液质联用技术（共7篇）
液质联用技术 篇1
液相色谱-质谱联用技术,简称液质联用(HPLC-MS),它的分离系统为液相色谱,检测系统为质谱。液质联用结合了色谱强大的分离能力与质谱优越的定性功能,广泛应用于药物分析、生物化学、食品安全和环境监测等众多领域。
一、液质联用技术的发展
目前常用的液质联用系统具有两大分类系统:
1.根据质量分析器分类,包括四级杆、飞行时间(TOF)、傅立叶变换质谱等。四极杆射频(RF)的稳定性大大提高质谱对于分析化合物的选择性,分辨质量数的宽度可以达到0.1Da;其离子选择反应监测(selected-reaction monitoring,SRM)模式适于进行常规生物分析。20世纪90年代,随着基质辅助激光解吸离子化技术的出现,飞行时间分析器快速发展。最先进的飞行时间质谱分析仪测得分子的质量数准确度非常高,分辨率能够高达20,000Da。傅立叶变换离子回旋共振质谱基于其高分辨率和准确度的优势,被广泛地应用于生物大分子的研究。
2.从离子源角度来进行分类,包括:等离子体喷雾(PSP)、热喷雾(TSP)、大气压电离(API)、粒子束(LINC)和动态快原子轰击(FAB)。目前广泛应用的大气压电离源主要有电喷雾离子化(ESI)、大气压化学离子化(APCI)和离子喷雾离子化(ISI)3种模式。
目前应用最广泛的离子源有电喷雾电离源和大气压化学电离源。电喷雾(ESI)技术起源于20世纪60年代末,其显著优势有:可将质荷比降低到各种不同类型的质量分析器都能检测的程度,在带电状态进行检测从而计算离子的真实分子量,可以生成高度带电且不发生碎裂的离子,同时,对于分子离子的同位素峰也可确定其分子量和带电数。
大气压化学离子化(APCI)技术与ESI源的发展基本上是同步的,其离子化过程主要是借助于电晕放电启动一系列气相反应来完成,整个电离过程是在大气压条件下完成的。ESI和APCI的共同点是离子化效率高,从而显著增强分析的灵敏度和稳定性,大多与离子阱质谱仪和三重四极杆质量分析器联用。
液质联用仪(沃特世公司,型号为Waters Xevo TQ-S)
二、液质联用技术的应用
1. 在生物化学中的应用
生物体内的化合物具有强极性、难挥发性,并且具有显著的热不稳定性,同时,这些化合物往往以蛋白质、肽和核酸的混合物状态出现,而液相色谱对于不易挥发、强极性、对热不稳定及高分子量化合物的分离能力高;质谱可以对复杂混合物中的化合物进行准确定性,所以液质联用作为生化分析的一个有力工具,日益得到重视。
Henry等对液质联用技术在单克隆抗体结构表征上的应用进行了研究,先采用液质联用对曲妥珠单抗完整蛋白及其亚基(轻链和重链)的相对分子质量进行测定;然后用多种酶(胰蛋白酶和Asp N)酶解蛋白并用液质联用肽图分析法对曲妥珠单抗的氨基酸全序列进行解析和确定,同时对可能发生的翻译后修饰(PTMs)进行定性和定量分析;再通过PNGase F酶来释放抗体上的糖链并应用液相色谱荧光检测与质谱联用方法对其糖基化修饰进行结构分析及确认,建立了一套单克隆抗体结构表征的平台化方案。
2. 在药物分析中的应用
在药物分析研究领域中,大部分药物是极性较大的化合物,而在诸多分析仪器中,液相色谱分析范围广,包括不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物(包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)。质谱特异性强,可以提高较多的结构定性信息,而且检测灵敏度很高。液质联用技术能够对准分子离子进行多级裂解,从而提供化合物的相对分子量以及丰富的碎片信息。在药物研发中的杂质研究和药物动力学研究阶段,通常杂质和药代动力学样品的血药浓度的含量很低,分析难度大且干扰多,液质联用技术由于其选择性强和灵敏度高,可以快速准确地测定药物分析中的痕量物质。
任雪等采用液质联用对国产鲑降钙素注射液中的主要降解杂质进行结构鉴定。贾薇采用液质联用法分析生物样品中四环素类药物和金刚乙胺的代谢物,结果显示,牛奶中四环素,土霉素及美他环素浓度在0.05μg/m L,金霉素在0.1μg/m L时可以准确可靠地被检出。贾连群等采用液质联用技术研究脾虚大鼠血清代谢物谱群特征,对大鼠进行血清代谢组学检测,应用正交偏最小二乘判别分析研究组间代谢物谱图差异,并通过变量重要性投影(OPLS-DA)选取血清中与证型相关的生物标志物。结果显示,脾气虚及脾阳虚模型大鼠血清中多种代谢物的相对含量发生了显著变化,并初步获得了一些可能与脾虚证候相关的潜在小分子生物标志物。曹文利利用液质联用技术对白芍总苷、芍药内酯苷和芍药苷在大鼠体内的代谢物进行了分析。结果发现,代谢位点主要为糖苷键、酯键、苯环,胆汁中白芍总苷的代谢物明显多于单体状态。
3. 在食品安全中的应用
食品安全卫生直接影响到人的身体健康,并且食品中的有害成分往往含量很低,需要进行痕量分析,液质联用技术应用于食品安全检测始于上世纪末本世纪初,主要集中在农药、兽药残留及生物毒素的痕量分析。
裴燕采用液质联用技术对肉鸡肌肉和肝脏中金霉素及其代谢物的残留量和排泄量进行了检测,结果表明,服用金霉素后,肉鸡的肌肉、肝脏和排泄物中均有金霉素及其代谢物均被检出。刘栋采用液质联用对多种贝类毒素进行研究,为我国贝类及其产品中贝毒的检测分析提供了具体的方法和技术规范。
4. 在环境监测中的应用
随着工农业的快速发展,各类环境污染问题频发,如饮用水中的抗生素残留、多环芳烃、多氯联苯、农药残留等问题。因此发展高灵敏度的多残留可靠分析方法已经成为环境分析化学的重要战略目标。上世纪80年代末,研究人员成功地将大气压电离质谱与液相色谱联合应用,自此,液质联用开始逐步成为环境监测最有力的工具。
江鑫对食品及环境样品中三聚氰胺的液质联用分析技术进行了研究,研究采用液质联用技术同时测定水样中痕量三聚氰胺和灭蝇胺的分析方法,该方法测定三聚氰胺和灭蝇胺的最低检测限均达到了纳克级。
三、结语
液质联用技术以其高效快速的分离能力、超高的灵敏度在很多领域得到的广泛的应用。随着现代化高新技术的不断发展,未来几年,液质联用技术必将得到飞速发展,并且在更多的领域发挥日趋重要的作用。
参考文献
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[3]李忠红,王玉,倪坤仪.LC-MSn在药物分析中的应用[J].药物分析杂志,2004,24(3):341.
