肺缺血再灌注（精选11篇）
肺缺血再灌注 篇1
缺血/再灌注损伤主要发生在再灌注的初期，与长时间缺血后突然再灌注引起细胞呼吸爆发、氧自由基的堆积、Ca2+超载等有关。多年来，针对如何进行再灌注干预一直是减轻缺血器官损伤研究的热点[1]。“渐处理”也称逐渐、温和或阶段性再灌注，是指缺血再灌注时从零开始逐渐增加血流到不加以控制。研究证实，缓慢地再灌注可以减轻缺血再灌注损伤[2,3,4]。“渐处理”作为一种改良的缺血后处理方式，不需要预知缺血事件发生的时间，又没有繁琐的再灌注/缺血循环操作，不附加额外的缺血，可能有更广阔的临床应用前景。本实验拟通过建立大鼠在体肺缺血再灌注模型，探讨“渐处理”对肺缺血再灌注损伤的作用及机制，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 动物与试剂
健康雄性SD大鼠40只，体重250～350 g，由南京医科大学实验动物中心提供。参附注射液由雅安三九药业有限公司生产，国药准字Z51020664。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒均购置于南京建成生物工程公司；细胞凋亡检测试剂盒购置于武汉博士德生物工程公司。
1.2 动物模型制备
参照Eppinger等[5]大鼠肺缺血再灌注损伤模型加以改进，健康大鼠以戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，尾静脉注射肝素。气管切开后进行气管插管，小动物呼吸机辅助通气。胸骨右缘第四肋间开胸，于吸气末用无创血管夹阻断右肺门包括右主支气管和右肺动静脉（以肺无舒缩为阻断标准）。并应用温热的37℃生理盐水棉纱敷盖创口。缺血的时间为45 min，为缺血期。45 min后放开结扎线，使肺脏充盈后，计时120 min，为再灌注期。再灌注期结束后左房放血处死大鼠。
1.3 动物分组及处理
40只大鼠随机分成四组，每组10只。手术对照组（S组）：仅解剖，不阻断右肺门持续灌注165 min；缺血再灌注组（I/R组）：在吸气末用无创伤血管夹阻断右肺门，45 min后开放再灌注120 min；缺血后处理组（IPO组）：阻断右侧肺门45 min后，短暂再灌注10 s，缺血10 s，反复5次，然后再全面恢复灌注120 min；缺血后渐处理组（IGR组）：阻断右侧肺门45 min后，逐步恢复再灌注血流，50%1 min,80%2 min，然后再全面恢复灌注120 min。
1.4 观察指标及方法
1.4.1 肺组织湿干重比（W/D）用滤纸吸去右肺上叶血，分析天平称重为湿重，置于70℃电热恒温干燥箱中烤至恒重，称重为干重，计算肺W/D比值。
1.4.2 病理检查取约1 cm×1 cm×1 cm新鲜右肺组织，沾去表面血迹，经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色后光学显微镜观察。
1.4.3 肺组织MDA、SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法测血浆SOD活性；硫代巴比妥酸法测MDA活性。
1.5 统计学方法
采用SPSS 12.0统计软件包进行资料录入、整理及统计分析处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采采用单因素方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 四组大鼠肺组织湿干比比较
I/R组、IPO组及IGR组大鼠肺组织W/D明显高于S组（P<0.01）。IPO组及IGR组大鼠肺组织W/D值明显低于I/R组（P<0.01）。IPO组及IGR组大鼠肺组织W/D比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
（±s)
注：与S组比较，**P<0.01；与I/R组比较，##P<0.01
2.2 四组大鼠肺组织病理变化
光镜下S组肺泡腔内无水肿、出血及坏死，间隔无增宽，无炎症细胞浸润，结构清晰可见；I/R组肺泡腔内明显出血、水肿、血管扩张、炎性细胞浸润明显，并有局灶性肺气肿，肺泡间隔增宽，偶见局灶性坏死，组织细胞结构紊乱；与I/R组比较，IPO组及IGR组肺组织水肿、出血、炎性细胞浸润等明显减轻。
2.3 四组大鼠肺组织匀浆中SOD活力及MDA水平比较
与S组大鼠比较，I/R组、IPO组及IGR组大鼠肺组织匀浆中SOD活力明显降低，MDA水平明显增高，差异有统计学意义（P<0.05、P<0.01）；与I/R组大鼠比较，IPO组及IGR组大鼠肺组织匀浆中SOD活力明显升高，MDA水平明显降低，差异有高度统计学意义（P<0.01）;IPO组大鼠肺组织匀浆中SOD活力明显低于IGR组（P<0.05），两组MDA水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
（±s)
注：与S组比较，*P<0.05，**P<0.01；与I/R组比较，##P<0.01；与IPO组比较，△P<0.05
3 讨论
人们已越来越认识到再灌注是一把“双刃剑”，一方面使缺血组织细胞重获血供，挽救了缺血组织损伤，另一方面它产生大量活性氧类和Ca2+超载等，会导致比单纯缺血更为严重的损伤，即所谓的缺血再灌注损伤[6]。近年来，对如何减轻并防止再灌注损伤进行了广泛的研究，包括缺血前的预处理和缺血后处理[7]。缺血后处理不需要预知缺血事件发生的时间，更具有操作性和临床价值，因此成为目前研究的热点，并已在不同动物的不同器官证明了缺血后处理对缺血/再灌注器官的保护作用。目前有多种后处理方法应用于基础和临床研究中[8]。
研究证实，“渐处理”作为一种改良的后处理方式，和后处理一样均促进再灌注后心功能的恢复，并降低再灌注后心肌损伤，且没有繁琐的再灌注/缺血循环操作，更易于临床应用[2,3]。本研究应用动物试验模型研究了“渐处理”对肺缺血再灌注损伤的影响及机制。肺毛细血管内皮细胞受损是肺缺血再灌注损伤的特征性改变，主要表现为肺血管通透性和血管阻力增加、肺顺应性降低，导致肺水肿。本实验从细胞结构观察，以及对肺组织含水量的检测发现，I/R组肺W/D较S组显著增加，表示肺组织微血管通透性增高，血管内水分漏出增加，且光镜下可见肺泡间隔变窄，炎性细胞浸润及出血，呈典型的肺损伤形态学改变。IPO组及IGR组组织、细胞结构仍清晰，损伤程度较肺I/R组明显减轻，肺W/D显著降低，IPO组及IGR组无明显差异。表明“渐处理”能够减轻大鼠缺血再灌注肺损伤，其保护作用可能通过改善肺毛细血管的通透性、减轻肺的氧化应激反应、减少中性粒细胞的聚集等机制得以实现。
研究证实，肺缺血再灌注损伤的发病机制与氧自由基及脂质过氧化反应有关[9]。MDA是脂质过氧化的最终产物，测定MDA可直接反映自由基水平，其含量高低是组织细胞损伤的重要标志。SOD是自由基的重要清除酶之一，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，因而SOD活性可反映机体对氧自由基清除能力的高低。本组实验中，观察了“渐处理”对脂质过氧化损伤的保护作用。结果发现IGR组，SOD活力明显高于I/R组及IPO组，而MDA水平明显低于I/R组；表明“渐处理”具有清除超氧化物阴离子自由基、减轻脂质过氧化损伤、保护细胞的作用，从而保护缺血/再灌注过程中的肺组织细胞，减轻了缺血及再灌注的损伤作用。
实验结果证明，经典缺血后处理及“渐处理”对缺血再灌注损伤肺组织均有保护作用。“渐处理”作为一种改良的后处理方式，由于没有繁琐的再灌注/缺血循环操作，以及对缺血器官“二次缺血”的打击，是一种更有效的、更适合临床应用的、减轻再灌注损伤的方法。
参考文献
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[3]范谦,杨新春,王数岩,等.“渐处理”降低了犬心肌缺血/再灌注损伤[J].中华心血管病杂志,2006,34(4):363-366.
[4]Musiolik J,van Caster P,Skyschally A,et al.Reduction of infarct sizeby gentle reperfusion without activation of reperfusion injury salvage ki-nases in pigs[J].Cardiovasc Res,2010,85(1):110-117.
[5]Eppinger MJ,Ward PA,Bolling SF,et al.Regulatory effects of inter-leukin-10 on lung ischemia-reperfusion injury[J].J Thorac CardiovascSurg,1996,112:1301-1306.
[6]Braunwald E,Kloner RA.Myocardial reperfusion:a double edged sword[J].J Clin Invest,1985,76(5):1713-1719.
[7]Cour M,Gomez L,Mewton N,et al.Postconditioning:from the benchto bedside[J].J Cardiovasc Pharmacol Ther,2011,16(2):117-130.
[8]马小波,张建福.缺血后处理对再灌注器官保护作用的研究进展[J].徐州医学院学报,2009,29(11):778-783.
[9]Ishii M,Suzuki Y,Takeshita K,et al.Inhibition of c-Jun NH2-terminalkinase activity improves ischemia/reperfusion injury in rat lungs[J].JImmunol,2004,172(4):2569-2577.
肺缺血再灌注 篇2
目的:研究脑缺血再灌注(CIR)后脑组织中蛋白酶激活受体-1(PAR-1)的表达及其与炎症反应的关系. 方法:40只雄性SD大鼠线栓法建立大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,再灌注后于3 、6 、12 h及1 、2 、3 、7 d取脑,免疫组化法和脑组织匀浆法检测PAR-1、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的.含量. 结果:缺血再灌注后脑组织PAR-1表达增加(P＜0.01),MDA含量增多(P＜0.01),SOD活性降低(P＜0.01);PAR-1表达与MDA含量正相关(r1=0.844,P＜0.05),与SOD含量负相关(r2=-0.901,P＜0.01). 结论:CIR后PAR-1表达增多可加重脑组织炎性反应.
