肢体缺血再灌注（精选11篇）
肢体缺血再灌注 篇1
缺血预处理 (ischemic preconditioning, IPC) 能有效地减轻骨骼肌缺血再灌注损伤[1,2]。而且临床研究证实IPC对人体骨骼肌缺血再灌注损伤也具有保护作用[2]。然而IPC需反复多次缺血再灌注预处理, 操作复杂、费时, 其临床应用受到一定限制, 因此发展药物预处理对临床防治缺血再灌注损伤具有重要意义。3-硝基丙酸 (3-nitropropionic acid, 3-NPA) 是线粒体琥珀酸脱氢酶抑制剂。最近的研究表明, 单次应用小剂量3-NPA预处理可以诱导脑组织对缺氧.缺血的耐受性[3,4,5]。目前3-NPA预处理对肢体骨骼肌缺血再灌注损伤的影响, 未见文献报道。为此本研究观察了3-NPA预处理对骨骼肌缺血再灌注损伤的影响, 报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物模型制备
健康雄性SD大鼠30只, 体重220±20g, 3%戊巴比妥钠 (30-50mg/kg) 腹腔麻醉后, 沿股血管切开皮肤, 分离股血管鞘, 游离股动、静脉及神经。于股鞘下用张力带环扎肢体阻断侧枝循环。用动脉夹阻断股动脉。制成右侧肢体缺血模型。
1.2 分组与处理
实验动物随机分为三组, 每组10只。假手术组:仅显露股血管鞘, 不做缺血再灌注, 经腹腔注射同体积生理盐水;对照组:经腹腔注射同体积生理盐水, 持续缺血4h, 再灌注1h。3-NPA预处理组:实验前经腹腔注射3-NPA 20mg/kg后持续缺血4h, 再灌注1h。
1.3 监测指标与方法:
1.3.1 血浆CPK测定各组动物于灌注1h后, 取股动脉血用全自动生化分析仪测定血浆CPK、LDH含量。
1.3.2 血浆MDA测定用硫代巴比妥酸 (TBA) 比色法测定血浆MDA含量。
1.3.3 取小腿三头肌, 用10%中性福尔马林固定, 石蜡包埋, 切片行HE染色。在显微镜下, 观察小腿三头肌结构变化及中性粒细胞聚集情况。
1.3.4 腓肠肌超微结构观察取2×1×1mm腓肠肌, 用4%戊二醛及1%锇酸溶液双重固定, 常规酒精、丙酮脱水, Epon812包埋, 超薄切片, 醋酸铀和枸掾酸铅染色, 透射电镜观察。
1.4 统计方法
所有资料均以X±Sx表示。数值间的比较采用t检验。
2 结果
2.1 3-NPA预处理对血清CPK、LDH、MDA (nmol/L) 的影响
对照组和实验组血清CPK, LDH, MDA与假手术组相比明显升高 (p<0.01) ;3-NPA预处理组各指标与对照组相比显著降低 (p<0.01) 。见表1。
注:*与假手术组比较p<0.01;#与对照组比较p<0.01
2.2 组织学观察
光镜下, 假手术组肌膜及间质无水肿, 肌纤维排列整齐, 肌纤维间中性细胞少见;对照组肌膜及间质明显水肿, 渗出增加, 肌纤维排列紊乱, 部分溶解, 肌纤维间有大量中性细胞浸润;3-NPA预处理组肌膜及间质轻度肿胀, 肌纤维排列尚整齐, 肌纤维间可见少量中性细胞浸润。
2.3 腓肠肌超微结构观察
电镜下, 假手术组肌原纤维间有大量糖原颗粒及线粒体, 肌丝结构完整, 排列规则;对照组肌原纤维明显水肿, 肌丝断裂, 肌质网重度扩张, 线粒体严重肿胀, 嵴断裂, 毛细血管内皮肿胀, 糖原颗粒少见;3-NPA预处理组线粒体肿胀程度减轻, 嵴结构部分完整, 肌质网轻度扩张, 出现大量糖原颗粒及形态各异的线粒体。
3 讨论
3-NPA是线粒体琥珀酸脱氢酶的抑制剂, 是一种存在于植物和真菌的毒素, 能不可逆抑制琥珀酸脱氢酶即线粒体复合体Ⅱ, 使氧化磷酸化解耦联, ATP产生减少, 从而造成化学性缺氧, 故可以用来模拟缺血预处理的保护机制[6]。研究表明3-NPA进入机体后迅速与琥珀酸脱氢酶共价结合, 抑制电子从琥珀酸脱氢酶向辅酶Q的传递, 阻断呼吸链, 引起组织性缺氧[7]。最近文献报道, 小剂量3-NPA预处理不足以产生神经组织学损伤, 反而对再次发生的严重的脑缺氧.缺血产生耐受性。Riepe等[8]发现, 在大鼠腹腔注射3-NPA20mg/kg预处理后1d, 脑海马切片耐受缺氧能力明显提高, 神经元密度增加约50%。Weih等[4]将体外培养的皮层神经元用3-NPA预处理, 发现预处理后数小时至2d, 这些神经元抗缺氧能力明显增强。Wiegand等[9]报道, 在大鼠局灶性脑缺血前3d给予3-NPA预处理可以诱导脑缺血耐受, 而在缺血前15min、12h、24h、2d、5d进行3-NPA预处理均不能诱导保护效应。而Sugino等[10]认为, 不同剂量 (3~20mg/kg) 3-NPA预处理沙土鼠后1~4d, 均可以诱导海马对全脑缺血产生耐受性, 以预处理后3d效应最佳。Horiguchi等[5]进一步证实, 3-NPA预处理大鼠后3d, 可以对脑缺血.再灌注损伤产生耐受性。Aketa等[11]用3-NPA (4mg/kg) 对动物做腹腔注射的实验表明:3-NPA诱导的化学预处理 (chemical precondition-ing, CP) 可产生明显的组织缺氧耐受, 腺苷受体的激活参与此过程。Huber等[12]通过实验认为, 3-NPA诱导的CP可抑制低氧期游离N-甲基-D-天冬氨酸 (NADH) 的增加, 从而增加组织耐受性, 并认为这是由于游离NADH向蛋白质的结合转移所致。本研究通过大鼠后肢缺血再灌注损伤模型, 观察3-NPA预处理能明显抑制血浆CPK、LDH的升高;CPK、LDH在骨骼肌缺血再灌注损伤时, 由于细胞膜结构破坏, 细胞内的酶大量释放入血, 故测定血清CPK、LDH活性变化可反映骨骼肌损伤的指征;MDA是氧自由基引起的细胞膜脂质过氧化的终末产物, 可间接反映自由基对组织的损伤程度;本研究结果显示3-NPA预处理能显著降低血浆MDA, 说明3-NPA预处理能可抑制氧自由基的产生, 减轻骨骼肌过氧化损伤;组织学观察显示3-NPA预处理可明显减轻再灌注骨骼肌组织中中性粒细胞的聚集。电镜观察显示3-NPA预处理能使骨骼肌缺血再灌注损伤的超微结构明显减轻, 维持骨骼肌结构的完整性, 因此, 本研究结果表明3-NPA预处理对骨骼肌缺血再灌注损伤具有显著的保护作用。
研究表明, 腺苷A3受体、线粒体ATP敏感的钾通道、Bcl-2、促红细胞生成素、星形胶质细胞的激活等参与3-NPA预处理诱导脑缺血耐受的形成[5,13], 3-NPA预处理减少脑梗死体积和减轻脑水肿的作用可能是通过以上的一个或多个机制实现的。目前3-NPA预处理对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用机制尚不十分清楚, 本研究证实3-NPA预处理可减轻骨骼肌缺血再灌注损伤, 为临床防治肢体再灌注损伤提供了新的途径。因此, 进一步研究3-NPA预处理对骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用机制以及3-NPA的最佳用药途径和剂量, 对临床应用具有重要意义。
摘要：目的探讨3-硝基丙酸 (3-nitropropionic acid, 3-NPA) 预处理对肢体缺血再灌注损伤的影响。方法采用大鼠右后肢缺血再灌注模型, 将30只实验大鼠随机分为假手术组、对照组、3-NPA组。测定各组血清磷酸激酶 (CPK) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 、丙二醛 (MDA) 变化, 观察腓肠肌组织学及超微结构变化。结果对照组和3-NPA组血清CPK、LDH、MDA与假手术组相比明显升高 (p<0.05) ;3-NPA组各指标与对照组相比显著降低 (p<0.05) 。结论3-硝基丙酸预处理对肢体骨骼肌缺血再灌注损伤具有保护作用。
关键词：3-硝基丙酸,骨骼肌,缺血再灌注损伤
肢体缺血再灌注 篇2
目的:研究脑缺血再灌注(CIR)后脑组织中蛋白酶激活受体-1(PAR-1)的表达及其与炎症反应的关系. 方法:40只雄性SD大鼠线栓法建立大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,再灌注后于3 、6 、12 h及1 、2 、3 、7 d取脑,免疫组化法和脑组织匀浆法检测PAR-1、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的.含量. 结果:缺血再灌注后脑组织PAR-1表达增加(P＜0.01),MDA含量增多(P＜0.01),SOD活性降低(P＜0.01);PAR-1表达与MDA含量正相关(r1=0.844,P＜0.05),与SOD含量负相关(r2=-0.901,P＜0.01). 结论:CIR后PAR-1表达增多可加重脑组织炎性反应.
