局灶性脑缺血再灌注（共7篇）
局灶性脑缺血再灌注 篇1
近些年来人们发现, 在中枢神经系统中小胶质细胞参与免疫反应[1]。小胶质细胞在脑缺血后变得异常活跃, 缺血性脑损伤以后小胶质细胞的反应极复杂, 已超出了清除变性坏死组织和对神经元的营养作用的范围[2]。本实采用大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型, 探讨银杏叶提取物 (Extract of Ginkgo biloba, EGB) 对缺血-再灌注中小胶质细胞的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
成年Wistar大鼠72只, 体重280~380g, 随机分为假手术组:只做分离动脉手术, 大脑中动脉不栓塞;缺血-再灌注组, 栓塞大脑中动脉2h, 再灌注24h;EGB治疗组:栓塞大脑中动脉2h, 栓塞2min内进行尾静脉注射EGB (20mg/kg) , 再灌注24h内, 给药共3次。每组24只。手术前12h禁食, 可自由饮水。
1.2 方法
1.2.1 栓子的制备
将一根直径0.23mm、长35mm的尼龙钓鱼线的一端均匀地涂上一层聚胺酯, 使其直径达到0.25~0.26mm, 晾干待用。
1.2.2 大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型的制备
采取颈内动脉插入线法造模[3~5]。Wistar大鼠用3.5%水合氯醛 (350mg/kg) 麻醉, 仰卧固定。切开颈部正中皮肤, 游离右侧颈总动脉 (CCA) 、颈外动脉 (ECA) 、颈内动脉 (ICA) , 仔细分离避免刺激迷走神经。由CCA分叉处向头端依次游离, 用电热烧灼器烧断颈外动脉所有分枝, 使其主干游离。然后分离ICA至颅底, 并分离出ICA颅外段的唯一分支翼腭动脉 (PPA) 。用蛙心夹夹住CCA和ICA, 并在ECA (靠近CCA分叉处) 上剪一小口, 将制好的栓子 (预先蘸有肝素钠溶液) 沿切口插入ECA, 经CCA分叉处并将预先放置于ECA根部的手术缝合线缚紧, 防止栓子滑出和出血, 然后放开ICA上的蛙心夹, 将栓子缓慢地向ICA入颅方向推进约19~21mm, 微遇阻力即停, 使栓子头端停留在大脑中动脉 (MCA) 与大脑前动脉 (ACA) 分叉处。固定好栓子, 即完成一侧MCA的栓塞。栓塞2h后, 缓慢的轻拉栓子使其头端回到ECA内, 即可实现MCA再灌注。
1.2.3 EGB干预
术后2min尾静脉给药, 20mg/kg, 每天3次。
1.2.4 神经病学评分
参考Kuluz[6]神经缺陷三级评分的标准, 动物清醒后分别在对应时间点进行评分。符合条件的大鼠才可进入下一步试验。
1.3 小胶质细胞的检测
1.3.1 硝酸银染色法
染色步骤: (1) 组织固定于FAB液 (溴化铵-福尔马林) ; (2) 冰冻切片20μm; (3) 在含有数滴氨水的蒸馏水中洗30s; (4) 蒸馏水洗2次; (5) 浸碳酸银液体30s; (6) 10%福尔马林还原; (7) 蒸馏水洗; (8) 0.2%氯化金调色10min; (9) 蒸馏水洗; (10) 5%次亚硫酸钠固定5min; (11) 蒸馏水洗; (12) 脱水、透明、封固。
1.3.2 S-100蛋白表达检测-SABC
步骤如下: (1) 冰冻切片, 载玻片防脱片处理:经Polylysine防脱片处理。 (2) 低温恒冷切片机大鼠脑连续切片厚20μm。捞于Poly-lysine防脱片处理载玻片。 (3) 纯丙酮室温固定30min。蒸馏水洗。 (干燥后冰冻保存) 。 (4) 纯甲醇加H2O2至0.3%, 室温浸泡30min, 以灭活内源性过氧化物酶, 蒸馏水洗3次。0.1M PBS洗2min×3次。 (5) 滴加正常山羊血清封闭液, 室温20min。甩去多余液体, 不洗。 (6) 滴加适当稀释的一抗S-100 (一抗的稀释度1:100 0.1M PBS稀释) , 4℃过夜。0.1M PBS洗, 2min×3次。 (7) 滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, 37℃20min。0.1M PBS洗2min×3次。 (8) 滴加HIGH-SABC, 37℃20min。0.1M PBS洗5min×4次。 (9) DAB显色:使用DAB显色试剂盒。取1mL蒸馏水, 加试剂盒中A, B, C试剂各一滴, 混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间, 蒸馏水洗涤。 (10) 苏木素轻度复染。脱水、透明、封片。显微镜观察。
1.4 统计学处理
采用SPSS软件处理, 组间采用方差分析, 组内采用独立样本t检验。所有数据以均值±标准差表示, 显著性差异水平为P<0.05。
2 结果
2.1 小胶质细胞AgNO3染色观察
假手术组小胶质细胞胞体较小, 突起比较长 (图1) ;缺血2h再-灌注24h组, 在神经细胞严重损害的梗死区边缘, 小胶质细胞肥大、增生, 而在含散在萎缩神经元的梗死毗邻区域出现圆状、阿米巴状、杆状小胶质细胞 (图2) ;EGB治疗组与缺血2h再灌注24h组比较细胞数量多, 突起较长 (图3) 。
2.2 小胶质细胞S-100免疫组化染色观察
缺血2h再灌注24h组小胶质细胞S-100阳性细胞数量与假手术组 (图4) 相比明显增多, 小胶质细胞增生 (图5) ;EGB治疗组S-100阳性细胞数介于假手术组与缺血2h再灌注24h组之间 (图6) 。
3 讨论
几十年来人们对EGBCNS的作用进行了大量的研究, 表明EGB对CNS的保护作用明显, 能促进神经元的可塑性, 保护神经元的缺血损伤。但脑缺血-再灌注后EGB对小胶质细胞的影响少见报道。小胶质细胞在CNS损伤时能转变为有吞噬能力的小胶质细胞, 清除坏死的细胞及结构损伤的髓鞘, 在免疫应答的过程中发挥关键作用。脑缺血-再灌注后缺血损害区的小胶质细胞被激活, 其形态表现为圆形、阿米巴状、杆状, 并分化、增殖, S-100蛋白表达增强, 形态的变化表明其已转化为具有吞噬能力的小胶质细胞, 参与病理生理过程, 本实验中缺血2h再灌注24h组结果与其一致。小胶质细胞吞噬清除病原体和细胞碎片以及分泌抗炎物质、神经生长因子等, 有利于神经元再生和死亡周边区神经元的存活, 发挥神经营养作用。但有实验表明被激活的小胶质细胞对CNS也具有损伤作用, 即激活的小胶质细胞可产生一些细胞因子, 然后细胞因子如IL-1又可进一步刺激小胶质细胞产生更多的神经毒性自由基以及炎症因子, 对CNS产生损伤。因神经元不能再生, 其损伤作用显然更为有害。本实验结果显示大鼠脑缺血-再灌注后小胶质细胞被激活, 增生、肥大, S-100蛋白表达增加, EGB治疗组与缺血2h再灌注24h组比较细胞数量减少, 突起较长, S-100阳性细胞表达减弱, 表明EGB可抑制小胶质细胞过度激活, 减轻其对CNS的进一步损伤, 从而对脑组织起到保护作用。