作 者：周青珍 王华梅 吴家幂 ZHOU Qing-zhen WANG Hua-mei WU Jia-mi 作者单位：周青珍,ZHOU Qing-zhen(郧阳医学院附属东风医院神经内科,湖北,十堰,442000)王华梅,WANG Hua-mei(江宁医院神经内科,江苏,南京,211100)
吴家幂,WU Jia-mi(弋矶山医院神经内科,安徽,芜湖,241001)
刊 名：郧阳医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF YUNYANG MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)：2008 27(3) 分类号：Q26 关键词：大脑中动脉 栓塞 蛋白酶激活受体-1★ 高血压注意事项
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肺缺血再灌注 篇3
【关键词】脑缺血再灌注；ICAM-1；P-selectin；炎症反应
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物：选用健康成年雄性SD大鼠，体重250～300g。
1.1.2主要试剂和药品：2%戊巴比妥钠-生理盐水；4%多聚甲醛-PBS；抗ICAM-1羊抗鼠抗体；免疫组化二抗试剂盒；防脱片剂。
1.1.3主要实验仪器：玻璃匀浆器、凝胶成像分析系统、电子天平、光学显微镜。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组
采用完全随机的原则，将大鼠分为四组，每组10只，分组如下：正常对照组、假手术组、模型1组、模型2组。
1.2.2线栓制备
取4-0单股尼龙丝线40mm，直径0.23mm。
1.2. 3大脑中动脉栓塞（MCAO）模型制作
参照Zea Lnoga等方法稍加改进，行右侧MCAO手术。于缺血2小时后拔出栓线，建立缺血再灌注模型。整个手术过程采用体表加热/制冷将肛温控制在36.5～37. 5℃范围内，同时将环境温度控制在25～30℃左右。
1.2.4神经症状行为学检测
依据Zea longa及Bederson等确定的5级评分方法进行神经功能评分。
1.2.5操作方法
正常组：与其它各组同时期常规饲养。假手术组：大鼠麻醉切开颈部皮肤后，仅分离CCA及ICA至PPA，不插线栓。模型组：将手术后造模成功，即神经功能评分在2～3分归入模型1组和模型2组，缺血2h后，按各组要求分别再灌注6h和24h。
1.2.6取材
各组动物在规定时间的手术观察完成后，于再灌注后各时间点以2%的戊巴比妥钠过度麻醉，迅速断头取脑，每组各取3例在冰盘上自大脑中动脉梗死区中心为起始点前后做约4mm厚的冠状切片，投入20%中性福尔马林固定液中固定，以做病理组织切片HE染色。
1.2.7指标检测与方法：缺血再灌注侧脑组织病理切片观察；ICAM-1、P -selectin的免疫组化染色。
1.2.8数据处理和统计学分析：采用SPSS（10.00版）统计软件包进行统计，所有数据采用平均数±标准差（M±SD）表示。各组组间差异采用单因素方差分析，继以LSD检验，以P<0.05作为具有显著性差异的标准。
2 结果
2.1局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO）大鼠行为学改变
①静止时不能充分伸展左前爪，行走时向左侧转圈或倾倒；②动物爬板实验时，总是落向左侧；③提尾实验时，左前肢内收，头弯向左上；④出现霍纳氏征。神经功能评分在2～3分。
2.2脑缺血侧脑组织形态学改变
2.2.1大体标本观察
脑缺血再灌注模型组和治疗组：缺血再灌注6h见脑膜血管高度充血，冠状切面组织有肿胀；缺血再灌注24h见脑组织轻度变软，切面淡黄色灰暗，灰质与白质界限变模糊，脑室变形。正常和假手术组：脑组织无充血水肿及坏死。
2.2.2光镜下观察（病理组织切片HE染色）
（1） 低倍镜下情况：观察到模型组和治疗组大脑皮层缺血坏死区域都集中在颞叶皮质区，即MCA支配供血区。表明造模成功，MCAO手术模型恒定，缺血区域一致，为大脑中动脉供血区。
（2） 高倍镜下情况
正常组与假手术组：皮质区正常，未出现坏死灶，脑组织及血管内未见炎性细胞。局灶性脑缺血再灌注6h模型组：缺血皮质区神经元开始变性坏死，可见胞核固缩为三角形，结构及核仁消失。局灶性脑缺血再灌注24h模型组：缺血皮质区神经元溶解性坏死严重，可见大量空泡形成，血管周围也出现较多炎性细胞并形成围管现象。
2.3脑缺血再灌注大鼠ICAM-1和P-selectin表达情况
免疫组化结果显示ICAM-l阳性血管表达部位主要分布在缺血侧皮层，与梗死灶周围区相一致；P-selectin阳性血管表达部位主要分布在缺血侧皮层，与梗死灶周围区相一致。
3 讨论
脑缺血损伤与动物模型的选择制备本模型的优点是：缺血部位恒定，且可进行再灌注，模拟了人类永久性及短暂性局灶性脑缺血的不同状态；由于对缺血及再通时间能进行准确控制，因而便于分析神经元对缺血的敏感性和耐受性，便于评价再灌注作用以及治疗时间窗的选择【1】；勿需开颅，术中不会引起血压、体温、血气的异常变化，避免了开颅对颅内环境的影响。局灶性脑缺血再灌注早期（1～24小时）缺血皮质出现神经元变性坏死和炎性细胞聚集、粘附及浸润，脑组织坏死范围和程度随着病程进展，炎症反应的继续而扩大加重【2】。在脑缺血再灌注早期（6小时）脑组织中ICAM-1、P-选择素表达水平即明显增高，且增高趋势在炎症反应期（24h）随病程进展而上升。
参考文献：
[1] 谢红妹，朱玲.细胞间钻附分子-1在局部缺血再灌流脑损伤中作用的研究.上海医学.1999，22（2）：109
肺缺血再灌注 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
SD大鼠36只,雌雄不限,体重250～300 g,购自东南大学实验动物繁殖中心。
1.1.2 主要试剂
伊文蓝购自美国Sigma公司,VEGF酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试剂盒购自德国R&D公司。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与肺缺血再灌注损伤模型的建立
36只SD大鼠随机分为假手术组和模型组(各18只),每组动物又分为VEGF检测、肺毛细血管通透性检测、肺干/湿重比检测3个亚组(每组各6只)。模型组大鼠称重后,按50 mg·kg-1腹腔内注射戊巴比妥钠全身麻醉,将其固定在动物支架上,尾静脉穿刺接输液泵,静脉输注乳酸林格液10 ml·kg-1·h-1;行气管插管,接小动物呼吸机(ASV,691-001型,美国),调整参数如下:容量控制通气,潮气量6 ml·kg-1,PEEP 5 cmH2O (1 cmH2O=0.098 kPa),呼吸频率 60～70 次·min-1,持续中等流量给氧 。在胸骨左外侧第3、4、5肋骨处切开皮肤,去除部分肌肉组织,暴露肋骨,平行于胸骨外缘切断3、4、5肋骨,暴露左侧胸腔,伸入平镊牵拉肺组织,暴露肺门,夹闭肺门,40 min后松开血管钳并开始计时,2 h时处死动物。假手术组组动物只切断3、4、5肋骨,暴露左侧胸腔,不闭合肺门。
1.2.2 肺灌洗液的获取
处死动物后,剪断气管,完整分离出肺脏。止血钳夹闭右主支气管,从主气管插入冲洗管(注射针皮条做成),用2 ml 注射器抽取1.5 ml PBS注入支气管,然后回抽;如此重复3次,收集3次的灌洗液用于VEGF检测。
1.2.3 肺组织蛋白抽提
取待检肺组织100 mg,加组织细胞裂解液1 ml,于匀浆器中制成匀浆液,以10 000 r·min-1 离心10 min后取上清液,经Brodfard法蛋白定量后用于ELISA测定。
1.2.4 VEGF检测
采用ELISA法。取出包被的酶标板,加入待测样品和标准品稀释液,每孔100 μl;封板纸覆盖酶标板,37 ℃孵育1 h;将酶标板内液体全部弃去,加入洗板液300 μl洗板,重复5次;加入生物素化的抗VEGF抗体,每孔100 μl,37 ℃孵育1 h;每孔加入100 μl HRP工作液。盖上盖板,37 ℃孵育30 min;每孔加入100 μl TMB工作液,盖上盖板,37 ℃避光孵育30 min;各孔加入中止液100 μl,混匀30 s;酶标仪测定450 nm光密度值;空白标准曲线计算出VEGF浓度。
1.2.5 肺毛细血管通透性检测
处死大鼠0.5 h前按20 mg·kg-1经尾静脉注射1%伊文蓝溶液,处死后,取出肺脏,将肺表面水分吸尽后称重,剪开左心房,自右心室内推注平衡盐液,冲洗肺血管内伊文蓝,直至流出液体清亮。而后将肺组织浸入4 ml甲酰胺溶液中,37 ℃恒温水浴中抽提24 h,离心,取上清液,用722型分光光度计在620 nm波长处读取吸光度值,通过标准曲线计算出提取的染料量,以单位组织中染料提取量反映肺毛细血管通透性。
1.2.6 肺干/湿重比检测
处死动物后,取左肺部分组织称重后,放入60 ℃恒温烤箱中72 h至恒重,再次称重,两次肺组织的净重比值即干/湿重比(W/D),可粗略反映肺水肿程度即血管外肺水测定。
1.3 统计学处理
所得数据应用t检验处理,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 肺灌洗液VEGF含量
见表1。
pg·g-1蛋白质
表1显示,模型组鼠肺VEGF的平均含量为2.640 pg·g-1蛋白质,假手术组的平均含量为1.450 pg·g-1蛋白质,经检验,两组肺灌洗液VEGF含量差异有统计学意义(t=3.10,P<0.05)。
2.2 肺组织VEGF含量
见表2。
pg·g-1蛋白质
表2显示,模型组鼠肺VEGF的平均含量为9.435pg·g-1蛋白质,假手术组的平均含量为8.64 pg·g-1蛋白质,经检验,两组肺组织VEGF含量差异无统计学意义(t=1.08,P>0.05)。
2.3 两组肺毛细血管通透性
见表3。
×10-3 mg·kg-1
表3显示,模型组鼠肺的伊文蓝平均含量为7.98×10-3 mg·kg-1,假手术组动物为4.39×10-3 mg·kg-1,经检验,两组动物肺毛细血管通透性差异有统计学意义(t=6.41,P>0.05)。
2.4 两组肺干/湿重比
见表4。
表4显示,模型组鼠肺干/湿重比值平均为 0.170,假手术组动物为0.207,经检验,两组动物肺肺干/湿重比差异有统计学意义(t=2.95,P<0.05)。
3 讨 论
