸代谢型受体激活配体操控性钙离子通道 (Recpter Operatedea Ca2+Channels, ROCC) , 使细胞内质网储存的Ca2+释放, 造成Ca2+超载; (4) 肾缺血、缺氧时, 产生大量的自由基, 使膜脂质过氧化, 损伤了脂质膜, 影响膜的通透性及离子转运, 引起Ca2+内流。钙超载主要是通过以下环节参与缺血再灌注损伤: (1) 激活膜结构中的钙依赖性磷脂酶, 破坏膜结构; (2) 干扰线粒体的氧化磷酸化偶联, 使能量代谢发生障碍; (3) 改变微管微丝的收缩作用和结构, 破坏细胞骨架, 最终导致细胞损伤; (4) 引发细胞调亡, 可能的机制:钙超载后激活Ca2+依赖性的核酸内切酶, 从而使双链DNA在核小体连接部位裂解, 形成DNA分块;钙超载可激活蛋白酶C, 使G蛋白磷酸化, G蛋白减少, 胞内CAMP增加, 导致细胞凋亡。钙超载与氧自由基的产生是肾IRI的重要因素, 二者相互影响, 协同作用, 导致肾IRI加重。细胞内产生过量的氧自由基可直接损伤细胞膜, 导致细胞膜通透性增加, Ca2+内流。而细胞内Ca2+浓度增高, 又可激活Ca2+依赖性蛋白酶, 后者可催化黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶, 而黄嘌呤氧化酶在有氧条件下能促进次黄嘌呤分解为尿酸的同时产生大量的氧自由基。
3 激素、免疫调节
恢复缺血肾组织的血供后.常发现局部仍无血流经过, 产生这种无血流现象的机制目前认为系激素与免疫分子的作用导致肾微循环障碍、细胞肿胀等引起。激素主要有内皮素 (ET) 、儿茶酚胺、肾素-血管紧张素、前列腺素和一氧化氮等。ET、儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ等主要是通过收缩肾小动脉、降低肾小球滤过率发挥对肾功能的损害作用。实验发现ET与其受体亲和力随再灌注时相的延长而增加;ET受体拮抗剂可明显增加肾缺血再灌注后的肾皮质血流, 减轻肾功能损害及组织学改变。改善GFR。一氧化氮是左旋精氨酸 (L-arginine) 在一氧化氮合成酶 (NOS) 的作用下合成的。研究发现, NOS分为两大类, 即原生型NOS (constitutive NOS, CNOS) 和诱生型Nos (inducible Nos, i Nos) [14~15], NO在肾脏中的作用有直接和间接两种, 前者由c NOS介导, 而后者由i NOS介导[16~18]。肾缺血再灌注后, i NOS的表达上调, 使NO产生增加, 当肾局部NO浓度过高时, NO的间接作用 (即毒性作用) 表现明显, 从而对肾脏造成损伤。
4 细胞凋亡
鲍磊[19]研究显示证实神经细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤中起十分重要的作用, Chatterjee等[20~21]发现肾IRI能激发较为广泛的细胞凋亡现象, 其病理变化主要表现为皮髓质交界部的肾小管发生细胞凋亡, 细胞凋亡在再灌注12h后逐渐下降, 至再灌注72h时尚可见到无核物质的凋亡小体, 最终被再生的肾小营上皮挤入管腔而排出, 并非被巨噬细胞吞噬清除。由此认为肾小管上皮凋亡是缺血再灌注后引起肾小管上皮细胞死亡的一个重要原因, 以控制肾小管上皮细胞的过度增殖.尽可能保证肾小管管腔免于堵塞而处于开放状态。
心肌缺血再灌注损伤的研究进展 篇8
1 心肌缺血再灌注损伤的病理生理机制
冠状动脉闭塞15~20s后,发生无氧糖酵解,并成为新的高能量磷酸盐的唯一重要来源。这些足以满足心肌细胞最基本的能量需求,但60~90min的缺血,心脏被影响的区域发生梗死[4]。心肌严重缺血时,无氧糖酵解在提供ATP中起了关键的作用,这一点在抑制无氧糖酵解的实验中得到了充分的证实。如果没有糖酵解的ATP形成,不到5min,贮存的能量磷酸盐就会全部耗尽,心肌将发生梗死[4]。
再灌注时,线粒体在数秒钟内氧化磷酸化恢复到缺血前的水平,但是,心脏收缩力只能逐渐恢复,这种现象定义为心肌顿抑(Myocardial stunning)[5,6]。顿抑的心肌在收缩时需要消耗更多的氧,同时机械效率降低。再灌注时期,迅速恢复细胞内的pH值:在缺血时期,无氧糖酵解产生的H+堆积在细胞内;再灌注时,H+与Na+交换,转移至细胞外,恢复细胞内的pH值。细胞内增多的Na+会激活细胞膜的2Na+/Ca2+交换体,导致细胞内的Na+与细胞外的Ca2+交换。高比率的2Na+/Ca2+交换体最终会导致细胞内钙超载和细胞死亡。
在动物实验中已证实在心肌再灌注时,脂肪酸氧化的比率相当高,破坏丙酮酸氧化,加速无氧糖酵解。高比率的脂肪酸β氧化显著的抑制葡萄糖氧化,导致了糖酵解与糖氧化之间的不平衡。急性心肌梗死后,血浆中会出现高浓度游离脂肪酸抑制丙酮酸氧化。如果糖酵解与葡萄糖氧化偶联,由糖酵解产生的H+为0。但是,如果糖酵解与葡萄糖氧化不偶联,来自糖酵解产生的丙酮酸转换成乳酸,一分子葡萄糖酵解产生2个H+。
基于新陈代谢的研究,线粒体渗透性转换孔(Permeability transition pore,PTP)为线粒体内膜非选择性通道,在致死性再灌注损伤中起了重要作用。在再灌注时期,细胞的命运由线粒体通透性的程度决定,若程度轻,心肌细胞会恢复正常;若程度中等,心肌细胞会发生程序性死亡;若程度重,细胞也许会因为能量不足而坏死。开放通道后线粒体膜电位崩解,氧化磷酸化分离,导致ATP耗尽和细胞死亡。在心肌缺血时期,线粒体PTP依旧关闭,只有在心肌再灌注几分钟内钙超载、氧化应激、生理pH值的恢复和ATP耗尽诱导线粒体PTP开放。因此,线粒体PTP成为了一个重要的治疗缺血再灌注损伤的新靶点。