[4]任雪,田文静,杨化新等.液质联用分析鲑降钙素注射液中的降解杂质[J].中国药学杂志,2015,2:87-90.
[5]贾薇.液质联用法分析生物样品中四环素类药物和金刚乙胺代谢物[D].辽宁.沈阳药科大学,2001,7-9.
[6]贾连群,甄毕贤,徐荧等.应用液质联用技术研究脾虚大鼠血清代谢物谱群特征[J].中国中西医结合杂志,2016,3:104-110.
[7]曹文利.白芍总苷基于代谢组学的保肝机理及体内代谢研究[D].河北.河北医科大学,2014,18-20.
[8]W.M.A.Niessen,Progress in liquid chromatography-mass spectrometry instrumentation and its impact on high-throughput screening[J].Joural of Chromatography A,1000(2003):413-436.
[9]裴燕.肉鸡肌肉、肝脏中金霉素和代谢物差向金霉素液质联用检测法及其残留量和排泄量的研究[D].江苏.扬州大学,2011,31-33.
[10]刘栋.高效液相色谱-串联质谱法检测多种贝类毒素研究[D].辽宁.辽宁大学,2013,56-58.
[11]江鑫.食品及环境样品中三聚氰胺的液质联用分析技术研究[D].江西.南昌航空大学,2010,72-74.
液质联用技术 篇2
1 液质联用较其他方法的优点
水中有机物的测定方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱串联质谱法, 国家标准关于有机物的测定方法主要为气相色谱法和气相色谱-质谱法, 但气相色谱法和气相色谱-质谱法中个别方法检测限不能完全满足最高有机物残留限量的要求[2];气相色谱-质谱法不能分析难挥发、热不稳定的化合物[3]。液质联用技术从根本上解决了色谱流出物的定性问题, 可获得复杂基质中单一成分的质谱图, 允许同时对多个成分进行定性定量分析;较高的灵敏度使其不需要使分析物之间实现完全的色谱分离, 简化了预处理过程[4];而且可以利用特征离子的优势进行多组分检测, 特别是保留时间和特征离子可以双重定性, 既提高了方法的检测效率又提高了方法的准确性[5]。
2 液质联用技术在水质检测中的应用
液质联用技术是将高效液相色谱和质谱串联成整机使用的检测技术, 充分结合了高效液相色谱的高分离能力和质谱的强定性能力。液质联用技术是目前发展最迅速的水质检测手段。
2.1 农药的检测
从20世纪90年代以来, 农药生产量和施用量快速上升, 在农药的使用品种中杀虫剂、除草剂和杀菌剂占90%以上。杀虫剂用量最大的为有机磷杀虫剂, 如敌敌畏、毒死蜱、敌百虫、辛硫磷、氧乐果、乙酰甲胺磷等;此外, 拟除虫菊酯类的氟氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯等用量也在逐渐上升;除草剂用量大的有草甘膦、乙草胺、莠去津、丁草胺、百草枯、甲草胺丁酯、氟乐灵、二氯喹啉酸和二甲四氯等[6]。多数农药对人体有致癌、致畸、致突变作用, 作用于人体主要毒性症状表现为神经系统和皮肤症状[7,8]。而在农业生产过程中大部分农药残留在土壤中或漂浮在大气中, 通过降雨沉降和径流进入地表水和地下水中。因此, 通过液质联用技术有针对性地对水中残留农药的检测有十分重要的意义。
对水中农药的测定常用的方法为高效液相色谱串联质谱法, 刘莉治等[9]利用高效液相色谱串联质谱联用 (LC-MS-MS) 建立了水体中同时检测的43种农药的分析方法。实验中以5 mmol/L醋酸铵为流动相A, 甲醇为流动相B, 在20 min内完成了对杀线威、噻虫嗪、吡虫啉、噻虫胺、杀草敏、氧化莠锈灵等43种常用农药的定量分析, 得到43中农药化合物的线性方程和相关系数, 线性系数为0.999 1~0.999 8, 线性关系良好, 最低检出限为1μg/L, 连续6次进样计算所得相对标准偏差均小于5%。颜流水等[10]利用液质联用离子阱二级质谱法, 实现了包括酚类、三嗪类、苯脲类、氨基甲酸酯类、有机磷类和肽酸酯类在内的饮用水中15中常见痕量有机污染物的同时测定。实验中以甲醇-水为流动相, 丙酮作为洗脱剂进行定量分析, 实验结果表明, 该方法线性关系良好, 灵敏度高, 检测限均低于25ng/L, 各组分平均回收率在75.1%~99.5%, 重复测定的相对标准偏差为4.6%~12.3%, 可见该方法的准确度和精密度均符合残留分析的要求。
2.2 抗生素的检测
随着养殖业的迅速发展, 为治疗、预防动物疾病和促进机体生长, 相当一部分饲养者违规超量使用抗生素。抗生素使用后, 相当一部分以原物或代谢物的方式随粪便排出, 对周围环境、土壤、水体产生危害, 其中水体受到抗生素类污染最为严重[11]。目前, 畜禽饲养过程中使用较多的抗生素包括氯霉素、四环素类、喹诺酮类和磺胺类。其中氯霉素有严重的不良反应, 它能抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血和粒状白细胞缺乏症等疾病, 欧盟、美国等均在食品法规中规定氯霉素残留限量标准为“零容许量” (zero tolerance) , 即不得检出[12];磺胺类药物具有潜在的致癌性, 已被多个国家规定限量或禁止使用;喹诺酮类药物在美国属水产养殖业的禁用药[13]。同时, 细菌耐药性的产生, 以及由此产生的人体健康和生态问题, 其残留问题已引起人们的广泛关注。
