局灶性脑缺血模型

局灶性脑缺血模型（共7篇）

局灶性脑缺血模型 篇1

实验室动物研究已取得较大的进步, 大鼠是公认的建立脑缺血模型的首选动物之一, 其生命力强, 造模后不易死亡, 大脑结构与人类相似。随着科学技术的进步, 造模的方法亦不断改进, 现将造模过程中出现的问题及笔者总结的方法与体会报道如下。

1术前准备

1.1 大鼠选择

一般选择SD大鼠, 其大脑动脉环 (Willis环) 解剖结构相对稳定, 变异较少。体质量一般为250～300g, 级别为清洁级以上的精壮大鼠, 购买回来后严格按照规则适应性饲养1周。

1.2 动物麻醉

根据文献的报道及实验室的实际操作对比, 用10%水合氯醛4ml/kg腹腔注射可达到较满意的麻醉效果。实践证明麻醉前不必禁食, 因大鼠无呕吐反应, 不用担心胃内容物反流阻塞气管而窒息死亡。

2模型的建立

2.1 历史沿革

Koizumi等[1]于1986年首次采用颈总动脉插入尼龙线栓建立大脑中动脉闭塞模型并获得成功。Longa等[2]于1989年将其方法改进, 即每只大鼠按400mg/kg体质量腹腔注射三氯乙醛进行麻醉, 将30mm的4-0尼龙线栓的一端用酒精灯烧灼至钝圆, 从颈总动脉分叉处远端插入至颈内动脉管腔约17～18mm, 至有阻力感为止, 缺血诱导120min后抽出线栓进行再灌注, 最后将其放回鼠笼并密切监视其麻醉苏醒清况。后来学者多按其方法造模。

2.2 个人方法

本实验室采用Liu等[3]改进的大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血大鼠模型, 10%水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉, 固定后颈部正中消毒, 然后做一长约2.5～3.0cm的切口, 钝性分离出右侧颈总动脉, 在其远心端分叉处分离出颈内动脉和颈外动脉。结扎颈总动脉和靠近气管的颈外动脉, 然后在颈总动脉分叉处近心端作一小切口, 将一段一端钝圆的4～0尼龙线由颈总动脉插入至颈内动脉, 感觉到有轻微阻力为止, 大约进入 (17.0±0.5) mm, 然后结扎固定, 缝合切口。手术过程中室温保持在20～30℃并使用加热垫或灯光照射, 术后将动物放入清洁的饲养盒中, 自由饮食活动。

2.3 其他方法

Katsunori等[4]用原创的“四血管闭塞法”建立大鼠脑缺血模型, 戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉, 用双极电凝器电烙双侧椎动脉, 暴露双侧颈总动脉, 用液压血管封堵器将其闭塞, 使脑血液循环中断10min, 麻醉苏醒后出现右侧肢体扶正反射。Oh等[5]建立短暂局灶性脑缺血模型, 用含2.5%乙醚的N2O和O2 (70∶30) 的混合气体将大鼠麻醉, 颈部正中切口, 暴露右侧颈总动脉, 将一段钝头涂有硅的4～0尼龙线从分叉处插入右侧大脑中动脉, 大脑中动脉阻断 (MCAO) 2h后抽出线栓进行再灌注, 以严重左侧偏瘫和右侧Horner征作为模型标准。另外还有光化学诱导法、栓塞法等。

3模型的评定

3.1 Longa分级评分法

Longa等[2]用五级评分标准在大鼠MCAO造模苏醒后24h进行神经系统指征评定, 0级:行为无明显变化, 0分;1级:左前肢屈曲, 左后肢伸展, 1分;2级:有左侧追尾现象, 2分;3级:行走困难, 摇摆不定, 3分;4级:无自发性活动, 有意识障碍, 4分。将第1、2、3级大鼠确定为成功模型, 分值越高, 说明动物行为障碍越严重。

3.2 红四氮唑 (TTC) 染色法

TTC是脂溶性光敏感复合物, 用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。将大鼠断头取脑后放入-20℃冰箱速冻25～30min, 取出后切片, 一般切成5～6片, 每隔2mm一片。切片部位在与后叶尾极之间。将切片置于2%TTC中, 放入37℃水浴箱中20～30min。MCAO模型成功的标志之一是大脑中动脉供血区的梗死, 即TTC上皮质及纹状体和部分海马梗死。

3.3 其他

动物苏醒后表现为提尾时左前肢内收屈曲;同侧Horner征;爬行时向左划圈;站立时向患侧倾倒。凡具有上述4项体征者即可评定为研究对象。

4问题与展望

大鼠局灶性脑缺血模型已经应用到多项实验研究当中, 如干细胞的研究、缺血性脑卒中的治疗等, 较熟练的掌握造模技术, 不但可节省实验时间, 而且还可降低大鼠的死亡率、节约科研经费等。在造模操作中会遇到种种问题与困难, 如线栓插不进去、死亡率高等, 插线的深度一定要掌握好, 一般线栓进入颅内的深度为6～11mm, 插入太浅大鼠无反应, 造模不典型、不成功;插入太深, 则会插破大脑血管, 导致大鼠蛛网膜下腔出血 (SAH) , 容易引起死亡, 同样也是造模不成功。造模后70%的大鼠都会有症状, 如无症状则应考虑线栓的粗细是否合适, 插入的深度是否合乎要求。偶而也有线栓插不进去的时候, 多由动脉未分离好或操作不熟练引起, 应继续分离颈内动脉后将线栓重新插入并多加练习反复操作。经过多次对比实验, 将线栓用蜡涂一层会明显降低模型的死亡率, 这样可避免划破血管。这就需要实验研究人员不断的去改进和创新实验方法。总之, 要熟练掌握并运用造模技术, 造出符合标准的局灶性脑缺血大鼠模型, 为下一步实验研究打下基础。

关键词：大鼠,脑缺血, 局灶性,实验模型

参考文献

[1] Koizumi J, Yoshida Y, Nakazawa T, et al.Experimental studies of ische-mic brain edema.Anewexperimental model of cerebral embolism in ratsin which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Jpn JStroke, 1986, 8:1-8.

[2] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al.Reversible middle cerebral ar-tery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke, 1989, 20 (1) :84-91.

[3] Liu BY, Cai GX, Liu W, et al.Effect of Buyang Huanwu decoction on vascular endothelial growth factor and its receptor Flkl in rats after focal cerebral ischemia[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2007, 38 (3) :394-397.

[4] Katsunori I, Nobuaki E, Yuki T, et al.Nilvadipine prevents the impair-ment of spatial memory induced by cerebral ischemia combined withβ-amyloid in rats[J].Biol Pharm Bull, 2007, 30 (4) :698-701.

[5] Oh JK, Hyun SY, Oh HR, et al.Effects of anemarrhena asphodeloides onfocal ischemic brain injury induced by middle cerebral artery occlusionin rats[J].Biol Pharm Bull, 2007, 30 (1) :38-43.