参考文献
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局灶性脑缺血再灌注 篇2
代谢组学研究的是生物体各种细胞整合在一起的代谢物变化,以生物体的体液或组织为研究对象,着重强调生物体的代谢物谱在疾病或环境刺激下的整体应激和变化[2]。通过疾病引起的代谢物轮廓谱变化的分析,能够帮助更好地理解疾病的病变过程及机体内物质的代谢途径,同时也有助于疾病的生物标志物的发现和达到辅助临床诊断的目的[3]。气相色谱-质谱(GC-MS)方法具有高性能的毛细管柱,再加上高灵敏度的质谱检测,GC-MS不仅可以用来分析大多数的挥发性化合物,而且可以通过化学衍生化方法,分析许多半挥发性和非挥发性代谢物,被视为一种有用的代谢轮廓分析技术。
本文旨在利用已经建立GC-MS技术结合样品的衍生化反应的方法,获得正常大鼠和局灶性脑缺血模型大鼠血浆中内源性代谢物指纹图谱,并从代谢组学角度,利用主成分析方法探讨正常大鼠和模型大鼠血浆中代谢物的差异,以期发现脑缺血模型的生物标志物,为筛选治疗中风药物提供新的途径。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂 Agilent
6890N/5973N 气相色谱-质谱联用仪,配有Agilent7683自动进样器,Agilent DB-5MS毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 mm),Agilent色谱工作站和NIST2002质谱数据库。N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSTFA)和吡啶均为色谱纯,购于阿拉丁试剂公司,其余试剂均为分析纯。
1.2 动物模型制备和生物样品取样
SPF级SD大鼠10只,体重200 g±20 g,购于广东省实验动物中心。动物每笼5只群养,饲养于SPF级动物房,室内温度保持为(22±2)℃,相对湿度保持为30%～40%,喂常规饲料,自由进食饮水,造模。
建立大鼠大脑中动脉栓塞局灶性缺血模型。分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉和翼腭动脉。动脉夹夹闭右颈总动脉,在颈外动脉距结扎处近心端约0.5 cm处用注射器针头刺一小口,牵拉颈外动脉近心端至与颈内动脉成一直线。将尼龙线栓经右侧颈外动脉主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进,以颈总动脉分叉处为标记,推进18 mm～20 mm感到轻微阻力时,即已阻断大脑中动脉。完成脑缺血模型。
血浆样本的获取,取SPF大鼠,分别于再灌注后12 h、24h、48 h和72 h后,眼眶取血,血液中加入1%肝素抗凝,离心10min(10 000 r/min),移取血浆置于-80 ℃下保存。
1.3 生物样品制备
取200 μL冻后样本,加入200 μL乙腈沉淀蛋白,冰浴超声10 min后,离心分离10 min 。取上清置GC进样瓶,氮气吹干。加衍生化试剂BSTFA 30 μL,混匀,70 ℃下肟化1 h,静置1 h。
1.4 GC-MS条件
进样量,1 μL;进样口温度,270 ℃;载气,超纯氦(99.999 6%);流量,1 mL/min;接口温度:260 ℃;色谱柱DB-5MS毛细管柱;不分流进样。升温程序见表1。质谱条件,离子源温度,200 ℃;检测质荷比范围30～600;溶剂延时,5 min;扫描速度:20张图谱/秒。
2 结 果
2.1 方法学考察
2.1.1 精密度和重复性
分别对同一制备好血浆样品连续进样6次,计算主要共有峰的峰面积相对标准偏差。血浆样品中29个主要共有峰的峰面积相对标准偏差范围1.38%～6.78%,全部共有峰的峰面积相对标准偏差小于10%。说明仪器精密度良好。平行制备血液样品各6份,分别测定,计算主要共有峰的相对标准偏差,血浆样品的主要共有峰相对偏差2.14%～13.36%。说明该样品制备方法重复性良好。
2.1.2 样品稳定性
考察样品在冻融过程中的稳定性。取血浆样品按照1.3项下制备供试品各3份,经过一个冻融循环后,再取同样样品采用相同方法制备供试品各3份。血液供试品6份,GC-MS测定,并计算主要共有峰的峰面积相对标准偏差。结果显示,主要共有峰的峰面积相对标准偏差均小于15%,说明样品在一个冻融循环周期能保持稳定。
2.2 正常组大鼠血液样本的代谢指纹谱
正常大鼠血浆中内源性物质鉴定主要基于NIST质谱数据库,在数据库匹配中,根据匹配度和可能性来鉴定指纹谱中的色谱峰所代表的物质。选择匹配度大于900,并且可能性大于80%,基本上可表明该物质的鉴定结果具有较强的可信度。
本实验从大鼠血浆中共鉴定了29种化学物质,主要为氨基酸、有机酸、糖类、脂肪酸和固醇类等物质。这些物质经过NIST质谱数据库的鉴定,均具有较高的匹配度和可信度。鉴定结果见图1。
29种代谢物分别鉴定为:1,乳酸;2,丙氨酸;3,缬氨酸;4,甘氨酸;5,丝氨酸;6,苏氨酸;7,2,4-二羟基丁酸;8,氨基丙二酸,9,蛋氨酸;10,脯氨酸;11,谷氨酰胺;12,苯丙氨酸;13,磷酸甘油;14,柠檬酸;15,酪氨酸;16,十六碳烯酸;17,软脂酸;18,肌醇;19,赖氨酸;20,十八碳烯酸;21,硬脂酸;22,亚油酸;23,油酸;24,花生四烯酸;25,二十二碳六烯酸;26,软脂酸甘油酯;27,单硬脂酸甘油;28,磷酸核糖;29,胆固醇。
同时,对四批次正常大鼠的血浆代谢物指纹谱进行了分析和物质鉴定,结果如图1所示,经过指纹图谱相似度软件评价,其指纹图谱相似度为1.000,说明大鼠血浆代谢物谱的物质组成基本一致,主要是由氨基酸、有机酸、脂肪酸和固醇类等组成。不同批次大鼠之间的血浆代谢物指纹图谱基本无差异,个体差异基本不影响大鼠血浆代谢物谱的获得。
2.3 模型大鼠血浆代谢物指纹谱
本实验建立的GC/MS分析方法应用于线栓法制备的大鼠模型代谢组学研究,代谢物指纹图谱详见图2。同时利用NIST质谱数据库鉴定模型大鼠血浆中的内源性代谢物,运用主成分分析法(PCA)识别代谢物谱随脑缺血时间变化规律。如图2所示,脑缺血12 h、24 h、48 h和72 h的代谢物谱与空白血浆代谢物谱进行对比,图谱中色谱峰的分布基本一致,空白血浆中鉴定的29个代谢物在模型大鼠血浆代谢物谱中也能够找到,说明建立的分析方法具有很好的重现性。