VEGF又称为血管通透因子(vascular permealility factor,VPF),它包括几种作用相似的因子,即VEGF- A、VEGF- B、VEGF- C、VEGF- D。各种亚分子构成的氨基酸数目有一定的差异。VEGF家族通过3种高亲和力酪氨酸激酶受体(VEGFR)发挥作用,分别为:VEGFR- 1、 VEGFR- 2和VEGFR- 3受体[4,5,8]。一般认为,VEGFR- 1主要介导血管的通透性,VEGFR- 2主要介导血管内皮的新生,VEGFR- 3则主要维持正常的血管功能。VEGF及其受体在正常胚胎发育中发挥重要作用,可维持血管内皮细胞的存活。VEGF通过与其高亲和的受体结合后,导致细胞蛋白的酪氨酸磷酸化,从而调节细胞的各种功能,其中,缺血缺氧是VEGF mRNA表达的最强刺激因素[8]。
正常情况下,VEGF在肺组织中分布广泛,主要分布于Ⅱ型肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、外周细胞、气管及支气管的上皮细胞等部位。应激条件下,如低氧、缺血、感染等均能引起VEGF的大量释放,同时介导VEGF的合成增加[9]。
临床及实验已经证实,在急性肺损伤过程中,血管渗透性明显增强,VEGF在其中起到十分重要的作用[10,11,12]。在人类的急性呼吸窘迫综合征,VEGF的作用明显增强[13]。另外,Carpenter等发现,低氧环境下感染的鼠使用VEGF的受体抑制剂可以明显减轻肺组织的水肿[14],从而更进一步明确了VEGF在肺组织损伤中的作用。
本实验发现,模型组动物肺组织伊文蓝的浸出明显增加,表明肺缺血再灌注后血管的通透性明显增加;同时,模型组鼠肺干/湿重比明显小于假手术组,表明模型组鼠肺含有更多的液体成分。我们推测是由于再灌注后血管的通透性增加,导致大量液体释放滞留于肺泡及肺间质,从而导致干/湿重比降低。
肺缺血再灌注后组织的水肿有多种因素,一般认为缺血后的低氧、活性氧族(ROS)及活性氮族(RNS)的大量产生,以及一些炎症介质的释放都是导致血管渗出性增加的重要因素,而VEGF作为肺组织中分布广泛、功能活跃的重要的生物介质,也可能起到一定的作用。Mura等[3]通过肺缺血再灌注造成急性肺损伤的模型检测到肺灌洗液中VEGF蛋白明显增加,肺组织中VEGF的mRNA表达明显增加,提出了VEGF是诱发肺组织水肿的重要因素,Carpenter等[14]则观察到,在低氧环境下病毒感染的鼠肺VEGF蛋白和mRNA表达都有明显的增加,认为其是导致肺组织水肿的主要原因。
肺缺血再灌注 篇5
【关键词】雌激素；肝脏缺血再灌注；保护
【中图分类号】R575.5【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0039-01
肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)常见于临床上入肝血流阻断肝切除术和肝移植。近年来，许多研究发现应用雌激素可以明显改善心、脑缺血再灌注损伤所带来的器官功能损害[1],那么雌激素在肝缺血再灌注损伤中是否发挥保护作用呢?本实验拟建立大鼠I/R模型，以研究雌激素在大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用。
1材料与方法
1.1材料与试剂选用清洁及健康雄性Wistar大鼠12只，月龄2.5个月左右，体重250～270g；雌性Wistar大鼠36只，月龄2～3个月，体重200～240g；17β-雌二醇，美国SIGMA公司提供。
1.2方法
1.2.1动物模型制作实验前12 h动物禁食，自由饮水。2％氯胺酮腹腔内注射麻醉(每100g体重注射0.5m1)，上腹正中切口进腹，入腹后离断肝周韧带，用小号血管夹分别夹闭左、中、右肝蒂，仅保留尾状叶作为门静脉与腔静脉血液回流通道。肝脏缺血90min后，放开血管夹，同时切除尾状叶。
1.2.2实验分组A组直接制作HIRI模型。B组及D组于肝缺血手术前10d切除双侧卵巢；C组也于肝缺血手术前10d作开腹手术，但不切除卵巢；B组和C组于术后每日均给予0.2 ml二甲基亚砜(DMS0)腹腔注射，D组在切除双侧卵巢后每日腹腔注射17β-雌二醇0.1mg/kg(溶于DMSO0.2 ml中)共10d，10d后制作HIRI模型。
1.2.3检测指标各组动物实验完成后下腔静脉取血4ml，测定其中ALT、AST、AKP水平。
1.2.4统计学处理实验数据以±s表示,组间比较采用方差分析。
2结果
各组大鼠血清中ALT、AST、AKP的含量见表1。
3讨论
缺血再灌注损伤是临床各科常需面临的一个问题。国内外有研究发现雌激素对脑、心、视网膜等脏器缺血再灌注损伤有一定的保护作用，而对肝脏缺血再灌注损伤的影响研究较少。本研究结果表明17β-雌二醇能降低肝脏缺血再灌注后血清转氨酶水平，提示雌激素对肝脏缺血再灌注损伤确有一定保护作用。但与假手术组相比，17β-雌二醇处理组转氨酶上升较明显，说明雌激素对肝脏缺血再灌注损伤虽有保护作用但并不能完全消除其所致肝脏损伤。关于雌激素对肝缺血再灌注损伤的保护机制，目前推测有以下几点：① 雌激素可通过非基因途径增加血管内皮源性NO合成酶的活性[2]，增加NO的合成与释放，而NO是目前所知最强的血管松弛因子之一，NO含量的升高，可使血管扩张，从而改善循环，减轻损伤；② 雌激素不仅可通过NO介导依赖机制减少超氧化物的产生[3]，其本身也具有抗氧化的特性，因此可从双方面减少I/R的损伤；③有研究表明，在I/R时，应用雌激素可明显增强微血管对乙酰胆碱和苯肾上腺素的应答，从而有助于再灌注期微血管功能的恢复[4]。
参考文献
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肺缺血再灌注 篇6
关键词：大鼠,肺,缺血再灌注损伤,NTR1,TLR4
肺移植是终末期肺疾病患者的唯一治疗方案,但约20%肺移植会发生肺缺血再灌注损伤(lung ischemia-reperfusion injury,LIRI),LIRI是原发性移植肺功能衰竭的最主要原因,后者的死亡率高达60%[1]。炎症性损伤是LIRI的重要相关因素,与LIRI的成因密切相关。目前,神经降压素(neurotensin,NT)及神经降压素受体1(neurotensin receptor 1,NTR1)已被证实与炎症病理过程有密切关系。炎症因子Toll样受体4(TLR4)特异性激动剂LPS刺激可促进NTR1介导的炎症作用,如上调IL-8表达[2]。说明NTR1可能参与了缺血再灌注损伤病理过程,NTR1是否参与LIRI及TLR4介导的炎症病理过程还不明确。另有研究表明,NT-NTR1可通过活化缺氧诱导因子(HIF-1α)调控大肠炎的炎症过程[3]。本实验通过建立大鼠LIRI及干预模型,观察NTR1在LIRI中的表达、NTR1对LIRI的作用及NTR1与TLR4和HIF-1α的关系,从而探讨NTR1在LIRI中的病理作用机制及可能存在的信号通路,为寻找新型治疗手段提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
清洁级雄性SD大鼠,体重250~300 g,40只,购于扬州大学比较医学中心。采用随机数字表法将SD大鼠分为8组,每组5只:(1)假手术组;(2)LIRI组;(3)LIRI+生理盐水对照组,静脉注射生理盐水2ml;(4)LIRI+DMSO对照组,静脉注射2 ml DMSO;(5)LIRI+脂多糖干预组,将1.5 mg的TLR4特异性激活剂脂多糖溶于2 ml生理盐水中,静脉注射;(6)LIR-I+TAK-242干预组,将TLR4特异性抑制剂TAK-242 10 mg/kg溶于2 ml DMSO,静脉注射;(7)LIRI+NT干预组,将4 nmol/kg的NT溶于2 ml生理盐水,静脉注射;(8)LIRI+SR48692干预组,将2mg/kg的SR48692溶于2 ml DMSO,腹腔注射。各组均在阻断肺门前30 min进行上述相应的处理。
1.2 大鼠LIRI模型的建立
参照FARVIAI等[4]的制作方法建立原位大鼠LIRI模型,阻断大鼠左肺门1 h,再灌注3 h。具体为:经大鼠腹腔注射15 g/L的戊巴比妥钠溶液60mg/kg进行麻醉,并腹腔注射0.5 mg/ml阿托品0.1mg,皮下注射肝素1 000 IU/kg。大鼠经口气管插管,置入14G静脉留置针套管(长度45 mm),接动物呼吸机维持呼吸,通气频率为70~75次/min,潮气量为10 ml/kg,呼气末正压为2 cm H2O(0.196 k Pa),吸入氧浓度为21%。动物保持右侧卧位,沿左侧第5肋间作3 cm切口,切开胸廓,暴露左肺门,游离下肺韧带。于吸气时完全阻断左肺门,1 h后恢复血流灌注,实验过程中腹腔注射生理盐水0.5 ml/h,于恢复血流后3 h时完整切取左肺。假手术组不阻断肺门,其他操作同LIRI组。
1.3 检测项目
1.3.1 各组肺组织中NTR1、HIF-1α、白细胞介素6(IL-6)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)等m RNA表达的检测
采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行检测,引物序列详见表1。用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA。用Hi Fi-MMLV c DNA第一链合成试剂盒进行反转录,实验操作按产品说明书进行,然后以c DNA为模板,利用各基因的检测引物进行PCR。扩增程序为:95℃10 min,然后以95℃15 s、60℃60 s、为1个循环,进行40个循环。用ABI7900HT型荧光定量PCR仪,采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
1.3.2 各组肺组织中相关蛋白的表达
采用蛋白质印迹法进行定量检测。取-80℃冻存各组大鼠肺组织各100 mg,加入2~3 ml的组织蛋白裂解液,匀浆器将组织研碎,取出匀浆液4℃离心(16 000 r/min)15 min。取上清液,按BCA法测定蛋白浓度。等量蛋白上样进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,用PVDF膜转膜(湿转法)。一抗包括NTR1(1∶500,美国abcam公司)及HIF-1α(1∶300,美国abcam公司),并在同样情况下测定内参β肌动蛋白(β-actin),将同一条件下待测蛋白与β-actin的吸光度值进行统计。
1.3.3 各组肺组织病理学检查
取大鼠左肺中部1/3肺组织,加入4%多聚甲醛固定,行HE染色,显微镜下观察肺泡和间质水肿、中性粒细胞浸润以及出血情况,肺损伤严重性评分参考相关文献[5]。