局灶性脑缺血模型 篇2

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年清洁级Wistar大鼠36只,雄性,鼠龄8月龄,营养良好,体重(280±20) g,由内蒙古大学实验动物中心提供(许可证号:SCXK(蒙)2002-0001)。利用随机数字表将大鼠分为单纯梗死组12只、梗死后2 h再灌注组12只、对照组12只(假手术组)。

1.2 线栓的制作

取直径0.26 mm日本产钓鱼线,打磨掉其头部的棱角,蘸熔化硬蜡(熔点在60 ℃以上),在需要长度(距头端20 mm)处标记,将此线浸泡消毒,临用前用无菌生理盐水浸泡,再将头端浸于无菌37 ℃肝素盐水中备用。

1.3 动物麻醉及消毒

乙醚诱导麻醉后腹腔注射10 %水合氯醛0.3 mL/100 g复合麻醉,背部皮下注射阿托品抑制粘液腺分泌。手术器械消毒备用,动物手术部位去毛并无菌处理,手术过程严格无菌操作。

1.4 手术步骤

(1)颈前正中切口,分离右侧颈总动脉(CCA)及颈外动脉(ECA)并暴露CCA分叉及颈内动脉(ICA)起始端,ECA以1号手术缝合尼龙线结扎;(2)距分叉1.5 cm处结扎CCA;(3)ICA下穿“线夹”(即穿线两头交叉不打结,用两把止血钳牵拉)暂时夹闭ICA以防止血液逆流出血;(4)在CCA结扎线与分叉之间备线打单结,避免碰到颈动脉窦,在CCA备线近心侧剪一小口穿入线栓,待线栓头端至ICA起始端被“线夹”挡住不能进入,此时打紧CCA备线单结,松开“线夹”,继续穿线栓入ICA(图1)[2];(5)线栓穿入方向为向头端偏内侧,这样可避免穿入翼颚动脉(如误入翼颚动脉处理见后),至线栓标记到分叉处时感穿线栓有阻力即插线栓成功;(6)进一步打紧CCA备线结扎紧线栓,以防不慎将其拔出或进一步插入导致不良后果,线栓在CCA外露约1.0 cm即可;(7)再灌注组于术后2小时再次麻醉打开切口,直视下抽出线栓约1 cm。假手术组只结扎CCA不导入线栓。

术中注意事项:(1)操作轻柔避免损伤过多组织,严格无菌操作。(2)清楚地分离血管和神经,避免损伤和结扎神经。(3)误入翼颚动脉时的判断:不能顺利插入线栓至标记,转动线栓有阻力,线栓尾端向内偏;处理及注意事项:退出线栓头端至ICA入口时重新插入;总插线过程时间不宜过长,以防动脉血栓形成。插线不宜用力过猛,防止穿破血管造成蛛网膜下腔出血。

1.5 术后评分

术后2 h动物麻醉苏醒后进行评分,参考经典的Zea Longa法(5级4分法)[3]。0分:无神经功能缺损症状;1分:轻微神经功能缺损,不能完全伸展对侧前爪;2分:中度局灶性神经功能缺损,向对侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损,向对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识水平下降。2～4分为模型成功并入组继续后续试验;严重意识障碍者和少于2分者弃去并重新补入成功模型制备动物,继续后续试验。

1.6 观察终点及取脑

于插线栓进入大脑中动脉为计时起点,24 h时取脑。取脑采用两种不同的方法。

1.6.1 麻醉后断头冰浴取脑法

大鼠腹腔注射10 %水合氯醛0.4 mL/100 g深麻醉,用大鼠断头器迅速断头并将其置预先准备的冰盘内降低温度,尽快减少脑的热缺血时间,在冰浴中快速开颅,结合大鼠颅骨的结构(图2)[4],剪掉颅骨表面的皮肤和肌肉组织,用咬骨钳咬开枕骨大孔及枕骨,暴露出脑干和小脑以及两块顶骨的后缘,用钳夹每侧顶骨后缘向两侧搬开顶骨,暴露两侧大脑半球,然后用咬骨钳咬掉两侧颞骨及部分额骨大部分,露出脑组织。用眼科剪将脑干小脑侧颅神经剪断并剪开硬脑膜,轻轻撬起脑干再剪断颅底三叉神经和视神经将整个脑与颅底结构分离,最后剥离嗅脑并取出完整脑,置入4%多聚甲醛缓冲液继续固定。

冰浴取脑注意事项:速度要快;操作轻柔,取脑过程尽量保护脑组织不被挤压和切刺伤;剪开硬脑膜要彻底,避免硬脑膜牵拉损伤脑组织,如果硬脑膜与颅骨粘连要更加小心。

1.6.2 4 %多聚甲醛缓冲液心脏灌注取脑

灌注液配制方法:称取40 g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500～800 mL蒸馏水置加热至60 ℃水浴锅内,持续搅拌使粉末完全溶解,需加少量的NaOH才能使溶液清亮。待多聚甲醛完全溶解液体清亮后,称取并加入NaH2PO4·2H2O 2.964 g、Na2HPO4·12H2O 29.012 g,搅拌至完全溶解,将液体倒入量筒,加蒸馏水定容至1 000 mL并调pH值为7.4,4 ℃保存备用。

灌注取脑具体步骤:大鼠腹腔注射10 %水合氯醛0.4 mL/100 g深麻醉,固定于大鼠手术台,依次剪开左前胸皮肤、肌肉,暴露肋骨,在胸骨左缘剪断肋骨,拉开胸腔露出搏动的心脏,辨别左右心室(暗红色为右心室粉红色为左心室),用连接有生理盐水静脉输液器(已排尽空气)的9号注射针头在心尖部穿刺入左心室,灌注生理盐水200 mL,冲出血液后灌注4%多聚甲醛缓冲液约300～400 mL,灌注时见大鼠四肢抽动、尾巴翘起、头后仰,最后整个身体强直僵硬。整个过程需要1 h左右。灌注完毕取脑(方法同前)。整个灌注取脑过程须在通风厨或有换气扇的实验室进行。

灌注取脑注意事项:配置灌注液时最好待多聚甲醛完全溶解后加入NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O,否则会有部分多聚甲醛残留不溶,需用过滤才能除去。穿刺注射针头一定要入左心室,否则灌注将不成功;灌注前一定要排尽输液器内空气,否则可造成气体栓塞影响灌注固定效果;灌注完毕取脑亦宜在冰浴中进行。

2 结果

2.1 术后评分

用SPSS15.0软件对单纯梗死组、再灌注组、假手术组术后评分进行组间独立样本t检验,结果再灌注组评分高于单纯梗死组,差异有统计学意义(P<0.05)。单纯梗死组、再灌注组评分均高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.01)。详见表1。

2.2 常规病理观察

将对照组的12只大鼠随机分为3组,进行同一灌注液不同灌注时间对脑组织病理改变影响的观察。

2.2.1 非灌注组

采用冰浴直接断头取脑然后整块脑组织浸泡入灌注液的方法。取材后肉眼观察,见脑组织呈红色,表面有血迹,质软;HE染色光镜观察,见大脑皮质神经细胞胞体大,核大、核呈三角形,核仁浓缩;海马锥体细胞1、2、3、4区神经细胞结构基本清楚,神经细胞变性、坏死严重,血管周围间隙不大,未见水肿液,见图3。皮质下脑白质及核团神经组织形态改变较重,细胞小、有固缩,核呈三角形、条形,核仁浓缩。见图4。

(左)海马锥体细胞1、2、3、4区神经细胞结构基本清楚,神经细胞变性、坏死严重(↑),血管周围间隙不大,未见水肿液;(右)皮质神经细胞胞体大,核大、核呈三角形,核仁浓缩(▲);HE×100

左侧为损伤严重的皮质下脑白质神经细胞,细胞小、有固缩,核呈三角形、条形,核仁浓缩(↑);右侧为大脑皮层神经细胞,皮质神经细胞胞体大,核大、核仁清楚(↑);HE×100