M-12,缺血12 h;M-24,缺血24 h;M-48,缺血48 h;M-72,缺血72 h。
2.4 正常大鼠与模型大鼠血浆代谢指纹图谱差异
大鼠脑缺血2 h麻醉清醒后,表现为不同程度的局灶性神经功能障碍。如耸毛,左上肢屈曲内收,提尾向前爬行时向左侧转圈(追尾征),向左侧倾倒,侧推抵抗力下降,蜷卧少动等;再灌注4 h～6 h后局灶性神经功能障碍症状如左上肢屈曲内收,及提尾向前爬行时向左侧转圈或向左侧倾倒等基本消失,双侧抗侧推抵抗力基本相同,仅表现为耸毛,蜷卧少动。
大鼠处死后取脑肉眼观察,正常组脑组织颜色形态均正常,无苍白及肿胀。脑缺血2 h再灌注24 h后缺血侧大脑组织肿胀明显,颜色变浅,软脑膜血管有出血。光镜下观察,正常组脑神经细胞结构完整,细胞核较大,核仁清楚,细胞及间质无水肿;脑缺血2 h再灌注2 h组脑神经细胞多数神经细胞核固缩,核仁显示不清,细胞外空隙明显增宽,间质疏松,显示细胞周围及间质水肿。
从代谢角度,上述的生理变化主要体现为生物体液中各种代谢物的改变。根据获得的正常和模型大鼠代谢物GC/MS指纹谱,采用主成分分析法(PCA)对正常大鼠与模型大鼠血浆代谢物指纹图谱差异进行分析,PCA是目前代谢组学数据处理中最常用的方法之一,能够将原数据的高维样本点投影到是少数就几个主成分上,最大限度地提取原变量的数据结构信息,从而达到数据降维。正常组和模型组的样本点完全分离,且各组内样本点聚集较好,说明模型组大鼠生理及物质代谢状况已经发生了明显改变,与行为学观察及手术观察结果一致。
2.5 不同时间点模型大鼠血浆代谢物指纹图谱差异
不同时间组与正常组的偏离程度不同,呈现一定的规律,表明代谢物谱模式变化与脑缺血时间相关,可以清楚地显示脑缺血模型随着时间的延长,缺血程度逐渐减轻,脑梗死逐渐恢复的变化过程。与脑缺血模型的行为学观察比较一致(随着时间延长,中风行为学症状逐渐减轻)。12 h和24 h组均偏离正常组较远,表明脑缺血损伤严重;48 h开始接近对照组,呈现恢复趋势;72 h与正常组基本接近,表明缺血损伤已经开始恢复。
2.6 重要化合物的差异
根据测得的正常组和模型组血浆代谢物指纹图谱数据,发现14个在两组间变化非常明显的化合物,以加入的内标二十二烷为参照,分别计算这14个峰的相对峰面积。12个主要代谢物相对峰面积在正常组和模型组间具有统计学意义。其中血浆中的氨基酸比正常组有显著降低,说明脑缺血引起的细胞损伤应该与氨基酸的代谢紊乱有关系。可初步认为这12个变化显著的化合物为脑缺血再灌注损伤的生物标志物。详见表2。
3 讨 论
本实验利用建立的GC/MS代谢组学分析方法应用于局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型的代谢组学研究,利用GC/MS技术检测血浆中的内源性代谢物,并采用主成分分析法对所获得的代谢组数据进行模式识别。研究结果显示,随着缺血时间的推移,大鼠血浆的GC/MS代谢物指纹谱存在着一定的变化规律,部分游离氨基酸等代谢物在不同缺血时间之间呈现显著差异。以脑组织病理检查结果作对照,发现上述变化都与脑损伤程度密切相关。说明基于GC/MS的代谢组学方法能有效识别因生理状态改变而紊乱的代谢模式差异。
摘要：目的 利用基于硅烷基衍生化反应的气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)的代谢组学测定方法,获得局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的血浆代谢物指纹图谱,初步揭示局灶性脑缺血再灌注损伤的生物标志物,为脑缺血药物筛选提供新的方法。方法 通过硅烷基化反应,将生物样品中的氨基酸、脂肪酸、有机酸、糖类和固醇类物质制成热稳定性强、易挥发的硅烷酯或醚,通过优化色谱条件对大鼠血浆中内源性代谢物进行分析测定。结果 利用已建立的GC-MS测定方法,获得了大鼠血浆代谢物指纹图谱,并鉴定了其中29个主要色谱共有峰,并通过主成分分析方法比较正常和模型组的指纹图谱差异。结论 通过正常组和模型组大鼠血浆代谢物指纹图谱的比较分析,发现与脑缺血相关的生物标志物。
关键词：局灶性脑缺血再灌注损伤,气相色谱-质谱联用技术,代谢组学,指纹图谱
参考文献
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局灶性脑缺血再灌注 篇3
1 材料与方法
1.1 试验药物与试剂
迷迭香酸购自Sigma公司。2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)为中国医药上海化学试剂公司产品。SOD、GSH-Px和MDA试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。
1.2 动物
雄性Wistar大鼠,体重200～280g,由兰州大学医学实验动物中心提供。
1.3 仪器
病理图象分析系统(四川大学产品),UV29100 紫外可见分光光度仪(北京第二光学仪器厂产品) 。
1.4 方法
1.4.1 分组及给药
大鼠35只随机分为5组,腹腔注射给药3天后用线栓法造模[8],缺血 4h后再灌注 2h,然后观察各项指标。
1.4.2 行为学评分[9]
评分标准:①提鼠尾,左前肢内收,左肩内旋者1～4分。②将大鼠置光滑平面,推右肩向左侧移动,阻力降低者1～3分。③左前肢肌张力降低1～3分。共10分。分数越高,动物的行为障碍越显著。
1.4.3 脑梗塞体积的测定
大鼠股动脉取血然后迅速断头处死, 连续冠状切片,迅速放入2%TTC 溶液(37℃)中染色30min,缺血区呈苍白色,正常区为玫瑰色,采用病理图象分析系统计算脑梗塞体积所占百分比。
1.4.4 MDA含量测定
大鼠股动脉取血制备血清,测定血清MDA含量。
1.4.5 SOD和GSH-Px的活力测定
采用SOD和GSH-Px试剂盒测定血清SOD和GSH-Px的活力。
1.4.6 统计学处理
所有结果以undefined表示,用t检验分析结果。
2 结果
2.1 迷迭香酸对大鼠行为学的影响
除假手术组未出现神经缺损的症状外,其余各组出现不同程度的神经缺损的症状。表现为左前肢内收;躯体向病灶对侧倾斜,向左侧推阻力下降;部分大鼠活动时有向瘫痪侧打转现象。与假手术组比较,模型组出现严重的神经缺损症状。与模型组比较,迷迭香酸10、50mg/kg及葛根素50mg/kg均能显著改善大鼠神经缺损的症状(P<0.01)。在剂量相同时,迷迭香酸的作用与葛根素相当(P>0.05)。结果见表1。
注:与模型组比较,*P< 0.05,**P< 0.01。
2.2 迷迭香酸对大鼠脑梗塞体积的影响