1.3.4 各组肺组织细胞的凋亡
采用原位末端标记法(TUNEL)进行检测。采用TUNEL技术标记肺组织石蜡切片中凋亡细胞核DNA3’OH,替代TUNEL反应液作阴性对照,方法参照试剂盒说明书,显微镜下观察凋亡细胞核为棕褐色,正常细胞核呈淡蓝色。每张玻片随机选取6个视野(×400倍),观察凋亡细胞,并计算凋亡指数(凋亡细胞数/整个视野细胞数×100%)。
1.4 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据处理,计量资料采用均数±标准差(±s)表示。各组间的数据用单因素方差分析One-way ANOVA进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 假手术组及LIRI组中NTR1 m RNA及蛋白的表达
两组肺组织中NTR1 m RNA及蛋白的表达情况详见图1。LIRI组NTR1 m RNA及蛋白的表达较假手术组增加,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05,图1)。
2.2 各组肺组织中炎症因子、细胞凋亡、肺损伤及肺组织病理改变情况的比较
为了进一步探讨NTR1表达在LIRI中的作用,应用NT及特异性NTR1抑制剂SR48692,发现NT可进一步增加炎症因子水平(TNF-α和IL-6,图2)、细胞凋亡(图3)及肺组织病理损伤,而SR48692可减轻LIRI模型的上述改变;LIRI组肺组织呈现明显的弥漫性肺泡损伤,包括炎症、肺间隔水肿、肺泡内出血、肺不张及充血,NT可增强上述肺损伤,肺损伤严重性评分增加,而SR48692则起减轻作用(表2、图4)。
1)与假手术组比较,F=17.51,P=0.003;2)与假手术组比较,F=7.63,P=0.025
1)与LIRI组比较,F=24.99,P=0.000;2)F=17.43,P=0.000;3)与LIRI组比较,F=15.30,P=0.000;4)F=13.41,P=0.000
2.3 各组肺组织中TLR4对NTR1表达的影响
经蛋白质免疫印迹检测发现,与LIRI组比较,脂多糖干预组NTR1表达进一步增强,TAK-242干预组NTR1表达则受到抑制(P<0.05)(图5)。
与LIRI组比较,HIF-1αm RNA和蛋白表达被SR48692抑制,而被NT增强(P<0.05,图6)。
A:假手术组;B:LIRI组;C:LIRI+NT干预组;D:LIRI+SR48692干预组
A:假手术组;B:LIRI组;C:LIRI+NT干预组;D:LIRI+SR48692干预组
1)与LIRI组比较,F=17.20,P=0.000;2)与LIRI组比较,F=15.33,P=0.000;A:假手术组;B:LIRI组;C:LIRI+DMSO对照组;D:LIRI+NT干预组;E:LIRI+TAK-242干预组
1)与LIRI组比较,F=23.78,P=0.000;2)与LIRI组比较,F=24.74,P=0.000;A:假手术组;B:LIRI组;C:LIRI+DMSO对照组;D:LIRI+NT干预组;E:LIRI+SR48692干预组
注:与LIRI组比较,1)F=71.46,P=0.000;2)F=60.48,P=0.000;3)F=48.05,P=0.000;4)F=22.17,P=0.000
3 讨论
在组织缺血基础上恢复血流后炎症反应介质增多,导致组织损伤反而加重,甚至发生不可逆性损伤的现象称为缺血再灌注损伤。因此,炎症性损伤是缺血再灌注损伤的重要相关因素,与其成因密切相关。在本研究中,LIRI的NTR1表达显著上调,NT-NTR1在LIRI中促进了炎症反应,发挥了损伤性病理作用,而炎症相关因子TLR4显著正调控NTR1表达,说明NT-NTR1参与并调节LIRI的病理过程,并且受TLR4的调控,可能是TLR4的下游信号,而NTR1信号可正调控HIF-1α表达,因此,本研究显示,在LIRI的发生发展中可能存在TLR4-NTR1-HIF-1α的信号通路。
NT参与炎症病理过程的早期证据是由LAZARUS等[6]发现的,他们发现NT可通过高亲和力受体与肥大细胞紧密结合,通过钙动员及磷脂酶C激活释放组胺,NTR1特异性抑制剂SR48692可阻止这一过程,表明该受体可直接激活肥大细胞,参与炎症过程。研究表明,NT-NTR1参与了多种炎症病理过程[2,7]:NT可作用于中性粒细胞、T淋巴细胞及巨噬细胞,促进炎症细胞的增殖,并具有趋化作用,增强人血中性粒细胞的吞噬作用。配体结合研究表明,NT可通过外周血淋巴细胞表面的高亲和力NT受体正调控淋巴细胞系MOLT-4的生长。在梭菌毒素A介导假膜性结肠炎模型中,梭菌毒素A注入结肠绊后,在发生分泌性及炎症性病变前,结肠黏膜的NT/NTR1 m RNA及蛋白表达短期内即明显增多,SR48692可抑制降低肠渗透性,减轻中性粒细胞浸润、肠损伤及肥大细胞活性,并具有剂量依赖性。在炎症肠病中,肠黏膜毛细血管内皮细胞表达的NTR1及NT结合可导致炎症相关细胞因子的活化。NT可增强支气管活化巨噬细胞IL-1β的表达,可刺激中性粒细胞黏附支气管上皮细胞,调节气道的炎症反应。NT可显著增加腹腔淋巴细胞的黏附性和化学趋向性,作用于硫胶质诱导的鼠腹膜巨噬细胞及骨髓来源巨噬细胞,可刺激两者的吞噬活性。以上说明NT-NTR1与炎症有着密切关系,在炎症中发挥了重要的作用,也可能是LIRI发生发展的重要作用机制。在本研究中,LIRI组的NTR1 m RNA及蛋白表达较假手术组均增强,说明NTR1与LIRI具有密切相关性,为了进一步研究NTR1在LIRI中的作用机制,研究人员应用NTR1的激动剂NT及特异性抑制剂SR48692对LIRI组进行干预,发现NT可进一步增加LIRI的炎症及病理损伤(包括炎症因子、细胞凋亡及肺组织病理损伤),而SR48692可减轻LIRI模型的上述改变,进一步表明NTR1在LIRI的发生发展中起了重要作用。
至于NT-NTR1参与LIRI发生发展的分子信号机制目前还不清楚。在本组LIRI中,TLR4信号可正调控NTR1的表达,而NTR1可正调控HIF-1α的表达。PEREIRA等[8]研究发现,在稳定的内环境中,施加LPS炎症刺激,可上调成纤维细胞系的NT/NTR1表达,促进NT信号介导的炎症过程,如上调IL-8表达,IL-8是一种强有力的中性粒细胞趋化因子。并有研究表明,NT-NTR1可通过活化HIF-1α调控大肠炎的炎症及血管形成过程[3]。HIF-1α信号通路在能量代谢、炎症反应及细胞增生与凋亡中起非常重要的作用,抑制HIF-1α的活性被认为是治疗许多疾病的新靶点,这些疾病包括局部缺血、脂多糖介导的败血症、恶性肿瘤和慢性炎症等[9,10]。在缺血性损伤或IRI预处理模型中,HIF-1α通常被认为是一种适应性因子,对器官起保护性作用[11],事实是,HIF-1α的作用是保护性还是损害性可能依赖于损伤的类型及性质[12]。PEYSSONNAUX等[13]发现在早期脓毒症中,脂多糖诱导的TLR4依赖性HIF-1α可引发炎症细胞活素类的产生,抑制HIF-1α可减轻上述过程及脓毒症的死亡率。有关研究已报道了HIF-1α在LIRI之TLR4信号中的损害性作用[14]。据上所述,在LIRI中,可能存在TLR4-NTR1-HIF-1α信号通路,或是LIRI发生发展的分子机制之一,NTR1是其中重要的信号传递因子。NT–NTR1在炎症中还可能存在其他信号通路。ZHAO[15,16,17]等发现,在NCM460肠上皮细胞中,NT–NTR1的作用依赖Rho A-NF-κB信号,NT使Ik Bα磷酸化降解,并促进NF-κB亚基P65的磷酸化及转录,经由细胞内钙动员及PKCα活性,促进IL-8转导活性。老鼠空肠缺血再灌注损伤的NF-k B/IκB系统激活也与NT相关。以上表明炎症中还存在NT-NTR1-NF-κB信号通路。
肺缺血再灌注 篇7
1 材料与方法
1.1 动物模型制备及方法
健康wistar大鼠36只, 雌雄不拘, 体质量 (250±20) g之间, 由山西医科大学实验动物中心提供 。阿托品0.1 mg肌内注射 、25% 乌拉坦 (5 ml/kg) 腹腔注射麻醉, 气管切开插管接动物呼吸机辅助呼吸 (呼吸频率20～30次/min, 潮气量10 ml/kg, 吸入氧气浓度100%) , 左颈内静脉插管, 生理盐水0.5～1.5 ml/min静脉滴注维持;沿胸骨左缘切断第3、第4和第5根肋骨, 游离左肺门后穿越并留置阻断带, 静脉注射肝素 (1 mg/kg) 抗疑, 在呼气末用活结阻断左侧肺动脉、肺静脉及左主支气管为左肺缺血, 开放恢复供血和通气为左肺再灌注。动物随机分为3组, 每组12只:Ⅰ组: (假手术组, s组) , 即开胸后左肺门过阻断带, 不作结扎 , 机械通气4 h, 未予其他处理 。Ⅱ组:缺血再灌注组 (ischemia reperfusion, IR组) , 开胸后左肺门阻断 45 min, 开放再灌注3 h。Ⅲ组:缺血再灌注 +红花注射液组, 给药:术前3 d给红花组大鼠250 mg/ (kg·d) 尾静脉注射, 连用3 d, IR组和假手术组给予等量PBS, 分别至手术前24 h。分别在缺血前20 min和再灌注即刻静注红花注射液2.0 ml/kg (红花注射液 (50 mg/ml, 山西康意制药有限公司) 。于缺血45 min、再灌注1、2、3 h (或对组相应时间点) 时记录数值。
1.2 检测指标和方法
不同时段监测血气 (PaCO2和PaO2) 来评价肺功能, 分离血清 (置低温冰箱保存) 测髓过氧化物酶 (MPO) 、丙二醛 (MDA) 含量, 取各实验组左肺下叶相同部位肺组织测W/D及病理学检查 (光镜和电镜) 。
1.3 统计学方法
实验数据均以均数±标准差
2 结果
2.1 动脉血气参数的变化缺血结束时, 各项血气指标均无显著差异。
Ⅱ组再灌注2、3 h的PaO2分别为 (13.34±1.07) kPa和 (13.71±0.28) kPa, 显著低于I组[分别为 (15.41±0.81) kPa和 (15.60±0.53) kPa];PaCO2分别为 (4.79±0.38) kPa和 (4.86±0.34) kPa, 显著高于I组 别为 (3.57±0.13) kPa和 (3.61±0.11) kPa (P<0.01) ;II组PaO2和paCO2较Ⅱ组有显 著改善 (P<0.05) 。
2.2 3组血浆MDA含量变化
3组再灌注前MDA活性变化差异不显著 ;Ⅱ组再灌注后各时点血浆MDA渐升高且显著高于 I组 (P<0.01) ;III组仍有升高 , 但明显低于Ⅱ组 (P<0.05) , 见表 1。
注:与同时段组比较Ⅰ组比较▲P<0.05, **P<0.01;与同时段Ⅱ组比较▲*P<0.05