2.2.2 短期灌注组

采用心脏穿刺快速灌注20 min,其中生理盐水灌注50～100 mL,4 %多聚甲醛缓冲液灌注150 mL,然后断头在冰浴中取脑,然后整块脑组织浸泡入灌注液的方法。取材肉眼观察,见脑组织呈苍白色表面无血迹,质稍硬;HE染色光镜观察,见皮质神经细胞胞体大,核大、核仁清楚;海马锥体细胞1、2、3、4区神经细胞结构较清楚,未见变性、坏死,血管周围间隙不大,未见水肿液。皮质下脑白质及核团神经组织结构自溶改变较轻,偶见细胞小、核固缩。见图5。

海马锥体细胞1、2、3、4区神经细胞结构基本清楚,偶见变性、坏死细胞(↑);HE×100

2.2.3 长期灌注组

方法同短期灌注组,但是灌注时间延长到1 h,其中生理盐水灌注200 mL,4 %多聚甲醛缓冲液灌注400 mL,断头在冰浴中取脑,然后整块脑组织浸泡入灌注液的方法。取材肉眼:见脑组织呈苍白色表面无血迹,质硬;HE染色光镜检测基本同短期灌注组,只是皮质下脑白质及核团结构保护较前明显完整。见图6。

海马锥体细胞1、2、3、4区神经细胞结构较清楚,未见变性、坏死(↑);HE×400

3 讨论

目前,研究缺血性脑损伤的主要途径是选择不同种属的动物通过不同的手段来建立脑缺血动物模型,再通过相应的干预手段研究缺血后的病理生理改变以及治疗措施的效果。在各种实验动物模型中,大鼠的脑血管与人脑血管最为相似,均由颈动脉和椎基底动脉系统共同构成脑底动脉环,再发出分支完成脑供血。由于应用大鼠制备脑缺血模型具有费用低廉、操作方便、动物耐受性好等优点,因此,大鼠是建立脑缺血模型的最适宜动物,在缺血性脑损伤研究中被广泛应用。经过几十年科研工作者的不断努力,脑缺血动物模型的制备已渐成熟。大鼠脑缺血模型的制作方法很多,目前在实验中应用最多的是线栓法。

关于大鼠大脑中动脉脑缺血动物模型的制备方法的研究比比皆是,但是作为实验研究有的规范操作起来不大可行,如廖维靖等[5]所述,模型建立条件要求很高,而且要求术者有相当的熟练程度,这些是在国内普通实验室难以达到的。如何完成这类实验的模型建立已成为同行者面临的课题。1984年国际脑血管病委员会对此类动物模型提出了明确的手术和设计要求,手术方式要避免颅内组织暴露以减少脑部手术性损伤,即避免破坏颅内内环境的稳定性,模型设计单根血管可重复阻滞;阻滞血管引起的改变可从血流变化等方面进行观察;避免在血管阻塞期间使用巴比妥盐,利于观察神经功能障碍,同时可避免巴比妥盐的神经保护和影响血流的作用;尽量模拟人类病变;可再通的阻滞血管,需恢复60 %的再灌注。结合以上标准我们认为建立可信模型的关键是要有标准、科学的对照,通过实验研究发现,合理的对照和较大的样本量基本上可以控制好模型的质量。所谓的规范也只能是高级实验室的经验和体会,只能用来参考。通过预实验的手术训练,我们设计前文所述的分组方法,从大鼠神经功能缺损评分研究认为再灌注组的评分高于单纯梗死组,与蒋大海等[5]的研究一致。通过实验过程,我们将每个步骤的注意事项记述如上,与同行共勉。

关于模型建立后的灌注取脑问题前人研究甚少,可能在早期的病理学研究中涉及到。大多数人认为脑组织需要固定液灌注后取材以最大程度地保护结构不被自溶所破坏。但是,很多研究的灌注时间和灌注方法不尽相同。我们参照文献报道、免疫组化检测对组织固定的要求以及陈钟和等[6]的灌注方法后稍作改进,并设计了不同灌注方法的对照研究,结论如下:非灌注组组织结构保留差;短期灌注组脑组织结构保留基本良好,与长期灌注组相比稍差,研究皮层和海马结构损伤基本可以满足;长期灌注组结构保留最好,但是耗时长、固定液用量大,致使试验进度慢等缺点不容忽视。我们推荐,对皮层和海马缺血再灌注损伤研究选择短期灌注取脑尚可满足需要,深部脑白质及核团缺血再灌注损伤研究还是要用长期灌注固定取脑法,或者在取脑后立即根据实验取材要求将脑切成块再浸泡入固定液充分固定。

摘要：目的:研究Wistar大鼠大脑中动脉脑缺血动物模型的规范制备方法和不同灌注方法灌注取脑的对照研究,总结关键环节和注意事项。方法:结扎颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA),不结扎翼腭动脉,用适当粗细的鱼线从CCA盲插入颈内动脉(ICA)直到阻断大脑中动脉,拔出再灌注;规定时间4%多聚甲醛缓冲液心脏灌注取脑。结果:造模成功率高,造模动物临床表现典型;非灌注固定取脑,脑组织结构保留差;短期灌注固定取脑较好保留皮层和海马结构,但深部白质及核团结构保留差;长期灌注固定保留结构都好,但耗时长,固定液用量大,进行脑深部白质及核团结构研究效果好。结论:本模型制备方法易操作,注意事项详细,可信度高;研究皮层和海马缺血再灌注损伤选择短期灌注固定取脑尚可满足需要,如需研究深部白质及核团结构尚需长期灌注固定取脑。

关键词：缺血再灌注损伤,动物模型,脑

参考文献

[1]Koizumi J,Yoshida Y,Nakazawa T,et al.Experimentalstudies of ischemic brain edema.A new experimentalmodel of cerebral embolism in rats in which recirculationcan be introduced in the ischemic area[J].Jan J Stroke,1986,8:1-8.

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[3]Zea Ionga E,Weinsten PR,Carlson S,et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusion without craniectomyinrats[J].Stroke,1989,20:84-91.

[4]杨安峰,王平.大鼠的解剖和组织[M].北京:科学出版社,1995:7.

[5]蒋海山,陆兵勋.线栓法大鼠缺血/再灌注脑损伤模型的改良[J].第一军医大学学报,2004,24(10):1156-1159.