与假手术组比较,模型组出现严重的脑梗塞,脑梗塞体积为(22.92±1.92)%。与模型组比较,迷迭香酸10和50mg/kg对脑梗塞体积均有显著的降低作用,分别使梗塞体积降低到(18.78±2.43)%和(17.77±3.90)%。在剂量相同时,迷迭香酸的作用与葛根素相当(P>0.05)。结果见表1。
2.3 迷迭香酸对大鼠血清MDA含量的影响
模型组与假手术组比较,血清MDA含量显著升高(P<0.01)。与模型组比较,葛根素50mg/kg使MDA含量降低39.69%, 迷迭香酸10和50mg/kg分别使MDA含量减低42.05%和45.52%(P<0.01)。结果见表2。
注:与模型组比较,*P< 0.05,**P< 0.01。
2.4 迷迭香酸对大鼠血清SOD和GSH-Px活力的影响
模型组与假手术组比较,血清SOD活性显著降低(P<0.01)。与模型组比较,葛根素50mg/kg使血清SOD活性增加1.16倍, 迷迭香酸10和50mg/kg分别使血清SOD活性增加1.12和1.15倍(P<0.01)。结果见表2。
模型组与假手术组比较,血清GSH-Px活性显著降低(P<0.01),与模型组比较,葛根素50mg/kg使血清GSH-Px活性增加1.07倍, 迷迭香酸50mg/kg使血清GSH-Px活性增加1.06倍(P<0.01)。结果见表2。
3 讨论
大脑中动脉(MCA)是人群脑缺血的多发部位,MCA闭塞模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型,而插线法这种模型无须开颅,MCA闭塞效果较理想,是目前能进行再灌流损伤研究的理想动物模型。本实验采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,观察迷迭香酸对大鼠脑缺血的影响。结果显示迷迭香酸可减少大脑中动脉阻断所致的脑梗塞体积,改善脑缺血大鼠的行为障碍。研究结果表明迷迭香酸对脑缺血性损伤具有明显的保护作用。
涉及再灌注损伤机制的因素有许多, 其中氧自由基的生成在其中起重要作用。一般认为,脑缺血时自由基的损害以脑缺血后再灌注为甚,可能是不完全性脑缺血残留的滴状供血,提供微量氧气,使脂质过氧化得以维持进行,加重损害。脂质过氧化的终产物(MDA) 有很强的毒性和反应性, 它们可使脂质过氧化在细胞膜系统蔓延导致细胞功能的破坏, 所以测量脂质过氧化的终产物被认为是氧自由基损伤的重要指标。在正常状态下, 机体ROS 的产生和清除间存在着动态的平衡, 产生的自由基可被SOD、GSH-Px和过氧化氢酶等清除, 测定抗氧化酶类的活性可以间接反应体内清除自由基的能力变化。脑缺血再灌注时,ROS的生成过多,超过了抗氧化酶对它的清除,就会导致氧化应激和细胞损伤。脑缺血大鼠再灌注后,MDA含量明显升高,SOD和GSH-Px显著降低,表明脑缺血再灌注期脂质过氧化增加,机体抗氧化能力降低。迷迭香酸能显著降低MDA含量,提高SOD和GSH-Px的活性,表明迷迭香酸对脑损伤的保护作用与其抗氧化作用有关。
参考文献
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局灶性脑缺血再灌注 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
健康成年雄性SD大鼠144只, 体重250~280 g, 由石河子大学实验动物中心提供。随机分为四组, 每组36只:缺血/再灌注对照组 (MACO组) , calpeptin治疗组 (calpeptin组) , 溶剂二甲基亚砜对照组 (DMSO组) , 假手术组 (sham组) 。每组又分为再灌注后12、24和48 h三小组, 每组12只, 每个时间点分别取6只大鼠行TTC染色检测脑梗死体积, 6只检测海马CA1区神经元凋亡。Calpeptin及DMSO购至calbiochem公司, TUNEL试剂盒购至博士德公司。
1.2 方法
1.2.1 给药方法
手术前大鼠用1%的戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 腹腔注射麻醉后, 俯卧固定于脑立体定位仪上, 暴露前囟, 调节微调旋钮, 使微量注射器针尖正对左侧侧脑室 (前囟左侧1.8 mm, 后0.8 mm) , 钻孔, 将微量注射器下移至软脑膜, 缓慢进针4.5 mm, 注射calpeptin 50μg (溶于DMSO 5μL中) 或DMSO5μL, 注射时间5 min, 留针5 min, 注射后即进行造模手术。
1.2.2 MCAO模型的建立
参照Belayev等[3]改良的Longa方法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型, 假手术组尼龙线插入的深度为10 mm, 其余步骤相同。手术期间用100 W的白炽灯照射, 保持大鼠肛温在36.5~37.5℃。2 h后小心拉出尼龙线10 mm即造成再灌注模型, 再次扎紧CCA及其内的尼龙线。
1.2.3 神经功能评价
大鼠麻醉清醒后, 参考Longa5分制评分标准在相应的时间点对其进行神经功能评定, 0分:无神经损伤体征;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向对侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发行走, 意识丧失[4]。分值越高说明大鼠行为障碍越严重。
1.2.4 TTC染色测量脑梗死体积
神经功能行为评价完成后, 动物麻醉后断头处死, 迅速取脑, 生理盐水冲洗残血, 置0℃生理盐水中15 min, 再取出置于大鼠脑垫中, 去掉鼠脑嗅球、小脑和部分低位脑干, 剩余部分由前向后行2 mm厚冠状切片, 迅速放入2%TTC溶液中, 37℃恒温孵育30 min, 染色后置10%甲醛中固定。24 h后取出用数码相机拍照脑片两面, 输入计算机, 用多功能真彩色病理图像分析仪及计算机病理图像分析仪测量脑片两个面的梗死面积 (玫瑰红色区为正常脑组织, 苍白色区为梗死区) , 根据梯形法计算出梗死灶体积, 各脑片梗死体积之为总的梗死体积。同时计算出每个脑片的体积, 每个脑片的体积之和为整个脑体积, 梗死体积和脑体积之比为梗死体积百分比。
1.2.5 原位细胞凋亡检测 (TUNEL法)