液相色谱串联质谱法灵敏度高, 选择性和特异性好, 抗干扰能力强, 能够对目标化合物含量较低的样品进行很好的定性确认, 使其成为目前较为先进和常见的环境中抗生素类药物的检测方法。张秀妍等[14]应用液质联用仪测定海水中的氯霉素含量, 以50%的甲醇-水溶液为流动相, 采用液相色谱-三重四级杆串联质谱仪、多反应监测扫描模式检测和氘代氯霉素内标法定量, 海水中氯霉素检测方法的线性范围是0.10~10.0 ng/ml, 检出限为0.04μg/L, 定量限为0.10μg/L, 加标浓度在线性范围内时, 回收率大于90%。尹燕敏[11]建立了固相萃取-超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法同时测定水中四环素、土霉素和罗红霉素残留, 水样经过固相萃取纯化、富集, 采用甲酸溶液 (体积分数为0.01%) -乙腈作为流动相梯度洗脱, 在5 min内完成对3种目标化合物的分析, 3种目标化合物的方法检出限介于0.08~0.35 ng/L之间, 测定结果的相对标准偏差为1.4%~5.6%, 空白样品和实际样品的加标回收率分别为82.5%~114%、71.5%~126%。高立红等[15]建立了固相萃取与高效液相色谱-串联质谱联用检测污水中8种氟喹诺酮类抗生素残留的分析方法, 以0.1%甲酸甲醇溶液和0.1%甲酸水溶液作为流动相, 用5%氨水-甲醇溶液洗脱, 以去离子水和污水为基质, 诺氟沙星-d5为替代物进行回收率评价, 8种氟喹诺酮类抗生素在加样浓度为100和25 ng/L时的回收率分别为73.8%~113%和56.8%~115%, 相对标准偏差分别为2.60%~13.2%和3.70%~12.3% (n=4) , 方法检出限为0.2~1 ng/L。
2.3 其他污染物的检测
液质联用技术在水质检测中的应用不仅局限在对农残和抗生素类的检测上, 也广泛应用于其他环境污染物, 这些物质主要集中在染料、表面活性物质、树脂等工业产品的分解产物上。国外使用液质联用技术分析水质中其他环境污染物的应用报道主要有日本利用液质联用技术检测河水中的8个2-苯基苯并三唑化合物[16], 美国液质联用技术检测水中的高氯酸盐及消毒副产物[17], 西班牙液质联用技术检测海底淤泥中的阴离子及非离子表面活性剂[18]。颜流水等[19]建立了利用LC/MS-MS分析检测饮用水中痕量双酚A和邻苯二甲酸丁酯的方法, 水样中双酚A和邻苯二甲酸二丁酯经HLB固相萃取小柱富集, 以V (乙腈) ∶V (水) =90∶10为流动相, 该方法对水样体积为250 ml时双酚A和邻苯二甲酸二丁酯的线性范围为0.4~40 ng/L, 检出限分别为0.16和0.10 ng/L, 低中高3个不同水平的加标平均回收率均在90%以上。宋之光等[20]建立了利用高效液相色谱-串联质谱测定方法对低本底水环境中全氟辛酸和全氟寅酸的测定方法, 以乙腈-乙酸铵为流动相, 该分析方法对于2个分析目标物的最低检出限皆为0.04 ng/L, 定量限分别为0.10和5 ng/L, 标准加入回收率全氟辛酸为92%~99%, 全氟寅酸为90%~105%。
3 结语
综上所述, 液质联用技术由于其具有快速、简便、灵敏等优点, 使其在水质检测领域中得到广泛推广, 对于水中痕量有机污染物的检测有其不可替代的优势。随着色谱技术的发展, 小型或微型色谱柱和有效、科学的流动相组成及洗脱方式等都大大提高了液质联用技术的分离效果, 接口技术的改进和完善、MS谱库识别技术的发展使LC-MS分析的检测限大大降低, 灵敏度得到很大的提高。随着液质联用技术的日益成熟, 其在水质检测领域的应用将得到广泛应用, 同时可以发挥其快速、简便、灵敏的特点探索液质联用技术在突发应急事件中对水体水质快速检测的应用, 在突发应急事件处置中充分发挥其作用。
摘要：液质联用技术 (LC-MS) 是将液相色谱与质谱串联整合成整机的检测技术, 在水质检测、食品检测、药物分析等领域得到了广泛的应用。作者综述了液质联用技术在水质检测中的应用研究进展, 主要从液质联用技术的优点、对水质中农药的检测、抗生素的检测和其他污染物检测的应用等方面进行综述。
液质联用技术 篇3
本文对近年来液质联用的最新技术在食品安全监测中的应用, 尤其是抗生素检测方面的最新应用进行了部分总结, 着重介绍以应用目的为中心, 综合运用增强子离子扫描信息、高质量精度、同位素丰度比例、高质量精度二级离子等信息的工作流程。
抗生素筛查的主要进展
目标抗生素筛查的进展。
在进行抗生素多残留筛查的工作时, 如何精准的定性被测组份, 也就是说如何避免假阳性和假阴性的干扰, 一直以来都是困扰所有筛查工作的难题。随着高分辨质谱的普及, 实验人员寄希望于通过提高分辨率的方法, 避免假阳性的干扰。但在实践工作中发现, 靠分辨率提高所排除的同质异素体 (质量数相同, 分子量只有小数部分的差异) 往往只是干扰的一小部分。实验中带来干扰的同分异构体恰恰占了很大的比重, 比如说常见的磺胺类化合物就有多种同分异构体。而且, 同质异素体的干扰同样可以通过同位素丰度比例的办法进行克服。这样一来, 就要求我们运用尽可能多的信息, 进行确证工作。经过研究, 有机化合物的确证情况和使用的信息符合图1所示关系。因此, 如何建立一种有效的将上述信息整合起来的确证方法是目前为止亟需的解决方案。
目前, AB SCIEX的Triple TOF系列高质量精度质谱平台 (图2) 上的Master View系列软件, 已经运用了上述结论, 全面采用了精确分子量、同位素丰度比例、二级离子预测、谱库确认和保留时间等信息, 可以在大规模基质添加的盲样检测中, 从数百种药物残留中得到可靠的筛查结果, 成功率可达98%, 并且无一例假阴性结果 (没有漏检) 。其筛查过程可以设置上述所有参数的阈值, 如图3所示, 而不同基质条件或者化合物对这些阈值的影响, 也应该成为下个阶段研究的内容。
非目标抗生素的研究。