局灶性脑缺血模型 篇3

关键词：川芎嗪,白细胞,免疫,脑缺血,大鼠

免疫参与缺血性脑损伤,多形核白细胞/单核巨噬细胞在缺血早期即出现,影响着脑梗死的发展和预后[1], 川芎嗪(Lig)为植物川芎的主要有效成分之一,属于酰胺类生物碱,化学结构为四甲基吡嗪(TMP),临床主要用于治疗急性心脑血管疾患,具有保护血管内皮和抑制平滑肌细胞增殖的作用和抗炎作用[2],本实验旨在研究脑缺血时白细胞的变化及Lig预处理对其的影响,探讨脑缺血的免疫机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制备

雄性SD大鼠80只,200 g～250 g,分为缺血组、小剂量川芎嗪组(术前3 d腹腔注射盐酸川芎嗪注射液10 mg/kg,每日1次)、大剂量川芎嗪组(术前3 d腹腔注射盐酸川芎嗪注射液50 mg/kg,每日1次)。第3次注射后30 min采用周锡英等[3]方法制作大鼠单侧局部脑梗死模型,20%乌拉糖(100 g体重0.6 mL)腹腔注射麻醉,左侧卧位固定于手术台上,于右眼外眦距外耳道连线中点,垂直切开皮肤及颞肌,暴露颞骨,齿科钻开颅,手术显微镜下切开硬脑膜,暴露大脑中动脉主干,用双极电凝器烧灼大脑中动脉主干,完全阻断血流,逐层缝合肌肉及皮肤。在缺血后12 h、24 h、3 d、7 d、10 d分别麻醉动物,4%多聚甲醛经左心室灌注固定,断头取脑,在大脑中动脉供应区,取下厚约0.6 cm 的冠状脑片,常规石蜡包埋、切片,用于HE染色和免疫组化染色。

1.2 免疫组化染色(SABC法)

石蜡切片脱蜡至水,0.3% Triton X-100室温30 min,0.3%甲醇双氧水室温30 min,正常兔血清封闭37 ℃ 30 min,滴加CD3、CD4、CD8山羊抗大鼠IgGI抗,4 ℃孵育24 h,Ⅱ抗37 ℃孵育30 min,SABC复合物37 ℃孵育30 min,每步间用0.01 mol/L PBS洗5 min共3次,DAB室温显色5 min,蒸馏水终止反应,常规脱水、透明、封固、镜检,阴性对照片用0.01 mol/L PBS代替Ⅰ抗。

1.3 观察计数

在光镜下以相同光亮强度,用C6网格目镜测微尺在40×镜下(1 mm2)计数CD3、CD4、CD8阳性细胞数,每组中每个动物随机取2张切片,每张切片随机取3个视野,记录网格内阳性反应的细胞数。

1.4 统计学处理

用SPSS 8.0版本进行方差分析和t检验,计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示。

2 结 果

2.1 组织学观察

缺血组:12 h,软膜下可见较多的多形核细胞(PMNL),部分标本病灶区有少量白细胞浸润。24 h,围绕坏死中心区有较多的白细胞聚集,其中多数为PMNL。3 d～7 d,缺血部位分区明显,形态上分为坏死中心区、转化带、反应区和周边区。大量PMNL进入坏死中心区,转化带有大量的细胞浸润,可见较多巨大细胞。反应区有较多的淋巴细胞、单核细胞,血管周围有大量的单核细胞聚集,并可见淋巴细胞围绕血管浸润。10 d,坏死区PMNL基本消失,软膜上仍可见炎性细胞浸润。 川芎嗪各剂量组:12 h～24 h,软膜下和缺血区有小量淋巴细胞浸润,PMNL 浸润不明显。3 d,部分标本可见白细胞围绕坏死中心区聚集。7 d,PMNL成灶性进入坏死中心区,细胞数目较少,转化带不明显,反应区有较多的淋巴细胞、单核巨噬细胞。10 d炎性细胞不明显。大剂量川芎嗪组白细胞数减少比小剂量川芎嗪组更明显。

2.2 CD3、CD4、CD8染色结果(见表1～表3)

3 讨 论

大脑中动脉闭塞(MCAO)后,随着缺血时间的延长,严重缺血部位发展为梗死,3 d以后,缺血灶分区明显。本研究认为可以将缺血区划分为坏死区、转化带、反应区、周边区。因为从组织病理学观察,各区细胞反应不同,界限较明显,形态上易于区分。在坏死区的外缘,或反应区的内侧缘,类似于Kato等[4]所谓的“转化缘”和Braun等[5]描述的“梗死组织紧邻缘”,笔者将其命名为“转化带”,为坏死区和反应区之间的狭窄区域,相似于缺血半暗带区,因为此区细胞反应强烈,细胞形态明显不同于反应区和坏死区,HE染色可见特异的巨大细胞,T细胞亚群免疫组化染色在此区形成明显的阳性反应圈。推测此区可能在坏死区向反应区扩展的过程中发挥重要作用,浸润的细胞产生多种免疫分子和毒性产物,直接影响着反应区神经元的存活,本实验结果表明此区能对治疗发生明显反应,对反应区神经元存活有保护作用。

Schroeter研究了永久性MCAO后局部免疫反应,发现缺血1 d,CD5+T细胞在部分动物出现于软膜表面,3 d～7 d,在梗死灶的边缘CD5+T细胞数目增加,14 d时明显下降,CD4+T细胞少见,而CD8+T细胞丰富,且CD8+T细胞数目超过CD5+T细胞。也提示可能有CD5-/CD8+NK细胞存在。这与本实验中缺血组的结果一致:永久性MCAO后12 h,软膜上有少数散在的CD3+淋巴细胞,3 d～7 d CD3+、CD8+淋巴细胞聚集达高峰,且CD8+超过CD3+,推测有NK细胞存在,多分布于转化带和散在于缺血区。NK细胞可能通过非MHC限制和抗原非特异机制杀伤包括神经原在内的靶细胞,导致梗死后早期组织损伤。早期、长时间的T细胞浸润是比较特殊的现象,但诱导T细胞浸润的信号还不清楚。

Jander等[6]研究发现,大鼠局灶性脑缺血时有双重巨噬细胞反应, CD8+巨噬细胞第1周内达高峰,之后明显下调,而CD4+巨噬细胞高水平持续到第2周,脑缺血的CD8+/CD4-巨噬细胞的出现可能在局灶性缺血性脑损伤中发挥特殊的功能。本实验中,缺血3 d～7 d转化带大量的CD8+细胞可能为CD8+/CD4-巨噬细胞,其来源为血源性还是脑源性还有待于进一步研究,这与Jander等[6]报道的缺血1周内CD8+/CD4-巨噬细胞达高峰一致。Lig预处制后,改变之一是:CD3淋巴细胞在两个剂量组3 d～7 d均有明显减少,CD8阳性细胞减少最明显,提示Lig可能有免疫抑制和免疫调节作用。改变之二是转化带“巨大细胞”的消失,此区细胞反应强烈,川芎嗪预处理减少了此区浸润的细胞数。

Lig为植物川芎的主要有效成分之一,化学结构为四甲基吡嗪,临床主要用于治疗急性心脑血管疾患,具有保护血管内皮和抑制平滑肌细胞增殖的作用和抗炎作用[2],张道宏等[7]实验发现,TMP能拮抗环磷酰胺所致的小鼠胸腺,脾重量减轻,增加小鼠外周血中T淋巴细胞数量和血清溶血素的生成量,并增强巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬活性,和吞噬指数,表明TMP在机体细胞免疫、体液免疫与非特异性免疫方面有较好的促进作用。刘勇等[8]报道Lig具有抑制细胞因子刺激内皮细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的作用。有研究Lig对脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(TNF-α)mRNA和蛋白的影响,认为高剂量Lig抑制TNF-α释放[9]。TNF-α可诱导血管内皮细胞TF的表达,同时具有多种生物学功能,如介导细胞增殖分化、凋亡、应激和炎症反应[10] 。脑缺血后白细胞到达缺血区是多步骤过程:附壁、与内皮细胞黏附、浸润到脑实质。白细胞与内皮细胞黏附浸润需要有黏附分子介导,并受到细胞因子的调节。本实验研究发现:Lig可明显推迟PMNL出现的时间,减少PMNL的数目,且大剂量组减少更明显,提示Lig对免疫机制有影响,其作用机制可能与上述因素有关。本研究也证实了Lig对淋巴细胞数目有影响,提示Lig具有抑制细胞免疫作用并具有免疫调节作用。但Lig是抑制了淋巴细胞增殖还是抑制了细胞向缺血区浸润尚不清楚。免疫系统的参与,加速了脑卒中的形成,加重了卒中后的继发性脑损伤,采用不同的抗炎、抗免疫疗法能够不同程度的减轻脑损害。Lig预处理的免疫抑制和免疫调节作用,可能是其发挥保护作用的机制之一。提示临床上若长期使用Lig应注意观察细胞免疫功能的变化,以了解此药对整体功能的影响,也具有一定的理论和临床意义。