缺血再灌注改变了细胞内环境,比如H+和Ca+的堆积和线粒体膜电位的崩解,导致了自由基(Free radical)或活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的形成。ROS堆积并激活促炎症途径在缺血再灌注损伤中起了重要的作用。因此,缺血再灌注损伤的重要调节者为氧衍生的自由基,引起不同类型的氧结构。活性氧中间体(Reactive oxygen intermediates)直接导致细胞DNA、蛋白质和脂质的破坏,另外激活了压力反应通路。这种非特定的损伤启动了细胞因子介导级联,导致肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)。过度的TNF-α表达,随后心肌细胞TNF受体Ⅰ型激活,导致心肌收缩功能失调、细胞肥大、纤维化和细胞死亡。磷酸钙复合物和尿酸属于同一类所谓的危险信号,能与细胞内的蛋白复合物结合被称为炎症小体(Inflammasomes)。这些炎症小体包括不同的接头分子,它们能增加白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)β的生成和分泌。危险信号激活Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs),最终通过激活核因子-κB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)刺激分泌更多的促炎因子和趋化因子。
最后,在心肌再灌注前6h内,趋化物的释放使嗜中性粒细胞进入梗死区域,在接下来的24h,它们迁移至心肌组织,细胞黏附分子推动着这个过程。这些嗜中性粒细胞导致血管堵塞,酶释放减少和更多的ROS。
如上所诉,组织缺氧会发展为代谢性酸中毒。这些代谢的改变直接影响着组织炎症,组织的完整性,甚至细胞的生存。因此曲美他嗪能通过抑制线粒体酶,将脂肪酸代谢转变成葡萄糖代谢,减轻缺血再灌注损伤和组织炎症并不奇怪。曲美他嗪能选择性地抑制参与β氧化最终的酶——长链3-酮酰辅酶A-硫解酶(Long-chain 3-ketoacy-CoA thiolase)。事实上,心衰的随机对照试验的Meta分析显示曲美他嗪对全死因、心血管事件和住院治疗各组均有显著的保护作用。
另一方面,抗炎症药物是否在心肌缺血再灌注损伤中对心脏的代谢起到了有益的作用。实际上,已有研究报道IL-6能通过抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activeated protein kinase,AMPK)阻止心肌细胞葡萄糖代谢。在缺血再灌注中,AMPK激活和葡萄糖代谢为心脏提供了重要的能量来源,因此,抗炎合剂潜在的影响了心脏的新陈代谢。需要未来的临床研究更全面的解释在心肌缺血再灌注损伤中炎症和新陈代谢的关系。
2 缺血预处理
内科医生在治疗急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome)(包括严重的不稳定心绞痛和急性心肌梗死)时,偶然发现了“心脏Warm-up现象”。其被解释为患者在经历长时间的心肌缺血之前,有过至少1次的不严重的心绞痛。1986年,Murry[2]等人首次用实验证实了这个现象,在冠状动脉完全闭塞之前予心脏多次短暂的缺血,能明显减少心肌梗死的面积,这种方式被定义为缺血预处理。首次表明了心肌梗死面积可以被限制的可能性。
虽然直接的缺血预处理能减少再灌注损伤,但是主要的缺点是对靶器官的直接压力和大血管结构的机械性创伤,这点限制了在临床上的运用。远程预处理(Remote ischemic preconditioning,RIPC)是新的方法,一个组织或器官的缺血预处理要么通过释放生物信号在循环中,要么通过激活神经信号通路来提高远隔器官对后续缺血的耐受力。1993年,Mc Clanahan首次证实了RIPC在心肌中的作用。他发现肾脏缺血后再灌注将减少心肌缺血梗死的面积。在动物模型中,主要是肢体、肠、肠系膜的缺血再灌注减少心肌缺血梗死面积。在人体实验中,骨骼的预处理被运用到心肌的保护中,归功于内皮保护功能。现在有许多关于RIPC的临床研究不断进行着,虽然最基本的机制和通路尚未清楚,但是经典的预处理有希望在临床中得到运用。NO,一种由eNOS催化血管内皮细胞不断产生的可溶性气体,调节着基底血管和内皮功能,通过缺氧性肺血管收缩维持血氧饱和度。许多研究已经涉及到内源性NO,或它在缺血再灌注中的临床应用。NO和NO受体能减轻心肌缺血再灌注损伤,减少梗死面积和改善内皮功能。
3 缺血后处理
尽管经典的缺血预处理在临床中得到运用,如心脏外科手术,但是对急性心肌梗死的病人并不可行,因为当患者在医院接受治疗的时候冠状动脉已经闭塞。Zhao等首次描述了被称为“缺血后处理”的现象。缺血预处理是在长时间冠脉闭塞之前予重复的短暂的缺血再灌注处理,缺血后处理是在长时间冠脉闭塞后予重复多次短暂的血流灌注/阻断。与缺血预处理不同,缺血后处理的临床试验可以直接应用到临床医疗中,特别是在经皮冠状动脉成形术(Percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)中的应用。既然这样,在PTCA术中反复扩张、收缩球囊模拟动物缺血后处理的模型。数个临床研究证实在患者急性心肌梗死后通过冠脉成形术予缺血后处理对心脏具有保护作用。如果这个效果能实现,那么这个好处将十分大(梗死的面积将减少35%)。如今,越来越难以证实新疗法的额外好处超过当前的治疗,因为,相对而言是梗死面积小和死亡率的ST段提高的急性心肌梗死的患者入选到试验中。但是,现在需要心脏和远程缺血后处理的多中心临床试验的统计学数据有力的证实缺血后处理能减少临床终点事件的发生。
4 炎症
心肌缺血再灌注导致炎症反应造成了梗死周围能生存的组织的损伤,可能由于加速了细胞凋亡。心肌缺血引起的急性和慢性免疫应答对心脏造成了严重的损害。最初,炎症反应的研究集中在效应器如白细胞。但是,越来越多的证据指出许多内源性配体(Endogenous ligands)充当了“危险信号”,被称为与损伤相关的分子模式(Danger-associated molecular patterns,DAMPs)。许多白细胞上的TLRs和实质细胞原本是抵制入侵微生物的第一道防线,如今在心肌缺血再灌注损伤、心力衰竭等非感染性心血管疾病中起了重要的作用。从治疗的角度出发,DAMPs将会成为引人注意的靶点。
TLRS牵涉到心肌缺血再灌注损伤,那么给予大鼠TLR4阻滞剂Eritoran治疗能对抗损伤过程。其保护机制可能为减轻了炎症反应,如降低髓过氧化物酶活性。心肌在缺血再灌注损伤中释放的热休克蛋白70通过TLR-4信号在缺血后炎症反应中起了重要作用。TLR-2在心肌缺血再灌注损伤中同样起了重要的作用,可能与其对白细胞活性的调节有关,从而调节冠状动脉的内皮功能。