与目标抗生素相比, 非目标抗生素的毒性更加不明确, 对于环境和细菌耐药性的影响更加复杂。因此, 对于非目标抗生素的筛查和鉴定对于食品安全风险评估, 乃至整个食品和环境领域都有着极深远的意义。目前质谱研究非目标化合物, 均采用了Chem Spider数据库的数据。但是由于Chem Spider目前为止没有二级谱库, 如何对未知化合物进行准确的定性预测就需要更好的软件算法。AB SCIEX的Master View软件, 采用快速子离子预测的方式, 对子离子及其精确分子质量进行预测。如图4所示, 在未知物筛查领域取得了良好的效果。相信大规模的采用此工作流程, 进行鉴定并确定参数的时代已经到来。
抗生素代谢产物鉴定的最新进展
采用检测代谢产物的方法检测违禁药物的使用, 已经在如硝基呋喃等部分药物检测中发挥了重要作用。但是, 目前仍有一部分药品没有很好的代谢物检测方法。AB SCIEX的Light Sight可以根据母药的结构, 结合代谢通路, 对可能的子离子信息进行预测 (如图5所示, 赛庚啶原药的质谱行为预测) 。同时检测所有的相关通道, 自动完成整个代谢物搜索鉴定的工作。
展望
液质联用技术 篇4
1 对象与方法
1.1 对象
共纳入研究对象20例,均为汉族,农民。其中疾病观察组12例均为来源于河南省某地区的艾滋病病毒携带者、艾滋病患者(HIV/AIDS)脾肺气虚证者。健康对照组8例,均为当地健康人。疾病观察组:男6例(50%)、女6例(50%);年龄31～40岁1例(8.3%)、41～50岁6例(50%)、51～60岁5例(41.7%);已婚9例(75%)、离异1例(8.3%)、丧偶2例(16.7%)。健康对照组:男4例(50%)、女4例(50%);20～30岁1例(12.5%)、31～40岁1例(12.5%)、41～50岁3例(37.5%)、51～60岁3例(37.5%);已婚7例(87.5%)、未婚1例(12.5%)。经统计学分析两组对象一般资料差异无显著性。
1.2 诊断标准
西医诊断标准采用国家卫生部2005年推荐《艾滋病诊疗指南》诊断标准:有流行病学史、实验室检查HIV抗体阳性。
中医辨证标准:以课题组前期对HIV/AIDS患者大样本中医证候学的临床调查的研究成果为基础[国家自然科学基金项目(90409004):艾滋病中医证候分布规律及证候标准建立与验证],拟定艾滋病中医常见基本证候辨证标准中脾肺气虚证的诊断标准。中医证候脾肺气虚证相关的症状和体征:动则气喘、易感冒、咳痰清稀、咳声低微、自汗、神疲乏力、恶风寒、心慌心悸、胸闷、泄泻、便溏、舌体胖大、舌质淡或淡白、舌苔薄白、脉象虚或细弱等。
1.3 纳入标准
疾病观察组的纳入标准:(1)HIV确认试验阳性;(2)符合《HIV/AIDS常见中医证候诊断量表》中脾肺气虚证诊断标准,中医辨证须经两名副主任中医师以上职称医生诊断一致;(3)年龄在18～60岁;(4)签署知情同意书。
健康对照组的纳入标准:(1)HIV抗体阴性;(2)身体健康无脏器严重疾病或慢性病急性发作者;(3)无神志不清、痴呆、各种精神病患者;(4)非妊娠或哺乳期妇女;(5)年龄在18～60岁之间;(6)能配合调查并签署知情同意书。
1.4 排除标准
(1)不符合以上纳入标准者;(2)非因感染艾滋病所患的脏器严重疾病,原发性免疫缺陷,激素化疗等引起的继发性免疫缺陷,血液病,其它原因引起的中枢神经系统疾病。
1.5 仪器及试剂
主要仪器设备:LCQ Advantage MAX电喷雾离子阱液质联用仪(美国赛默飞世尔科技公司);色谱柱(Agilent Zorbax C18)(150×2.1mm,3.1μm);高速冷冻离心机(Jouan MR23i)(法国Jouan公司);低温冰箱(MDF5411)(日本三洋株式会社);超纯水器(MiII-QSyntheSiS)(美国MiIIPore公司);KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
主要试剂:乙腈(色谱纯级,购自Merck公司);甲酸 (HPLC/SPECTRO级,购自Tedia公司);甲醇(色谱纯级,购自Merck公司);高纯氮气(纯度>99.99%);高纯氦气(纯度>99.99%)。
1.6 尿液样品的预处理
用EP管收集正常对照组、脾肺气虚证组和湿热内蕴证组研究对象的晨尿2 ml,移取1 ml尿液,4000 转/分高速离心10分钟,取上清液。精密移取上清液300 μl,置1.5 ml离心管中,加入600 μl甲醇,用混匀器混匀约10分钟,然后高速离心10分钟,14000转/分,4 ℃控温,取上清液800 μl,用0.45 μm滤膜过滤,即得供试品溶液,低温冰箱保存。
1.7 液相色谱—质谱条件
(1)液相色谱条件:色谱柱为Agilent Zorbax C18 (150×2.1 mm,3.1 μm);流动相:0.2%冰醋酸水—甲醇梯度洗脱(见表1);流速:0.2 ml/min;进样盘温度:4℃;进样量:20 μl;柱温:30℃;色谱图采集时间不少于60分钟。(2)质谱条件:扫描方式:一级全扫描;鞘气流速:4000 kpa;辅助气流速:1000 kpa;喷雾电压:4 kV;毛细管电压:-4 V;毛细管温度:300℃,质荷比范围:80～1000,采用负离子扫描模式。
1.8 液质联用分析方法学考察
(1)空白溶剂考察:取供试品制备所用甲醇—水(2∶1),按照梯度洗脱条件进样,考察空白溶剂产生的干扰,对数据进行分析时,扣除空白溶剂的干扰。(2)精密度试验考察:取供试品溶液(如正常对照组10号样本),重复进样6次,以总离子流图中各色谱峰的保留时间和峰面积为指标,考察仪器的精密度,多次测量样本相对标准偏差RSD%<3%。(3)重复性试验考察:取同一患者的尿液,分别制样6份,行色谱分析,以总离子流图中各色谱峰的保留时间和峰面积为指标,考察方法的重复性,RSD%<3%;(4)稳定性试验考察:取供试品溶液(如健康对照组10号样本),分别于0、1、2、4、8、12小时稳定电压行色谱分析,以总离子流图中各色谱峰的保留时间和峰面积为指标,考察样品稳定性, RSD %<3%。