作 者：周青珍 王华梅 吴家幂 ZHOU Qing-zhen WANG Hua-mei WU Jia-mi 作者单位：周青珍,ZHOU Qing-zhen(郧阳医学院附属东风医院神经内科,湖北,十堰,442000)王华梅,WANG Hua-mei(江宁医院神经内科,江苏,南京,211100)
吴家幂,WU Jia-mi(弋矶山医院神经内科,安徽,芜湖,241001)
刊 名：郧阳医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF YUNYANG MEDICAL COLLEGE 年，卷(期)：2008 27(3) 分类号：Q26 关键词：大脑中动脉 栓塞 蛋白酶激活受体-1★ 高血压注意事项
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肢体缺血再灌注 篇3
【关键词】脑缺血再灌注；ICAM-1；P-selectin；炎症反应
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物：选用健康成年雄性SD大鼠，体重250～300g。
1.1.2主要试剂和药品：2%戊巴比妥钠-生理盐水；4%多聚甲醛-PBS；抗ICAM-1羊抗鼠抗体；免疫组化二抗试剂盒；防脱片剂。
1.1.3主要实验仪器：玻璃匀浆器、凝胶成像分析系统、电子天平、光学显微镜。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组
采用完全随机的原则，将大鼠分为四组，每组10只，分组如下：正常对照组、假手术组、模型1组、模型2组。
1.2.2线栓制备
取4-0单股尼龙丝线40mm，直径0.23mm。
1.2. 3大脑中动脉栓塞（MCAO）模型制作
参照Zea Lnoga等方法稍加改进，行右侧MCAO手术。于缺血2小时后拔出栓线，建立缺血再灌注模型。整个手术过程采用体表加热/制冷将肛温控制在36.5～37. 5℃范围内，同时将环境温度控制在25～30℃左右。
1.2.4神经症状行为学检测
依据Zea longa及Bederson等确定的5级评分方法进行神经功能评分。
1.2.5操作方法
正常组：与其它各组同时期常规饲养。假手术组：大鼠麻醉切开颈部皮肤后，仅分离CCA及ICA至PPA，不插线栓。模型组：将手术后造模成功，即神经功能评分在2～3分归入模型1组和模型2组，缺血2h后，按各组要求分别再灌注6h和24h。
1.2.6取材
各组动物在规定时间的手术观察完成后，于再灌注后各时间点以2%的戊巴比妥钠过度麻醉，迅速断头取脑，每组各取3例在冰盘上自大脑中动脉梗死区中心为起始点前后做约4mm厚的冠状切片，投入20%中性福尔马林固定液中固定，以做病理组织切片HE染色。
1.2.7指标检测与方法：缺血再灌注侧脑组织病理切片观察；ICAM-1、P -selectin的免疫组化染色。
1.2.8数据处理和统计学分析：采用SPSS（10.00版）统计软件包进行统计，所有数据采用平均数±标准差（M±SD）表示。各组组间差异采用单因素方差分析，继以LSD检验，以P<0.05作为具有显著性差异的标准。
2 结果
2.1局灶性脑缺血再灌注模型（MCAO）大鼠行为学改变
①静止时不能充分伸展左前爪，行走时向左侧转圈或倾倒；②动物爬板实验时，总是落向左侧；③提尾实验时，左前肢内收，头弯向左上；④出现霍纳氏征。神经功能评分在2～3分。
2.2脑缺血侧脑组织形态学改变
2.2.1大体标本观察
脑缺血再灌注模型组和治疗组：缺血再灌注6h见脑膜血管高度充血，冠状切面组织有肿胀；缺血再灌注24h见脑组织轻度变软，切面淡黄色灰暗，灰质与白质界限变模糊，脑室变形。正常和假手术组：脑组织无充血水肿及坏死。
2.2.2光镜下观察（病理组织切片HE染色）
（1） 低倍镜下情况：观察到模型组和治疗组大脑皮层缺血坏死区域都集中在颞叶皮质区，即MCA支配供血区。表明造模成功，MCAO手术模型恒定，缺血区域一致，为大脑中动脉供血区。
（2） 高倍镜下情况
正常组与假手术组：皮质区正常，未出现坏死灶，脑组织及血管内未见炎性细胞。局灶性脑缺血再灌注6h模型组：缺血皮质区神经元开始变性坏死，可见胞核固缩为三角形，结构及核仁消失。局灶性脑缺血再灌注24h模型组：缺血皮质区神经元溶解性坏死严重，可见大量空泡形成，血管周围也出现较多炎性细胞并形成围管现象。
2.3脑缺血再灌注大鼠ICAM-1和P-selectin表达情况
免疫组化结果显示ICAM-l阳性血管表达部位主要分布在缺血侧皮层，与梗死灶周围区相一致；P-selectin阳性血管表达部位主要分布在缺血侧皮层，与梗死灶周围区相一致。
3 讨论
脑缺血损伤与动物模型的选择制备本模型的优点是：缺血部位恒定，且可进行再灌注，模拟了人类永久性及短暂性局灶性脑缺血的不同状态；由于对缺血及再通时间能进行准确控制，因而便于分析神经元对缺血的敏感性和耐受性，便于评价再灌注作用以及治疗时间窗的选择【1】；勿需开颅，术中不会引起血压、体温、血气的异常变化，避免了开颅对颅内环境的影响。局灶性脑缺血再灌注早期（1～24小时）缺血皮质出现神经元变性坏死和炎性细胞聚集、粘附及浸润，脑组织坏死范围和程度随着病程进展，炎症反应的继续而扩大加重【2】。在脑缺血再灌注早期（6小时）脑组织中ICAM-1、P-选择素表达水平即明显增高，且增高趋势在炎症反应期（24h）随病程进展而上升。
参考文献：
[1] 谢红妹，朱玲.细胞间钻附分子-1在局部缺血再灌流脑损伤中作用的研究.上海医学.1999，22（2）：109
肢体缺血再灌注 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 在山西医科大学实验动物中心选取成年健康雄性Wistar大鼠42只, 鼠龄3个月~4个月, 体重200 g~250 g。
1.1.2 实验分组 42只Wistar大鼠, 随机分为假手术组 (A组) 、脑缺血组 (B组) 、脑缺血再灌注组 (C组) 、LIP组 (D组) 。LIP组再分为4组:LIP 0 h组 (D1组) 、LIP 6 h组 (D2组) 、LIP 12 h组 (D3组) 、LIP 24 h组 (D4组) , 分别在LIP后即刻、6 h、12 h、24 h行脑缺血再灌注。每组各6例。
1.1.3 实验设备 721分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司) ;TGL-16G高速冷冻离心机 (上海安亭科学仪器厂) ;电热恒温水浴锅 (上海医疗器械厂) ;XW-80A漩涡混合器 (上海手术器械厂) ;医用低温冰箱 (日本三洋公司) ;电热恒温培养箱 (上海跃进医疗器械厂) ;JY98-ⅢN超声波破碎仪 (上海京工实业有限公司) ;光学显微镜 (日本OLYMPUS公司) 。
1.1.4 主要试剂 微量MDA测定试剂盒、SOD测定试剂盒、超微量ATP酶试剂盒、考马斯亮蓝蛋白含量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。普通试剂由山西医科大学实验中心提供。721分光光度计, 其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型的制备 采用改良Longa法[1]建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。将大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉, 颈正中右旁开0.5 cm~1 cm切口, 钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉, 结扎颈外动脉、颈总动脉近心端, 在颈总动脉距离分岔口大约5 cm处用眼科剪剪开一小口, 将直径0.236 mm的进口鱼线插入, 以分岔口处开始测量距离, 插入1.8 cm~2 cm后固定鱼线, 缝合。缺血2 h后将线栓拉出1 cm左右即可, 形成再灌注。其中假手术组插入1.0 cm鱼线。神经功能缺损评分按照Longa等[1]的5级4分法标准。
1.2.2 肢体反复短暂缺血预处理方法 大鼠仰卧固定, 根据气压式肢体循环促进仪构造[2]自制小型充气气囊设备, 在双侧股动脉处充气10 min夹闭股动脉造成肢体缺血, 松气再灌注10 min, 反复4次。
1.2.3 神经功能缺陷评分标准 采用Longa等的5级4分法。0分:无神经功能缺损症状;1分:轻度局灶性神经功能缺损, 即提尾不能伸展左侧前爪;2分:中度局灶性神经功能缺损, 即行走向左侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损, 即行走困难, 并向左侧倾倒;4分:不能自发行走, 意识水平下降。
1.2.4 实验注意事项 实验过程中的动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。实验过程中, 适当用白炽灯照射动物, 维持其肛温在37 ℃左右, 直到恢复活动, 室温保持20 ℃以上, 除去未出现相应脑缺血体征或缺血后出现癫痫及生命体征不平稳的大鼠。
1.2.5 脑组织病理切片的制备及MDA、SOD、ATP含量的测定 各组大鼠缺血2 h再灌注24 h后行神经功能评分后颈椎脱臼处死, 在冰盘上快速取脑, 置0 ℃~4 ℃生理盐水中漂洗, 除去血液, 滤纸拭干, 各组随机取1只大鼠右侧脑组织迅速固定, 石蜡包埋后, 在海马部位做矢状切片, 厚约5 μm, HE染色, 观察脑组织变化。剩余右侧脑组织加入9倍量的0 ℃~4 ℃生理盐水, 在冰水浴中用玻璃匀浆器制成10%的脑匀浆, 3 000 r/min离心15 min, 取上清液检测MDA、SOD、ATP。严格按照试剂盒说明书步骤要求操作, 计算出各项指标含量。
1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件处理数据, 定量资料用均数±标准差
2 结 果
2.1 光镜下脑组织HE染色结果
A组大脑皮质及海马神经细胞形态基本正常。B组、C组神经细胞变性坏死明显, 胞体肿胀, 周围间隙增宽, 结构不清, 出现不同程度的核深染、核固缩、核溶解。D组神经细胞呈轻度缺血改变, 变性坏死不明显, 胞体呈轻度肿胀, 神经细胞缺失较B组、C组轻。
2.2 各组脑组织SOD活力、MDA含量比较
各组中SOD活力的比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , B组、C组、D组的SOD值均低于A组。D1组、D2组与B组和C组比较差异有统计学意义, 且SOD值均高于B组, 推测预处理初期有效。D3组、D4组与D1组、D2组比较差异有统计学意义。各组中MDA含量的比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , B组、C组、D组的MDA值均高于A组。D1组、D2组、D3组、D4组与B组及C组比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 且MDA值均低于B组、C组, 说明预处理后MDA含量有所下降。D3组、D4组与D1组比较差异有统计学意义。详见表1。
2.3 各组脑组织ATP含量比较
各组中Na+-K+-ATP, Ca2+-Mg2+-ATP含量的比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 且B组、C组、D3组、D4组Na+-K+-ATP含量均低于A组 (P<0.05) 。D1组、D2组、D3组、D4组Na+-K+-ATP含量均高于B组与C组 (P<0.05) ;D1组、D2组Ca2+-Mg2+-ATP含量均高于B组 (P<0.05) 。D3组、D4组Na+-K+-ATP, Ca2+-Mg2+-ATP含量低于D1组、D2组 (P<0.05) 。各组中总ATP含量的比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 且ATP含量均低于A组。D1组、D2组总ATP含量高于B组 (P<0.05) 。D1组总ATP含量高于C组 (P<0.05) 。D3组、D4组总ATP含量均低于D1组 (P<0.05) 。详见表2。
3 讨 论
近年来对肢体反复短暂缺血预处理在脑缺血再灌注损伤中的保护作用方面的研究较多, 但对于其具体作用机制方面的研究较少。本课题通过观察大鼠肢体反复短暂缺血预处理时脑组织SOD、MDA及ATP酶水平的影响, 探讨其在脑缺血及缺血再灌损伤中可能的保护作用, 以指导临床中脑缺血患者的治疗, 提高患者的生存率, 减少复发率及致残率, 提高患者的生存质量。