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局灶性脑缺血模型 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

成年Wistar大鼠72只, 体重280~380g, 随机分为假手术组:只做分离动脉手术, 大脑中动脉不栓塞;缺血-再灌注组, 栓塞大脑中动脉2h, 再灌注24h;EGB治疗组:栓塞大脑中动脉2h, 栓塞2min内进行尾静脉注射EGB (20mg/kg) , 再灌注24h内, 给药共3次。每组24只。手术前12h禁食, 可自由饮水。

1.2 方法

1.2.1 栓子的制备

将一根直径0.23mm、长35mm的尼龙钓鱼线的一端均匀地涂上一层聚胺酯, 使其直径达到0.25~0.26mm, 晾干待用。

1.2.2 大鼠局灶性脑缺血-再灌注模型的制备

采取颈内动脉插入线法造模[3~5]。Wistar大鼠用3.5%水合氯醛 (350mg/kg) 麻醉, 仰卧固定。切开颈部正中皮肤, 游离右侧颈总动脉 (CCA) 、颈外动脉 (ECA) 、颈内动脉 (ICA) , 仔细分离避免刺激迷走神经。由CCA分叉处向头端依次游离, 用电热烧灼器烧断颈外动脉所有分枝, 使其主干游离。然后分离ICA至颅底, 并分离出ICA颅外段的唯一分支翼腭动脉 (PPA) 。用蛙心夹夹住CCA和ICA, 并在ECA (靠近CCA分叉处) 上剪一小口, 将制好的栓子 (预先蘸有肝素钠溶液) 沿切口插入ECA, 经CCA分叉处并将预先放置于ECA根部的手术缝合线缚紧, 防止栓子滑出和出血, 然后放开ICA上的蛙心夹, 将栓子缓慢地向ICA入颅方向推进约19~21mm, 微遇阻力即停, 使栓子头端停留在大脑中动脉 (MCA) 与大脑前动脉 (ACA) 分叉处。固定好栓子, 即完成一侧MCA的栓塞。栓塞2h后, 缓慢的轻拉栓子使其头端回到ECA内, 即可实现MCA再灌注。

1.2.3 EGB干预

术后2min尾静脉给药, 20mg/kg, 每天3次。

1.2.4 神经病学评分

参考Kuluz[6]神经缺陷三级评分的标准, 动物清醒后分别在对应时间点进行评分。符合条件的大鼠才可进入下一步试验。

1.3 小胶质细胞的检测

1.3.1 硝酸银染色法

染色步骤: (1) 组织固定于FAB液 (溴化铵-福尔马林) ; (2) 冰冻切片20μm; (3) 在含有数滴氨水的蒸馏水中洗30s; (4) 蒸馏水洗2次; (5) 浸碳酸银液体30s; (6) 10%福尔马林还原; (7) 蒸馏水洗; (8) 0.2%氯化金调色10min; (9) 蒸馏水洗; (10) 5%次亚硫酸钠固定5min; (11) 蒸馏水洗; (12) 脱水、透明、封固。

1.3.2 S-100蛋白表达检测-SABC

步骤如下: (1) 冰冻切片, 载玻片防脱片处理:经Polylysine防脱片处理。 (2) 低温恒冷切片机大鼠脑连续切片厚20μm。捞于Poly-lysine防脱片处理载玻片。 (3) 纯丙酮室温固定30min。蒸馏水洗。 (干燥后冰冻保存) 。 (4) 纯甲醇加H2O2至0.3%, 室温浸泡30min, 以灭活内源性过氧化物酶, 蒸馏水洗3次。0.1M PBS洗2min×3次。 (5) 滴加正常山羊血清封闭液, 室温20min。甩去多余液体, 不洗。 (6) 滴加适当稀释的一抗S-100 (一抗的稀释度1:100 0.1M PBS稀释) , 4℃过夜。0.1M PBS洗, 2min×3次。 (7) 滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, 37℃20min。0.1M PBS洗2min×3次。 (8) 滴加HIGH-SABC, 37℃20min。0.1M PBS洗5min×4次。 (9) DAB显色:使用DAB显色试剂盒。取1mL蒸馏水, 加试剂盒中A, B, C试剂各一滴, 混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间, 蒸馏水洗涤。 (10) 苏木素轻度复染。脱水、透明、封片。显微镜观察。

1.4 统计学处理

采用SPSS软件处理, 组间采用方差分析, 组内采用独立样本t检验。所有数据以均值±标准差表示, 显著性差异水平为P<0.05。

2 结果

2.1 小胶质细胞AgNO3染色观察

假手术组小胶质细胞胞体较小, 突起比较长 (图1) ;缺血2h再-灌注24h组, 在神经细胞严重损害的梗死区边缘, 小胶质细胞肥大、增生, 而在含散在萎缩神经元的梗死毗邻区域出现圆状、阿米巴状、杆状小胶质细胞 (图2) ;EGB治疗组与缺血2h再灌注24h组比较细胞数量多, 突起较长 (图3) 。

2.2 小胶质细胞S-100免疫组化染色观察

缺血2h再灌注24h组小胶质细胞S-100阳性细胞数量与假手术组 (图4) 相比明显增多, 小胶质细胞增生 (图5) ;EGB治疗组S-100阳性细胞数介于假手术组与缺血2h再灌注24h组之间 (图6) 。

3 讨论

几十年来人们对EGBCNS的作用进行了大量的研究, 表明EGB对CNS的保护作用明显, 能促进神经元的可塑性, 保护神经元的缺血损伤。但脑缺血-再灌注后EGB对小胶质细胞的影响少见报道。小胶质细胞在CNS损伤时能转变为有吞噬能力的小胶质细胞, 清除坏死的细胞及结构损伤的髓鞘, 在免疫应答的过程中发挥关键作用。脑缺血-再灌注后缺血损害区的小胶质细胞被激活, 其形态表现为圆形、阿米巴状、杆状, 并分化、增殖, S-100蛋白表达增强, 形态的变化表明其已转化为具有吞噬能力的小胶质细胞, 参与病理生理过程, 本实验中缺血2h再灌注24h组结果与其一致。小胶质细胞吞噬清除病原体和细胞碎片以及分泌抗炎物质、神经生长因子等, 有利于神经元再生和死亡周边区神经元的存活, 发挥神经营养作用。但有实验表明被激活的小胶质细胞对CNS也具有损伤作用, 即激活的小胶质细胞可产生一些细胞因子, 然后细胞因子如IL-1又可进一步刺激小胶质细胞产生更多的神经毒性自由基以及炎症因子, 对CNS产生损伤。因神经元不能再生, 其损伤作用显然更为有害。本实验结果显示大鼠脑缺血-再灌注后小胶质细胞被激活, 增生、肥大, S-100蛋白表达增加, EGB治疗组与缺血2h再灌注24h组比较细胞数量减少, 突起较长, S-100阳性细胞表达减弱, 表明EGB可抑制小胶质细胞过度激活, 减轻其对CNS的进一步损伤, 从而对脑组织起到保护作用。