1.9 数据分析
(1)经质谱分析仪器自带软件导出原始数据(质荷比对应的峰强度)Excel文件,对数据进行筛选,筛选原则为:每个证型中相同质荷比(数据上下浮动在±1的定义为同一类物质)。(2)对所筛选出的差异结果通过SPSS 13.0软件进行t检验分析,P<0.05有统计学意义。根据P值、各组间相同质荷比均数(同一质荷比对应的不同分组中所有样本峰强度的均数)的比值(以1.5倍原则)进行筛选,筛选出差异物质,通过比较两组间相应代谢产物的峰值明确其变化的趋势(增多或减少)。(3)对其中有显著差异的数据采用PCA模式识别分析。
2 结果
2.1 方法学考察
空白溶剂考察结果显示试剂无干扰;精密度考察、重复性和稳定性考察结果表明仪器精密度良好、方法的重复性和稳定性良好。
2.2 指纹图谱
(见图1～2)
2.3t检验分析
从图3可以看出在HIV/AIDS脾肺气虚证组中质荷比分别为794、618、339、502、118、384的6种物质与正常组相比峰强度均减小,且相差大于1.5倍。质荷比为412、413、368、229、286、287、325、327、529、299、210、347、311、329、331、303、345、523、505、295、300、213、521、507、293、 365的26种物质在HIV/AIDS脾肺气虚证组峰强度明显的高于健康对照组,相差远大于1.5倍。两组物质经t检验均P< 0.05,差异有明显性。其中质荷比为412、505、794、118、329、331的6种物质,在两组中峰度均较高且两组差异明显。可能为两组间的特异性物质。
2.4 PCA分析结果
数据用正交信号校正(Orthogonal Signal Correction,OSC)后进行偏最小二乘模式识别(Partial Least Squares-discriminant analysis,PLS-DA)分析。从变量散点图(plot)中可发现显著差异的变量,即为“生物标志物”。
从图4中可以看出:健康对照组(■所示)和HIV/AIDS脾肺气虚证组(◆所示)两组间能明显的区分开,两组之间存在显著的差异。
从图5中可以看出在分子量为352、388、618、562、502、159、560、384、794、109、101、118、117、125、339的离子物与其他离子相距较远,可以认为是艾滋病病人脾肺气虚证组相对于健康对照组的潜在标志物。
从图6中可以看到:第一主成分:R2Y=0.59,Q2=0.51;第二主成分:R2Y=0.86,Q2=0.75,这说明:第一主成分代表了整体信息的程度为59%左右,预测率为51%左右;第二主成分可以代表整体样本信息的程度为27%左右,预测率为24%左右。前两个主成分对整体样本信息的覆盖程度为80%,整体预测率为75%。这可以认为是一个很理想的模型,它对大部分的数据(主成分)都能进行解释,且预测率较高,预测能力强,结果意义可信。
3 讨论
中医药认识疾病的方法、理论均缺乏合适的现代科学表达体系,目前仍是一种不能与现代医学相兼容、相通的“语言”。要进一步实现中医药的现代化和国际化, 其根本在于用现代科学语言阐释中医独特的理论体系。代谢组学通过获取体内动态变化的综合信息了解人体可能受影响的部位和环节,这与传统中医学“思外揣内”的诊治方法具有内在的同一性,代谢组学是一种较全面的系统的研究技术,在方法学上具有融整体、动态、综合、分析于一体的特点,采用代谢组学这种现代医学承认的尖端技术可以克服中医传统方法的局限,成为适合现代中医药研究的重要技术手段,成为沟通中医和现代医学的桥梁。而且无论是中医的“证”还是代谢组学,研究的都是致病因素作用于人体后机体某一阶段反映的病理性变化的综合情况,二者皆从机体整体变化的角度进行评价分析,共同体现了即时性、整体性的特点。中医“证”是辨证论治的起点和核心,应用代谢组学技术可以分析中医证候的特异性代谢产物或标志物, 进而促进中医证候的客观化和证本质的研究,为中医证候诊断的量化、客观化和标准化提供方法和依据[3]。
本研究运用液质联用技术与主成分分析方法相结合来研究HIV/AIDS脾肺气虚证患者与健康对照研究对象的尿液代谢轮廓的差异,结果显示该方法能够将两组间的尿液代谢轮廓进行良好的区分(PLS-DA图),HIV/AIDS脾肺气虚证患者组相对与健康对照组存在着显著的差异物质或物质群(PLOT图)。基于液质联用技术结合PCA模式识别的代谢组学的研究方法是一种可以用于研究机体复杂病理生理变化的先进的技术方法,或许可以成为揭示中医证候本质研究的强有力的工具。
本次研究通过探索HIV/AIDS脾肺气虚证的代谢物质的差异,尝试为中医药在诊断和防治艾滋病进展中的作用研究提供崭新的思路,尝试为中医证本质研究,更为临床多种疾病的诊断和防治提供新的思路和方法。
摘要：目的 探讨艾滋病病毒携带者、艾滋病患者(HIV/AIDS)脾肺气虚证者尿液的代谢组学特征。方法 采用液质联用技术结合主成分分析方法分析、比较12例HIV/AIDS脾肺气虚证者和8例健康对照者的尿液代谢产物代谢谱的差异。结果 与健康对照组相比较,HIV/AIDS脾肺气虚证者尿液相关代谢产物发生了显著的变化,两组的数据在得分图中实现了准确的分类。结论 运用液质联用技术结合PCA模式识别分析的代谢组学研究方法可以将HIV/AIDS脾肺气虚证者的尿液代谢轮廓与健康对照组进行良好的区分,可以为HIV/AIDS脾肺气虚证的诊断提供一定的客观依据。
关键词：艾滋病,液质联用,主成分分析,中医证候,代谢组学
参考文献
[1]Nicholson JK,Connelly J,Lindon JC,et al.Metabonomics:a platform for studying drug toxicity and gene function[J].Nat Rev Drug Discov,2002,1(2):153-161.