2.3 3组左肺组织MPO活性变化
3组再灌注前MPO活性变化差异不显著 ;Ⅱ组再灌注后各时点均显著升高 (P<0.01与 I组比较 ) Ⅲ组显著低于Ⅱ组 (P<0.05) , 见表2。
2.4 3组左肺组织W/D的变化
3组再灌注前W/D变化差异不显著 ;Ⅱ组再灌注后各时点左肺组织 W/D逐渐升高 , 显著高于I组 (P< 0.01) ;Ⅲ组与 I组差异不显著, 但明显低于Ⅱ组 (P<0.05) 见表 3。
注:与同时段组比较Ⅰ组比较▲P<0.05, ★★P<0.01;与同时段Ⅱ组比较▲★P<0.05
注:与同时段Ⅰ组比较▲P<0.05, ★★P<0.01;与同时段Ⅱ组比较▲★P<0.05
2.5 病理形态学及分析
Ⅰ组正常肺组织肺泡结构形态, 肺泡间隔结构正常, 未见毛细血管充血, 肺泡腔及肺泡囊内未见渗液、红细胞及白细胞 (图1) 。
Ⅱ组肺组织弥漫性充血、出血, 肺泡间隔增宽, 肺泡腔内水肿液积聚, 肺泡腔内有较多的白细胞及红细胞 (图2) ;Ⅲ组肺组织亦有损伤, 肺泡间隔轻度增宽, 肺泡腔及肺泡囊腔中可见少量白细胞及红细胞, 肺泡腔内无明显渗液 (图3) 。
3 讨论
本实验采用在大鼠缺血再灌注损伤模型来观察I/R 损伤的影响。该动物模型阻断肺门的支气管, 肺动静脉, 支气管动脉, 神经等结构, 完全阻断一侧肺的血供和通气造成缺血, 放开肺门阻断带后, 肺可以迅速恢复血供和通气, 形成再灌注。通过对I/R 过程肺的形态结构变化的观察, 证实该动物模型的复制是成功的。
根据实验, 红花注射液防止肺损伤的机制可能有以下几个方面:①扩张微血管, 增加 PMN的变形性, 促进PMN通过微循环, 防止无复流现象的发生。② 减少血小板聚集, 保护血小板受体, 避免血小板大量活化和耗损。③能减少蛋白水解酶、氧自由基、花生四烯酸等毒性产物的释放, 减轻肺内皮细胞脂质过氧化反应, 保护Ⅱ肺型细胞的结构和功能, 保证了肺表面活性物质的合成和释放。④抑制肿瘤坏死因子α (TNF-α) 、白介素-1、2、6、8等炎性细胞因子的生成而抑制PMN的激活, TNF-α可诱导内皮细胞产生ICAM-1, 使ICAM-1增强, 因而利用正确适当的抗TNF-α防止I/R损伤。⑤直接或间接抑制整合素CD116CD18DE表达, 从而抑制PMN的活化游走粘附促进PMN顺利通过微循环, 减少PMN在肺血管内的聚集, 降低肺血管通透性, 减轻肺组织的损伤程度。⑥补充高能化合物提高缺血期Na-K-ATP酶的活性, 防止细胞内钙超载, 保护非内皮细胞免受损伤。本实验结果表明Ⅲ组的PaCO2和PaO2指标变化较Ⅱ组有显著改善 (P<0.05) 说明红花注射液预处理引起肺氧交换能力能力的的下降;Ⅲ组血浆MDA含量均显著低于Ⅱ组P<0.05) , 说明红花注射液预处理可降低脂质过氧化, 稳定细胞膜的结构和功能;Ⅲ组左肺湿干重比明显低于Ⅱ组P<0.05) , 说明红花注射液能减轻由I/R引起的肺血管内水的外渗, 降低I/R导致的肺毛细血管通透性的增高。
总之, 本实验通过肺在体缺血再灌注动物模型比较了红花注射眼预处理对肺缺血、再灌注损伤的保护效应, 结果证实红花注射液预处理对肺缺血/再灌注损伤有明显的保护作用。
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肺缺血再灌注 篇8
关键词：姜黄素,四肢,再灌注损伤,肺,脂质过氧化反应
肢体缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)是临床断肢再植、四肢大血管栓塞或损伤、严重的肢体挤压伤及手术时肢体长时间应用止血带等过程中共有的病理过程,不仅导致肢体本身的损伤,而且对远隔器官尤其是肺的结构和功能产生广泛的影响,甚至导致急性呼吸窘迫综合征[1],研究表明此种损伤与氧化应激有关[2,3]。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素,是植物姜黄的主要活性成分之一,具有很强的抗炎及抗氧化作用,其对心、脑、肾、肠等脏器I/R损伤的保护作用已被实验证实[4,5,6,7]。笔者旨在探讨姜黄素预处理对肢体I/R肺损伤时脂质过氧化反应的影响。
1 资料与方法
1.1 材料与试剂
健康成年雄性SD大鼠72只,质量250～300 g(中国医科大学实验动物中心提供);姜黄素:购自Sigma-Aldrich公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及蛋白定量检测试剂盒:购自南京建成生物工程研究所。
1.2 动物分组及给药
大鼠适应性饲养1周后,随机分为6组,每组12只:假手术组(S组)、肢体缺血再灌注组(IR组)、姜黄素预处理组(C50、C100和C200组)和姜黄素对照组(C组)。C50组、C100组、C200组和C组分别于缺血前2 h经腹腔注射姜黄素50、100、200和200 mg/kg,S组和IR组给予等容量(2 m L)的生理盐水腹腔注射。实验中所采用的姜黄素剂量及配制方法参考文献[8,9,10]。
1.3 动物模型的制备
参照文献[11,12]的方法,采用肢体缺血2 h再灌注3 h制备肢体缺血再灌注继发肺损伤模型。所有动物缺血前12 h禁食,自由饮水,腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后,右颈外静脉置管建立静脉通路。在大鼠后肢股三角区切开皮肤,分离出股动、静脉,除S组和C组外,其余各组大鼠均用无创微动脉夹夹紧近腹股沟韧带处股动脉,使双后肢缺血2 h,松开无创微动脉夹双后肢再灌注3 h。应用多普勒血流探测仪监测血流以保证肢体缺血再灌注成功实施,以未监测到血流为缺血成功标志,监测到血流为再灌注成功标准。实验过程中静脉输注生理盐水1.5 m L/(kg·h)。
1.4 指标检测
1.4.1 血气分析测定
再灌注3 h时颈动脉采血测PaO2。
1.4.2 肺病理学检查
取右肺上叶1 cm3置于10%中性福尔马林中固定,常规石蜡包埋、切片,HE染色,光镜下观察形态学改变。
1.4.3 肺组织湿/干重比测定
取右肺中叶用4℃生理盐水冲去残血,滤纸吸干水分称湿重(W)后置于80℃烘干48 h,称干重(D),计算肺W/D。
1.4.4 血浆及肺组织MDA和SOD测定
颈动脉采血3 m L,收集血浆,取左肺组织200 mg,制备10%肺组织匀浆,分别采用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法检测MDA含量和SOD活性,具体操作按试剂盒说明书进行。
1.5 统计学分析
所有数据采用SPSS 13.0软件包进行分析,数据以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析,LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织病理学改变
S组和C组的肺组织形态结构未见异常;IR组肺泡壁增厚,肺间质和肺泡水肿,大量炎症细胞浸润,呈局限性肺不张;C50组、C100组和C200组肺组织损伤较IR组明显减轻,C200组只有少量渗出及肺泡隔轻度增宽,基本接近于正常肺组织,见附图。
2.2 血气指标P a O2和肺组织W/D变化
与S组比较,IR组Pa O2明显降低,IR组、C50组和C100组肺组织W/D升高(P<0.01);与IR组比较,C50组、C100组和C200组Pa O2升高,肺组织W/D剂量依赖性降低(P<0.01),见表1。
2.3 肺组织及血浆中S OD活性变化和MDA含量
与S组比较,IR组的肺组织和血浆SOD活性明显降低,而MDA含量增加(P<0.01);与IR组比较,C50组、C100组和C200组肺组织和血浆SOD活性升高,而MDA含量降低,且呈剂量依赖性(P<0.05或P<0.01),见表2。
注:1)与S组比较,P<0.01;2)与IR组比较,P<0.01;3)与C50组比较,P<0.01;4)与C100组比较,P<0.01
注:1)与S组比较,P<0.01;2)与IR组比较,P<0.05;3)与IR组比较,P<0.01;4)与C50组比较,P<0.05;5)与C50组比较,P<0.01;6)与C100组比较,P<0.05;7)与C100组比较,P<0.01
3 讨论
氧分压作为肺气体交换功能的主要表现形式,是评价肺损伤程度及其保护作用的最敏感的指标;肺组织W/D可反映肺间质及肺泡微血管通透性改变的程度。在笔者的研究中IR组大鼠肢体缺血再灌注后Pa O2明显降低,肺组织W/D明显升高,并出现了明显的肺组织水肿、大量炎症细胞浸润、局限性肺不张等病理损伤,提示肢体缺血再灌注肺损伤模型制备成功。
研究表明,姜黄素是一种新型的抗氧化剂。PRIYADARSINI等[13]证实,姜黄素分子结构中的酚羟基在姜黄素的抗氧化活性中起决定性的作用。姜黄素及其结构类似物通过抗过氧化脂质达到保护生物膜的目的。不仅如此,姜黄素还能抑制自由基介导的脂质过氧化反应,减轻线粒体的氧化还原反应及呼吸功能损害,增加还原型谷胱甘肽含量,减少活性氧产生并抑制蛋白质羟化,从而减轻氧化应激反应及细胞损伤[14,15]。实验证明,姜黄素可阻止丙酮醛/赖氨酸诱导的氧化应激和DNA损害,并且抑制丙酮醛诱导的人单核细胞凋亡和活性氧的产生[16]。HEMEIDA等[17]观察姜黄素对于氨甲喋呤引起的大鼠肝脏氧化损害时发现,连续5 d给予大鼠100 mg/(kg·d)姜黄素,能明显提高肝SOD、CAT、GSH活性,降低其MDA水平,提示姜黄素抗氧化作用不仅依赖于GSH非酶抵抗系统,也依赖于SOD、CAT等酶系统。
肺脏是一个高灌注的器官,对I/R损伤非常敏感。肢体I/R损伤中氧自由基起重要作用,介导整个肺损伤过程[18]。氧自由基对细胞的主要损害是造成脂质过氧化,其代谢产物为MDA,通过测定MDA的含量,能够反映氧自由基的代谢及脂质过氧化对机体的损伤程度。SOD是体内主要的氧自由基清除酶,可以通过歧化作用清除体内的自由基,使机体免受氧自由基造成的脂质过氧化损伤。已有文献[19,20]报道脂质过氧化反应在缺血期即已启动,再灌注时氧进入缺血组织中,作为电子的接受体,使氧自由基大量增加,结果使脂质过氧化反应迅速加强,导致肺脏结构和功能异常。笔者研究IR组血浆和肺组织中SOD活性明显降低,MDA含量显著增高,与对照组比较差异有统计学意义,表明肢体I/R时氧自由基生成增多,机体清除氧自由基的能力降低,导致脂质过氧化,结合肺组织病理改变等说明肢体I/R诱发肺损伤与脂质过氧化损伤有关。从姜黄素预处理结果来看,各组血浆和肺组织中SOD活性升高,MDA含量降低,随着姜黄素剂量增加肺损伤改善程度增加,呈剂量依赖性,提示姜黄素对缺血再灌注时脂质过氧化损伤有一定的拮抗作用,其作用机制可能是通过提高SOD的活性,增强机体抗氧化能力,减少氧自由基的生成,从而起到调节氧化/抗氧化失平衡的作用。