参考文献

局灶性脑缺血模型 篇5

1材料与方法

1.1模型制造将100只健康成年雄性SD大鼠(河北医科大学实验动物中心提供)按随机数值表法分为5组,每组20只。A组:假手术组,B组:脑缺血再灌注组,假手术3d后给予2h大脑中动脉闭塞(MCAO),再灌注22h后处死。C组:脑缺血预处理组,缺血预处理10min,3d后给予2hMCAO,再灌注22h后处死。D组:ASA预处理组,阿司匹林粉剂(河南华利药业有限责任公司 提供,批号:0780633)以60 mg/kg剂量溶于2mL生理盐水 中 ,灌胃3次 ,3d后给予2h MCAO,再灌注22h后处死。E组:Ply预处理组,大黄素甲醚 (山东新华 制药股份 有限公司 提供,批号: 0506338;以40mg/kg剂量溶于2mL生理盐水中,灌胃3次,3d后给予2h MCAO,再灌注22h后处死。 给予A、B、C组等量生理盐水灌胃。

实验动物用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后,用Zea-longa等[5]的大脑中动脉线栓法制作大鼠左侧大脑中动脉缺血灌注模型。采用颈部正中切口,结扎并切断左侧颈外动脉,在颈外动脉残端剪一小口,并插入一根顶端粘有石蜡的尼龙丝线,向上深入至分叉以上(19~21)mm,结扎颈外动脉近心端,缺血(以插渔线成功开始计时)后2h实施再灌注,外拉渔线约20 mm恢复MCA供血,完成缺血预处理。假手术组除不插入渔线外,其余操作相同。造模成功标志:大鼠不能伸展右侧前肢(即提尾时右前肢内收屈曲)、行走时向向右转圈(追尾现象)或行走时向右侧倾倒,出现上述三者之一即为造模成功。再灌注3d后用相同方法再次造成MCAO 2h,于处死前进行神经功能缺失评分,心脏取血,后断头处死。

1.2神经功能缺失评分按Zea Long5分制[5]标准评分,0分:无功能障碍;1分:不能完全伸展对侧前爪; 2分:向右侧转圈;3分:向右侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。

1.3脑梗死体积测定再灌注22h每组随机选取10只动物断头取脑,去除嗅球、小脑和低位脑干,沿冠状面用排刀切成5片,每片厚约2mm,置于2%TTC溶液中,避光染色30min,用10%甲醛缓冲液固定24h后用数码相机照相,正常脑组织呈红色,梗死组织呈白色,利用图像分析法计算各个脑片梗死面积,并计算梗死体积。

1.4脑组织白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)含量测定再灌注22h后取每组另10只动物用10%的水合氯醛麻醉后处死,取出鼠脑剥离左侧皮质 ,制成100g/L的脑组织 匀浆 ,低温离心1 5min (3 000r/min)。取上清液采用FFDFr-晶体闪烁计数仪, 用放射免疫法测定各组动物脑组织IL-1β和TNF-α的含量 。具体操作按大连生物工程公司生 产的试剂 盒进行。

1.5统计学处理计量资料以均数±标准差( ±s ) 表示,用SPSS13.0统计软件处理,多组比较进行单因素方差分析及两两比较q检验,两组间比较采用t检验。

2结果

2.1神经功能缺失评分假手术组无神经功能障碍表现。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组神经功 能缺失评 分与缺血 再灌注组 比较明显 降低 (P <0.01)。Ply预处理组神经功能缺失评分明显降低,与ASA预处理组比较明显降低(P <0.05)。详见表1。

2.2血清NSE含量脑缺血再灌注组血清NSE含量与假手术组比较明显升高 (P <0.05)。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较血清NSE含量降低(P <0.01)。Ply预处理组血清NSE含量与ASA预处理组 比较明显 降低 (P <0.05)。详见表1。

2.3脑梗死体积假手术组无肉眼可见的梗死灶形成。脑缺血再灌注组大鼠均表现不同程度的梗死灶形成。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较梗死体积缩小(P <0.01)。Ply预处理组 梗死体积 与ASA预处理组 比较明显 缩小 (P <0.05)。详见表1。

2.4脑组织IL-1β和TNF-α含量脑缺血再灌注组脑组织IL-1β和TNF-α含量与假手术组比较明显升高(P <0.01)。 缺血预处 理组、ASA预处理组 及Ply预处理组 与脑缺血 再灌注组 比较病变 侧脑组织IL-1β和TNF-α含量降低 (P <0.05)。Ply预处理组脑组织IL-1β和TNF-α含量与ASA预处理组比较明显降低 (P <0.05)。详见表2。

ng/mL

3讨论

BIP是指对脑组织采用机械刺激,如一次或多次短暂性脑缺血再灌注后,使其对以后较长时间的缺血性损伤产生IT[1]。其机制之一为抑制缺血后的炎症反应,诱导脑组织产生内源性保护作用,减轻缺血再灌注所致的神经损伤。本实验发现,提前给予BIP可以使再次缺血时神经功能缺失减轻,梗死体积缩小,血清NSE含量下降,均较缺血再灌注损伤组有统计学意义 (P <0.01)。近年来发现预先给予一些药物也可诱导IT,此现象称为药物预处理[2],研究表明ASA具有这种作用。提前给予ASA预处理可同样使再次缺血时神经功能缺失减轻,梗死体积缩小,血清NSE含量下降,均较缺血再灌注损伤组有统计学意义(P <0.01)。

炎症反应可能在缺血再灌注损伤及脑IT中具有重要意义,抗炎治疗可减轻缺血再灌注所致的神经损伤[6]。Ply属蓼科植物大黄的根及根茎所含的蒽醌衍生物之一,可通过血脑屏障,并具有很强的抗炎作用。 已有前期研究证明Ply通过抗炎机制而起到脑保护作用[4],但对IT的影响报道尚少见。本实验发现,提前给予Ply预处理可以使再次缺 血时神经功能缺 失减轻,梗死体积缩小,血清NSE含量下降,均较ASA预处理组有统计学意义(P <0.01),中药Ply亦可诱导IT产生脑保护作用,效果优于ASA。

脑缺血后的再灌注损伤是一系列复杂的病理过程,主要与氧化应激反应、能量代谢障碍、炎性反应、兴奋性氨基酸释放、细胞凋亡及突触传递受阻等有关[7]。 其中炎性级联反应是一个重要的损伤机制,各种炎症因子的释放在损伤机制中起着重要作用,一方面促进炎性细胞黏附于微血管内皮细胞,机械性堵塞微循环通道,影响组织的血流供应;另一方面促进相关炎性因子释放,导致白细胞在缺血区浸润和聚集,活化的白细胞在缺血区可释放大量毒性氧自由基、蛋白水解酶等物质而进一步损伤局部组织血管,导致血管通透性增加而致组织水肿,加重组织损伤[8]。在炎性级联反应中以炎性细胞因子(如IL-1β、TNF-α)表达上调为首发特征,IL-1β、TNF-α作为炎症反应的起始因子,检测其含量对衡量脑缺血再灌注损伤有重要意义[9]。本实验采用放射免疫分析法动态观察了不同预处理方式对大鼠脑缺血再灌注侧脑组织IL-1β和TNF-α含量的变化。结果发现,缺血再灌 注脑组织 中IL-1β和TNF-α含量明显 升高 ,且均高于 假手术组 (P < 0.01)。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较病变侧脑组织IL-1β和TNF-α 含量降低 (P <0.05)。该结果与相关 报道一致[10]。 表明IL-1β、TNF-α参与了脑缺血再灌注损伤的发生, 在脑缺血性疾病的发生、发展和转归中起一定的作用。 而不同方式的预 处理可能 通过降低IL-1β和TNF-α 在病灶侧的过度表达,并对随后发生的脑缺血再灌注损伤起保护性作用。