实验动物在设定时间点神经功能评分后经戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后, 依次用4℃生理盐水200 m L及4℃4%多聚甲醛400 m L经左心室升主动脉灌注, 灌注完立即断头取脑, 置于4%多聚甲醛中后固定10 h, 酒精梯度脱水, 石蜡包埋, 在海马与齿状回互抱处取材, 每隔100μm连续6μm切片6张, 切片贴附于预处理的载玻片上, 用前脱蜡至水。用TUNEL技术检测大鼠缺血侧海马CA1区的神经元凋亡, 具体操作方法按说明书进行。在高倍镜 (×400) 下观察海马CA1区中相互不重叠的4个视野, 细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞, 计数其中阳性细胞数, 取均值。每一批实验中设立阳性对照和阴性对照。阳性对照为在TUNEL标记反应前用DNaseⅠ (1 mg/m L) 37℃温箱孵育切片20 min, 结果细胞核呈阳性。阴性对照为TUNEL标记反应液中省去TUNEL反应混合液, 而只加标记液, 结果细胞不显色。
1.3 统计学处理
所有数据使用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析, 计量资料以 (±s) 表示, 数据比较用单因素方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠神经功能学评分
sham组大鼠苏醒后未见明显的神经功能学缺失, MCAO组麻醉苏醒后即有明显的神经功能缺失, 再灌注24 h神经功能缺失最为严重。DMSO组与MCAO对照组相比较差异无统计学意义, 各时间点的calpeptin处理组与同时间点MCAO组及DMSO组相比神经功能有明显改善, 但仍高于sham组。见表1。
分
*P<0.05, **P<0.01, 与同时间点MCAO组比较;与同时间点DMSO组比较, #P<0.05
2.2 海马CA1区神经元凋亡
TUNEL技术检测发现, sham组有少量的神经元凋亡, MCAO组在缺血2 h再灌注12 h即可检测到明显的神经元凋亡, 在24 h达高峰, DMSO组与同时间点的MCAO组相比差异无统计学意义, 各时间点calpeptin组与同时间点MCAO组及DMSO组比较, 凋亡的神经元显著减少。见表2。
*P<0.05, **P<0.01, 与同时间点MCAO组比较;与同时间点DMSO组比较, #P<0.05
2.3 脑梗死体积
sham组未见明显的梗死灶, MCAO组可见比较恒定的白色梗死区, 梗死部位主要集中在额顶区皮质、尾壳核背外侧。DMSO组与同时间点的MCAO组相比梗死体积差异无统计学意义, 各再灌注时间点calpeptin处理组与同时间点MCAO组及DMSO组相比, 梗死体积显著减小。见表3。
*P<0.05, **P<0.01, 与同时间点MCAO组比较;#P<0.05, ##P<0.01, 与同时间点DMSO组比较
3 讨论
缺血性脑血管病是严重危害人类健康的疾病之一, 其病理生理过程涉及多种毒性级联过程[5]。calpain在缺血性脑损伤中起着重要的作用而备受关注, 是近年来研究的热点之一[6]。calpain分为calpainⅠ (又称μ-calpain) 和calpainⅡ (又称m-calpain) 两种类型, 可分别被微摩尔和毫摩尔水平的Ca2+激活[7], 在生理状态下, calpain以酶原的形式存在于细胞质中[8], 在病理情况下 (如脑缺血等) , 细胞内Ca2+超载, Ca2+与calpain催化区的特异性钙调蛋白样位点结合引起构象改变, 从而使其激活, 激活后的calpain可水解关键的细胞骨架蛋白而导致细胞死亡[9]。有研究发现猴子短暂性全脑缺血后, 海马CA1区神经元内μ-calpain大量激活, 激活后的μ-calpain可水解溶酶体膜连接蛋白, 导致溶酶体破裂, 导致水解酶大量释放, 造成神经元坏死[10]。激活后的calpain还可引起线粒体渗透性转变, 导致细胞死亡。
以往一直认为calpain主要参与细胞坏死, 但越来越多的证据表明它也在凋亡中也起着重要作用。有研究发现钙蛋白酶抑制剂PD1506可显著抑制培养的神经胶质母细胞瘤细胞及海马神经元的凋亡, 说明calpain参与了神经元的凋亡的发生[11]。
局灶性脑缺血再灌注 篇5
1 材料与方法
1.1 材料 选择健康雄性SD大鼠40只,体重250 g～300 g (由遵义医学院珠海校区实验动物中心提供)。大鼠随机分为假手术组、缺血组、小剂量葛根素治疗组(小剂量组)、大剂量葛根素治疗组(大剂量组),每组10只。以上各组再随机均分为两组,一组用于TTC染色,另一组用于Bcl-2、Bax蛋白及凋亡细胞测定。大、小剂量组分别在缺血前30 min及缺血后1 h再灌注,同时腹腔内注射葛根素(由海南斯达制药有限公司生产,批号:031105029)20 mg/kg及80 mg/kg。缺血组、大剂量组、小剂量组均在缺血再灌注后24 h处死。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制备 参照改良Longa方法[2]制作大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型,阻断血流1 h后将栓线拔出使其恢复血流,实现再灌注。假手术组除不插线外,余步骤同手术组。
1.2.2 TTC染色 各组大鼠在缺血再灌注后24 h快速断头取脑,行2 mm厚冠状切片,立即置于2%红四氮唑(TTC)溶液中,37 ℃恒温下避光染色30 min,正常组织染率红色,梗死组织染为白色。利用Luxex-F图像分析仪测定梗死体积。
1.2.3 切片制备 实验动物在缺血再灌注24 h后,以4%多聚甲醛经心脏灌注固定,断头取脑,再以4%多聚甲醛固定24 h。常规脱水、透明、石蜡包埋、连续冠状切片,切片厚度6 μm。同一层面相邻切片分别作TUNEL染色、Bcl-2及Bax免疫组化染色。
1.2.4 细胞凋亡检测 采用TUNEL法原位标记DNA片段检测凋亡细胞,试剂盒购自武汉博士德公司,严格按照说明书进行具体操作。
1.2.5 Bcl-2和Bax免疫组化染色 试剂购自武汉博士德公司。采用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)免疫组化染色方法检测Bcl-2和Bax蛋白。切片常规脱蜡水化后用3%甲醇过氧化氢孵育20 min,微波抗原修复后,滴加山羊血清封闭液20 min,分别滴加兔抗Bcl-2抗体和Bax抗体于4 ℃过夜,滴加生物素化羊抗兔IgG 20 min,辣根酶标记的链霉亲和素20 min,以上各步骤均用PBS 0.01 mol/L(pH 7.4)充分洗涤,最后用DAB显色。
1.3 统计学处理 在高倍物镜下,取每张切片中梗死灶边缘区域相互不重叠的4个视野,计数其中阳性细胞总数,实验数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 梗死体积(见表1)