一个多中心双盲的安慰剂对照的随机临床试验证实,CD11/CD18白细胞整合素受体的抗体不能减少接受直接血管成形术患者的心肌梗死面积。但是,不同的研究证实“腺苷”对炎症介导的缺血再灌注损伤起到了保护作用。腺苷的保护作用机制包括直接作用于器官实质细胞,扩张冠状动脉和白细胞介导的炎症反应。细胞外的腺苷通过4个腺苷受体(Adenosine receptors,ARs;A1,A2a,A2b,A3)起到保护作用。在不同的情况下,所有的ARs都与心肌组织的保护有关。特别是A2受体与缺血预处理和缺血后处理均有关系。虽然在著名的AMISTAD-Ⅱ试验中,口服腺苷治疗没能减少所有组的死亡率,但是对减少梗死面积的作用是显著的。未来的研究应在再灌注时期运用更加特效的腺苷激动剂才能全面阐明腺苷在缺血再灌注损伤中的保护作用。
5 代谢
心脏的脂肪酸和葡萄糖代谢,特别是脂肪酸β氧化和葡萄糖氧化是心肌能量供应的主要来源。心肌缺血再灌注后脂肪酸和葡萄糖氧化会产生复杂的改变并对心肌功能和机构起着负面影响。药理学通过增加葡萄糖氧化取代脂肪酸氧化来改变脂肪酸β氧化和葡萄糖氧化之间的平衡,提高在再灌注时ATP的合成和水解的效能。这样的能源物质代谢的转化在心肌缺血再灌注中对心肌具有保护作用。
限速酶调节线粒体脂肪酸摄入,肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ(Carnitine palmitoyltransferaseⅠ,CPTⅠ)能抑制心肌脂肪酸β氧化。乙莫克舍是CPTⅠ的不可逆抑制剂,已证实在大鼠心肌完全缺血的情况下能增加心功能并增加葡萄糖氧化。
曲美他嗪是部分脂肪酸β氧化的抑制剂,能竞争抑制长链3-酮酰辅酶A-硫解酶,同样能提高葡萄糖氧化。临床试验已证实曲美他嗪的抗缺血作用。用曲美他嗪治疗心绞痛的患者被证实了能延长ST段压低1mm时间。
雷诺嗪,另一种部分脂肪酸β氧化的抑制剂,能增加葡萄糖氧化。在美国,雷诺嗪已经证实可以用于慢性稳定性心绞痛患者的治疗。单用雷诺嗪可提高运动能力和延长ST段压低1mm时间,减少心绞痛发作次数。
葡萄糖-胰岛素-氯化钾(Glucose-insulin-potassium,GIK)治疗能增加葡萄糖的浓度,同时能降低循环中游离脂肪酸的聚集。转向葡萄糖的利用能减少心肌梗死面积,提高缺血后心功能。GIK研究已证实了能降低死亡率,虽然这种好处仅限于没有心衰的患者。更近的荷兰的GIK研究表明在GIK组可能有更高的死亡率。
直接增加心肌葡萄糖氧化意味着能提高心功能。二氯乙酸通过抑制PDK的活性刺激线粒体PDH的合成。二氯乙酸通过增加糖酵解和葡萄糖氧化的偶联发挥心脏保护的作用。一个小型的临床研究,将二氯乙酸静脉注射到冠心病患者,在不改变心率、左室舒张末压(Left ventricular end diastolic pressure)或者心肌氧耗的情况下提高了左室每搏输出量(Stroke volume)。
其他以代谢为靶点的研究集中在不同的心外刺激,如负荷工作和循环中的营养素(如脂肪酸),影响心脏的代谢和收缩功能,并且显示出明显的昼夜规律。几乎所有的生物的生物规律都与太阳的白天/黑夜或光明/黑暗的循环有关。这种规律影响着人类的许多生理功能早已得到公认。视交叉上方的下丘脑交叉上核(Suprachiasmatic nucleus)控制着人的生物钟。交叉上核对外部信号(如:周围的光)进行处理后将信息传入大脑,大脑调节着各种循环功能,包括体温,睡眠觉醒周期,激素的分泌(如:皮质醇、褪黑素、甲状腺素和抗利尿激素)。在遗传背景的试验中已明确Clock基因的突变影响着代谢。破坏另一个生物调节蛋白Bmal1,同样被证实造成破坏胰岛素反应和减少糖异生的代谢异常。
因此周围的光等体外的信号是昼夜节律的重要调节器,如果将患者暴露在可调节的日光中会改变代谢。在临床试验中,利用日光维持生理的昼夜规律的方法改善患者心肌缺血再灌注后的代谢。实际上,最近一项研究发现利用红光可加速缺血后心肌收缩功能的恢复和减少心肌缺血后大量的脂质过氧化的分子产物。未来的研究应明确昼夜节律对心脏的保护作用,或许能发现新的、作用大的、简单适用的能阻止或改善围手术期的心肌缺血再灌注损伤或急性心肌梗死所致的后果的治疗方式。
6 结束语
虽然将基础研究的成果运用到临床治疗中的结果让人失望,许多在基础研究中突出的成果如缺血预处理、缺血后处理或远程预处理的临床运用价值不高。但是基于对缺血再灌注中炎症或代谢新的理解,研发新的靶向药物如TLRs或心脏代谢为临床试验提供了有希望执行的方法。
摘要：心肌缺血再灌注损伤的防治主要有缺血预处理、缺血后处理、抗炎治疗、改善心脏代谢等方面,本文对此作一综述。
关键词：心肌缺血再灌注损伤,心肌梗死,缺血预处理
参考文献
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心脏缺血再灌注 篇9
关键词：心肌缺血再灌注,远隔缺血预适应,硫氧还蛋白,细胞凋亡
心肌缺血再灌注(IR)损伤广泛存在于临床,严重威胁着人类的身体健康。1986年,Murry等[1]首先报道心肌缺血预适应(IPC)有心脏保护作用,之后又发现远隔缺血预适应(RIPC)也有类似的心肌保护作用。 RIPC可以减少细胞凋亡、梗死范围和再灌注心律失常等,有保护心肌缺血再灌注作用[2,3]。RIPC是通过何种机制发挥心肌保护作用的呢?研究发现RIPC可以上调心肌保护性基因、蛋白水平[4,5]。随着研究的深入,硫氧还蛋白(Trx)进入了人们的视线。肿瘤学研究发现Trx有调节氧化还原平衡、促进生长、抗凋亡和调节炎症反应等多种生物学功能[6,7]。而抗氧化应激、抑制凋亡和减弱炎症反应的调节恰恰是防治再灌注损伤的重要切入点。本研究进一步探讨RIPC对心肌细胞IR损伤的保护作用,深入研究Trx在RIPC中作用。
1材料与方法
1.1主要试剂及仪器HX-300动物呼吸机,成都泰盟科技有限公司;RM6240B型多道生物信号采集处理系统,成都仪器厂;LY294002(PI3K抑制剂),碧云天生物技术研究所;PX-12(Trx拮抗剂),英国Tocris公司;SP Mouse HRP Kit鼠Streptavidin-HRP试剂盒、 DAB Kit(DAB显色试剂盒),北京康为世纪生物技术有限公司;Trx小鼠抗大 鼠多克隆 抗体,Santa公司; HRP标记兔抗山羊IgG(H+L)、HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP标记抗小鼠二抗、HRP标记抗山羊二抗,中衫金桥公司;凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(BIOTIN标记POD法),凯基生物。