[2]徐舒,陈合兵,李洪,等.“肝郁证”大鼠模型的建立及代谢组学的初步研究[J].中华中医药杂志,2009,24(6):787-791.
液质联用法测定水中敌百虫的含量 篇5
关键词：液相色谱—串联质谱法,敌百虫
敌百虫属于有机磷农药磷酸酯类型的一种，多用于杀虫剂，在农业领域被广泛适用。《饮用水中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》GB/T23214-2008
中规定了用液质联用法测定生活饮用水及其水源水中敌百虫的检测方法。
第一部分，检测方法和原理：
检测方法：经过萃取剂萃取并且富集的手段，用液质联用仪正模式下测定的方法。
第二部分，使用到的试剂以及仪器：
A.仪器
1、美国安捷伦公司6430型液质联用仪
检测器型号：6430 Triple Quad LC/MS:;
色谱柱型号：Agilent SB-C18柱，3.5·2.1·100mm；
自动进样器型号:1260型；
B.试剂
1、载气：液氮；
2、流动相A：甲醇（进口）；
3、流动相B：超纯水；
4、乙酸胺（分析纯);(配成5.0毫摩尔乙酸胺待用）
5、乙腈（色谱纯）；
6、甲酸（进口）；
7、敌百虫标准溶液(进口标准）；
第三部分，检测方法的确认步骤：
A.方法检测条件定性以及优化步骤：
配制高浓度敌百虫标准，通过液质联用仪检测，根据色谱峰形状和峰面积对方法进行优化，确定检测条件如下：
按照优化后的检测条件进样检测，确定敌百虫保留时间为4.46min。
B.标准曲线的测定
分别取0.5,1.0,2.0,5.0,10.0mL敌百虫标准使用溶液，溶于10mL甲醇水（1:1）溶液中，配制的浓度值分别为（ug/l):100,200,400,600,800。测定后峰面积分别为：4431,6202,18541,30868,40179。此外标法线性的相关系数为0.991。
C.精密度的测定
配制敌百虫中间浓度的标准溶液，重复进样7次，测得结果如下表（ug/l):
利用Grubbs检验法进行检验，判断无异常值
D.检测限计算
配制敌百虫，重复进样11次，测得结果如下表(ug/L):
利用Grubbs检验法进行检验，以判断是否有异常值。
DL=SD×t(n-1,0.01）。[t(n-1,0.01）是单侧显著性水平，t取2.764]DL为仪器检出限（单位：mg/L):
定量检出限一般为仪器检出限的5倍，并对数据圆整。
水样检测限（单位：mg/L）的确定：水样在测定时，取250mL水样进行固相萃取，最后得1mL洗脱液，所以水样检测限是定量检测限1/250。最后将数据取整后，得敌百虫检出限为0.0004mg/L。
E.定量检测限的验证
配制浓度接近仪器定量检出限的标准溶液，进样2次，结果如下：
F.高低浓度回收率的确认
配制高浓度和低浓度敌百虫标准溶液并重复进样2次，测得结果如下：
低浓度人回收率：
高浓度回收率：
第四部分，结论：
1.《饮用水中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》GB/T 23214-2008
中提出了水中敌百虫的最大允许浓度可以满足该规范对水质检测的要求。
2.《饮用水中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》GB/T 23214-2008
包含了液质联用分离检测水中敌百虫的检测方法。这次方法确认工作表明此检测过程可以复现。
参考文献
液质联用技术 篇6
关键词：液质联用,2-巯基苯并噻唑,检测
2 - 巯基苯并噻唑,纯品为淡黄色粉末,有微臭和苦味,溶于丙醇、乙醇、氯仿、氨水、氢氧化钠和碳酸钠等碱性溶液,微溶于苯,不溶于水和汽油,主要用作橡胶的硫化促进剂,也用作农药杀菌剂,又可用作腐蚀抑制剂。
2 - 巯基苯并噻唑作为通用型硫化促进剂,合成研究报道很多[1,2],广泛用于各种橡胶。对于天然橡胶和通常以硫磺硫化的合成胶具有快速促进作用。但使用前需要氧化锌、脂肪酸等活化。常与其他促进剂体系并用,如与二硫代秋兰姆和二硫代氨基甲酸碲并用可作丁基胶的促进剂; 与三盐基顺丁稀二酸铅并用,可用于浅色耐水的氯磺化聚乙烯胶料,在胶乳中常与二硫代氨基甲酸盐并用。
2 - 巯基苯并噻唑在橡胶中易分散、不污染,但具有一定的毒性。因此,建立适当的检测方法来测定2 - 巯基苯并噻唑的含量是非常有必要的。目前,对于2 - 巯基苯并噻唑的检测主要采用气相色谱和高效液相色谱法[3,4,5,6],本研究利用2 - 巯基苯并噻唑溶于丙酮的特点,对样品用丙酮进行萃取,由于2- 巯基苯并噻唑具有紫外吸收,且在碱性条件下容易电离,选用超高效液相色谱- 二极管阵列- 质谱联用技术来快速分析塑胶制品中2 - 巯基苯并噻唑。
1 实验
1. 1 样品的前处理
从样品干净部位取样,剪碎至2 mm × 2 mm × 2 mm以下,称取1 g ± 0. 1 g( 精确至0. 1 mg) 的样品于60 m L玻璃反应瓶中,加入10 m L的丙酮,萃取60 min,反复以上操作一次,合并两次的提取液,混匀,用旋转蒸发仪浓缩至少量剩余,再慢慢氮吹至干,然后用丙酮定容至1m L,最后将样品通过0. 22 μm微孔滤膜过滤,得到待测试样,UPLC - PDA - MS分析测试。