通过对不同方式预处理的比较,药物预处理具有相对安全、方便、易于控制剂量的优点,且中药Ply具有更加广阔的发展前景。本实验有可能对临床缺血性脑血管病的防治提供新的依据。

摘要：目的 探讨不同预处理方式,即缺血预处理及药物预处理(阿司匹林及中药大黄素甲醚)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及可能的作用机制。方法 SD大鼠随机分为5组,分别为假手术组、脑缺血再灌注组、脑缺血预处理组、阿司匹林预处理组及中药大黄素甲醚预处理组。各组以线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉缺血再灌注损伤及缺血预处理实验动物模型,给予各组大鼠不同预处理方式,比较各组神经功能缺失评分、脑梗死体积、血清神经无特异性烯醇化酶(NSE)含量及脑组织白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。结果 脑缺血预处理、药物预处理均可使神经功能缺损减轻、脑梗死体积缩小、血清NSE含量降低,且药物预处理中大黄素甲醚预处理较阿司匹林预处理效果更为明显,同时脑组织IL-1β和TNF-α含量降低亦更为明显。结论药物预处理与缺血预处理同样可诱导脑缺血耐受现象,对局灶性脑缺血再灌注损伤起到保护作用,且中药大黄素甲醚效果更加明显,其机制可能与下调脑组织再灌注损伤时IL-1β和TNF-α的表达有关。

局灶性脑缺血模型 篇6

1 材料与方法

1.1 试验药物与试剂

迷迭香酸购自Sigma公司。2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)为中国医药上海化学试剂公司产品。SOD、GSH-Px和MDA试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。

1.2 动物

雄性Wistar大鼠,体重200～280g,由兰州大学医学实验动物中心提供。

1.3 仪器

病理图象分析系统(四川大学产品),UV29100 紫外可见分光光度仪(北京第二光学仪器厂产品) 。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药

大鼠35只随机分为5组,腹腔注射给药3天后用线栓法造模[8],缺血 4h后再灌注 2h,然后观察各项指标。

1.4.2 行为学评分[9]

评分标准:①提鼠尾,左前肢内收,左肩内旋者1～4分。②将大鼠置光滑平面,推右肩向左侧移动,阻力降低者1～3分。③左前肢肌张力降低1～3分。共10分。分数越高,动物的行为障碍越显著。

1.4.3 脑梗塞体积的测定

大鼠股动脉取血然后迅速断头处死, 连续冠状切片,迅速放入2%TTC 溶液(37℃)中染色30min,缺血区呈苍白色,正常区为玫瑰色,采用病理图象分析系统计算脑梗塞体积所占百分比。

1.4.4 MDA含量测定

大鼠股动脉取血制备血清,测定血清MDA含量。

1.4.5 SOD和GSH-Px的活力测定

采用SOD和GSH-Px试剂盒测定血清SOD和GSH-Px的活力。

1.4.6 统计学处理

所有结果以undefined表示,用t检验分析结果。

2 结果

2.1 迷迭香酸对大鼠行为学的影响

除假手术组未出现神经缺损的症状外,其余各组出现不同程度的神经缺损的症状。表现为左前肢内收;躯体向病灶对侧倾斜,向左侧推阻力下降;部分大鼠活动时有向瘫痪侧打转现象。与假手术组比较,模型组出现严重的神经缺损症状。与模型组比较,迷迭香酸10、50mg/kg及葛根素50mg/kg均能显著改善大鼠神经缺损的症状(P<0.01)。在剂量相同时,迷迭香酸的作用与葛根素相当(P>0.05)。结果见表1。

注:与模型组比较,*P< 0.05,**P< 0.01。

2.2 迷迭香酸对大鼠脑梗塞体积的影响

与假手术组比较,模型组出现严重的脑梗塞,脑梗塞体积为(22.92±1.92)%。与模型组比较,迷迭香酸10和50mg/kg对脑梗塞体积均有显著的降低作用,分别使梗塞体积降低到(18.78±2.43)%和(17.77±3.90)%。在剂量相同时,迷迭香酸的作用与葛根素相当(P>0.05)。结果见表1。

2.3 迷迭香酸对大鼠血清MDA含量的影响

模型组与假手术组比较,血清MDA含量显著升高(P<0.01)。与模型组比较,葛根素50mg/kg使MDA含量降低39.69%, 迷迭香酸10和50mg/kg分别使MDA含量减低42.05%和45.52%(P<0.01)。结果见表2。

注:与模型组比较,*P< 0.05,**P< 0.01。

2.4 迷迭香酸对大鼠血清SOD和GSH-Px活力的影响

模型组与假手术组比较,血清SOD活性显著降低(P<0.01)。与模型组比较,葛根素50mg/kg使血清SOD活性增加1.16倍, 迷迭香酸10和50mg/kg分别使血清SOD活性增加1.12和1.15倍(P<0.01)。结果见表2。

模型组与假手术组比较,血清GSH-Px活性显著降低(P<0.01),与模型组比较,葛根素50mg/kg使血清GSH-Px活性增加1.07倍, 迷迭香酸50mg/kg使血清GSH-Px活性增加1.06倍(P<0.01)。结果见表2。

3 讨论

大脑中动脉(MCA)是人群脑缺血的多发部位,MCA闭塞模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型,而插线法这种模型无须开颅,MCA闭塞效果较理想,是目前能进行再灌流损伤研究的理想动物模型。本实验采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,观察迷迭香酸对大鼠脑缺血的影响。结果显示迷迭香酸可减少大脑中动脉阻断所致的脑梗塞体积,改善脑缺血大鼠的行为障碍。研究结果表明迷迭香酸对脑缺血性损伤具有明显的保护作用。

涉及再灌注损伤机制的因素有许多, 其中氧自由基的生成在其中起重要作用。一般认为,脑缺血时自由基的损害以脑缺血后再灌注为甚,可能是不完全性脑缺血残留的滴状供血,提供微量氧气,使脂质过氧化得以维持进行,加重损害。脂质过氧化的终产物(MDA) 有很强的毒性和反应性, 它们可使脂质过氧化在细胞膜系统蔓延导致细胞功能的破坏, 所以测量脂质过氧化的终产物被认为是氧自由基损伤的重要指标。在正常状态下, 机体ROS 的产生和清除间存在着动态的平衡, 产生的自由基可被SOD、GSH-Px和过氧化氢酶等清除, 测定抗氧化酶类的活性可以间接反应体内清除自由基的能力变化。脑缺血再灌注时,ROS的生成过多,超过了抗氧化酶对它的清除,就会导致氧化应激和细胞损伤。脑缺血大鼠再灌注后,MDA含量明显升高,SOD和GSH-Px显著降低,表明脑缺血再灌注期脂质过氧化增加,机体抗氧化能力降低。迷迭香酸能显著降低MDA含量,提高SOD和GSH-Px的活性,表明迷迭香酸对脑损伤的保护作用与其抗氧化作用有关。