肺缺血再灌注 篇9
1 材料与方法
1.1 试剂及设备
主要试剂:
链脲佐菌素(STZ,购于美国Sigma公司,1g/支)。
SOD、MDA试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
SP-A酶联免疫分析(elisa)试剂盒购于上海锐聪实验室设备有限公司。
主要设备:
低温高速离心机A1303052上海艾测电子科技有限公司
超薄切片机KCQ-2上海科学技术大学仪器厂
紫外可见光分光光度计Vis-7220北京第二光学仪器厂
恒温混匀器XW-80A上海医科大学仪器厂
动物人工呼吸机HX-300泰盟科技
电热恒温水浴箱HH.W21.600-C北京长源实验设备厂
电热恒温鼓风干燥箱SKFG-01湖北黄石医疗仪器厂
-80℃低温冰箱MDF-U5410日本三洋公司
1.2 动物实验
1.2.1 实验动物分组及糖尿病大鼠模型建立
(1)分组:选取健康雄性SD大鼠32只,体重(250±50)g,随机分为正常大鼠空白对照组(A组)、正常大鼠缺血再灌注组(B组)、胰岛素依赖型糖尿病空白对照组(C组)、胰岛素依赖型糖尿病缺血再灌注组(D组)四组,每组8只。
(2)糖尿病组大鼠模型的建立:禁食12小时后,给予糖尿病组大鼠腹腔注射链脲佐菌素60mg/kg(STZ,美国sigma公司,以0.1mmol/L枸橼酸盐溶液稀释),对照组同时等剂量腹腔注射枸橼酸盐缓冲液。注射药物48h后,尾部采血测定餐后血糖所有大鼠自由进食、饮水。糖尿病大鼠注射STZ 3~4周进行在体肺缺血再灌注实验,实验前尾部采血测定餐后血糖。
1.2.2 实验步骤
常规消毒后,以10%乌拉坦(1.5g/kg)腹腔注射麻醉,动物仰卧于动物台上,气管切开,气管插管并连接动物呼吸机,呼吸机设定呼吸频率70次/分,潮气量3.5ml,吸呼时间比2/3。减去动物胸毛,沿左侧第五肋间进胸后切除4-5肋,充分暴露手术视野,对各组分别进行如下操作:
A组及C组:仅游离左侧肺门不阻断,持续灌注90min。
B组及D组:游离左肺门,小动脉夹阻断左肺血流30min取出动脉夹再灌60min。
实验结束后,迅速取大鼠左肺后处死大鼠,生理盐水冲净肺叶,放入5ml EP管后迅速转移至-80℃低温冰箱冷藏。
1.3 指标检测
取部分标本准确称重后制备10%组织匀浆后,根据试剂盒要求测定SOD、MDA、SP-A含量,HE切片观察肺组织结构变化。最后称取准确称量一定量肺组织(W),置于60℃电热恒温鼓风干燥箱中,48h后取出称取干重(D),并计算肺组织湿干重比(W/D)。
1.4 统计学处理
数据均以均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计软件分析,P<0.05为具有统计学意义。
2 结果
2.1 各组肺组织W/D、SOD、MDA及SP-A含量
糖尿病大鼠对照组(C组)与正常大鼠对照组(A组)肺组织湿干重比(W/D)、肺表面活性物质相关蛋白(SP-A)含量无明显差别(P>0.05)、SOD活性显著降低(P<0.05)、MDA含量显著升高(P<0.05)。而缺血再灌注后,糖尿病大鼠缺血再灌注组(D组)较正常大鼠缺血再灌注组(B组)肺表面活性物质相关蛋白(SP-A)、丙二醛(MDA)显著增高、肺组织湿干重比(W/D)、超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低(P<0.05)。见下表1。
3 讨论
肺缺血再灌注 篇10
【摘 要】 目的：观察回药失荅剌知丸对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中Fas及FasL表达的影响，探讨失荅剌知丸治疗脑缺血性疾病的机制。方法：SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知丸高浓度组，局灶性脑缺血再灌注模型制备成功后分别于12h、24h、72h取材，采用干湿重法测脑含水量，免疫荧光法观察Fas阳性细胞表达量，TUNEL和免疫组化法观察神经细胞凋亡情况及FasL表达的变化。结果：与假手术组相比，缺血再灌注损伤后脑含水量、神经细胞凋亡数量及Fas、FasL的表达明显增高（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，用药组各时段脑含水量、神经细胞凋亡数量及Fas、FasL的表达均减弱（P<0.05），以失荅剌知丸高浓度组的表达减弱显著（P<0.01）。结论：失荅剌知丸能够有效减轻脑组织水肿，抑制Fas、FasL的表达，其发挥神经保护的作用机制可能与抑制神经细胞凋亡有关。
【关键词】 失荅剌知丸；脑缺血；Fas；FasL
【中图分类号】R743 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）05-0073-04
Abstract：Objective： To observe the effect of expression of Fas and FasL in the hippocampus of ischemia-reperfusion injury rats brain tissue by taking Shida Lazhi Wan， and to explore Shida Lazhi Wan mechanism for the treatment of cerebral ischemic diseases. Methods： SD male rats were randomly divided into 6 groups： sham group，the ischemia reperfusion model group （hereinafter referred to as the model group），JinNaDuo group，Shida Lazhi Wan low concentration group， Shidalazhiwan medium concentration group，Shida Lazhi Wan high concentration group， After focal cerebral ischemia models were established，at 12h、24h、72h，neurons apoptosis，wet and dry weight measured brain water content， immunofluo-rescence techniques to measure Fas expression，TUNEL and immunohistochemical method to observe neuronal apoptosis and the change of FasL expression. Result： To compared with the sham operation group，after ischemia-reperfusion injury ， brain water、number of nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were significantly increased（P<0.01， P<0.05）；compared with the model group， every treatment groups brain water number、nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were recede （P<0.05），especially Shida Lazhi Wan high concentration group Reduce significantly （P<0.01）. Conclusion：Shida Lazhi Wan can ？reduce brain water effectively， inhibition of Fas and FasL express， its nerve protection mechanism may be related to inhibition of neural cell apoptosis.
Keywords：Shida Lazhi Wan；ischemia reperfusion；Fas；FasL
随着人口老龄化进程的加速，高血压、冠心病等相关危险因素的增加，脑血管疾病的发病率也逐年攀升，对人类的生命健康和生活质量造成了严重的威胁。其中，缺血性脑血管疾病最为常见，约占脑血管疾病的80%左右[1]。目前，临床上最常用的是在有限的时间内进行溶栓等治疗以达到恢复脑血管血液供应的目的，但有可能造成脑组织的进一步损伤，即脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤机制庞杂，相互交联，有研究表明，细胞凋亡在其发病进程中担任着至关重要的角色。细胞凋亡多发生于脑缺血急性期，主要出现在缺血半暗带区和对缺血缺氧敏感的海马、齿状回和大脑皮质[2]，神经细胞凋亡数量的多少决定着脑组织梗死体积的大小。细胞凋亡是一个有严格程序控制的可逆过程，因此，着力于调控其机制，限制其进一步发展，对减小脑梗死体积以及神经功能恢复等具有重大意义[3]。失荅剌知丸作为回医药治疗脑缺血性疾病的传统、经典方药，前期系列研究业也表明：失荅剌知丸可以调节细胞抗凋亡信号转导通路PI3K-AKT通路的活性，上调PI3K和AKT的表达，通过抑制促凋亡分子的活化，抑制神经细胞凋亡[4]。Fas/FasL 是目前研究较为清楚的死亡受体信号转导通路，在正常大脑中维持免疫抑制状态，当脑缺血发生后，Fas与FasL交联，参与并促进脑缺血再灌注所引起的脑组织损伤[5]。为进一步探讨失荅剌治丸保护缺血再灌注损伤脑组织的作用机制，笔者开展失荅剌治丸对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织FasL表达水平的实验研究，现报告如下。
1 材料
1.1 动物 SD大鼠，雄性，80只，SPF级，体重（280±50）g，购于宁夏医科大学实验动物中心，合格证编号：SCXK（宁）2011-0001，所有大鼠均在同一动物房内常规饲养3d后进行实验。