假手术组未发现梗死病灶,缺血组梗死病灶位于缺血侧额顶叶皮质及尾状核、壳核区域。小剂量组、大剂量组梗死体积均明显小于缺血组(P<0.01),大剂量组梗死体积小于小剂量组(P<0.05)。详见表1。
2.2 凋亡细胞测定(见表1)
假手术组未见或仅见少量凋亡细胞出现。缺血组可见缺血周边区内有大量凋亡细胞存在。小剂量组、大剂量组缺血周边区内凋亡细胞数较缺血组明显减少(P<0.01),大剂量组凋亡细胞数少于小剂量组(P<0.05)。
2.3 Bcl-2、Bax蛋白表达(见表1)
假手术组可见Bcl-2、Bax呈少量表达。缺血组在缺血周边区Bcl-2蛋白表达较假手术组增加(P<0.01)。小剂量组、大剂量组Bcl-2表达显著高于缺血组(P<0.01),大剂量组Bcl-2蛋白表达高于小剂量组(P<0.05)。缺血组Bax蛋白较假手术组表达显著增高(P<0.01),小剂量组Bax蛋白表达少于缺血组(P<0.05),大剂量组Bax蛋白表达明显少于缺血组(P<0.01),小剂量组、大剂量组两组Bax蛋白表达无统计学意义。
3 讨 论
脑缺血后神经元死亡是一个极其复杂的病理过程。研究结果表明缺血后神经元死亡主要表现为坏死和凋亡两种形式,分别涉及主动和被动细胞死亡机制。在脑缺血急性期,神经元坏死与凋亡并存,细胞坏死位于缺血中心区,细胞凋亡主要出现在缺血半暗带,而在脑缺血的迟发性神经元死亡期,则以细胞凋亡为主。凋亡可能决定了最终梗死体积。细胞凋亡是在生理和病理条件下的一种主动死亡方式,是受细胞内基因和一些细胞外因子调控的生物学过程。自1990年以来,大量的动物实验证实缺血性神经元损伤过程存在细胞凋亡后,凋亡相关基因和蛋白的研究也日趋深入。业已证明,Bcl-2家族蛋白在神经元凋亡的调控过程中具有重要作用,其抗凋亡蛋白成员和促凋亡蛋白成员之间的协同作用共同决定细胞是否进入凋亡程序[3]。Bcl-2与Bax作为Bcl-2家族蛋白中的重要成员,其表达的变化对细胞的命运起决定作用[4]。
Bcl-2是最早发现的一种重要的内源性抗凋亡因子[5],为Bcl-2基因编码的一种由229个氨基酸残基组成的跨膜蛋白,相对分子质量为25 000～26 000,只存在于线粒体、核膜和内质网,其基本生物学功能为延长细胞的生命期限,增加细胞对多种凋亡刺激因素的抵抗性,是一种强有力的细胞死亡抑制因子。Ferrer等[6]研究发现鼠局灶性脑缺血1 h和再灌注0 h、1 h、4 h、6 h、12 h,在皮质、缺血梗死区边缘有Bcl-2表达,存活的神经细胞中Bcl-2表现增高,可见Bcl-2在决定神经元生存中起重要作用。Bcl-2对神经元的保护作用在一些转基因治疗的实验中也得到了证实。Martinou等[7]培养了神经元过表达人类Bcl-2蛋白的转基因鼠,Bcl-2的过表达可使脑缺血后梗死体积缩小50%。故认为缺血脑组织中Bcl-2的表达是抑制神经细胞凋亡的关键步骤[8],Bcl-2在调节神经元凋亡过程中发挥着关键作用。在研究Bcl-2蛋白及其作用机制时,发现一种相对分子质量为21 000的蛋白,命名为Bax;并发现当Bax同源二聚体形成,便促进细胞凋亡[9]。一般说来,在胞质中的Bax以单体形式存在,然而在细胞发生凋亡时,与线粒体关联的Bax既可能以无活性的单体形式存在,也可能以与线粒体膜结合的大分子量的活性复合物形式存在。研究发现Bax可能是Bcl-2家族中最重要的死亡促进基因,Bcl-2与Bax结合成异二聚体是Bcl-2发挥抗凋亡活动所必需的[10]。近年研究表明[11],脑缺血再灌注后Bcl-2与Bax的比值(Bcl-2/Bax)决定着细胞受诱导刺激后是凋亡抑或存活,比值增高时促进细胞存活,否则细胞死亡。
局灶性脑缺血再灌注 篇6
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠72只, 体重220 g～280 g, 山西医科大学生理教研室动物中心提供。
1.2 药物与试剂
米诺环素 (sigma公司) ;兔抗大鼠p-JNK单克隆抗体、鼠抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、TUNEL试剂盒和SP免疫组化试剂盒 (北京中山生物技术有限公司) ;2%红四氯氮唑 (TTC) 溶液;10%水合氯醛;4%多聚甲醛。
1.3 方法
1.3.1 实验分组及动物模型制备
72只健康雄性Wistar大鼠随机分为:假手术组、脑缺血再灌注组 (MCAO组) 、米诺环素干预组。每组又分为再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h 共4个时间点, 每个时间点6只。大鼠腹腔麻醉后, 取颈部正中切口, 分离出右侧颈总动脉 (CCA) 、颈内动脉 (ICA) 及颈外动脉 (ECA) , 结扎ECA及其分支, 结扎CCA近心端, 于CCA近分叉处切口, 插入0.23 mm尼龙线。栓线插入深度自CCA分叉处为16 mm～18 mm。假手术组仅插入10 mm, 余步骤相同。米诺环素组在缺血1 h再灌注即刻给予米诺环素腹腔注射, 首剂45 mg/kg, 后每12 h给药一次, 每次22.5 mg/kg, 直至大鼠处死。假手术组和模型组给予等量生理盐水腹腔注射。
1.3.2 脑缺血后神经功能评分标准
用Berderson等[1]5分制法进行神经功能评分评分。以大鼠手术麻醉清醒后神经功能缺陷评分1分～3分, 无蛛网膜下腔出血动物进行实验。0分、4分或死亡剔除, 再随机补充。
1.3.3 免疫组织化学染色
切片依次脱蜡, 3% 过氧化氢孵育15 min, PBS洗5 min×3次;高压抗原修复1.5 min;滴加1∶100的p-JNK、Bcl-2抗体, 放入4 ℃冰箱过夜;PBS洗5 min×3次;滴加二抗工作液, 37℃温箱孵育20 min;PBS洗3 min×3次, DAB显色、脱水、透明、封片。每张切片于高倍镜下 (400×) 缺血侧皮质区随机采集5个非重叠视野进行统计。
1.4 统计学处理
实验结果以均数±标准差
2 结 果
2.1 病理学改变
2.1.1 肉眼观察
假手术组脑组织形态、色泽正常。缺血再灌注对照组大鼠梗死侧半球明显肿胀, MCA供血区苍白、无光泽, 脑表面血管充血。米诺环素干预组较模型组病变减轻。
2.1.2 HE染色光镜下观察
假手术组缺血侧脑组织HE染色着色较深, 细胞密度大, 形态和结构无异常。缺血再灌注脑组织梗死灶位于右侧额顶叶皮质和纹状体区, 成片状分布。缺血中心区灶性细胞肿胀、溶解等坏死特征, 梗死灶周围出现部分细胞核固缩浓染, 核仁模糊或消失, 细胞间质染色浅而不均匀偶见凋亡小体;随再灌注时间延长梗死灶周围具有凋亡性细胞形态的神经细胞增多。米诺环素干预组各时间点神经元细胞肿胀、空泡变性及不规则核较少, 程度较轻。梗死灶周围固缩浓染的细胞数明显减少, 细胞间质染色较均匀。