1.2心肌I/R损伤模型大鼠以10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉,连续监测Ⅱ导心电图(ECG), 气管插管呼吸机辅助呼吸。沿胸骨左缘分离肋骨,暴露心脏,于左心耳下3mm~4mm略靠近动脉圆锥处结扎前降支。缺血45min后剪开结扎线,再灌注180 min,为心肌I/R损伤模型。
1.3 RIPC模型大鼠 以10% 水合氯醛 (3.5 mL/ kg)腹腔注射麻醉,选择一侧下肢小心分离出股动脉, 动脉下穿线小心提拉5min使血流中断,放松10 min使血流恢复,反复进行3次后缝合皮肤,单独饲养24h后进行后续试验。
1.4实验分组将72只Wistar雄性大鼠随机分为6组,每组12只,其中4只检测梗死范围。对照组:建立RIPC模型,IR模型假手术;IR组:RIPC模型假手术, 建立IR模型;RIPC+IR组:建立RIPC和IR模型; Trx拮抗剂组:建立RIPC和IR模型,再灌注前10 min注入Trx拮抗剂;PI3K抑制剂组:建立RIPC和IR模型,再灌注前10 min注入PI3K抑制剂;单纯RIPC组:建立RIPC模型,IR模型假手术。Trx拮抗剂和PI3K抑制剂组在再灌注前10min尾静脉注药, 其余各组灌注生理盐水。
1.5观察指标
1.5.1梗死面积再灌注结束后伊文思蓝溶液2mL充分染色,冲洗后取下心脏漂洗干净,吸干后剪取左心室,吸干后保鲜膜包裹,-20 ℃冷冻30min均匀切成1mm等厚的薄片,可见血供正常区着蓝色,缺血危险区不着色;分离并分别称重;然后将缺血危险区置于2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液中,37 ℃孵育20min,10%中性甲醛溶液固定24h。染成红色为存活心肌,被甲醛漂成灰白色为坏死心肌。再次分离并分别称重。以梗死区重量占缺血危险区重量的百分比来表示心肌梗死范围的大小。公式为:心肌梗死面积=梗死心肌/缺血危险区×100%
1.5.2病理观察取距前降支结扎线远端约2 mm处左心室前壁组织,常规制作心肌标本切片,光镜下观察大鼠心肌组织病理形态学改变。
1.5.3细胞凋亡的检测采用TUNEL试剂盒检测各组心肌细胞的凋亡。凋亡的心肌细胞核染成棕黄色,而未凋亡的显深蓝色。每张切片随机选取5个视野(×400倍),每个视野至少100个细胞,以凋亡阳性细胞个数/所有细胞个数求阳性百分率,计算平均阳性细胞率来反映各组心肌细胞凋亡的情况。
1.5.4免疫组化半定量分析心肌Trx阳性细胞百分比。在低倍镜下随机选择5个(×400)视野,分别计算这5个不同视野着色细胞的百分比及胞浆、胞核的着色程度,得分取其均值。基本不黄染定为0分,着色淡为1分,较深染色为2分;着色细胞百分比:≤5%计为0分,6%~25%计为1分,26%~50%计为2分,≥ 51%计为3分,最终得分计作每张切片染色细胞百分比得分×黄染程度得分。
1.6统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析,数据以均数±标准差( ±s)表示,多组均数及组间两两比较分别采用单因素方差分析,以P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1心肌组织病理形态学改变对照组和单纯RIPC组心肌纤维呈束状整齐分布,结构完整,均匀着色,细胞形态正常。IR组、Trx拮抗剂组和PI3K抑制剂组心肌纤维排列紊乱,着色不均,心肌纤维少量断裂,可见大片状心肌坏死,细胞核有浓缩、破裂、溶解、消失现象,可见心肌间质大量炎性细胞浸润。RIPC+IR组心肌纤维排列相对整齐,结构相对完整,着色较均匀; 细胞核有轻度的浓缩、溶解现象,心肌间质轻度水肿、 少量炎性细胞浸润。
2.2梗死范围与对照组和单纯RIPC组比较,其他组梗死范围显著增大(P <0.05);与RIPC+IR组比较,IR组、PI3K抑制剂组和Trx拮抗剂组梗死范围明显增大(P <0.05);IR组、PI3K抑制剂组和Trx拮抗剂组3组间比较差异无统计学意义(P >0.05)。详见表1。
%
2.3心肌细胞凋亡对照组和单纯RIPC组仅可见少量散在TUNEL阳性细胞核,两组间差异无统计学意义(P >0.05)。IR组、Trx拮抗剂组和PI3K抑制剂组均可见到典型TUNEL阳性凋亡细胞核,心肌细胞凋亡明 显 ,成群分布 ,3组间差异 无统计学 意义 (P> 0.05)。与对照组和单纯RIPC组比较,其他组细胞凋亡率显著升高(P <0.05);与RIPC+IR组比较,IR组、PI3K抑制剂组和Trx拮抗剂组细胞凋亡率明显 升高(P <0.05)。详见表2。
%
2.4免疫组化与对照组比较,其他组Trx表达显著增加(P <0.05);与IR组比较,RIPC+IR组、Trx拮抗剂组、PI3K抑制剂组和单纯RIPC组Trx表达明显增加(P<0.05),RIPC+IR组、Trx拮抗剂组、PI3K抑制剂组和单纯RIPC组Trx表达差异无统计学意义(P> 0.05)。详见表3。
3讨论
研究证实,Trx作为一种氧化还原调节蛋白,广泛存在于原核和真核细胞中,在多个方面起到保护心肌缺血再灌注的作用:1调节氧化还原平衡:可以清除ROS,降低氧自由基的破坏;2与各种蛋白质相互作用发挥抗凋亡促生长作用,通过蛋白间的互动,Trx改变酶的活性或接触蛋白如核因子κB(NF-κB)的亚细胞定位,从而影响各种细胞功能[8];3调节炎症反应:类趋化因子活性抑制白细胞聚集,发挥调节免疫作用[9]。 作为机体对氧化应激的防御反应,Trx可分泌到细胞外,发挥抗凋亡、抗炎作用保护细胞,以及作为自分泌/ 旁分泌因子促进增长,影响到邻近的细胞,并可能防止损伤扩展[8]。RIPC保护心肌缺血再灌注途径中,Trx发挥何种作用尚不完全明了。本实验证实RIPC保护心肌缺血再灌注作用与Trx密切相关。
本实验发现IR组缺血区心肌细胞大片状坏死,伴广泛的心肌细胞凋亡;大量细胞核浓缩、破裂、溶解、消失,心肌间质大量炎性细胞浸润。而RIPC+IR组梗死范围、凋亡明显减少,结构相对完整,证实RIPC起到了心肌保护作用,许多类似的实验也证明这种心肌保护作用[10,11]。同时,本实验发现RIPC+IR组Trx高表达,接着对RIPC大鼠注入Trx拮抗剂PX-12抑制Trx功能,发现Trx拮抗剂组大鼠出现类似缺血再灌注样改变。证实Trx参与了RIPC延迟相的心肌保护作用,抑制Trx的功能可以削弱RIPC对心肌IR的保护作用。