本实验通过LIP后对大鼠脑组织MDA、SOD含量及ATP酶活性变化进行统计学分析, 观察LIP在大鼠脑缺血再灌注损伤中的保护作用, 结果显示大鼠脑缺血再灌注时大脑出现明显损伤性改变, 经过股动脉反复4次短暂 (10 min) 夹闭的LIP可使1 d内脑缺血引起的神经元损伤有所改善, 即通过观察肢体反复短暂缺血再灌注0 h、6 h、12 h、24 h大鼠脑组织MDA、SOD、ATP的变化情况, 结果发现反复短暂肢体缺血再灌注后大鼠脑组织中MDA、ATP早期即有明显的升高, 12 h、24 h升高不明显。这些结果表明LIP可以对远隔器官脑缺血再灌注损伤产生对抗作用, 但间隔时间过长, LIP的这种保护作用有所减弱。这与Lepore等[3]研究发现大鼠后肢损伤性缺血前1 d给予缺血预处理不能改善肌肉的生存状况, 认为LIP对后续的肢体缺血再灌注损伤不能产生延迟性保护作用结果相一致。分析其相关机制可能为:①脑缺血后血流重建时缺血区自由基增多, 与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化连锁反应[4], 分解产生MDA, 使脑组织生物膜结构破坏、蛋白降解、核酸主链断裂、透明质酸解聚、细胞崩解, 脑细胞发生不可逆性损害, 导致神经元死亡。②SOD作为体内清除自由基的首要物质, 通过清除超氧阴离子自由基保护神经细胞免受损伤。③脑缺血再灌注早期, 脑细胞内ATP合成减少, 依赖ATP的离子泵, 尤其是Na+-K+-ATPase功能减弱, 使大量Na+内流, K+外流, 细胞膜电位下降产生去极化, 从而引起突触前膜释放兴奋性氨基酸, 兴奋性氨基酸主要通过受体活化方式而起兴奋性介质作用, 受体活化效应主要引发大量的Ca2+内流, 同时激活细胞内Ca2+库的释放, 导致细胞内游离Ca2+超载, 激活了各种降解酶, 引起DNA、蛋白质和磷脂降解, 细胞代谢、结构与功能多方面的异常改变, 神经细胞逐步死亡。有文献表明, 细胞内Na+增多, 导致渗透压升高, 是再灌注早期脑细胞内水肿和神经细胞坏死的重要原因[5]。同时过量Ca2+沉积于线粒体, 使线粒体氧化磷酸化失偶联进一步加重, 膜电位丧失, 导致细胞能量的严重丢失, 同时致使O2经单电子还原生成超氧阴离子 (O2-) 增多, 产生的大量自由基引起膜脂质过氧化, 导致膜结构破坏, 线粒体功能障碍, 细胞膜通透性也增加, 发生细胞溶解和组织水肿等一系列损害作用。此外有学者研究发现, LIP能明显对抗后续即刻给予的损伤性脑缺血再灌注引起的大鼠海马CA1区延迟性神经元死亡, 并从LIP后NO动态变化、C-Fos、Hsp蛋白的表达, 神经途径阐释了LIP对脑缺血再灌注损伤保护作用的可能机制[6,7,8]。
反复短暂肢体缺血预处理是一种便捷、安全、有效的脑保护方法, 对脑缺血再灌注损伤有保护作用, 其机制可能与增加自由基清除酶SOD活性, 抑制脂质过氧化反应, 降低MDA含量有关。通过促进脑缺血再灌注后线粒体脂肪酸代谢, 提高糖代谢, 加速ATP产生, 及早恢复缺血半暗区能量供应, 阻断后续的链式神经元损伤反应, 产生神经细胞保护作用有关。Na+-K+-ATPase活性升高可纠正细胞内酸中毒, Ca2+-Mg2+-ATPase活性升高可纠正Ca2+超载, 反复短暂肢体缺血预处理通过提高脑缺血再灌注后Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性, 维持钠泵、钙泵的稳定, 使细胞内外Na+、Ca2+平衡, 从而稳定神经细胞膜电位, 起到神经细胞保护作用。
虽然本实验将预处理组区分了四个时间点, 但LIP对缺血再灌脑保护的具体时间窗有待进一步研究, 在以后的试验中需更详细的制定时间窗以及对其他相关机制进一步研究。
摘要：目的 探讨肢体反复短暂缺血预处理 (LIP) 在大鼠脑缺血再灌注损伤中可能的脑保护机制。方法 随机将42只成年健康雄性Wistar大鼠分为7组, 假手术组、脑缺血组、脑缺血再灌注组、预处理0h组、预处理6h组、预处理12h组、预处理24h组。采用线栓法制备大脑中动脉缺血及缺血再灌注模型, 重复夹闭大鼠双侧股动脉4次 (每次10min, 间隔10min) 作为LIP, 采用生化方法测定各组脑组织中丙二醛 (MDA) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 、三磷酸腺苷 (ATP) 酶的含量;HE染色观察大鼠脑组织的病理改变。结果 肢体反复短暂缺血预处理组可明显减少MDA的含量, 升高SOD活性, 增加ATP含量, 尤以预处理0h和6h组为著, 同其余预处理组及对照组相比差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 肢体缺血预处理可提高脑缺血大鼠的SOD活性、降低MDA含量、促进ATP的生成, 推知反复短暂的肢体缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用, 它可通过提高脑组织抗氧化酶活性、提高线粒体能量, 抑制氧自由基产生及脂质过氧化反应来发挥作用。
关键词：肢体缺血预处理,脑缺血,丙二醛,超氧化物歧化酶,三磷酸腺苷
参考文献
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肢体缺血再灌注 篇5
【关键词】雌激素；肝脏缺血再灌注；保护
【中图分类号】R575.5【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0039-01
肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)常见于临床上入肝血流阻断肝切除术和肝移植。近年来，许多研究发现应用雌激素可以明显改善心、脑缺血再灌注损伤所带来的器官功能损害[1],那么雌激素在肝缺血再灌注损伤中是否发挥保护作用呢?本实验拟建立大鼠I/R模型，以研究雌激素在大鼠肝缺血再灌注损伤中的作用。
1材料与方法
1.1材料与试剂选用清洁及健康雄性Wistar大鼠12只，月龄2.5个月左右，体重250～270g；雌性Wistar大鼠36只，月龄2～3个月，体重200～240g；17β-雌二醇，美国SIGMA公司提供。
1.2方法
1.2.1动物模型制作实验前12 h动物禁食，自由饮水。2％氯胺酮腹腔内注射麻醉(每100g体重注射0.5m1)，上腹正中切口进腹，入腹后离断肝周韧带，用小号血管夹分别夹闭左、中、右肝蒂，仅保留尾状叶作为门静脉与腔静脉血液回流通道。肝脏缺血90min后，放开血管夹，同时切除尾状叶。
1.2.2实验分组A组直接制作HIRI模型。B组及D组于肝缺血手术前10d切除双侧卵巢；C组也于肝缺血手术前10d作开腹手术，但不切除卵巢；B组和C组于术后每日均给予0.2 ml二甲基亚砜(DMS0)腹腔注射，D组在切除双侧卵巢后每日腹腔注射17β-雌二醇0.1mg/kg(溶于DMSO0.2 ml中)共10d，10d后制作HIRI模型。
1.2.3检测指标各组动物实验完成后下腔静脉取血4ml，测定其中ALT、AST、AKP水平。
1.2.4统计学处理实验数据以±s表示,组间比较采用方差分析。
2结果
各组大鼠血清中ALT、AST、AKP的含量见表1。
3讨论
缺血再灌注损伤是临床各科常需面临的一个问题。国内外有研究发现雌激素对脑、心、视网膜等脏器缺血再灌注损伤有一定的保护作用，而对肝脏缺血再灌注损伤的影响研究较少。本研究结果表明17β-雌二醇能降低肝脏缺血再灌注后血清转氨酶水平，提示雌激素对肝脏缺血再灌注损伤确有一定保护作用。但与假手术组相比，17β-雌二醇处理组转氨酶上升较明显，说明雌激素对肝脏缺血再灌注损伤虽有保护作用但并不能完全消除其所致肝脏损伤。关于雌激素对肝缺血再灌注损伤的保护机制，目前推测有以下几点：① 雌激素可通过非基因途径增加血管内皮源性NO合成酶的活性[2]，增加NO的合成与释放，而NO是目前所知最强的血管松弛因子之一，NO含量的升高，可使血管扩张，从而改善循环，减轻损伤；② 雌激素不仅可通过NO介导依赖机制减少超氧化物的产生[3]，其本身也具有抗氧化的特性，因此可从双方面减少I/R的损伤；③有研究表明，在I/R时，应用雌激素可明显增强微血管对乙酰胆碱和苯肾上腺素的应答，从而有助于再灌注期微血管功能的恢复[4]。
参考文献
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肢体缺血再灌注 篇6
1 材料与方法
1.1 动物与分组
健康雄性SD大鼠24 只, 由河北联合大学动物中心提供, 体质量250~280 g, 随机分成3 组 (每组8只) 。1对照组 (Control) ;2肢体缺血再灌注组 (LIR) ;3牛磺酸组 (Tau) 。
1.2 主要试剂和仪器
SOD试剂盒、MDA试剂盒、XOD试剂盒、ROS试剂盒均购自南京建成生物工程研究所, s ICAM-1、P-Selectin试剂盒购自美国R&D公司, TXB2、1256-Keto-PGF1α 测定由河北联合大学附属医院完成, 器官血流检测采用瑞典帕瑞医学公司的激光多普勒PF5010 微循环血流单元 (激光多普勒血流灌注量检测) 。
1.3 模型制备及标本采集
实验前动物禁食12 h, 饮水自由。采用止血带法[5]复制LIR模型, 以橡皮圈环绕结扎大鼠双后肢根部, 完全阻断血流, 4 h后松解橡皮圈恢复血流灌注4 h, 自腹主动脉放血处死动物, 留取血浆备用, 迅速取后肢肌组织 (腓肠肌) 置于固定液中固定;Tau组在松解前30 min腹腔注射牛磺酸 (200 mg/kg) , 其余操作同LIR组;Control组除了不结扎肢体外其余操作同LIR组。
动物双下肢血流的检测:动物双下肢缺血4 h, 恢复血流灌注4 h时, 采用Peri Flux 5001 激光多普勒血流仪测定各组大鼠双下肢血流情况:将该仪器配备的光导纤维探头固定于大鼠双下肢足掌部位, 然后打开血流仪进行监测。
1.4 观测指标
所取血液予以抗凝离心后, 取上层清液, 按照各试剂盒所示方法测定血浆中可溶性细胞间黏附分子1 (s ICAM-1) 、P- 选择素 (P-selectin) 、丙二醛 (MDA) 、黄嘌呤氧化酶 (XOD) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 、活性氧 (ROS) 、前列环素 (PGI2) 的稳定代谢产物1256-Keto-PGF1α 的含量以及血栓素A2 (TXA2) 的稳定代谢产物血栓烷素B2 (TXB2) 的含量。激光多普勒血流仪测定双下肢血流情况。
1.5 光镜及电镜检查
所取肌组织一部分固定后经梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片、HE染色后进行光镜观察并摄片。另一部分经2.5%戊二醛固定, 乙醇丙酮脱水, 环氧树脂包埋, 超薄切片, 透射电子显微镜下观察并摄像。
1.6 统计学处理
所有数据均以均数±标准差 (±s) 表示, 采用SPSS 17.0 软件进行数据处理, 组间数据比较以单因素方差分析t检验, P <0.05 有显著性差异。
2 结果
2.1 各组血浆中MDA、XOD、SOD、ROS含量的变化
与Control组比较, LIR组血浆中MDA、XOD、ROS水平均显著升高, SOD活性降低;与LIR组比较, Tau组血浆中MDA、XOD、ROS值均显著降低, SOD活性升高。见表1。
2.2 各组大鼠血浆中s ICAM-1、P-Selectin、TXB2和125I-6-Keto-PGF1α 的变化
与Control组比较, LIR组血浆中s ICAM-1、P-Selectin、TXB2 值显著升高, 1256-Keto-PGF1α降低, TXB2 与125I-6-Keto-PGF1α 比值升高;与LIR组比较, Tau组血浆中s ICAM-1、P-Selectin、TXB2 显著降低, 125I-6-Keto-PGF1α 显著升高, TXB2 与125I-6-Keto-PGF1α 比值降低。见表2。
(n =8, ±s)
注:1) 与对照组比较, P <0.05, 2) 与对照组比较, P <0.01;3) 与LIR组比较, P <0.05, 4) 与LIR组比较, P <0.01
(±s)
注:1) 与对照组比较, P <0.05, 2) 与对照组比较, P <0.01;3) 与LIR组比较, P <0.05, 4) 与LIR组比较, P <0.01
2.3 各组大鼠双下肢血流变化
与Control组比较, LIR组双下肢血流减少;而Tau后处理组动物双下肢血流较LIR组增加。见表3。
(n =8, ±s)
注:1) 与对照组比较, P <0.05, 2) 与对照组比较, P <0.01;3) 与LIR组比较, P <0.05, 4) 与LIR组比较, P <0.01
2.4 各组大鼠骨骼肌肌光镜观察结果