2.2 p-JNK的表达
假手术组皮层偶见极少数的p-JNK染色阳性细胞。缺血再灌注对照组不同时间点缺血侧皮层可见较多阳性细胞, 主要在神经元核、核膜中表达, 部分胞浆内也可见, 阳性显著的神经元形态变化较大, 胞体肿胀明显。高峰为再灌注后48 h, 与其他时间点相比有统计学意义 (P<0.01) , 随着时间的延长以缺血周围区显著。米诺环素干预组同样出现阳性细胞, 细胞形态及好发部位、不同时间点的表达规律与缺血再灌注组无差异, 但在各时间点阳性数目均降低, 与缺血再灌注组比较有统计学意义 (P<0.01 ) , 以缺血周围区下降较明显。详见表1。
与前一时间点比较, 1) P<0.05, 2) P<0.01;与缺血再灌注组比较, 3) P<0.01
2.3 Bcl-2表达的变化
假手术组及缺血再灌注组非缺血侧大脑半球未见Bcl-2阳性表达。缺血再灌注组在缺血侧皮层有Bcl-2阳性表达, 主要在神经元胞质、突起及核浆中, 呈棕黄色细小颗粒状, 胞核不着色。缺血1 h再灌注6 h组阳性表达较少, 再灌注12 h组阳性表达达高峰;再灌注48 h阳性细胞表达下降。米诺环素干预组细胞形态及好发部位与模型组无差异, 但在各时间点阳性数目增多, 与缺血再灌注组比较有统计学意义 (P<0.01) , 以缺血周围区阳性细胞下降较明显。详见表2。
与前一时间点比较, 1) P<0.01;与缺血再灌注组比较, 2) P<0.01
3 讨 论
3.1 p-JNK与脑缺血再灌注
JNK信号通路是1991年发现的一类MAPK 通路, 作为MAPK信号通路中重要的通路之一, 参与了多种生理、病理过程, 在脑缺血再灌注损伤过程中尤其是程序性细胞死亡过程中起着重要的调控作用。JNK通路的激活与细胞凋亡关系密切, 可介导氧化应激、细胞因子、紫外线、蛋白质合成抑制剂、渗透压应激等。
本实验发现p-JNK在缺血再灌注后随时间的延长, 表达持续增高到48 h, 随着再灌注时间的延长, 主要表达在缺血周围区域, 提示JNK通路可能是缺血后神经元延迟性死亡的重要机制。Hiroshi等通过构建大鼠局灶性脑缺血发现p-JNK于从缺血再灌注7 h明显增高并随着再灌注时间的延长逐渐增多, 并认为JNK介导的死亡信号通路与pI3K/Akt介导的存活信号通路决定了大鼠脑缺血周围区的细胞命运[2]。 Nicholas等[3]对18例脑梗死患者尸检发现 p-JNK与TUNEL 共表达于脑组织的梗死灶和缺血半暗带中, 说明p-JNK与脑缺血周围区的细胞凋亡关系密切, 揭示p-JNK可能参与细胞凋亡的过程。
3.2 Bcl-2与脑缺血再灌注
Bcl-2家族蛋白成员在细胞凋亡中起重要作用, 它们之间可形成同源二聚体或异源二聚体, 调节细胞死亡和存活信号的平衡状态, 是决定细胞存亡的关键。Bcl-2蛋白是一种与细胞器特别是线粒体膜相关联的稳定蛋白, 维护线粒体膜的完整性, 防止膜间隙凋亡蛋白溢出而抑制凋亡[4], 抑制Ca2+的释放, 从而抵制钙依赖性的细胞损伤而抑制凋亡[5]。另外, Bcl-2还能直接与凋亡蛋白活性因子-1 (Apaf-1) 结合, 形成Bcl-2/Apaf-1/caspase-9复合物, 从而阻断caspase的始动激活[6]。
本实验结果表明, 脑缺血再灌注时在缺血侧皮层区有Bcl-2阳性表达, 主要分布在缺血周围区皮层, 并于再灌注较早期表达达高峰, 说明Bcl-2的这种变化可能是神经细胞自我保护机制之一, 可防止或减少脑缺血再灌注时细胞凋亡的发生。米诺环素干预组中各时间点Bcl-2表达较缺血再灌注组增多, 提示米诺环素具有上调皮层神经元细胞中Bcl-2的表达, 进一步抑制细胞凋亡。
米诺环素是半合成四环素类抗生素, 具有良好的脂溶性, 可有效地通过血脑屏障。Michaelis等[7]的研究表明米诺环素可以抑制西尼罗河病毒介导的脑细胞凋亡及阻断病毒所激活的JNK通路, 具有与c-jun抑制剂相同的作用, 提示米诺环素可以通过JNK通路从而抑制神经元的凋亡。于欢等[8]认为米诺环素能减少caspase-3的裂解, 抑制线粒体凋亡通路启动, 从而减轻癫痫发作对神经元的损伤。这一作用与抗凋亡因子Bcl-2的上调有关。本实验探讨了p-JNK和Bcl-2 在大鼠缺血再灌注损伤后时空表达的特点, 以及米诺环素在脑缺血再灌注的作用机制, 认为米诺环素能通过抑制p-JNK, 上调Bcl-2表达起到抗凋亡的作用, 减轻缺血再灌注后神经细胞的损伤, 具体机制需要进一步的研究。
参考文献
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[2]Mitsios N, Gaffney J, Krupinski J, et al.Expression of signalingmolecules associated with apoptosis in human ischemic stroke tis-sue[J].Cell Biochem Biophys, 2007, 47 (1) :73-86.
[3]Kamada H, Nito C, Endo H, et al.Badas a converging signalingmolecule between survival PI3-K/Akt and death JNKin neuronsafter transient focal cerebralischemia in rats[J].J Cereb BloodFlow Metab, 2007, 27 (3) :521-533.
[4]Tsuji motoY.Cell death regulation by the Bcl-2 protein family inthe mitoeh-ondria[J].J Cell Physiol, 2003, 195 (2) :158-167.
[5]Rizzuto R, Pintonp, Ferrari D, et al.Calcium and apoptosis:Factsand hypotheses[J].Oncogene, 2003, 22:8619-8627.
[6]Sutton VR, Davis JE, Cancilla M, et al.Initiation of apoptosis bygranzyme Brequires direct cleavage of bid, but not direct granzymeB-mediated caspase activation[J].J Exp Med, 2000, 192 (10) :1403-1414.