1.2 药物 失荅剌知丸（出自《回回药方考释》）：柴胡30g，黑诃子30g，芦荟60g，元胡6g，石菖蒲6g，番盐6g，药西瓜9g，松蕈9g，安息香9g，阿魏9g，砂糖15g，干姜3g，胡椒3g，荜拨3g，白芥子3g，芸香3g，巴豆9g，共计213g，以上所有药物切制、煎煮后放置于恒温水浴锅中分别浓缩至低浓度1.112 g/ml、中浓度2.223g/ml、高浓度4.446g/ml的药液，置于4 ℃冰箱备用。金纳多（银杏叶提取物，德国威玛舒培公司）临用前配制成1.04mg/ml的混悬液。
1.3 试剂 水合氯醛（批号：2636-4A，国药集团化学试剂有限公司，临用前配成浓度为10%的水合氯醛溶液）；兔抗大鼠Fas抗体（批号：BA0048）、兔抗大鼠FasL抗体（批号：BA0148）、山羊抗兔IgG（批号：BA1128）、浓缩型正常山羊血清（批号：AR1009）均为博士德生物公司产品。
1.4 仪器 FX4-2型电热恒温干燥箱（Shella公司）：BT224S 型电子天平（Sartorious公司）。
2 方法
2.1 分组及给药 80只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知丸高浓度组，后5组采用线栓法制备大脑中动脉阻塞-再灌注模型，并分为术后12、24、72h三个亚组，共16组，每组5只。SD大鼠给药量为1ml/100g，用药组分别给予相应药物，于造模前30min第一次灌胃，以后每天2次，直至取材；假手术组、模型组给予相应浓度的生理盐水。
2.2 模型制备 参照改良的Longa法[6]，利用线栓阻塞大鼠大脑中动脉，造成脑缺血2h后再灌注模型。10%的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位，沿颈部正中线切开，依次钝性分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，将直径为0.24mm的线栓自颈外动脉小切口处插入至颈内动脉，直至感到轻微阻力，长度约为18±2mm，用手术缝合线将颈外动脉小切口和线栓尾端一起结扎，阻断血流2h后实行再灌注，待大鼠清醒后进行神经功能评分，评分≥2分者作为模型成功标准。假手术组钝性剥离颈内外动脉后缝合伤口。
2.3 取材 各组分别于术后12h 、24h、72h取材，10%水合氯醛过量麻醉大鼠，经心尖生理盐水冲洗，再换用4%多聚甲醛溶液进行灌注固定，取出全脑，切取缺血侧大脑海马区，常规石蜡包埋，余脑组织放于冻存管保存在液氮内。
2.4 脑含水量测定 采用干湿质量法测定缺血侧含水量，于各时间点麻醉大鼠，快速断头取脑，将待测脑组织滤纸擦去表面水分，称取湿质量后置于100℃电烤箱24h，称取干质量。脑含水量 =（m湿质量-m干质量）/m湿质量×100%。
2.5 脑组织病理学观察 待测脑组织切片后经HE染色，在光学显微镜下观察脑组织结构的变化。
2.6 TUNEL细胞凋亡检测 标本经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，严格按TUNEL检测试剂盒进行操作。以胞核内有棕黄色颗粒者为凋亡阳性细胞，在400倍镜下随机选取梗死灶周边五个不重叠的视野拍照并计数凋亡阳性细胞数，取平均数进行统计。
2.7 免疫荧光法检测Fas表达 待测脑组织经过常规包埋、切片、脱蜡、水化、抗原修复、复温、山羊血清封闭、滴加兔抗大鼠抗体、滴加山羊抗兔荧光二抗、封片、荧光显微镜下观察，假手术组对照使用PBS缓冲液代替一抗，余相同，所有步骤严格按照试剂盒说明操作。每个标本取 3 张切片，每张切片取3 个互不重叠部位，应用激光扫描共聚焦显微镜扫描（扫描参数：激发光波长488 nm，检测的发射光波长518nm），计数400×视野下荧光阳性细胞，取平均值。
2.8 免疫组化法检测FasL表达 标本切片为6mm，经常规二甲苯和梯度酒精脱蜡水化，枸橼酸钠缓冲液抗原修复，3% H2O2消除内源性过氧化物酶，滴加10%的山羊血清封闭1h，滴加一抗4℃冰箱过夜，阴性对照组加PBS缓冲液，次日取出37℃复温1h，PBS缓冲液冲洗3遍×5min，滴加二抗室温置放1h，DAB染色，PBS缓冲液冲洗3遍×5min，中性树胶封片，显微镜下观察。以胞质或胞核内有棕黄色颗粒者为阳性细胞，每张切片在400倍镜下随机选取梗死灶周边5个不重叠的视野拍照，并计数阳性细胞数，取平均数进行统计。
2.9 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，以均数加减标准差（x±s）表示，使用单因素方差分析法，P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 脑含水量测定 与假手术组相比，各组各时间点脑含水量均明显增高（P<0.01）；与模型组相比，各用药组各时间点脑含水量均明显降低（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中浓度及高浓度组脑含水量有不同程度的降低（P<0.05或P<0.01）；同组别72h相比，失荅剌知丸高浓度组减少更加明显（P<0.01）。见表 1。
3.2 病理学观察 假手术组大鼠脑组织神经元形态正常，大小均匀，排列整齐，层次分明；模型组大鼠神经形元态明显异常，大小不均，神经元皱缩，排列紊乱，层次不清，多数细胞核呈现三角形或锥形；失荅剌知丸低剂量神经元细胞较紊乱，多数皱缩变形，大小欠均匀；金纳多组及失荅剌知丸中浓度组大多数神经元形态欠规则，有皱缩现象，层次欠清晰，且各时间点神经元形态区别不明显；失荅剌知丸高浓度组大鼠大多数神经元形态正常，存有少量皱缩神经元，层次较清晰，且正常神经元比例随着用药时间的延长而增多，以失荅剌知丸组72h组较明显。
3.3 各组缺血侧海马区Fas表达比较 Fas蛋白主要位于神经细胞膜上，在本实验中标记为绿色，与假手术组相比，各组各时间点Fas表达均明显增高（P<0.01）；与模型组相比，各用药组各时间点Fas蛋白表达明显减少（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中剂量组各时间点FasL蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），失荅剌知丸高剂量组各时间点Fas蛋白表达有所减少（P<0.05），尤以72h组减少明显（P<0.01）。见表2。
3.4 对大鼠脑缺血再灌注TUNEL凋亡阳性细胞的影响 从表3看出，与假手术组比较，模型组及各用药组各时间点凋亡细胞数有显著增高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组各时间点凋亡细胞数有减少（P<0.05或P<0.01），以24h、72h凋亡细胞数减少尤为明显（P<0.01）；失荅剌知丸组24h、72h组凋亡细胞数明显少于金纳多组（P<0.01）。见表3。
3.5 对脑缺血再灌注大鼠缺血侧海马区FasL表达的影响 从表4可以看出，与假手术组比较，模型组及各用药组各时间点FasL蛋白表达明显增高（P<0.01）；与模型组比较，各用药组各时间点FasL蛋白表达明显减少（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中剂量组各时间点FasL蛋白表达无显著性差异（P>0.05），失荅剌知丸高剂量组各时间点FasL蛋白表达有所减少（P<0.05或P<0.01），尤以72h组减少明显（P<0.01）。见表4。
4 讨论
近年来，国内外研究发现脑缺血再灌注损伤主要与兴奋性氨基酸、自由基损伤、血脑屏障破坏、炎症反应、细胞凋亡等机制有关[7-8]。这些机制彼此重叠，互为因果，相互联系，产生一系列快速级联反应，最终导致脑组织的损伤[9]。在这个复杂的过程中，神经细胞的凋亡被认为是脑缺血再灌注损伤的主要环节，因此调控神经细胞凋亡成为治疗缺血性脑病的关键所在。FasL在细胞凋亡中起着关键的作用。Fas被称为死亡受体分子，属于肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）/神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）受体家族，是促细胞凋亡的最重要分子之一。FasL作为Fas的天然配体与3个Fas 分子结合，促使死亡结 构域（DD）聚集后结Fas 的相关死亡结构域（FADD），进而通过引起Caspase 酶联反应致使细胞凋亡[10]。抑制因促凋亡系统Fas/FasL的激活而产生的生物学作用是发挥保护脑组织的关键环节[11]。已有大量研究发现中医药可以减轻脑缺血再灌注损伤后促凋亡因子的表达[12-13]。
失荅剌知丸出自《回回药方》，是防治脑血管疾病的经典方剂，由柴胡、黑诃子、芦荟、元胡、石菖蒲、药西瓜、阿魏、 安息香、干姜、胡椒、荜拨、白芥子、芸香等药组成，以芳香通窍，利痰化湿，祛寒通络为治疗原则，运用大量芳香药以加强血管通透性、增强药物透过血脑屏障[14]，治疗脑卒中后骨节疼痛，口眼歪斜，半身不遂等症状。研究结果显示，脑缺血再灌注损伤发生后，对缺血缺氧敏感的海马区脑含水量及神经细胞凋亡的数量迅速增加，于24h达到高峰，72h后下降。较模型组比较，各用药组脑含水量及神经细胞凋亡的数量均有所减少，但不同浓度的失荅剌知丸下调水平有所差别，以失荅剌知丸高剂量组效果明显，说明长期服用高浓度的失荅剌知丸可以通过抗凋亡以达到有效治疗和缓解脑缺血再灌注损伤后引起的脑组织损伤。Fas、FasL在脑组织缺血后，迅速表达促进了神经细胞凋亡，扩大了梗死体积，实验研究结果表明，不同浓度的失荅剌知丸较模型组相比，能够明显下调海马区Fas、FasL蛋白表达，较金纳多组相比，高剂量失荅剌知丸阻抑Fas、FasL蛋白表达作用更强。由此可见，失荅剌知丸可以通过降低Fas、FasL蛋白表达以减少神经细胞的凋亡，为临床回医药防治缺血性脑血管疾病提供了实验依据。
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肾缺血再灌注损伤的研究进展 篇11
1 氧自由基与脂质过氧化