本实验发现RIPC可以防止 心肌缺血 再灌注损 伤,而在给予特异性PI3K信号通路阻断剂LY294002后,细胞凋亡率和心肌梗死面积增加,抑制了RIPC的心肌保护作用。PI3K抑制剂可以抑制RIPC保护心肌的作用,提示PI3K信号通路在RIPC中发挥重要作用。PI3K/Akt信号通路与细胞生存密 切相关,研究表明,缺氧诱导的心肌细胞凋亡能够被高表达PI3K或Akt抑制[12]。PI3K可以激活Akt,激活后的Akt主要通过底物水平磷酸化,改变凋亡基因表达水平发挥抗凋亡、促细胞生存功能。激活的PI3K/Akt能够阻断许多刺激因子所诱导的细胞凋亡[13,14]。有研究发现外源性Trx通过调控细胞外信号调节激酶和对PI3K的激活保护肺泡Ⅱ型上皮细胞免受高氧症诱导的细胞损伤[15]。
研究发现Trx和PI3K在肿瘤生成中存在上下游关系,这些提示在RIPC保护作用中,可能也存在这种上下游的关系。本实验发现Trx和PI3K都与RIPC保护作用密切相关,抑制PI3K或拮抗Trx的功能,都可以显著削弱心肌保护作用;而PI3K抑制剂组Trx同样高表达,除外Trx位于PI3K下游的可能。推论RIPC延迟相的 心肌保护 作用可能 通过升高Trx表达,激活PI3K信号通路完成。
心脏缺血再灌注 篇10
【摘 要】 目的：观察回药失荅剌知丸对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中Fas及FasL表达的影响，探讨失荅剌知丸治疗脑缺血性疾病的机制。方法：SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知丸高浓度组，局灶性脑缺血再灌注模型制备成功后分别于12h、24h、72h取材，采用干湿重法测脑含水量，免疫荧光法观察Fas阳性细胞表达量，TUNEL和免疫组化法观察神经细胞凋亡情况及FasL表达的变化。结果：与假手术组相比，缺血再灌注损伤后脑含水量、神经细胞凋亡数量及Fas、FasL的表达明显增高（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，用药组各时段脑含水量、神经细胞凋亡数量及Fas、FasL的表达均减弱（P<0.05），以失荅剌知丸高浓度组的表达减弱显著（P<0.01）。结论：失荅剌知丸能够有效减轻脑组织水肿，抑制Fas、FasL的表达，其发挥神经保护的作用机制可能与抑制神经细胞凋亡有关。
【关键词】 失荅剌知丸；脑缺血；Fas；FasL
【中图分类号】R743 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）05-0073-04
Abstract：Objective： To observe the effect of expression of Fas and FasL in the hippocampus of ischemia-reperfusion injury rats brain tissue by taking Shida Lazhi Wan， and to explore Shida Lazhi Wan mechanism for the treatment of cerebral ischemic diseases. Methods： SD male rats were randomly divided into 6 groups： sham group，the ischemia reperfusion model group （hereinafter referred to as the model group），JinNaDuo group，Shida Lazhi Wan low concentration group， Shidalazhiwan medium concentration group，Shida Lazhi Wan high concentration group， After focal cerebral ischemia models were established，at 12h、24h、72h，neurons apoptosis，wet and dry weight measured brain water content， immunofluo-rescence techniques to measure Fas expression，TUNEL and immunohistochemical method to observe neuronal apoptosis and the change of FasL expression. Result： To compared with the sham operation group，after ischemia-reperfusion injury ， brain water、number of nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were significantly increased（P<0.01， P<0.05）；compared with the model group， every treatment groups brain water number、nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were recede （P<0.05），especially Shida Lazhi Wan high concentration group Reduce significantly （P<0.01）. Conclusion：Shida Lazhi Wan can ？reduce brain water effectively， inhibition of Fas and FasL express， its nerve protection mechanism may be related to inhibition of neural cell apoptosis.