1. 2 检测方法
1. 2. 1 仪器设备
ACQUITY UPLC H - CLASS SQD2 液相色谱- 二极管阵列-质谱联用仪( UPLC - PDA - MS) ,美国Waters公司; 2300HT超声波清洗器,上海安谱科学仪器有限公司; H1650 台式高速离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司; V - 850 旋转蒸发仪,瑞士BUCHI公司; XW - 80A漩涡混合器,上海精科实业有限公司; X205BDU十万分级分析天平,瑞士METTLER TOLEDO公司; AL204 万分级分析天平,瑞士METTLER TOLEDO公司。
1. 2. 2 实验材料
UPLC级丙酮,上海安谱科学仪器有限公司; 2 - 巯基苯并噻唑标准品,德国Dr. Enrenstorfer。
1. 2. 3 标准溶液的配制
用十万分级分析天平准确称取0. 01 g的2 - 巯基苯并噻唑标准品,加入10 m L容量瓶中,用丙酮溶解定容,配成1000 mg / L的标准储备液,然后逐级稀释成0. 1、0. 5、1、2、5、10 mg / L的标准工作溶液。
1. 2. 4 液相色谱- 二极管阵列- 质谱检测器条件选择
1. 2. 4. 1 液相色谱条件:
色谱柱: ACQUITY UPLC( R) BEH C181. 7 μm,2. 1 × 100mm Column; 保护柱: ACQUITY UPLC( R) BEH C181. 7 μm,2. 1× 5 mm Van Guard Pre - Column; 流动相A: 10 mmol / L乙酸铵水溶液,流动相B: 乙腈; 分析时间: 4 min; 流速: 0. 2 m L/min; 柱温: 40 ℃ ; 进样量: 1 μL。具体的洗脱程序见表2。
1. 2. 4. 2 二极管阵列检测器条件
波长扫描范围: 190 ~ 400 nm; 扫描通道: 324 nm; 采集速率: 20 点/秒; 采集时段: 0 ~ 4 min。
1. 2. 4. 3 质谱检测器条件
电离方式: ESI-; 载气: 液氮; 毛细管电压: 2. 0 k V; 锥孔电压: 50 V; 脱溶剂气温度: 500 ℃; 脱溶剂气流速: 1000 L/h;扫描方式: SCAN和SIR; SCAN离子范围( m/z) : 80 ~ 300;SIR离子( m / z) : 166. 2。
1. 2. 5 定性定量方法
通过PDA光谱图和MS质谱图同时对待测物质进行定性,采用外标法按PDA最大吸收波长324 nm处吸光度的峰面积或MS中SIR离子166. 2 的响应值进行定量。
1. 3 检测结果
1. 3. 1 2 - 巯基苯并噻唑的出峰情况及定量波长和定量离子的选择
在上述条件下,2 - 巯基苯并噻唑能够得到很好分离,基线平稳,峰形对称,达到了很好的试验结果。
1. 3. 2 标准工作曲线
从图3 中2 - 巯基苯并噻唑的PDA和MS标准工作曲线可以看出,在0. 1 ~ 10 mg/L的线性范围内,2 - 巯基苯并噻唑的PDA和MS线性相关系数均达到0. 999 以上,完全能满足测试要求。
1. 3. 3 检出限确定
在该方法条件下,对不同浓度的标样进行分析,可得出2- 巯基苯并噻唑的PDA和MS检出限( 3 倍信噪比) 均能达到0. 1 mg / L,可以满足2 - 巯基苯并噻唑的测试要求,如图4 所示。
1. 3. 4 精密度实验
在该方法条件下,取中间浓度点2 mg/L的2 - 巯基苯并噻唑标准样品,连续测定7 次,可得相对标准偏差< 5% ,精密度较好。结果见表5。
1. 3. 5 准确度实验
在该方法条件下,在空白样品中分别加入浓度为0. 05 mg/L,2 mg / L,10 mg / L的标样,每一个浓度点做三次平行试验,计算加标回收率。通过加标测试,得到2 - 巯基苯并噻唑的回收率在90% ~ 110% 之间,可见该方法准确度较高。结果见表6。
2 结论
( 1) 本研究建立了一种超高效液相色谱- 二极管阵列- 质谱联用法测定塑胶样品中2 - 巯基苯并噻唑的分析测试方法。该方法串联了PDA和MS两种检测器,能更好地对待测物质进行定性定量分析。
( 2) 该方法简便快速,选用丙酮作为萃取剂,通过两次超声萃取后就能达到很好的萃取效果,在优化的分析条件下,2- 巯基苯并噻唑在4 min时间内可以得到很好的色谱峰,并能获得很好的分离效果。
( 3) 该方法检测限低,重现性好,加标回收率高,用PDA和MS同时对2 - 巯基苯并噻唑进行定量分析,在0. 1 ~ 10 mg/L的浓度范围内线性良好,线性相关系数均能达到0. 999,检出限达到0. 1 mg/L,相对标准偏差< 5% ,样品加标回收率为90% ~ 110% .