Control组大鼠骨骼肌细胞大小、形态均正常, 横纹肌成束状且清晰。LIR组中, 可见部分肌原纤维断裂模糊, 横纹紊乱消失, 肌间隙增宽, 组织水肿, 血管充血出血, 炎细胞浸润。而Tau组与LIR组比较, 肌原纤维较完整, 排列较整齐, 炎细胞浸润减少, 出血减少。见图1。
2.5 各组大鼠骨骼肌电镜观察结果
缺血前Control组肌细胞肌节、肌丝排列紧密而整齐, 可见明暗相间的I带和A带, Z线和M线清晰可见, 肌原纤维间有较多糖元颗粒, 线粒体排列规整。LIR组部分肌丝溶解断裂, 排列紊乱, Z线不齐或消失, 肌原纤维间隙增宽, 糖元颗粒减少或消失, 线粒体明显肿胀扩张。Tau组上述损伤性变化明显减轻。见图2。
A:Control;B:LIR;C:Tau
A：Control；B：LIR；C：Tau
3 讨论
LIR的发生机制十分复杂, 目前认为自由基损伤、细胞内钙超载、白细胞的黏附、炎症介质的作用等都参与损伤的发生。牛磺酸是一种内源性 β- 氨基酸, 广泛分布于动物组织细胞内, 研究表明它对机体各组织器官有广泛的生理和药理学效应[6]。
本实验观察到大鼠LIR后血浆中XOD含量增高而SOD含量降低, 其所导致的后果是氧自由基产生增多而清除不足, ROS增多。MDA是自由基引起的脂质过氧化的终末代谢产物, LIR后其升高可表明脂质过氧化反应增强, 可使膜受体、膜蛋白酶、离子通道等受损, 引起细胞损伤。这些指标的变化提示LIR后骨骼肌的损伤可能与氧化应激反应增强有关。
微循环是组织血流灌注的基本单位, 又是IR时最易发生功能障碍的部位, 其功能障碍又会进一步加重组织损伤。本实验可见ROS与s ICAM-1 和P-Selectin的变化方向一致, s ICAM-1 和P-Selectin都属于黏附分子, 是介导细胞与细胞间和细胞与基质间相互结合的细胞表面受体, 介导白细胞滚动、黏附与聚集到炎症部位。当肢体缺血再灌注损伤时, 在缺氧和炎性介质的刺激下, P-Selectin迅速移行于内皮细胞表面, 介导中性粒细胞在内皮细胞表面滚动, 和s ICAM-1 共同作用, 使中性粒细胞黏附于内皮并活化, 变形后从血管内皮间隙移到周围组织[6], LIR组炎细胞的浸润可能与此相关。血流减少也可能与白细胞的黏附聚集有关。自由基还可破坏前列腺环素与血栓素之间的平衡。TXA2 和PGI2 为一对天然的拮抗物, PGI2 主要由血管内皮生成, 具有扩血管和抑制血小板聚集的作用, 与PGI2 的作用相反, TXA2 主要由血小板生成, 有强烈的促血小板聚集、收缩血管和溶细胞作用。生理状态下, TXA2 及PGI2保持一定的比例, 是维持血液循环稳定的因素之一。由于PGI2 和TXA2 皆不稳定, 迅速转变为相对稳定的无活性的125I-6-Keto-PGF1α 及TXB2, 因此测定后两者即可反映机体PGI2 及TXA2 水平。本实验可见LIR后TXB2 和125I-6-Keto-PGF1α 的比例升高, 平衡失调, 可能是LIR时血管内皮和血小板被激活释放PGI2 和TXA2 增多, 然而由于血管内皮细胞受损, PGI2 生成相对不足, 因而会出现血管收缩和血小板聚集等现象, 加重微循环障碍。同时内皮受损血管通透性增加, 会加重组织水肿和骨骼肌的溶解、破坏, 本研究还观察到LIR后大鼠双下肢血流明显减少, 这可能与骨骼肌微循环障碍及组织水肿有关。
牛磺酸具有稳定细胞膜、调节细胞内钙稳态和抗脂质过氧化的作用[7]。牛磺酸后处理组与LIR组比较, 动物XOD含量降低而SOD含量增高, ROS减少, MDA减少, 细胞损伤减轻, 表明氧自由基减少, 脂质过氧化反应减轻, 氧化应激反应受抑制。同时伴有血浆s ICAM-1 和P-Selectin水平降低, TXB2 和125I-6-Keto-PGF1α 比值降低, 双下肢血流量增加, 这可能与牛磺酸影响花生四烯酸代谢, 抑制TXA2合成酶的活性, 减少缩血管物质的生成有关[8]。
综上所述, 牛磺酸后处理对肢体缺血再灌注后骨骼肌损伤具有保护作用, 其机制可能与抑制氧化应激反应, 改善微循环、增加血流量有关, 但详细机制有待于进一步研究。
摘要：目的 探讨牛磺酸后处理对大鼠肢体缺血再灌注后骨骼肌损伤的影响及可能机制。方法 复制大鼠肢体缺血再灌注 (LIR) 损伤模型, 将24只大鼠随机均分为三组, 即对照组、缺血再灌组及牛磺酸组, 采用生物化学方法和放射免疫法等测定各组动物血浆中血栓烷素B2 (TXB2) 、6-酮-前列腺素F1α (125I-6-Keto-PGF1α) 、可溶性细胞间黏附分子1 (sICAM-1) 、P-选择素 (P-Selectin) 、活性氧 (ROS) 、丙二醛 (MDA) 、黄嘌呤氧化酶 (XOD) 及超氧化物歧化酶 (SOD) 的含量;激光多普勒血流仪检测大鼠双下肢血流情况;观察光镜及电镜下骨骼肌的形态学改变。结果 与对照组相比, 大鼠LIR后血浆中XOD、ROS、MDA、sICAM-1、P-Selectin、水平升高, 1256-Keto-PGF1α水平略有升高, 但两组比较无显著性差异, 并且TXB2/125I-6-Keto-PGF1α (T/P) 比值明显升高, SOD活性降低, 双下肢血流显著减少, 光镜下可见骨骼肌纤维变形, 横纹紊乱消失, 间质水肿, 肌间隙增宽, 炎细胞浸润, 血管充血出血明显, 电镜下可见LIR组肌丝溶解断裂甚至消失, 排列紊乱, Z线不齐或消失, 肌原纤维间隙增宽, 糖元颗粒减少或消失, 线粒体肿胀扩张, 部分肌膜消失, 牛磺酸后处理组大鼠血浆SOD活性增加, XOD、ROS、MDA、sICAM-1、P-Selectin、TXB2水平下降, 125I-6-Keto-PGF1α水平升高, 二者比值升高, 骨骼肌损伤性变化明显减轻, 双下肢血流增加。结论 牛磺酸后处理可减轻骨骼肌缺血再灌注损伤, 其机制与抑制氧化应激反应, 改善微循环、增加血流量有关。
关键词：牛磺酸,再灌注损伤,骨骼肌,微循环
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肢体缺血再灌注 篇7
1 材料与方法
1.1 药物及试剂
丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(上海第一生化药业有限公司生产,规格:2 m L∶10 mg,批号:国药准字H31022558)。SOD、MDA试剂盒均购置于南京建成生物工程研究所。
1.2 实验分组及模型建立
健康雄性Wistar大鼠48只,体重(210±20)g,由山西医科大学动物实验中心提供,动物合格证号为医动字第070101。将大鼠随机分为三组,每组16只,分别为丹参酮组、对照组、假手术组。丹参酮组于术前3、2、1 d及术前30 min,给予腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(20 mg/kg);同时对照组及假手术组给予腹腔注射等量生理盐水。术前大鼠禁食12 h,自由饮水,采用乌拉坦(40 mg/100 g)腹腔注射麻醉,取腹部正中切口,分离出腹主动脉,在髂总动脉分叉处上方0.5 cm处用动脉夹阻断腹主动脉,以远端动脉变扁平及搏动消失为标准,阻断2 h后,再灌注4 h。假手术组不做腹主动脉阻断,其他步骤同丹参酮组。
1.3 标本采集与检测
丹参酮组与对照组在腹主动脉阻断后2 h,各随机选8只大鼠从下腔静脉采血2 m L;另8只大鼠再灌注4 h后,相同方法采血。假手术组在对应时间相同方法采血。检测血清MDA含量采用硫代巴比妥酸法,检测SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法,严格按照试剂说明书进行。
1.4 制作病理切片
再灌注4 h后取大鼠后肢骨骼肌,10%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋后切片,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,光镜下观察。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,各组数据均服从正态分布,计量资料以均数±标准差表示,进行方差齐性检验,组内、组间两两比较采用完全随机设计方差分析(One-Way ANOVA)及LSD检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 丹参酮ⅡA对血清SOD活性和MDA含量的影响
缺血2 h及再灌注4 h,与对照组比较,假手术组血清SOD活性均升高(P<0.05),MDA含量均降低(P<0.05);丹参酮组血清SOD活性均升高(P<0.05),MDA含量均减少(P<0.05)。对照组大鼠再灌注4 h与缺血2 h比较,血清SOD活性进一步降低(P<0.05),MDA含量进一步增多(P<0.05);而丹参酮组大鼠再灌注4 h与缺血2 h血清SOD活性和MDA含量无明显变化(P>0.05)。见表1。
注:与对照组比较,*P<0.05;与缺血2 h比较,△P<0.05
2.2 丹参酮ⅡA对大鼠骨骼肌病理组织学的影响
光镜下观察,假手术组大鼠后肢骨骼肌染色均匀,肌纤维排列整齐,横纹清楚,肌核清楚可见;对照组肌纤维水肿,大部分横纹消失,胞浆淡染,部分肌核消失;丹参酮组肌纤维水肿明显减轻,大部分横纹清楚可见,肌核比较清楚。见图1。
3 讨论
各种原因造成的组织血液灌注量减少可使细胞发生缺血性损伤,尽早恢复血液供应是解决缺血性损伤的主要集中点,然而当缺血组织恢复血液再灌注后,细胞超微结构、功能、代谢与电生理等方面会出现进一步损伤且有加重现象,这种损伤称为缺血再灌注损伤[1,2]。严重的肢体缺血再灌注损伤可以造成肺、肾、心、胰腺、脊髓等远隔脏器及组织的损伤,引起全身炎症反应综合征[3],甚至多器官功能不全综合征。因此对缺血再灌注损伤防治的研究十分重要。
目前国内外用于防治缺血再灌注损伤的西药,由于其毒副作用等原因,仍未取得较好的临床疗效。多种中药作为天然氧自由基清除剂,作用温和,副作用较少,在防治肢体缺血再灌注损伤方面具有独特的优势[4]。丹参是唇形科鼠尾草属植物,丹参的干燥根及根茎具有活血调经、凉血消痈、养血安神等多种功效,是临床常用的活血化瘀药,祖国医学认为,“一味丹参饮,功同四物汤”,其功效可见一斑,丹参酮是丹参的脂溶性成分,其中丹参酮ⅡA为丹参酮中含量最高的活性成分[5]。临床上已有丹参酮ⅡA磺酸钠注射液用于心血管疾病预防和治疗,并获得了肯定疗效。
目前国内外丹参酮ⅡA对缺血再灌注损伤保护作用的研究主要集中于心脑,而对肢体缺血再灌注损伤的研究较少。本实验通过建立大鼠肢体缺血再灌注损伤模型,检测血清SOD活性和MDA含量,比较骨骼肌病理组织学变化,观察丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对大鼠肢体缺血再灌注损伤的影响,探讨丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对肢体缺血再灌注损伤大鼠的保护作用及其机制。
本实验研究发现,缺血2 h及再灌注4 h,丹参酮组与对照组比较,血清SOD活性均升高(P<0.05),MDA含量均减少(P<0.05)。缺血再灌注损伤发生的最根本机制是氧自由基的大量产生和细胞内钙超载以及随之而来的微血管功能障碍[6]。SOD存在于细胞中,对机体的氧化与抗氧化平衡、保护细胞免受损伤起着至关重要的作用,SOD活性的高低直接反映了机体清除自由基的能力[7]。MDA是脂质过氧化反应的代谢产物,因其能与膜磷脂、蛋白质分子等形成共轭交联和聚合结构,使膜的基本特性改变,蛋白质活性丧失,进而致细胞死亡[8]。测定MDA的含量可以反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映组织中氧自由基的含量及机体细胞受氧自由基攻击而损伤的程度[9]。本实验也发现,丹参酮ⅡA磺酸钠可升高肢体缺血再灌注损伤大鼠血清SOD活性,降低MDA含量,因而丹参酮ⅡA磺酸钠可能通过增强清除氧自由基能力、减少脂质过氧化反应代谢产物,达到保护缺血再灌注损伤肢体的作用。
本实验还发现,大鼠肢体缺血2 h,血清SOD活性降低(P<0.05),MDA含量增多(P<0.05);再灌注4 h与缺血2 h比较,血清SOD活性进一步降低(P<0.05),MDA含量进一步增多(P<0.05);而丹参酮组大鼠再灌注4 h与缺血2 h血清SOD活性和MDA含量无明显变化(P>0.05)。从而证明大鼠肢体缺血时,机体清除自由基的能力已减弱,氧自由基生成已增加,再灌注后这一程度进一步加强,机体损伤进一步加重;而经丹参酮ⅡA磺酸钠预处理后,再灌注后机体清除自由基的能力未进一步减弱,氧自由基生成未进一步增加,可见其对缺血再灌注损伤肢体有保护作用。以往研究证实脂质过氧化反应在缺血期即已启动,再灌注时氧进入缺血组织作为电子接受体,使氧自由基大量增加,结果使脂质过氧化反应迅速加强[10]。缺血骨骼肌再灌注后,仍有较大比例的营养性毛细血管不能灌流,从而延长组织缺血缺氧时间,加重组织损伤[11]。