Keywords：Shida Lazhi Wan；ischemia reperfusion；Fas；FasL
随着人口老龄化进程的加速，高血压、冠心病等相关危险因素的增加，脑血管疾病的发病率也逐年攀升，对人类的生命健康和生活质量造成了严重的威胁。其中，缺血性脑血管疾病最为常见，约占脑血管疾病的80%左右[1]。目前，临床上最常用的是在有限的时间内进行溶栓等治疗以达到恢复脑血管血液供应的目的，但有可能造成脑组织的进一步损伤，即脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤机制庞杂，相互交联，有研究表明，细胞凋亡在其发病进程中担任着至关重要的角色。细胞凋亡多发生于脑缺血急性期，主要出现在缺血半暗带区和对缺血缺氧敏感的海马、齿状回和大脑皮质[2]，神经细胞凋亡数量的多少决定着脑组织梗死体积的大小。细胞凋亡是一个有严格程序控制的可逆过程，因此，着力于调控其机制，限制其进一步发展，对减小脑梗死体积以及神经功能恢复等具有重大意义[3]。失荅剌知丸作为回医药治疗脑缺血性疾病的传统、经典方药，前期系列研究业也表明：失荅剌知丸可以调节细胞抗凋亡信号转导通路PI3K-AKT通路的活性，上调PI3K和AKT的表达，通过抑制促凋亡分子的活化，抑制神经细胞凋亡[4]。Fas/FasL 是目前研究较为清楚的死亡受体信号转导通路，在正常大脑中维持免疫抑制状态，当脑缺血发生后，Fas与FasL交联，参与并促进脑缺血再灌注所引起的脑组织损伤[5]。为进一步探讨失荅剌治丸保护缺血再灌注损伤脑组织的作用机制，笔者开展失荅剌治丸对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织FasL表达水平的实验研究，现报告如下。
1 材料
1.1 动物 SD大鼠，雄性，80只，SPF级，体重（280±50）g，购于宁夏医科大学实验动物中心，合格证编号：SCXK（宁）2011-0001，所有大鼠均在同一动物房内常规饲养3d后进行实验。
1.2 药物 失荅剌知丸（出自《回回药方考释》）：柴胡30g，黑诃子30g，芦荟60g，元胡6g，石菖蒲6g，番盐6g，药西瓜9g，松蕈9g，安息香9g，阿魏9g，砂糖15g，干姜3g，胡椒3g，荜拨3g，白芥子3g，芸香3g，巴豆9g，共计213g，以上所有药物切制、煎煮后放置于恒温水浴锅中分别浓缩至低浓度1.112 g/ml、中浓度2.223g/ml、高浓度4.446g/ml的药液，置于4 ℃冰箱备用。金纳多（银杏叶提取物，德国威玛舒培公司）临用前配制成1.04mg/ml的混悬液。
1.3 试剂 水合氯醛（批号：2636-4A，国药集团化学试剂有限公司，临用前配成浓度为10%的水合氯醛溶液）；兔抗大鼠Fas抗体（批号：BA0048）、兔抗大鼠FasL抗体（批号：BA0148）、山羊抗兔IgG（批号：BA1128）、浓缩型正常山羊血清（批号：AR1009）均为博士德生物公司产品。
1.4 仪器 FX4-2型电热恒温干燥箱（Shella公司）：BT224S 型电子天平（Sartorious公司）。
2 方法
2.1 分组及给药 80只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知丸高浓度组，后5组采用线栓法制备大脑中动脉阻塞-再灌注模型，并分为术后12、24、72h三个亚组，共16组，每组5只。SD大鼠给药量为1ml/100g，用药组分别给予相应药物，于造模前30min第一次灌胃，以后每天2次，直至取材；假手术组、模型组给予相应浓度的生理盐水。
2.2 模型制备 参照改良的Longa法[6]，利用线栓阻塞大鼠大脑中动脉，造成脑缺血2h后再灌注模型。10%的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位，沿颈部正中线切开，依次钝性分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，将直径为0.24mm的线栓自颈外动脉小切口处插入至颈内动脉，直至感到轻微阻力，长度约为18±2mm，用手术缝合线将颈外动脉小切口和线栓尾端一起结扎，阻断血流2h后实行再灌注，待大鼠清醒后进行神经功能评分，评分≥2分者作为模型成功标准。假手术组钝性剥离颈内外动脉后缝合伤口。
2.3 取材 各组分别于术后12h 、24h、72h取材，10%水合氯醛过量麻醉大鼠，经心尖生理盐水冲洗，再换用4%多聚甲醛溶液进行灌注固定，取出全脑，切取缺血侧大脑海马区，常规石蜡包埋，余脑组织放于冻存管保存在液氮内。
2.4 脑含水量测定 采用干湿质量法测定缺血侧含水量，于各时间点麻醉大鼠，快速断头取脑，将待测脑组织滤纸擦去表面水分，称取湿质量后置于100℃电烤箱24h，称取干质量。脑含水量 =（m湿质量-m干质量）/m湿质量×100%。
2.5 脑组织病理学观察 待测脑组织切片后经HE染色，在光学显微镜下观察脑组织结构的变化。
2.6 TUNEL细胞凋亡检测 标本经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，严格按TUNEL检测试剂盒进行操作。以胞核内有棕黄色颗粒者为凋亡阳性细胞，在400倍镜下随机选取梗死灶周边五个不重叠的视野拍照并计数凋亡阳性细胞数，取平均数进行统计。
2.7 免疫荧光法检测Fas表达 待测脑组织经过常规包埋、切片、脱蜡、水化、抗原修复、复温、山羊血清封闭、滴加兔抗大鼠抗体、滴加山羊抗兔荧光二抗、封片、荧光显微镜下观察，假手术组对照使用PBS缓冲液代替一抗，余相同，所有步骤严格按照试剂盒说明操作。每个标本取 3 张切片，每张切片取3 个互不重叠部位，应用激光扫描共聚焦显微镜扫描（扫描参数：激发光波长488 nm，检测的发射光波长518nm），计数400×视野下荧光阳性细胞，取平均值。