参考文献
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液质联用技术 篇7
1993年,BIPM(国际计量局)、ISO(国际标准化组织)、IFXX(国际临床化学联会)等七个国际组织联合制定了《测量不确定度表示指南》[1],将测量不确定度定义为:“与测量结果相关联的一个参数,用以表征合理地赋予被测量之值的分散性”,即不确定度用于表达测量结果的分散程度,是一个可用数字描述的定量概念[2]。,测量的水平越高,试验质量越高,则测量不确定度越小;反之亦然。测量不确定度评定的包括以下几步:第一,规定被测量;第二,识别不确定度的来源;第三,不确量化定度分量;第四,计算合成不确定度;第五,报告不确定度[3]。随着时代的发展,检测手段和检验方法的逐步完善,为了更合理、科学地控制质量,测量不确定度被引入食品药学领域[3]。
液相-质谱联用技术(Liquid Chromatography-Massspectrometry)是20世纪发展起来的一门综合分析技术,该技术在天然药物化学成分分离和鉴定、药物动力学和药物代谢产物研究、蛋白质分离和鉴定、残留物分析、临床诊断研究等方面都具有广泛的应用[4]。作为目前最重要的分离和鉴定分析方法之一的技术,其不确定度的评定也理所应当受到充分重视。近年来液质联用测定的不确定度评定也有不少文献报道,但由于液质联用测定不像传统光谱或高效液相色谱法测定参数简单、重现性好,不同仪器、不同参数、不同目标物质……甚至不同分析时间均产生不同误差,因此不确定度的评定也相对复杂。
本文综述了近年来发表的在食品药品等领域液质联用法评定不确定度的主要文献。
1 液质联用法的测量不确定度评定
张清华、杨劲、贺英等[5]采用液相色谱-串联质谱联用法测定曲克芦丁血药浓度,用自底向上法与方法学验证数据相结合的方法,计算相对标准不确定度和合成相对不确定度。结果:提取回收率和标准曲线是最主要不确定度分量。其中,标准曲线分量大小与浓度范围和重复次数密切相关。
杨杰、谭洁,邹建军[6],评价了液相色谱串联质谱法测定氯吡格雷羧酸代谢物SR26334血药浓度的不确定度,结果20μg/L的SR26334的标准不确定度为0.816μg/L,扩展不确定度为1.63μg/L。结论是样品前处理和标准曲线拟合是浓度测定结果的主要的不确定度来源。
武利庆、王晶[7]比对了直接流动注射电喷雾质谱法和液质联用电喷雾质谱法测定牛血清白蛋白相对分子质量的测量不确定度:直接流动注射法较液质联用法测定扩展不确定度高。作者认为:液质联用电喷雾质谱法测定结果的中心值与理论值更为接近主要是由于在直接流动注射分析时样品中残留的缓冲盐和少量的多肽等杂质可能与牛血清白蛋白形成加合物,使相对分子质量测定结果发生偏差;而液质联用测定时经过色谱柱的分离和脱盐,杂质对相对分子质量测定结果的影响大大降低。
徐淑暖、韩媛媛、陈砚朦等通过超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中氯霉素的残留[8]量,内标法定量。结果:不确定度的来源主要是标准溶液浓度、标准曲线拟合、待测样品的制备时、回收率和样品测定的重复性等。作者对测量不确定度较大的原因进行了讨论,并对计算方法进行简化,认为样品中氯霉素的含量低,对照品稀释步骤较多,引入贡献最大。并且待测样品基底和前处理复杂,造成回收率偏低,引入的不确定度较大。作者将与天平称量操作的重复性、定容体积重复性和移液体积重复性这几项重复性分量合并为总测量过程的一个分量,由测量结果的重复性表示,不再单独计算。
任雪冬、刘成雁、林雪征等[9]对畜禽肉中十种磺胺类兽药残留检测的不确定度进行了分析和评定。结果:标准品的配制、稀释,标准曲线校准,样品回收率对样品的相对不确定度贡献较大。作者同样认为样品前处理中样本制备、提取、净化等环节带来的污染或损失,基质干扰,仪器进样、检测器响应等误差均可以通过增加回收率实验考察不确定度贡献。
2 结果与讨论
测定不确定度与测量误差既有区别,又有联系。误差是客观存在的测量结果与真值之差。但由于真值往往不知道,无法准确得到。测量不确定度是说明测量分散性的参数,由分析和评定得到,因而与人的认识程度有关[10]。测量误差很小,但对不确定度的认识不足,计算的不确定度可能较大;反之分析估计不足,给出的不确定度比实际偏小。因此,科学的评估方法是关键。
高效液相色谱法评估测量不确定度的文献较多,鉴于液质联用法与普通高效液相色谱法的主要区别:测量浓度范围低和基质效应。采用液质联用法评定测量不确定度的文献多得出结论:不确定度来源主要为标准曲线和前处理。这主要是由于低浓度需要更多的稀释步骤,减少基质效应需要更复杂的样品前处理步骤,更需要进行回收率的验证;为了消除前处理回收率的变化,可以引入内标定量,而内标物质的回收率和基质效应又需要进一步验证。因此,采用液质联用法评定测量不确定度时应着重关注基质效应和回收率的问题,并且避免重复计算。
摘要：目的:提高液质联用法的测量不确定度的普及与运用水平。方法:精选汇总了近年来国内采用液质联用法评定不确定度方面发表的论文。结果与讨论总结不确定度评定的主要参数,指出了目前研究中存在的主要问题,以期为今后的研究提供基础资料。
关键词：不确定度,液质联用,研究进展
参考文献
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[5]张清华,杨劲,贺英,汤丽玲,杜迎翔.对液相色谱-串联质谱测定曲克芦丁血药浓度的不确定度评价[J].中国临床药理学杂志,2010,26(01):68-70.
[6]杨杰,谭洁,邹建军.液相色谱-串联质谱法测定氯吡格雷羧酸代谢物SR26334血药浓度的不确定度评价[J].中国新药与临床杂志,2013,32(08):664-668.
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[8]徐淑暖,韩媛媛,陈砚朦,彭寨玉,张少彬.超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中氯霉素残留量的不确定度评定[J].华南预防医学,2014,40(05):454-458.
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