本实验在光镜下观察大鼠骨骼肌病理变化时,发现缺血再灌注损伤的肌纤维水肿,大部分横纹消失,部分肌核消失。经丹参酮ⅡA磺酸钠预处理后肌纤维水肿明显减轻,大部分横纹清楚可见,肌核比较清楚。说明缺血再灌注损伤时大鼠骨骼肌受损,而丹参酮ⅡA磺酸钠对缺血再灌注损伤的大鼠骨骼肌有保护作用,其机制可能与丹参酮ⅡA的药理特性有关。国内有研究者建立兔肢体缺血再灌注损伤模型,发现HE染色可见肌纤维广泛盘状及空泡样改变,肌横纹消失,肌纤维间有大量的白细胞和红细胞浸润,微血管内皮细胞可见明显肿胀,血管壁内皮细胞上有白细胞黏附,可见肢体再灌注损伤是以缺血为基础,通过自由基及白细胞与血管内皮细胞间的相互作用,致肢体微循环障碍,最终损害肢体组织的一组损伤[12]。丹参酮ⅡA可以改善实验动物的凝血功能、血液流变性,降低血小板聚集率[13],达到改善肢体微循环,减轻骨骼肌损伤的作用。
综上所述,丹参酮ⅡA磺酸钠注射液可使大鼠血清SOD活性升高,MDA含量减少,减轻骨骼肌组织的损伤,对肢体缺血再灌注损伤大鼠有保护作用。其保护机制可能为,该药增强机体清除氧自由基能力,减少脂质过氧化反应代谢产物,改善凝血功能、血液流变性,降低血小板聚集率,改善肢体微循环。本实验证明丹参酮ⅡA磺酸钠注射液可用于临床肢体缺血再灌注损伤的防治。
摘要：目的 观察丹参酮ⅡA磺酸钠对大鼠肢体缺血再灌注损伤的影响。方法 健康雄性Wistar大鼠48只,随机分为丹参酮组、对照组、假手术组,每组16只。丹参酮组在术前3、2、1 d及术前30 min给予腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(20 mg/kg);同时对照组及假手术组给予腹腔注射等量生理盐水。丹参酮组与对照组建立肢体缺血再灌注损伤模型,观察各组缺血2 h及再灌注4 h血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(malon-dialdehyde,MDA)含量的变化,并观察大鼠后肢骨骼肌病理组织学变化。结果 假手术组大鼠再灌注4 h与缺血2h,与对照组比较,血清SOD活性均增多(P<0.05),而MDA含量均降低(P<0.05)。丹参酮组大鼠血清SOD活性均高于对照组(P<0.05),MDA含量均低于对照组(P<0.05)。对照组大鼠再灌注4 h与缺血2 h比较,血清SOD活性进一步降低(P<0.05),MDA含量进一步增多(P<0.05);而丹参酮组大鼠再灌注4 h与缺血2 h血清SOD活性和MDA含量无明显变化(P>0.05)。光镜下观察丹参酮组骨骼肌组织损伤比对照组明显减轻。结论 丹参酮ⅡA磺酸钠对肢体缺血再灌注损伤有保护作用。
肢体缺血再灌注 篇8
关键词：姜黄素,四肢,再灌注损伤,肺,脂质过氧化反应
肢体缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)是临床断肢再植、四肢大血管栓塞或损伤、严重的肢体挤压伤及手术时肢体长时间应用止血带等过程中共有的病理过程,不仅导致肢体本身的损伤,而且对远隔器官尤其是肺的结构和功能产生广泛的影响,甚至导致急性呼吸窘迫综合征[1],研究表明此种损伤与氧化应激有关[2,3]。姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素,是植物姜黄的主要活性成分之一,具有很强的抗炎及抗氧化作用,其对心、脑、肾、肠等脏器I/R损伤的保护作用已被实验证实[4,5,6,7]。笔者旨在探讨姜黄素预处理对肢体I/R肺损伤时脂质过氧化反应的影响。
1 资料与方法
1.1 材料与试剂
健康成年雄性SD大鼠72只,质量250～300 g(中国医科大学实验动物中心提供);姜黄素:购自Sigma-Aldrich公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及蛋白定量检测试剂盒:购自南京建成生物工程研究所。
1.2 动物分组及给药
大鼠适应性饲养1周后,随机分为6组,每组12只:假手术组(S组)、肢体缺血再灌注组(IR组)、姜黄素预处理组(C50、C100和C200组)和姜黄素对照组(C组)。C50组、C100组、C200组和C组分别于缺血前2 h经腹腔注射姜黄素50、100、200和200 mg/kg,S组和IR组给予等容量(2 m L)的生理盐水腹腔注射。实验中所采用的姜黄素剂量及配制方法参考文献[8,9,10]。
1.3 动物模型的制备
参照文献[11,12]的方法,采用肢体缺血2 h再灌注3 h制备肢体缺血再灌注继发肺损伤模型。所有动物缺血前12 h禁食,自由饮水,腹腔注射3%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后,右颈外静脉置管建立静脉通路。在大鼠后肢股三角区切开皮肤,分离出股动、静脉,除S组和C组外,其余各组大鼠均用无创微动脉夹夹紧近腹股沟韧带处股动脉,使双后肢缺血2 h,松开无创微动脉夹双后肢再灌注3 h。应用多普勒血流探测仪监测血流以保证肢体缺血再灌注成功实施,以未监测到血流为缺血成功标志,监测到血流为再灌注成功标准。实验过程中静脉输注生理盐水1.5 m L/(kg·h)。
1.4 指标检测
1.4.1 血气分析测定
再灌注3 h时颈动脉采血测PaO2。
1.4.2 肺病理学检查
取右肺上叶1 cm3置于10%中性福尔马林中固定,常规石蜡包埋、切片,HE染色,光镜下观察形态学改变。
1.4.3 肺组织湿/干重比测定
取右肺中叶用4℃生理盐水冲去残血,滤纸吸干水分称湿重(W)后置于80℃烘干48 h,称干重(D),计算肺W/D。
1.4.4 血浆及肺组织MDA和SOD测定
颈动脉采血3 m L,收集血浆,取左肺组织200 mg,制备10%肺组织匀浆,分别采用硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法检测MDA含量和SOD活性,具体操作按试剂盒说明书进行。
1.5 统计学分析
所有数据采用SPSS 13.0软件包进行分析,数据以均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析,LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺组织病理学改变
S组和C组的肺组织形态结构未见异常;IR组肺泡壁增厚,肺间质和肺泡水肿,大量炎症细胞浸润,呈局限性肺不张;C50组、C100组和C200组肺组织损伤较IR组明显减轻,C200组只有少量渗出及肺泡隔轻度增宽,基本接近于正常肺组织,见附图。
2.2 血气指标P a O2和肺组织W/D变化
与S组比较,IR组Pa O2明显降低,IR组、C50组和C100组肺组织W/D升高(P<0.01);与IR组比较,C50组、C100组和C200组Pa O2升高,肺组织W/D剂量依赖性降低(P<0.01),见表1。
2.3 肺组织及血浆中S OD活性变化和MDA含量
与S组比较,IR组的肺组织和血浆SOD活性明显降低,而MDA含量增加(P<0.01);与IR组比较,C50组、C100组和C200组肺组织和血浆SOD活性升高,而MDA含量降低,且呈剂量依赖性(P<0.05或P<0.01),见表2。
注:1)与S组比较,P<0.01;2)与IR组比较,P<0.01;3)与C50组比较,P<0.01;4)与C100组比较,P<0.01
注:1)与S组比较,P<0.01;2)与IR组比较,P<0.05;3)与IR组比较,P<0.01;4)与C50组比较,P<0.05;5)与C50组比较,P<0.01;6)与C100组比较,P<0.05;7)与C100组比较,P<0.01
3 讨论
氧分压作为肺气体交换功能的主要表现形式,是评价肺损伤程度及其保护作用的最敏感的指标;肺组织W/D可反映肺间质及肺泡微血管通透性改变的程度。在笔者的研究中IR组大鼠肢体缺血再灌注后Pa O2明显降低,肺组织W/D明显升高,并出现了明显的肺组织水肿、大量炎症细胞浸润、局限性肺不张等病理损伤,提示肢体缺血再灌注肺损伤模型制备成功。
研究表明,姜黄素是一种新型的抗氧化剂。PRIYADARSINI等[13]证实,姜黄素分子结构中的酚羟基在姜黄素的抗氧化活性中起决定性的作用。姜黄素及其结构类似物通过抗过氧化脂质达到保护生物膜的目的。不仅如此,姜黄素还能抑制自由基介导的脂质过氧化反应,减轻线粒体的氧化还原反应及呼吸功能损害,增加还原型谷胱甘肽含量,减少活性氧产生并抑制蛋白质羟化,从而减轻氧化应激反应及细胞损伤[14,15]。实验证明,姜黄素可阻止丙酮醛/赖氨酸诱导的氧化应激和DNA损害,并且抑制丙酮醛诱导的人单核细胞凋亡和活性氧的产生[16]。HEMEIDA等[17]观察姜黄素对于氨甲喋呤引起的大鼠肝脏氧化损害时发现,连续5 d给予大鼠100 mg/(kg·d)姜黄素,能明显提高肝SOD、CAT、GSH活性,降低其MDA水平,提示姜黄素抗氧化作用不仅依赖于GSH非酶抵抗系统,也依赖于SOD、CAT等酶系统。
肺脏是一个高灌注的器官,对I/R损伤非常敏感。肢体I/R损伤中氧自由基起重要作用,介导整个肺损伤过程[18]。氧自由基对细胞的主要损害是造成脂质过氧化,其代谢产物为MDA,通过测定MDA的含量,能够反映氧自由基的代谢及脂质过氧化对机体的损伤程度。SOD是体内主要的氧自由基清除酶,可以通过歧化作用清除体内的自由基,使机体免受氧自由基造成的脂质过氧化损伤。已有文献[19,20]报道脂质过氧化反应在缺血期即已启动,再灌注时氧进入缺血组织中,作为电子的接受体,使氧自由基大量增加,结果使脂质过氧化反应迅速加强,导致肺脏结构和功能异常。笔者研究IR组血浆和肺组织中SOD活性明显降低,MDA含量显著增高,与对照组比较差异有统计学意义,表明肢体I/R时氧自由基生成增多,机体清除氧自由基的能力降低,导致脂质过氧化,结合肺组织病理改变等说明肢体I/R诱发肺损伤与脂质过氧化损伤有关。从姜黄素预处理结果来看,各组血浆和肺组织中SOD活性升高,MDA含量降低,随着姜黄素剂量增加肺损伤改善程度增加,呈剂量依赖性,提示姜黄素对缺血再灌注时脂质过氧化损伤有一定的拮抗作用,其作用机制可能是通过提高SOD的活性,增强机体抗氧化能力,减少氧自由基的生成,从而起到调节氧化/抗氧化失平衡的作用。
肢体缺血再灌注 篇9
缺血预适应(ischemic preconditioning,IPC)已经被证实是机体一种内源性保护机制。非创性肢体缺血预适应(limb ischemic preconditioning,LIP)同样能为远隔组织提供相当于脏器原位IPC的保护程度[4]。本研究观察大鼠肝门阻断后脑皮层EAAs及其受体的改变,并探讨LIP预处理的作用,为减少术后神经系统并发症提供参考。
1 资料与方法
1.1 动物
健康雄性Wistar大鼠,体重200～250 g,中国医科大学盛京医院实验动物中心提供。室温20℃～27℃,湿度40.0%～60.0%,白天黑夜各12 h。
1.2 模型的制备
1.2.1 肝门阻断模型
常规消毒腹部正中切口入腹,离断肝周韧带以消除肝侧支循环。以Pringle法[5]用无损伤小动脉夹于肝十二指肠韧带处完全阻断门脉、肝动脉及胆总管,使全肝缺血,暂时关腹。30min后原路入腹恢复肝血供。观察肝及肠管血供复流良好后关腹。肝门阻断期间监测血压,必要时乳酸林格液扩容保持MAP不低于60 mm Hg。术毕腹腔内注入含青霉素20万u温生理盐水1 m L。保温至苏醒后归笼饲养。术后自主饮用100 g/L葡萄糖水,至预定时间点取材。术中失血量超过2 m L者弃用。
1.2.2 肢体缺血预适应模型
参考张连元[6]和KUNTSCHER[4]方案,大鼠右侧腹股沟处以弹力止血带环形捆扎下肢血流10 min后继以30 min再灌注建立LIP。
1.2.3 实验对象随机分成
假手术组(Sham组,n=8):经腹正中切口入腹,仅离断肝周韧带后关腹,6h后处死取材。肝门阻断组(HPO组,n=8):Pringle法阻断肝门30 min后复流再灌注,关腹6 h后处死取材。预适应组(LIP+HPO组,n=8):先建立LIP,继以HPO组处理,6 h处死取材。
1.3 实验取材
断头处死大鼠,消毒后以灭菌器械从枕骨大孔处剪开颅骨,取出大脑在-20℃冰玻上迅速分离脑组织,取约100 mg组织冻存液氮中待测RT-PCR。取约300 mg组织-70℃深低温冰箱冻存待测HPLC。取左侧大脑皮层约200 mg液氮冻存待测NMDAR2B蛋白定量。取小肠组织约1 g,部分在10%中性甲醛液中固定,其余组织-70℃冻存待测髓过氧化酶(MPO)活性。
1.4 观察指标和检测方法
1.4.1 模型生存率
计算6 h模型生存率。
1.4.2 小肠MPO活性测定