自由基是指电子轨道上有不配对电子的原子、分子, 包括氧自由基 (OFR) 系列如超氧阴离子 (O2-) 、羟自由基 (·OH) 、过羟自由基等和脂质自由基系列如烷自由基、烷基自由基、脂质过氧化物自由基等。氧自由基的形成可分为外源性和内源性。外源性主要是指能进行氧化还原反应循环的酮类、硝基类等物质。此外, 药物氧化、吸烟、电离、光照、热辐射冲击和氧化谷肤甘肤的物质、环境污染等外源性因素均能在细胞内形成自由基。内源性主要是指生物体内代谢过程中产生的自由基。正常状态下生物体的能量主要来自电子传递系统。在电子传递过程中, 分子氧完全还原成水的同时释放能量, 如果还原不完全则形成氧自由基。人体摄取的氧是接受线粒体内细胞色素体系传递的电子, 大部分接受四个电子还原成水, 其中仅有1%-2%的氧接受一个电子后漏出 (称为单价泄漏) 形成氧自由基。此时产生的氧自由基很少, 且组织细胞内的超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT) 、谷肤甘肤过氧化氢酶 (GSH--Px) 和髓过氧化物酶等能迅速清除氧自由基, 故组织细胞内不会出现氧自由基的堆积[5]。动物实验己经证实, 在细胞缺血的极早期, 细胞氧化磷酸化能力减弱, ATP合成减少, 离子泵功能部分失效, 特别是Na+-K+-ATP酶功能减弱, 使大量Na+内流, K+外流, 细胞膜电位下降, 产生去极化, 从而造成电压依赖性Ca2+通道开放, 大量Ca2+内流, 细胞缺血同时导致兴奋性氨基酸如 (谷氨酸、天冬氨酸等) 在细胞间隙的大量蓄积, 而后者又加剧Ca2+内流和细胞膜去极化, 导致细胞内Ca2+超载, 氧自由基增多, 其具体机理为: (1) 缺血后的肾脏血管内皮细胞以及中性粒细胞是产生氧自由基的主要细胞, 而在细胞中线粒体又是产生氧自由基的主要部位, 其中黄嘌呤氧化酶所催化的反应是氧自由基的主要来源。在电子传递链中复合物I脱氢酶 (NADH脱氢酶) 和复合物I I I (辅酶Q-细胞色素C还原酶) 是氧自由基产生的主要位点。肾缺血时由于缺乏相关的原料物质和氧气, 线粒体氧化磷酸化脱藕联, 辅酶Q循环中不稳定的中间产物半醌阴离子可以快速而且非酶性催化地将单电子直接传递给O2, 致使经单电子还原生成超氧阴离子 (O2-) 增多, 而经接受4个电子与4个氢离子还原生成水减少, 同时在这种病理条件下, 细胞内PH值降低, O2-更容易岐化成H2O2。同时肾脏组织中存在着黄嘌呤氧化酶, 它在细胞内以黄嘌呤脱氢酶 (D型) 的形式合成, 正常情况下D型占总活性的90%以上, 次黄嘌呤在分子氧的参与下经黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸和大量的氧自由基[6~7]。而此时, 肾脏组织细胞内的SOD, CAT, GSH-PX等氧自由基清除剂由于在缺血缺氧状态下生成减少、活力下降, 不能有效的清除氧自由基, 导致肾脏组织内氧自由基的大量堆积。 (2) 细胞内的Ca2+增高, 激活磷脂酶C和A2, 分解膜磷脂产生大量花生四烯酸 (AA) , 后者进一步分解, 不饱和脂肪酸经前列腺素合成酶催化生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸烟酰胺腺嘌呤二核昔酸, 此过程中生成大量氧自由基;细胞内Ca2+超载, 激活Ca2+依赖的蛋白激酶, 使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶, 同时肾缺血时ATP的降解产物次黄嘌呤和黄嘌呤增多。在黄嘌呤氧化酶作用下, 次黄嘌呤转变为黄嘌呤进而转变为尿酸。这两步反应中, 都以O2为电子受体产生大量O2-和H2O2。 (3) 再灌注时由于细胞中线粒体破坏殆尽, 不能利用氧进行有氧氧化产生ATP, 血液再灌注突然带入的氧一方面在黄嘌呤氧化酶的作用下产生O2-, 另一方面使缺血期因氧耗竭而停滞的烷自由基向脂质过氧化物自由基反应得以延续, 产生新的自由基, 进一步攻击不饱和脂肪酸[8]。此外, 再灌注带入的Ca2+可提高黄嘌呤氧化酶的活性, 促进O2-迅速转化为·OH, 重新激发自由基连锁反应, 造成更多的损害。自由基具有很高的化学活性, 可快速攻击其他化合物的分子并产生更多的自由基, 自由基破坏膜结构中蛋白成分、引起膜脂质过氧化, 导致膜损伤、线粒体功能障碍、溶酶体破裂、细胞溶解和组织水肿等一系列损害作用, 称之为自由基连锁反应。近年来大量研究证实, 自由基连锁反应是导致肾缺血再灌注损伤的主要原因[9], 其具体损伤机制可概括为: (1) 对生物膜的损害。生物膜包括细胞膜、线粒体膜和溶酶体膜等, 内含有丰富的多不饱和脂肪酸, 氧自由基因为具有极强的氧化活性, 极易攻击多不饱和脂肪酸生成多种脂质过氧化物, 导致生物膜多不饱和脂肪酸蛋白质比例失调, 生物膜的流动性下降和通透性增高[10~11], 进而造成生物膜的功能障碍。细胞膜受损后细胞肿胀, 细胞完整性破坏, 功能部分或全部丧失。线粒体膜受氧自由基攻击后发生肿胀、溶解、ATP合成障碍。溶酶体受攻击后出现溶酶体溶解破裂, 引起细胞自溶。由于线粒体是产生氧自由基的主要细胞器, 所以线粒体膜较细胞膜和溶酶体膜受损更严重。 (2) 自由基增加引起的核酸损伤 (Oxydative DNA Lesions, ODL) , 可以导致DNA链的断裂、交联导致细胞正常功能受损, 最终细胞死亡。其可能的方式为:自由基攻击核酸碱基, 造成碱基的化学修饰;攻击核糖与碱基之间的糖苷键, 形成无嘌呤无嘧啶位点;攻击核糖与磷酸基团之间的磷酸键, 形成带有3'-OH末端或3'-磷酸末端的DNA断裂片段:攻击核糖, 形成3'-磷酸糖基末端;氧自由基可以导致DNA链间或DNA与蛋白质之间产生交联。 (3) 氧自由基可诱发细胞凋亡, 其途径可能有以下两条:氧自由基可导致细胞内线粒体、内质网膜Ca2+迁移和质膜Ca2+-ATP酶活性下降或失活而导致细胞浆内Ca2+浓度升高。激活Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶, 导致DNA链的断裂。从而触发细胞凋亡。氧自由基可以影响与细胞凋亡有关的基因表达[12,13]。
2 Ca2+超载 (Calcium Overload)
细胞内Ca2+作为第二信使、代谢调节因子和膜稳定剂参与细胞膜生物电和胞内生化过程, 对修复基因转录核蛋白磷酸化和细胞凋亡过程均有影响, 在细胞正常机能活动中起重要作用。生理情况下, 细胞内的游离Ca2+浓度很低, 只有细胞外的1/10, 这依赖于细胞膜对Ca2+相对无通透性及细胞对Ca2+的主动排出来维持, 后一过程需消耗能量。多种转运系统参与了细胞的调节, 现己证实肾小管上皮细胞膜和细胞质内均存在钙的转运系统, 早期研究证实肾缺血再灌注损伤时可出现大量Ca2+内流, 且Ca2+内流的出现主要发生在恢复再灌注时。肾缺血后, 肾小管上皮细胞内Ca2+浓度明显升高, 从而使细胞内磷脂酶活力增加, 更多磷脂酶分解为游离脂肪酸, 另外Ca2+浓度增加使Ca2+-ATP酶活力增加, 从而消耗了更多ATP, Ca2+本身又可通过氧自由基途径造成组织损伤。缺血后再灌注期细胞内钙的变化与氧自由基的产生不同, 再灌注早期比缺血期有所减少, 这可能是与使Ca2+-ATP酶的活性一定程度恢复有关, 再灌注后期逐渐增高, 这可能是由于细胞膜结构的破坏所致。细胞内Ca2+超载的原因有以下几点: (1) 当肾缺血、缺氧时, 细胞氧化磷酸化能力减弱, ATP合成减少, 离子泵失效, 特别是Na+-K+泵功能的降低, 使大量的Na+内流, K+外流, 细胞膜电位下降产生去极化, 从而造成电压依赖性钙离子通道开放, 大量Ca2+内流; (2) 细胞缺血时, 由于K+和蛋白激酶C等作用, 兴奋性氨基酸、内皮素和NO等物质释放增多, 可使受体依赖性Ca2+通道开放, 也使大量Ca2+内流; (3) 胞内Ca2+增加, 可激活磷脂酶, 产生甘油二醋、前列腺素、三磷酸肌醇等物质, 协同兴奋性氨基酸代谢型受体激活配体操控性钙离子通道 (Recpter Operatedea Ca2+Channels, ROCC) , 使细胞内质网储存的Ca2+释放, 造成Ca2+超载; (4) 肾缺血、缺氧时, 产生大量的自由基, 使膜脂质过氧化, 损伤了脂质膜, 影响膜的通透性及离子转运, 引起Ca2+内流。钙超载主要是通过以下环节参与缺血再灌注损伤: (1) 激活膜结构中的钙依赖性磷脂酶, 破坏膜结构; (2) 干扰线粒体的氧化磷酸化偶联, 使能量代谢发生障碍; (3) 改变微管微丝的收缩作用和结构, 破坏细胞骨架, 最终导致细胞损伤; (4) 引发细胞调亡, 可能的机制:钙超载后激活Ca2+依赖性的核酸内切酶, 从而使双链DNA在核小体连接部位裂解, 形成DNA分块;钙超载可激活蛋白酶C, 使G蛋白磷酸化, G蛋白减少, 胞内CAMP增加, 导致细胞凋亡。钙超载与氧自由基的产生是肾IRI的重要因素, 二者相互影响, 协同作用, 导致肾IRI加重。细胞内产生过量的氧自由基可直接损伤细胞膜, 导致细胞膜通透性增加, Ca2+内流。而细胞内Ca2+浓度增高, 又可激活Ca2+依赖性蛋白酶, 后者可催化黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶, 而黄嘌呤氧化酶在有氧条件下能促进次黄嘌呤分解为尿酸的同时产生大量的氧自由基。
3 激素、免疫调节
恢复缺血肾组织的血供后.常发现局部仍无血流经过, 产生这种无血流现象的机制目前认为系激素与免疫分子的作用导致肾微循环障碍、细胞肿胀等引起。激素主要有内皮素 (ET) 、儿茶酚胺、肾素-血管紧张素、前列腺素和一氧化氮等。ET、儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ等主要是通过收缩肾小动脉、降低肾小球滤过率发挥对肾功能的损害作用。实验发现ET与其受体亲和力随再灌注时相的延长而增加;ET受体拮抗剂可明显增加肾缺血再灌注后的肾皮质血流, 减轻肾功能损害及组织学改变。改善GFR。一氧化氮是左旋精氨酸 (L-arginine) 在一氧化氮合成酶 (NOS) 的作用下合成的。研究发现, NOS分为两大类, 即原生型NOS (constitutive NOS, CNOS) 和诱生型Nos (inducible Nos, i Nos) [14~15], NO在肾脏中的作用有直接和间接两种, 前者由c NOS介导, 而后者由i NOS介导[16~18]。肾缺血再灌注后, i NOS的表达上调, 使NO产生增加, 当肾局部NO浓度过高时, NO的间接作用 (即毒性作用) 表现明显, 从而对肾脏造成损伤。
4 细胞凋亡
鲍磊[19]研究显示证实神经细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤中起十分重要的作用, Chatterjee等[20~21]发现肾IRI能激发较为广泛的细胞凋亡现象, 其病理变化主要表现为皮髓质交界部的肾小管发生细胞凋亡, 细胞凋亡在再灌注12h后逐渐下降, 至再灌注72h时尚可见到无核物质的凋亡小体, 最终被再生的肾小营上皮挤入管腔而排出, 并非被巨噬细胞吞噬清除。由此认为肾小管上皮凋亡是缺血再灌注后引起肾小管上皮细胞死亡的一个重要原因, 以控制肾小管上皮细胞的过度增殖.尽可能保证肾小管管腔免于堵塞而处于开放状态。