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局灶性脑缺血模型 篇7

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

选取健康雄性SD大鼠40只, 体重 (251±22) g, 年龄在7~8周, 来源为笔者所在医院实验动物中心。丁苯酞、DAB显色试剂盒、防脱片试剂以及干预性药物均由国家卫生部通过的医药公司供给。

1.2 实验方法

随机将40只SD大鼠分为假手术组与缺血再灌注组, 大鼠大脑中动脉内线栓阻断法将制备局灶性脑缺血再灌注模型[1,2], 其中假手术组大鼠分成4组, 每组大鼠各8只, 其中三组分别应用不同剂量的丁苯酞 (80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg) , 一组进行亚低温联合丁苯酞 (80 mg/kg) , 观察大鼠缺血2~24 h的状态, 采用Longa神经功能评分法评价不同组别神经功能评分, 并采集标本, 用免疫组化法对各组大鼠Caspase-3表达情况进行判定[3]。对大鼠进行药物治疗[1,2], 观察大鼠缺血2~24 h的状态, 并制成标本, 分别用免疫组化法与Longa神经功能评分法对丁苯酞联合亚低温影响的大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后Caspase-3表达进行观察, 其中假手术组大鼠分成4组, 每组大鼠各8只, 其中三组分别应用不同剂量的丁苯酞 (80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg) , 一组进行亚低温联合丁苯酞 (80 mg/kg) 研究, 然后按照Longa报道的方法改良缺血再灌注模型, 模型制定完后, 对比不同组别神经功能评分, 并采集标本, 进行结果判定[3]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0对所得数据进行统计分析, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析;计数资料以率 (%) 表示, 比较采用字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

缺血再灌注组的神经功能评分明显高于假手术组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。详见表1。

3 讨论

3.1 丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后Caspase-3表达的影响

在本研究中可以发现丁苯酞不仅能够对大鼠局灶性脑缺血再灌注模型中的神经症状具有改善作用, 也能够改善其脑组织的病理损害, 对Caspase-3表达起到抑制性作用。通过研究表明由于丁苯酞能够抑制Caspase-3这种蛋白的表达, 因此其对于脑神经元的凋亡具有控制作用, 在试验过程中, 应用不同剂量的丁苯酞对于抑制Caspase-3的表达具有不同的影响以及效果, 而应用的药物剂量越大则临床治疗效果越好。

从本研究中可以推断出丁苯酞对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后Caspase-3表达影响有两种实现途径, 第一种以线粒体或Cytc通路作为Caspase-3表达受到抑制的媒介。第二种是以内质网通路作为Caspase-3表达受到抑制的媒介。在第一种抑制神经元凋亡的控制途径中可以发现, 大鼠能量代谢是否出现障碍与其脑缺血缺氧的程度相关, 当大鼠线粒体的形态功能发生改变, 便会因线粒体MPTP不可逆过渡开放而出现细胞浆内的线粒体膜间隙Cytc的释放, 从而使Caspase级联反应得以启动[4], 使Caspase-3激活, 从而达到对细胞凋亡的抑制性作用。在第二种抑制神经元凋亡的控制途径中, 是通过在神经组织中减少Ca2+的毒性, 进而使内质网的内激反应减轻, 以抑制Caspase-3表达。

有文献指出, 当丁苯酞能够改善颅内缺血症状, 目前该研究结果也得到证实[5]。国外研究表明, 大鼠存在局灶性脑缺血再灌注损伤时, 利用丁苯酞治疗, 不仅能够改善颅内组织微循环状态, 还能够减少脑梗死面积, 一定程度上能够提高患者的预后治疗效果[6]。本文对丁苯酞剂量与鼠局灶性脑缺血再灌注损伤情况进行分析, 发现用药剂量与神经功能评分成正相关关系, 该研究结果提示, 取大剂量丁苯酞治疗局灶性脑缺血再灌注损伤的效果相对较好。有学者指出, 丁苯酞能够减少局灶性脑缺血再灌注损伤对颅内组织的破坏, 可达到延长治疗时间的目的。

丁苯酞对于大鼠局灶性脑缺血再灌注后Caspase-3的表达具有抑制与减轻作用, 通过这种抑制作用可以降低大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经元的凋亡率, 进而保护神经元, 对于减少神经功能症状学评分以及脑组织病理学变化具有重要的作用与价值。

与缺血再灌注组相较而言, 假手术组大鼠所表现的出的神经功能缺失症状明显要, 而Caspase-3表达减少30%。其中, 缺血灌注组大鼠缺血后2 h损伤侧海马组织Caspase-3活性增加了20%, 24~36 h达到高峰, 48 h开始下降至正常。而丁苯酞联合亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤治疗增加了大鼠0~3 h内脑组织匀浆Caspase样酶活性。同时, 随着丁苯酞剂量的增加, 其Caspase-3表达也就越明显, 其中丁苯酞联合亚低温相较于其他实验形式而言对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后Caspase-3表达起到了重要的影响, 具有保护大鼠脑凋亡脑细胞的作用[7,8]。

3.2 亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后Caspase-3表达的影响

近年来经过研究表明Caspase-3在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后4 h以内表达显著, 当灌注到7 d时, Caspase-3表达达到顶峰, 灌注至14 d时, Caspase-3表达开始缓慢下降, 与24 h的Caspase-3表达数据基本一致[9,10]。由此可见Caspase-3表达在脑缺血再灌注1~3 d时间内达到高峰, 一周后呈下降趋势, 2周后的表达数据与4 h内相同, 因此在脑缺血再灌注早期时随着时间的增加, Caspase-3表达也不断增加, 而在72 h后, 随着脑缺血时间的增加, Caspase-3表达开始不断下降, 而这种现象是由缺血神经元凋亡造成的, 亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后Caspase-3的表达相较于常温而言明显要低, 因此可以通过亚低温对核因子Caspase-3起到抑制性作用, 为临床治疗争取宝贵的时间。有学者研究亚低温在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后的影响因素进行分析时, 发现影响因素主要表现在两个方面, 即核因子Caspase-3和Survivin, 基于两者不同的高峰值, 提出Caspase-3蛋白与神经元受损状况存在直接关系[11]。然而, 有学者认为, 利用亚低温治疗首次局灶性脑缺血再灌注损伤的效果并不明显, 还有待进一步研究。基于上述研究结果, 笔者认为亚低温能够一直大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤对颅内神经元的破坏, 提高患者的预后治疗效果。

综上所述, 笔者所在医院应用丁苯酞联合亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后凋亡脑细胞进行抑制, 对Caspase-3的表达起到了重要的保护作用, 同时, 还能够延长溶栓药物的治疗时间, 避免患者并病情严重化发展, 为保护神经元提供了理论与实践性依据。

摘要：目的:研究丁苯酞联合亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后Caspase-3表达的影响, 并探讨其对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后神经细胞的保护作用。方法:40只SD大鼠将其随机分为假手术组与缺血再灌注组, 应用大脑中动脉内线栓阻断法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型, 分别用Longa神经功能评分法与免疫组化法评价丁苯酞联合亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经细胞保护作用及脑内Caspase-3表达的影响。结果:与缺血再灌注组相较而言, 假手术组大鼠所表现的出的神经功能缺失症状明显要, 而Caspase-3表达减少。结论:丁苯酞联合亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注具有重要的保护作用, 其中丁苯酞与亚低温均对Caspase-3表达有抑制作用, 因此与其作用机制有关。