采用比色法。试剂盒由南京建成生物有限公司提供,按说明书进行操作。取肠壁组织约100 mg,加入5%溴化十六烷基三甲胺(Sigma公司)2 m L超声匀浆,4℃12 000 r/min离心20 min。取上清0.1 m L加0.167g/L邻联茴香胺二盐酸化物(Sigma公司)及0.0005%过氧化氢混合液2.9 m L。保持温度27℃,紫外分光光度计在460nm处记录1 min内吸光度的变化代表酶活力的改变。即用每分钟△OD/g表达MPO活性(27℃)。
1.4.3 组织学观察
肠标本置于10%中性甲醛液中固定过夜。常规取材、脱水、石蜡包埋、HE染色、切片、40倍物镜下观察并摄像。
1.4.4 皮层谷氨酸(glutamic acid,Glu)和天门冬氨酸(aminosuccinic acid,Asp)含量测定
Glu、Asp标准品购自SIGMA公司。高效液相色谱法(HPLC)-柱前衍生化-荧光检测测定。脑组织加无水乙醇0.5 m L冰台匀浆。4℃12 000 r/min离心30 min后取上清。柱前衍生化:0.1mL上清液加入100 m M异硫氰酸苯酯0.05 m L和1 M三乙胺0.05 m L,静止反应1 h,再加0.2 m L正已烷去脂,振荡静置10 min后取下层液过滤。色谱柱:十八烷基硅烷键结合硅胶为填充剂;柱温:36℃,进样量25μL。二元梯度脱水:流动相A:0.1N CH3C00Na:乙晴=97∶3;流动相B:乙睛∶水(4∶1);A∶B=97∶3,流速1.0 m L/min;检测波长:Σx:254 nm。单位以μg/gwt表示。
1.4.5 免疫蛋白印迹杂交(Western-blot)检测脑组织天门冬氨酶受体
(N-methyl-D-aspartate recep-tor,NMDAR)亚单位NR 2B的蛋白表达(1)取组织100 mg加Tris-HCL 4℃匀浆,5 000 r/min离心20min取沉淀。酚试剂法蛋白定量。(2)制作SDS-PAGE凝胶。(3)分别吸取待测样品加样。(4)将胶浸入转移缓冲液中水平摇床慢摇30 min。将凝胶贴于PVDF膜50 V转印2 h。(5)取出PVDF膜TBs浸泡10 min后脱脂奶粉封闭。加入1∶1 000稀释的一抗(兔抗大鼠NMDAR2B一抗,美国Biosouse公司)4℃过夜。取出PVDF膜,加入1∶3 000稀释的二抗,摇床上杂交1 h。(6)显影分析。碱性磷酸酶显色,拍照。自动电泳凝胶成像分析仪上分析结果。蛋白相对表达量=各组光密度值/S组光密度值×100%。
1.5 统计学处理
计量资料以均值±标准差表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。组间数据比较采用单因素方差分析。生存率的显著性差异检验采用χ2检验。P<0.05表示差异有显著性。
2 结果
2.1 模型生存率
扣除出血及吸入麻醉药过量死亡的,Sham、HPO以及LIP组的存活率分别为:100%、30.8%和58.8%。3组差异有显著性(P<0.05),见图1。
1)与Sham组比较,P<0.05;2)与HPO组比较,P<0.05
2.2 形态学
Sham组小肠结构正常。HPO组小肠黏膜表面糜烂,炎症渗出,PMN细胞聚集,可见血管内皮损伤。LIP组肠黏膜表面损害,PMN浸润,程度较HPO组略轻。
2.3 小肠组织MP O活性
注:1)与Sham组比较,P<0.01;2)与HPO组比较,P<0.05
和Sham组比较,HPO组和LIP组再灌注后肠MPO活性均显著增高(均P<0.01),其中LIP组增幅较少(P<0.01)。提示HPO再灌注后肠道组织PMN数量明显增加,LIP预适应能减轻PMN浸润程度,但是仍然高于Sham组,见表1。
2.4 皮层Glu和As p含量
Glu:和Sham组比较,HPO6h时升高显著(P<0.01),LIP组差异未见显著性(P>0.05);和HPO组比较,LIP组明显降低(P<0.05)。Asp:和Sham组比较,HPO6h时升高显著(P<0.05),LIP组没有明显差别(P>0.05)。LIP组和HPO组比较未见差异。总EAA:和Sham组比较,HPO组显著升高(P<0.01);LIP组差异不明显(P>0.05)。LIP较HPO下降明显(P<0.05),见表2、图2。
注:1)与Sham组比较,P<0.05;2)与Sham组比较,P<0.01;3)与HPO组比较,P<0.05
注:1)与Sham组比较,P<0.05;2)与Sham组比较,P<0.01;3)与HPO组比较,P<0.05
2.5 NMDAR2B蛋白表达
和Sham组比较,HPO、LIP组NR2B表达均增强(P<0.01,P<0.05);和HPO组比较,LIP组表达量减少(P<0.05)。提示HPO再灌注6 h后该蛋白表达增加,LIP处理能够降低表达,但是仍高于对照组,见图3、4。
3 讨论
Pringle法能完全阻断入肝血流,是临床应用的经典方案[5]。HPO不仅涉及肝脏本身IR损伤,同时还有肠道系统的损伤[1]。中性粒细胞(PMN)活化后通过释放活性氧和蛋白酶等毒性物质增加微循环通透性导致细胞功能破坏。肠道上皮黏膜中富含PMN,在再灌注后期对组织损伤有着明显的放大作用[7]。髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是PMN嗜天青颗粒中含量较高的酶,每一个PMN中所含的MPO相对恒定,所以组织中MPO活性的高低基本上可定量表达组织中PMN的数量[8]。实验结果显示虽然HPO模型中肝门仅阻断30 min,但再灌注6 h后肠道上皮组织中即见MPO活性增加,和光镜下组织PMN浸润程度一致。LIP组MPO活性升幅低于HPO组,提示LIP能减少PMN黏附与聚集,减轻肠道上皮的再灌注损伤。
EAAs及其受体激活后引发的细胞内Ca2+超载是神经损伤的最后共同通路[9]。NR2B是NMDAR2最主要亚单位,与神经细胞发育和神经毒性密切相关[10]。实验结果表明LIP对脑细胞有直接的保护作用,使HPO后皮层中EAAs含量升幅减少,同时下调了EAAs刺激下NMDAR的表达,提高皮层在病理条件下的伤害性耐受能力。KUNJAN[11]也观察到IPC可以减少EAAs的生物合成和释放,降低兴奋性减少神经损害。
肢体缺血预适应也是机体一种内源性保护机制,同样能为远隔组织提供相当于脏器原位缺血预适应的保护程度[4]。目前动物模型中以止血带法应用较多且效果最好[12]。张连元[6]以弹力止血带环扎阻断下肢血流可以建立成熟的肢体IR模型,KUNTSCHER[4]阻断10 min/开放30 min的LIP方案可以稳定建立对腹壁皮肤的预适应保护效应。实验结果显示LIP能够减少HPO再灌注后动物死亡,模型生存率由30.8%明显提高到58.8%。虽然HPO后脑损伤并不是主要死因,但实验中的超微结构观察表明LIP能减轻皮层细胞器等器质损害。
LIP的机制目前没有定论。研究认为可能是腺苷传递激活远隔脏器的腺苷A1、A3受体起作用,PKC-ε激活和线粒体K-ATP通道开放可能是其细胞内的信号传导通路[13]。从作用过程看可以分成早期阶段和延迟保护阶段,前者在再灌注后1～3 h,主要有腺苷等介质的即时释放并传递,后者在再灌注后12～24 h,则有新的蛋白表达[14]。本实验中LIP可以明显减少HPO后脑皮层细胞兴奋性氨基酸的堆积,同时减轻NMDAR的表达上调。由于EAAs-NMDAR是中枢神经损伤的最后共同通路,LIP对改善HPO后脑细胞损害有一定作用。实验表明其机制至少包括:LIP直接保护脑神经细胞,增加其对伤害性刺激的耐受[15];LIP还减轻了HPO后肝和肠道上皮细胞PMN黏附与聚集及活化对组织的损害,减少伤害因子的生成,间接作用保护脑细胞。
文献中评价LIP效应的经典指标是心梗体积和皮瓣坏死面积等。实验中通过EAAs-NMDAR及PMN浸润程度评价LIP效应。由于HPO后EAAsNMDAR改变缺乏明显线性关系,实验结果同样不能量化其效应。只是观察到LIP能减少皮层EAAs堆积-NMDAR表达增加这一现象,进一步的深入研究是必要的。但是从机制上看,LIP保护效应存在一定的理论基础;实验结果上看,能明显提高HPO后的生存率。提示LIP存在一定程度的全身性的保护效应,当然,脑也受惠其中,特别是在这种脑损害尚轻模型中。
肢体缺血再灌注 篇10
【摘 要】 目的：观察回药失荅剌知丸对大鼠脑缺血再灌注后脑组织中Fas及FasL表达的影响，探讨失荅剌知丸治疗脑缺血性疾病的机制。方法：SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知丸高浓度组，局灶性脑缺血再灌注模型制备成功后分别于12h、24h、72h取材，采用干湿重法测脑含水量，免疫荧光法观察Fas阳性细胞表达量，TUNEL和免疫组化法观察神经细胞凋亡情况及FasL表达的变化。结果：与假手术组相比，缺血再灌注损伤后脑含水量、神经细胞凋亡数量及Fas、FasL的表达明显增高（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，用药组各时段脑含水量、神经细胞凋亡数量及Fas、FasL的表达均减弱（P<0.05），以失荅剌知丸高浓度组的表达减弱显著（P<0.01）。结论：失荅剌知丸能够有效减轻脑组织水肿，抑制Fas、FasL的表达，其发挥神经保护的作用机制可能与抑制神经细胞凋亡有关。
【关键词】 失荅剌知丸；脑缺血；Fas；FasL
【中图分类号】R743 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）05-0073-04
Abstract：Objective： To observe the effect of expression of Fas and FasL in the hippocampus of ischemia-reperfusion injury rats brain tissue by taking Shida Lazhi Wan， and to explore Shida Lazhi Wan mechanism for the treatment of cerebral ischemic diseases. Methods： SD male rats were randomly divided into 6 groups： sham group，the ischemia reperfusion model group （hereinafter referred to as the model group），JinNaDuo group，Shida Lazhi Wan low concentration group， Shidalazhiwan medium concentration group，Shida Lazhi Wan high concentration group， After focal cerebral ischemia models were established，at 12h、24h、72h，neurons apoptosis，wet and dry weight measured brain water content， immunofluo-rescence techniques to measure Fas expression，TUNEL and immunohistochemical method to observe neuronal apoptosis and the change of FasL expression. Result： To compared with the sham operation group，after ischemia-reperfusion injury ， brain water、number of nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were significantly increased（P<0.01， P<0.05）；compared with the model group， every treatment groups brain water number、nerve cell apoptosis and Fas、FasL expression were recede （P<0.05），especially Shida Lazhi Wan high concentration group Reduce significantly （P<0.01）. Conclusion：Shida Lazhi Wan can ？reduce brain water effectively， inhibition of Fas and FasL express， its nerve protection mechanism may be related to inhibition of neural cell apoptosis.