2.8 免疫组化法检测FasL表达 标本切片为6mm，经常规二甲苯和梯度酒精脱蜡水化，枸橼酸钠缓冲液抗原修复，3% H2O2消除内源性过氧化物酶，滴加10%的山羊血清封闭1h，滴加一抗4℃冰箱过夜，阴性对照组加PBS缓冲液，次日取出37℃复温1h，PBS缓冲液冲洗3遍×5min，滴加二抗室温置放1h，DAB染色，PBS缓冲液冲洗3遍×5min，中性树胶封片，显微镜下观察。以胞质或胞核内有棕黄色颗粒者为阳性细胞，每张切片在400倍镜下随机选取梗死灶周边5个不重叠的视野拍照，并计数阳性细胞数，取平均数进行统计。
2.9 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，以均数加减标准差（x±s）表示，使用单因素方差分析法，P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 脑含水量测定 与假手术组相比，各组各时间点脑含水量均明显增高（P<0.01）；与模型组相比，各用药组各时间点脑含水量均明显降低（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中浓度及高浓度组脑含水量有不同程度的降低（P<0.05或P<0.01）；同组别72h相比，失荅剌知丸高浓度组减少更加明显（P<0.01）。见表 1。
3.2 病理学观察 假手术组大鼠脑组织神经元形态正常，大小均匀，排列整齐，层次分明；模型组大鼠神经形元态明显异常，大小不均，神经元皱缩，排列紊乱，层次不清，多数细胞核呈现三角形或锥形；失荅剌知丸低剂量神经元细胞较紊乱，多数皱缩变形，大小欠均匀；金纳多组及失荅剌知丸中浓度组大多数神经元形态欠规则，有皱缩现象，层次欠清晰，且各时间点神经元形态区别不明显；失荅剌知丸高浓度组大鼠大多数神经元形态正常，存有少量皱缩神经元，层次较清晰，且正常神经元比例随着用药时间的延长而增多，以失荅剌知丸组72h组较明显。
3.3 各组缺血侧海马区Fas表达比较 Fas蛋白主要位于神经细胞膜上，在本实验中标记为绿色，与假手术组相比，各组各时间点Fas表达均明显增高（P<0.01）；与模型组相比，各用药组各时间点Fas蛋白表达明显减少（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中剂量组各时间点FasL蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），失荅剌知丸高剂量组各时间点Fas蛋白表达有所减少（P<0.05），尤以72h组减少明显（P<0.01）。见表2。
3.4 对大鼠脑缺血再灌注TUNEL凋亡阳性细胞的影响 从表3看出，与假手术组比较，模型组及各用药组各时间点凋亡细胞数有显著增高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组各时间点凋亡细胞数有减少（P<0.05或P<0.01），以24h、72h凋亡细胞数减少尤为明显（P<0.01）；失荅剌知丸组24h、72h组凋亡细胞数明显少于金纳多组（P<0.01）。见表3。
3.5 对脑缺血再灌注大鼠缺血侧海马区FasL表达的影响 从表4可以看出，与假手术组比较，模型组及各用药组各时间点FasL蛋白表达明显增高（P<0.01）；与模型组比较，各用药组各时间点FasL蛋白表达明显减少（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中剂量组各时间点FasL蛋白表达无显著性差异（P>0.05），失荅剌知丸高剂量组各时间点FasL蛋白表达有所减少（P<0.05或P<0.01），尤以72h组减少明显（P<0.01）。见表4。
4 讨论
近年来，国内外研究发现脑缺血再灌注损伤主要与兴奋性氨基酸、自由基损伤、血脑屏障破坏、炎症反应、细胞凋亡等机制有关[7-8]。这些机制彼此重叠，互为因果，相互联系，产生一系列快速级联反应，最终导致脑组织的损伤[9]。在这个复杂的过程中，神经细胞的凋亡被认为是脑缺血再灌注损伤的主要环节，因此调控神经细胞凋亡成为治疗缺血性脑病的关键所在。FasL在细胞凋亡中起着关键的作用。Fas被称为死亡受体分子，属于肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）/神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）受体家族，是促细胞凋亡的最重要分子之一。FasL作为Fas的天然配体与3个Fas 分子结合，促使死亡结 构域（DD）聚集后结Fas 的相关死亡结构域（FADD），进而通过引起Caspase 酶联反应致使细胞凋亡[10]。抑制因促凋亡系统Fas/FasL的激活而产生的生物学作用是发挥保护脑组织的关键环节[11]。已有大量研究发现中医药可以减轻脑缺血再灌注损伤后促凋亡因子的表达[12-13]。
失荅剌知丸出自《回回药方》，是防治脑血管疾病的经典方剂，由柴胡、黑诃子、芦荟、元胡、石菖蒲、药西瓜、阿魏、 安息香、干姜、胡椒、荜拨、白芥子、芸香等药组成，以芳香通窍，利痰化湿，祛寒通络为治疗原则，运用大量芳香药以加强血管通透性、增强药物透过血脑屏障[14]，治疗脑卒中后骨节疼痛，口眼歪斜，半身不遂等症状。研究结果显示，脑缺血再灌注损伤发生后，对缺血缺氧敏感的海马区脑含水量及神经细胞凋亡的数量迅速增加，于24h达到高峰，72h后下降。较模型组比较，各用药组脑含水量及神经细胞凋亡的数量均有所减少，但不同浓度的失荅剌知丸下调水平有所差别，以失荅剌知丸高剂量组效果明显，说明长期服用高浓度的失荅剌知丸可以通过抗凋亡以达到有效治疗和缓解脑缺血再灌注损伤后引起的脑组织损伤。Fas、FasL在脑组织缺血后，迅速表达促进了神经细胞凋亡，扩大了梗死体积，实验研究结果表明，不同浓度的失荅剌知丸较模型组相比，能够明显下调海马区Fas、FasL蛋白表达，较金纳多组相比，高剂量失荅剌知丸阻抑Fas、FasL蛋白表达作用更强。由此可见，失荅剌知丸可以通过降低Fas、FasL蛋白表达以减少神经细胞的凋亡，为临床回医药防治缺血性脑血管疾病提供了实验依据。