[7]Michaelis M, Kleinschmidt MC, Doerr HW, et al.Minocycline in-hibits West Nile virus replication and apoptosis in human neuronalcells[J].Anti microb Chemother, 2007, 60 (5) :981-986.
局灶性脑缺血再灌注 篇7
1 材料与方法
1.1 动物与试剂 选用健康雄性Wistar大鼠 (山西医科大学实验动物中心提供) 40只, 鼠龄3个月～4个月, 体重250 g±15 g。左卡尼汀 (珠海亿邦制药有限公司, 批号20090102) ; ATP酶试剂 (南京建成生物工程研究所提供) ;普通试剂由山西医科大学实验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及给药方法 健康雄性Wistar大鼠40只, 随机分为假手术组 (A组) 、生理盐水对照组 (B组) 、左卡尼汀100 mg/kg治疗组 (C组) 、左卡尼汀200 mg/kg治疗组 (D组) , 每组10只。B组、C组、D组制作模型前30 min分别以生理盐水1 mL, 左卡尼汀100 mg/kg、200 mg/kg腹腔注射。
1.2.2 右侧大脑中动脉缺血再灌注模型的建立 采用改良Longa法[2]建立大鼠脑缺血再灌注模型。将大鼠用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉, 颈正中右旁开0.5 cm～1.0 cm切口, 钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉, 结扎颈外动脉、颈总动脉近心端, 在颈总动脉距离分岔口大约5 cm处用眼科剪剪开一小口, 将直径0.236 mm的进口尼龙鱼线插入, 以分岔口处开始测量距离, 插入1.8 cm～2.0 cm后固定鱼线, 缝合。缺血2 h后将线栓拉出1 cm左右即可, 形成再灌注。其中假手术组插入1.0 cm鱼线, 其余步骤同实验组。神经功能缺损评分:按照Longa等[2]的5级4分法标准, 神经功能缺损评分在1分～3分者入选。
1.2.3 标本及病理切片的制备 左卡尼汀各剂量组、生理盐水对照组在缺血2 h再灌注24 h, 假手术组在24 h后, 颈椎脱臼处死, 迅速取脑, 各组随机取两只大鼠右侧脑组织迅速固定, 石蜡包埋后, 在海马部位做矢状切片, 厚约5 μm, HE染色, 观察组织学变化。
1.2.4 脑组织匀浆的制备与指标的检测 将脑组织用生理盐水漂洗, 除去血液, 滤纸拭干, 精确称重后制备10%匀浆。低温离心机将匀浆以3 500 r/min离心15 min, 取上清液检测ATP酶, 严格按照试剂盒提供的步骤进行测定。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件包, 数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 光镜下HE染色结果
假手术组大脑皮质及海马神经细胞形态基本正常。生理对照组神经细胞变性坏死明显, 胞体肿胀, 周围间隙增宽, 结构不清, 出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解。左卡尼汀各剂量组神经细胞呈轻度缺血改变, 变性坏死不明显, 胞体呈轻度肿胀, 神经细胞缺失较生理对照组轻。
2.2 脑组织ATP酶活性的变化
与A组比较, B组3种ATP酶的活性均明显降低 (P<0.01) 。C组、D组与B组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。详见表1。
3 讨 论
缺血性脑损伤的病因和病变机制十分复杂, 其中能量耗竭被认为是缺血性神经元损伤的始动因素。脑缺血再灌注后细胞能量代谢障碍可使脑细胞内ATP逐渐耗竭, 依靠ATP运转的离子泵 (Na+-K+-ATPase) 因能量障碍而受到抑制, 同时因Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低, 导致胞内Na+和Ca2+超载。细胞内Na+增多, 导致渗透压升高, 是再灌注早期脑细胞内水肿和神经细胞坏死的重要原因[3]。细胞内Na+增多, Na+-Ca2+交换增多, 进一步加重细胞内Ca2+超载, 引起自由基产生增多, 使细胞膜结构破坏, 细胞膜通透性增加, 细胞内外环境失去平衡, 最后导致神经元死亡。本研究显示, 大鼠脑缺血再灌注后脑组织ATP酶活性均明显较假手术组降低 (P<0.01) 。ATP酶活性被认为是神经细胞质膜功能状态的标记, 其活性已成为间接反映细胞能量代谢情况及脑缺血损伤程度评价的一项重要指标。
左卡尼汀是线粒体脂肪酸β-氧化产生能量的重要辅因子, 最近国外研究发现, 脂肪酸也作为一个重要能量底物被大脑使用, 大脑中13碳-辛酸酯 (13C-octanoate) 氧化产生能量几乎占大脑总能量的20%[4]。脑缺血后补充左卡尼汀可降低游离脂肪酸浓度, 使堆积的脂酰CoA进入线粒体内, 进行β氧化, 产生ATP供能[5]。左卡尼汀能降低脑乳酸/丙酮酸比率, 提高丙酮酸脱氢酶的活力, 促进葡萄糖的氧化利用, 改善预后的神经功能[6]。在体外神经细胞培养缺血缺氧模型中, 左卡尼汀可保持呼吸链复合物的活性, 提高呼吸链的代谢, 保护线粒体的蛋白质, 对抗线粒体氧化应激反应和调节细胞应激, 促进线粒体细胞色素C氧化酶的活性, 促进线粒体ATP的产生, 对缺血神经细胞产生保护作用[7,8]。Alves等[9]研究表明, 左卡尼汀对抗MDMA (二亚甲基双氧苯丙胺) 的神经毒性作用, 降低线粒体mtDNA缺失, 发挥神经保护作用。
本实验研究显示, 缺血前0.5 h腹腔注射左卡尼汀能使降低的ATPase活性不同程度的恢复, 提示左卡尼汀提高脑组织ATP酶活性, 减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。左卡尼汀对脑缺血再灌注损伤的保护机制可能有:通过促进脑缺血再灌注后线粒体脂肪酸代谢, 提高糖代谢, 加速ATP产生, 及早恢复缺血半暗区能量供应, 阻断后续的链式神经元损伤反应, 产生神经细胞保护作用。Na+-K+-ATPase活性升高可纠正细胞内酸中毒, Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高可纠正Ca2+超载, 左卡尼汀通过提高脑缺血再灌注后Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性, 维持钠泵、钙泵的稳定, 使细胞内外Na+、Ca2+平衡, 从而稳定神经细胞膜电位, 起到神经细胞保护作用。关于左卡尼汀在神经细胞保护的其他相关机制, 尚有待于进一步研究。
摘要：目的研究左卡尼汀对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法采用线栓法制备局灶性脑缺血 (MCAO) 再灌注损伤大鼠模型, 观察左卡尼汀对大鼠脑组织ATPase活性的影响。结果左卡尼汀各剂量组均能提高缺血再灌注大鼠脑组织ATPase的活性。结论左卡尼汀对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护机制可能与其促进脑能量代谢, 提高脑组织ATP酶活性, 维持钠泵、钙泵的稳定有关。
关键词：左卡尼汀,脑缺血再灌注,ATP酶
参考文献
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