Keywords：Shida Lazhi Wan；ischemia reperfusion；Fas；FasL
随着人口老龄化进程的加速，高血压、冠心病等相关危险因素的增加，脑血管疾病的发病率也逐年攀升，对人类的生命健康和生活质量造成了严重的威胁。其中，缺血性脑血管疾病最为常见，约占脑血管疾病的80%左右[1]。目前，临床上最常用的是在有限的时间内进行溶栓等治疗以达到恢复脑血管血液供应的目的，但有可能造成脑组织的进一步损伤，即脑缺血再灌注损伤。脑缺血再灌注损伤机制庞杂，相互交联，有研究表明，细胞凋亡在其发病进程中担任着至关重要的角色。细胞凋亡多发生于脑缺血急性期，主要出现在缺血半暗带区和对缺血缺氧敏感的海马、齿状回和大脑皮质[2]，神经细胞凋亡数量的多少决定着脑组织梗死体积的大小。细胞凋亡是一个有严格程序控制的可逆过程，因此，着力于调控其机制，限制其进一步发展，对减小脑梗死体积以及神经功能恢复等具有重大意义[3]。失荅剌知丸作为回医药治疗脑缺血性疾病的传统、经典方药，前期系列研究业也表明：失荅剌知丸可以调节细胞抗凋亡信号转导通路PI3K-AKT通路的活性，上调PI3K和AKT的表达，通过抑制促凋亡分子的活化，抑制神经细胞凋亡[4]。Fas/FasL 是目前研究较为清楚的死亡受体信号转导通路，在正常大脑中维持免疫抑制状态，当脑缺血发生后，Fas与FasL交联，参与并促进脑缺血再灌注所引起的脑组织损伤[5]。为进一步探讨失荅剌治丸保护缺血再灌注损伤脑组织的作用机制，笔者开展失荅剌治丸对大鼠脑缺血再灌注损伤脑组织FasL表达水平的实验研究，现报告如下。
1 材料
1.1 动物 SD大鼠，雄性，80只，SPF级，体重（280±50）g，购于宁夏医科大学实验动物中心，合格证编号：SCXK（宁）2011-0001，所有大鼠均在同一动物房内常规饲养3d后进行实验。
1.2 药物 失荅剌知丸（出自《回回药方考释》）：柴胡30g，黑诃子30g，芦荟60g，元胡6g，石菖蒲6g，番盐6g，药西瓜9g，松蕈9g，安息香9g，阿魏9g，砂糖15g，干姜3g，胡椒3g，荜拨3g，白芥子3g，芸香3g，巴豆9g，共计213g，以上所有药物切制、煎煮后放置于恒温水浴锅中分别浓缩至低浓度1.112 g/ml、中浓度2.223g/ml、高浓度4.446g/ml的药液，置于4 ℃冰箱备用。金纳多（银杏叶提取物，德国威玛舒培公司）临用前配制成1.04mg/ml的混悬液。
1.3 试剂 水合氯醛（批号：2636-4A，国药集团化学试剂有限公司，临用前配成浓度为10%的水合氯醛溶液）；兔抗大鼠Fas抗体（批号：BA0048）、兔抗大鼠FasL抗体（批号：BA0148）、山羊抗兔IgG（批号：BA1128）、浓缩型正常山羊血清（批号：AR1009）均为博士德生物公司产品。
1.4 仪器 FX4-2型电热恒温干燥箱（Shella公司）：BT224S 型电子天平（Sartorious公司）。
2 方法
2.1 分组及给药 80只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、金纳多组、失荅剌知丸低浓度组、失荅剌知丸中浓度组、失荅剌知丸高浓度组，后5组采用线栓法制备大脑中动脉阻塞-再灌注模型，并分为术后12、24、72h三个亚组，共16组，每组5只。SD大鼠给药量为1ml/100g，用药组分别给予相应药物，于造模前30min第一次灌胃，以后每天2次，直至取材；假手术组、模型组给予相应浓度的生理盐水。
2.2 模型制备 参照改良的Longa法[6]，利用线栓阻塞大鼠大脑中动脉，造成脑缺血2h后再灌注模型。10%的水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位，沿颈部正中线切开，依次钝性分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，将直径为0.24mm的线栓自颈外动脉小切口处插入至颈内动脉，直至感到轻微阻力，长度约为18±2mm，用手术缝合线将颈外动脉小切口和线栓尾端一起结扎，阻断血流2h后实行再灌注，待大鼠清醒后进行神经功能评分，评分≥2分者作为模型成功标准。假手术组钝性剥离颈内外动脉后缝合伤口。
2.3 取材 各组分别于术后12h 、24h、72h取材，10%水合氯醛过量麻醉大鼠，经心尖生理盐水冲洗，再换用4%多聚甲醛溶液进行灌注固定，取出全脑，切取缺血侧大脑海马区，常规石蜡包埋，余脑组织放于冻存管保存在液氮内。
2.4 脑含水量测定 采用干湿质量法测定缺血侧含水量，于各时间点麻醉大鼠，快速断头取脑，将待测脑组织滤纸擦去表面水分，称取湿质量后置于100℃电烤箱24h，称取干质量。脑含水量 =（m湿质量-m干质量）/m湿质量×100%。
2.5 脑组织病理学观察 待测脑组织切片后经HE染色，在光学显微镜下观察脑组织结构的变化。
2.6 TUNEL细胞凋亡检测 标本经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，严格按TUNEL检测试剂盒进行操作。以胞核内有棕黄色颗粒者为凋亡阳性细胞，在400倍镜下随机选取梗死灶周边五个不重叠的视野拍照并计数凋亡阳性细胞数，取平均数进行统计。
2.7 免疫荧光法检测Fas表达 待测脑组织经过常规包埋、切片、脱蜡、水化、抗原修复、复温、山羊血清封闭、滴加兔抗大鼠抗体、滴加山羊抗兔荧光二抗、封片、荧光显微镜下观察，假手术组对照使用PBS缓冲液代替一抗，余相同，所有步骤严格按照试剂盒说明操作。每个标本取 3 张切片，每张切片取3 个互不重叠部位，应用激光扫描共聚焦显微镜扫描（扫描参数：激发光波长488 nm，检测的发射光波长518nm），计数400×视野下荧光阳性细胞，取平均值。
2.8 免疫组化法检测FasL表达 标本切片为6mm，经常规二甲苯和梯度酒精脱蜡水化，枸橼酸钠缓冲液抗原修复，3% H2O2消除内源性过氧化物酶，滴加10%的山羊血清封闭1h，滴加一抗4℃冰箱过夜，阴性对照组加PBS缓冲液，次日取出37℃复温1h，PBS缓冲液冲洗3遍×5min，滴加二抗室温置放1h，DAB染色，PBS缓冲液冲洗3遍×5min，中性树胶封片，显微镜下观察。以胞质或胞核内有棕黄色颗粒者为阳性细胞，每张切片在400倍镜下随机选取梗死灶周边5个不重叠的视野拍照，并计数阳性细胞数，取平均数进行统计。
2.9 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，以均数加减标准差（x±s）表示，使用单因素方差分析法，P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 脑含水量测定 与假手术组相比，各组各时间点脑含水量均明显增高（P<0.01）；与模型组相比，各用药组各时间点脑含水量均明显降低（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中浓度及高浓度组脑含水量有不同程度的降低（P<0.05或P<0.01）；同组别72h相比，失荅剌知丸高浓度组减少更加明显（P<0.01）。见表 1。
3.2 病理学观察 假手术组大鼠脑组织神经元形态正常，大小均匀，排列整齐，层次分明；模型组大鼠神经形元态明显异常，大小不均，神经元皱缩，排列紊乱，层次不清，多数细胞核呈现三角形或锥形；失荅剌知丸低剂量神经元细胞较紊乱，多数皱缩变形，大小欠均匀；金纳多组及失荅剌知丸中浓度组大多数神经元形态欠规则，有皱缩现象，层次欠清晰，且各时间点神经元形态区别不明显；失荅剌知丸高浓度组大鼠大多数神经元形态正常，存有少量皱缩神经元，层次较清晰，且正常神经元比例随着用药时间的延长而增多，以失荅剌知丸组72h组较明显。
3.3 各组缺血侧海马区Fas表达比较 Fas蛋白主要位于神经细胞膜上，在本实验中标记为绿色，与假手术组相比，各组各时间点Fas表达均明显增高（P<0.01）；与模型组相比，各用药组各时间点Fas蛋白表达明显减少（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中剂量组各时间点FasL蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），失荅剌知丸高剂量组各时间点Fas蛋白表达有所减少（P<0.05），尤以72h组减少明显（P<0.01）。见表2。
3.4 对大鼠脑缺血再灌注TUNEL凋亡阳性细胞的影响 从表3看出，与假手术组比较，模型组及各用药组各时间点凋亡细胞数有显著增高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组各时间点凋亡细胞数有减少（P<0.05或P<0.01），以24h、72h凋亡细胞数减少尤为明显（P<0.01）；失荅剌知丸组24h、72h组凋亡细胞数明显少于金纳多组（P<0.01）。见表3。
3.5 对脑缺血再灌注大鼠缺血侧海马区FasL表达的影响 从表4可以看出，与假手术组比较，模型组及各用药组各时间点FasL蛋白表达明显增高（P<0.01）；与模型组比较，各用药组各时间点FasL蛋白表达明显减少（P<0.01）；与金纳多组比较，失荅剌知丸中剂量组各时间点FasL蛋白表达无显著性差异（P>0.05），失荅剌知丸高剂量组各时间点FasL蛋白表达有所减少（P<0.05或P<0.01），尤以72h组减少明显（P<0.01）。见表4。
4 讨论
近年来，国内外研究发现脑缺血再灌注损伤主要与兴奋性氨基酸、自由基损伤、血脑屏障破坏、炎症反应、细胞凋亡等机制有关[7-8]。这些机制彼此重叠，互为因果，相互联系，产生一系列快速级联反应，最终导致脑组织的损伤[9]。在这个复杂的过程中，神经细胞的凋亡被认为是脑缺血再灌注损伤的主要环节，因此调控神经细胞凋亡成为治疗缺血性脑病的关键所在。FasL在细胞凋亡中起着关键的作用。Fas被称为死亡受体分子，属于肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）/神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）受体家族，是促细胞凋亡的最重要分子之一。FasL作为Fas的天然配体与3个Fas 分子结合，促使死亡结 构域（DD）聚集后结Fas 的相关死亡结构域（FADD），进而通过引起Caspase 酶联反应致使细胞凋亡[10]。抑制因促凋亡系统Fas/FasL的激活而产生的生物学作用是发挥保护脑组织的关键环节[11]。已有大量研究发现中医药可以减轻脑缺血再灌注损伤后促凋亡因子的表达[12-13]。
失荅剌知丸出自《回回药方》，是防治脑血管疾病的经典方剂，由柴胡、黑诃子、芦荟、元胡、石菖蒲、药西瓜、阿魏、 安息香、干姜、胡椒、荜拨、白芥子、芸香等药组成，以芳香通窍，利痰化湿，祛寒通络为治疗原则，运用大量芳香药以加强血管通透性、增强药物透过血脑屏障[14]，治疗脑卒中后骨节疼痛，口眼歪斜，半身不遂等症状。研究结果显示，脑缺血再灌注损伤发生后，对缺血缺氧敏感的海马区脑含水量及神经细胞凋亡的数量迅速增加，于24h达到高峰，72h后下降。较模型组比较，各用药组脑含水量及神经细胞凋亡的数量均有所减少，但不同浓度的失荅剌知丸下调水平有所差别，以失荅剌知丸高剂量组效果明显，说明长期服用高浓度的失荅剌知丸可以通过抗凋亡以达到有效治疗和缓解脑缺血再灌注损伤后引起的脑组织损伤。Fas、FasL在脑组织缺血后，迅速表达促进了神经细胞凋亡，扩大了梗死体积，实验研究结果表明，不同浓度的失荅剌知丸较模型组相比，能够明显下调海马区Fas、FasL蛋白表达，较金纳多组相比，高剂量失荅剌知丸阻抑Fas、FasL蛋白表达作用更强。由此可见，失荅剌知丸可以通过降低Fas、FasL蛋白表达以减少神经细胞的凋亡，为临床回医药防治缺血性脑血管疾病提供了实验依据。