参考文献
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脑缺血再灌注损伤的几点意见 篇11
1 神经元能量代谢障碍
大脑的血液供给量大, 虽然大脑的重量只有人体的五十分之一, 但是静止状态下, 大脑血流量占了心脏总输出量的五分之一, 而且大脑没有能源的储备, 为大脑提供糖分养料, 必须继续采取正确的方式为大脑维持生理机能。因此, 在人的大脑在非常脆弱的器官循环依赖。直接参与细胞信号转导, 能源, 养分循环, 微循环障碍, 脑缺血再灌注的影响造成代谢紊乱和损害大脑的功能。资料表明阻断沙土鼠的颈总动脉, 并清晰可见软脑膜微血管收缩, 血管周的微渗漏可能成为再灌注并缺血, 可以提高到以前的水平的脑膜。人的大脑缺氧是很脆弱的, 大脑的神经细胞的葡萄糖氧化时间的能源太长, 因此脑缺血可能提供给神经元不可逆的损害。
2 脑细胞死亡
大脑是脑细胞 (神经元) 是一种网络组织, 通过脑细胞之间的信号转导功能。大脑结构的基本结构是简单和明确的。换言之, 是由神经胶质细胞在大脑的神经元和支持神经元的单一的功能。神经胶质细胞包括星形胶质和雪旺氏细胞。星形胶质细胞因其形状与海星类似而得名, 它是脑屏障和血管内皮细胞的重要构成。而许旺氏细胞薄片包裹轴突构成髓鞘。髓鞘导电, 所以它的电缆性能良好, 提高了动作电位的传导速度, 可使脑细胞之间的信息传递处于超导状态。当髓鞘出现故障、损坏, 则记忆、心理活动的思维会大大降低。资料阐述对缺血性脑损伤的研究与脑细胞死亡具有密切的联系, 通过在脑缺血再灌注损伤和坏死的细胞死亡的神经细胞, 尤其是延迟性神经元坏死。脑缺血再灌注损伤后, 大脑缺血, 脑神经元的死亡和灌注时间的相关性。大鼠脑缺血再灌注脑细胞的主要位置死后, 主要分布在缺血区, 在中间的缺血区脑细胞坏死, 随着缺血时间的增加, 在缺血细胞损伤, 坏死也逐渐增加, 在一个动态的细胞损伤演化机制和过程的脑细胞死亡, 过量产生的自由基和钙超载。对脑部缺血再灌注过程中的脑细胞的自由基损伤, 导致自由基的产生量大, 脂质过氧化的作用;中枢系统中含有不饱和脂肪酸, 易产生脂质过氧化, 脂质和蛋白质大分子交联;也可能使基地羟化, 核酸酸和染色体导致的神经元损伤甚至死亡的脑细胞。脑缺血再灌注损伤神经元的自由基可能与以下机制相关:大脑内毛细血管受损, 血液到达不了细胞, 细胞因缺少养分而受损。脑保护屏障遭到破坏。不饱和脂肪酸过度氧化致使细胞膜脂质、磷脂降解残缺。细胞膜通透性加大, 增大了细胞间钠离子、钙离子及较大分子的通过率。由于线粒体损伤扰动能量产生;溶酶体裂放出许多的可溶性酶, 致使神经细胞自己溶解。大量析出激动性氨基酸, 加速脑部神经元的坏死, 阻止干扰型氨基酸的生成, 导致大脑细胞结构的不可逆破坏。
3 线粒体功能障碍
线粒体膜由两层组成, 外膜光滑, 内膜向内折叠, 两层之间空腔, 线粒体是由中心基质。基质包含了所有的酶和三羧酸, 内膜有呼吸链酶和ATP酶。线粒体可以提供细胞生命活动形式, 是主要的氧化磷酸化和ATP制造工厂, 线粒体是以电子转移和磷酸氧化进行, 大脑缺血后, 产生大量大分子自由基和钙离子超载, 致使线粒体造成伤害。线粒体受损导致了呼吸系统呼吸障碍, 从而减少了ATP的合成, 能源供应减少, 脑细胞可能产生DNA障碍。大鼠试验研究表明[2], 脑缺血的早期, 在CA1区内锥体细胞减少, 细胞色素C氧化酶减少, 缺血再灌注时, 线粒体RNA和线粒体DNA氨基酸降低, 将影响到呼吸系统功能。此外, 线粒体磷脂膜分解, 并刺激脑细胞内的氧化反应, 最后促进了线粒体损坏, 甚至消失。总之线粒体功能会大幅度降低, 可能降低细胞代谢, 导致迟发性神经元死亡。
4 多巴胺的毒性
因钙超载引起的各种因素在细胞缺血再灌注后, 可以增加多巴胺的释放。与此同时, 因为能源消耗枯竭, 钠、钾离子活性减少, 细胞内钙离子依赖性钠离子浓度的变化, 未参与多巴胺转运蛋白质, 多巴胺的释放, 导致脑细胞外多巴胺积累。多巴胺和神经损伤, 其代谢产物提高氨基酸的兴奋性导致脑神经元凋亡。
5 讨论
在许多实验中研究脑部缺血再灌注损伤的大鼠, 其动物模型可以复制。大鼠实验模型常用的为:颈动脉缝合引流模型, 四血管阻断模型, 三血管阻断模型 (阻断两侧颈总动脉及基底动脉) , 颈动脉闭塞模型等。这些模式各有其优缺点, 要根据情况来选择。颈动脉引流对于循环, 呼吸系统影响较小, 手术方式是直视下, 可有效控制血流流速。动脉闭塞方法不必要开颅, 手术造成的创伤较小, 损伤的程度也较小, 适合生物的期后生存, 它的缺点是由于移动位置, 动物重量, 病灶深度和尼龙线粗细尺寸等各种因素的影响, 大脑中动脉的病灶部分块的位置, 导致在不同的实验模型的成功率, 脑梗死面积, 蛛网膜下腔大量出血, 动物早期死亡率, 不同种类动物的发病率等都难以确定。四血管阻断模型其优点是病理变化明确, 缺点是手术造成伤害较大。两侧颈总动脉闭塞模型手术方法简单, 但因为有两侧椎动脉进行供血, 使其代偿性增大, 使脑血流量有效性降低, 此方法对脑缺血损伤的试验不能进行。因血压低会导致心脏, 肾脏和全身器官缺血, 这样不利于脑缺血再灌注损伤的试验。
参考文献
[1]陈清棠.临床神经病学[M].1版.北京:科学技术出版社, 2000:178.