参考文献
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肾缺血再灌注损伤的研究进展 篇11
1 氧自由基与脂质过氧化
自由基是指电子轨道上有不配对电子的原子、分子, 包括氧自由基 (OFR) 系列如超氧阴离子 (O2-) 、羟自由基 (·OH) 、过羟自由基等和脂质自由基系列如烷自由基、烷基自由基、脂质过氧化物自由基等。氧自由基的形成可分为外源性和内源性。外源性主要是指能进行氧化还原反应循环的酮类、硝基类等物质。此外, 药物氧化、吸烟、电离、光照、热辐射冲击和氧化谷肤甘肤的物质、环境污染等外源性因素均能在细胞内形成自由基。内源性主要是指生物体内代谢过程中产生的自由基。正常状态下生物体的能量主要来自电子传递系统。在电子传递过程中, 分子氧完全还原成水的同时释放能量, 如果还原不完全则形成氧自由基。人体摄取的氧是接受线粒体内细胞色素体系传递的电子, 大部分接受四个电子还原成水, 其中仅有1%-2%的氧接受一个电子后漏出 (称为单价泄漏) 形成氧自由基。此时产生的氧自由基很少, 且组织细胞内的超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT) 、谷肤甘肤过氧化氢酶 (GSH--Px) 和髓过氧化物酶等能迅速清除氧自由基, 故组织细胞内不会出现氧自由基的堆积[5]。动物实验己经证实, 在细胞缺血的极早期, 细胞氧化磷酸化能力减弱, ATP合成减少, 离子泵功能部分失效, 特别是Na+-K+-ATP酶功能减弱, 使大量Na+内流, K+外流, 细胞膜电位下降, 产生去极化, 从而造成电压依赖性Ca2+通道开放, 大量Ca2+内流, 细胞缺血同时导致兴奋性氨基酸如 (谷氨酸、天冬氨酸等) 在细胞间隙的大量蓄积, 而后者又加剧Ca2+内流和细胞膜去极化, 导致细胞内Ca2+超载, 氧自由基增多, 其具体机理为: (1) 缺血后的肾脏血管内皮细胞以及中性粒细胞是产生氧自由基的主要细胞, 而在细胞中线粒体又是产生氧自由基的主要部位, 其中黄嘌呤氧化酶所催化的反应是氧自由基的主要来源。在电子传递链中复合物I脱氢酶 (NADH脱氢酶) 和复合物I I I (辅酶Q-细胞色素C还原酶) 是氧自由基产生的主要位点。肾缺血时由于缺乏相关的原料物质和氧气, 线粒体氧化磷酸化脱藕联, 辅酶Q循环中不稳定的中间产物半醌阴离子可以快速而且非酶性催化地将单电子直接传递给O2, 致使经单电子还原生成超氧阴离子 (O2-) 增多, 而经接受4个电子与4个氢离子还原生成水减少, 同时在这种病理条件下, 细胞内PH值降低, O2-更容易岐化成H2O2。同时肾脏组织中存在着黄嘌呤氧化酶, 它在细胞内以黄嘌呤脱氢酶 (D型) 的形式合成, 正常情况下D型占总活性的90%以上, 次黄嘌呤在分子氧的参与下经黄嘌呤氧化酶催化生成尿酸和大量的氧自由基[6~7]。而此时, 肾脏组织细胞内的SOD, CAT, GSH-PX等氧自由基清除剂由于在缺血缺氧状态下生成减少、活力下降, 不能有效的清除氧自由基, 导致肾脏组织内氧自由基的大量堆积。 (2) 细胞内的Ca2+增高, 激活磷脂酶C和A2, 分解膜磷脂产生大量花生四烯酸 (AA) , 后者进一步分解, 不饱和脂肪酸经前列腺素合成酶催化生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或磷酸烟酰胺腺嘌呤二核昔酸, 此过程中生成大量氧自由基;细胞内Ca2+超载, 激活Ca2+依赖的蛋白激酶, 使黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶, 同时肾缺血时ATP的降解产物次黄嘌呤和黄嘌呤增多。在黄嘌呤氧化酶作用下, 次黄嘌呤转变为黄嘌呤进而转变为尿酸。这两步反应中, 都以O2为电子受体产生大量O2-和H2O2。 (3) 再灌注时由于细胞中线粒体破坏殆尽, 不能利用氧进行有氧氧化产生ATP, 血液再灌注突然带入的氧一方面在黄嘌呤氧化酶的作用下产生O2-, 另一方面使缺血期因氧耗竭而停滞的烷自由基向脂质过氧化物自由基反应得以延续, 产生新的自由基, 进一步攻击不饱和脂肪酸[8]。此外, 再灌注带入的Ca2+可提高黄嘌呤氧化酶的活性, 促进O2-迅速转化为·OH, 重新激发自由基连锁反应, 造成更多的损害。自由基具有很高的化学活性, 可快速攻击其他化合物的分子并产生更多的自由基, 自由基破坏膜结构中蛋白成分、引起膜脂质过氧化, 导致膜损伤、线粒体功能障碍、溶酶体破裂、细胞溶解和组织水肿等一系列损害作用, 称之为自由基连锁反应。近年来大量研究证实, 自由基连锁反应是导致肾缺血再灌注损伤的主要原因[9], 其具体损伤机制可概括为: (1) 对生物膜的损害。生物膜包括细胞膜、线粒体膜和溶酶体膜等, 内含有丰富的多不饱和脂肪酸, 氧自由基因为具有极强的氧化活性, 极易攻击多不饱和脂肪酸生成多种脂质过氧化物, 导致生物膜多不饱和脂肪酸蛋白质比例失调, 生物膜的流动性下降和通透性增高[10~11], 进而造成生物膜的功能障碍。细胞膜受损后细胞肿胀, 细胞完整性破坏, 功能部分或全部丧失。线粒体膜受氧自由基攻击后发生肿胀、溶解、ATP合成障碍。溶酶体受攻击后出现溶酶体溶解破裂, 引起细胞自溶。由于线粒体是产生氧自由基的主要细胞器, 所以线粒体膜较细胞膜和溶酶体膜受损更严重。 (2) 自由基增加引起的核酸损伤 (Oxydative DNA Lesions, ODL) , 可以导致DNA链的断裂、交联导致细胞正常功能受损, 最终细胞死亡。其可能的方式为:自由基攻击核酸碱基, 造成碱基的化学修饰;攻击核糖与碱基之间的糖苷键, 形成无嘌呤无嘧啶位点;攻击核糖与磷酸基团之间的磷酸键, 形成带有3'-OH末端或3'-磷酸末端的DNA断裂片段:攻击核糖, 形成3'-磷酸糖基末端;氧自由基可以导致DNA链间或DNA与蛋白质之间产生交联。 (3) 氧自由基可诱发细胞凋亡, 其途径可能有以下两条:氧自由基可导致细胞内线粒体、内质网膜Ca2+迁移和质膜Ca2+-ATP酶活性下降或失活而导致细胞浆内Ca2+浓度升高。激活Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶, 导致DNA链的断裂。从而触发细胞凋亡。氧自由基可以影响与细胞凋亡有关的基因表达[12,13]。
2 Ca2+超载 (Calcium Overload)
细胞内Ca2+作为第二信使、代谢调节因子和膜稳定剂参与细胞膜生物电和胞内生化过程, 对修复基因转录核蛋白磷酸化和细胞凋亡过程均有影响, 在细胞正常机能活动中起重要作用。生理情况下, 细胞内的游离Ca2+浓度很低, 只有细胞外的1/10, 这依赖于细胞膜对Ca2+相对无通透性及细胞对Ca2+的主动排出来维持, 后一过程需消耗能量。多种转运系统参与了细胞的调节, 现己证实肾小管上皮细胞膜和细胞质内均存在钙的转运系统, 早期研究证实肾缺血再灌注损伤时可出现大量Ca2+内流, 且Ca2+内流的出现主要发生在恢复再灌注时。肾缺血后, 肾小管上皮细胞内Ca2+浓度明显升高, 从而使细胞内磷脂酶活力增加, 更多磷脂酶分解为游离脂肪酸, 另外Ca2+浓度增加使Ca2+-ATP酶活力增加, 从而消耗了更多ATP, Ca2+本身又可通过氧自由基途径造成组织损伤。缺血后再灌注期细胞内钙的变化与氧自由基的产生不同, 再灌注早期比缺血期有所减少, 这可能是与使Ca2+-ATP酶的活性一定程度恢复有关, 再灌注后期逐渐增高, 这可能是由于细胞膜结构的破坏所致。细胞内Ca2+超载的原因有以下几点: (1) 当肾缺血、缺氧时, 细胞氧化磷酸化能力减弱, ATP合成减少, 离子泵失效, 特别是Na+-K+泵功能的降低, 使大量的Na+内流, K+外流, 细胞膜电位下降产生去极化, 从而造成电压依赖性钙离子通道开放, 大量Ca2+内流; (2) 细胞缺血时, 由于K+和蛋白激酶C等作用, 兴奋性氨基酸、内皮素和NO等物质释放增多, 可使受体依赖性Ca2+通道开放, 也使大量Ca2+内流; (3) 胞内Ca2+增加, 可激活磷脂酶, 产生甘油二醋、前列腺素、三磷酸肌醇等物质, 协同兴奋性氨基酸代谢型受体激活配体操控性钙离子通道 (Recpter Operatedea Ca2+Channels, ROCC) , 使细胞内质网储存的Ca2+释放, 造成Ca2+超载; (4) 肾缺血、缺氧时, 产生大量的自由基, 使膜脂质过氧化, 损伤了脂质膜, 影响膜的通透性及离子转运, 引起Ca2+内流。钙超载主要是通过以下环节参与缺血再灌注损伤: (1) 激活膜结构中的钙依赖性磷脂酶, 破坏膜结构; (2) 干扰线粒体的氧化磷酸化偶联, 使能量代谢发生障碍; (3) 改变微管微丝的收缩作用和结构, 破坏细胞骨架, 最终导致细胞损伤; (4) 引发细胞调亡, 可能的机制:钙超载后激活Ca2+依赖性的核酸内切酶, 从而使双链DNA在核小体连接部位裂解, 形成DNA分块;钙超载可激活蛋白酶C, 使G蛋白磷酸化, G蛋白减少, 胞内CAMP增加, 导致细胞凋亡。钙超载与氧自由基的产生是肾IRI的重要因素, 二者相互影响, 协同作用, 导致肾IRI加重。细胞内产生过量的氧自由基可直接损伤细胞膜, 导致细胞膜通透性增加, Ca2+内流。而细胞内Ca2+浓度增高, 又可激活Ca2+依赖性蛋白酶, 后者可催化黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶, 而黄嘌呤氧化酶在有氧条件下能促进次黄嘌呤分解为尿酸的同时产生大量的氧自由基。
3 激素、免疫调节
恢复缺血肾组织的血供后.常发现局部仍无血流经过, 产生这种无血流现象的机制目前认为系激素与免疫分子的作用导致肾微循环障碍、细胞肿胀等引起。激素主要有内皮素 (ET) 、儿茶酚胺、肾素-血管紧张素、前列腺素和一氧化氮等。ET、儿茶酚胺、血管紧张素Ⅱ等主要是通过收缩肾小动脉、降低肾小球滤过率发挥对肾功能的损害作用。实验发现ET与其受体亲和力随再灌注时相的延长而增加;ET受体拮抗剂可明显增加肾缺血再灌注后的肾皮质血流, 减轻肾功能损害及组织学改变。改善GFR。一氧化氮是左旋精氨酸 (L-arginine) 在一氧化氮合成酶 (NOS) 的作用下合成的。研究发现, NOS分为两大类, 即原生型NOS (constitutive NOS, CNOS) 和诱生型Nos (inducible Nos, i Nos) [14~15], NO在肾脏中的作用有直接和间接两种, 前者由c NOS介导, 而后者由i NOS介导[16~18]。肾缺血再灌注后, i NOS的表达上调, 使NO产生增加, 当肾局部NO浓度过高时, NO的间接作用 (即毒性作用) 表现明显, 从而对肾脏造成损伤。
4 细胞凋亡
鲍磊[19]研究显示证实神经细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤中起十分重要的作用, Chatterjee等[20~21]发现肾IRI能激发较为广泛的细胞凋亡现象, 其病理变化主要表现为皮髓质交界部的肾小管发生细胞凋亡, 细胞凋亡在再灌注12h后逐渐下降, 至再灌注72h时尚可见到无核物质的凋亡小体, 最终被再生的肾小营上皮挤入管腔而排出, 并非被巨噬细胞吞噬清除。由此认为肾小管上皮凋亡是缺血再灌注后引起肾小管上皮细胞死亡的一个重要原因, 以控制肾小管上皮细胞的过度增殖.尽可能保证肾小管管腔免于堵塞而处于开放状态。