实验性糖尿病模型

实验性糖尿病模型（通用7篇）

实验性糖尿病模型 篇1

摘要：目的 通过建立符合2型糖尿病发病特点的大鼠模型,运用电针胃脘下俞穴的方法对2型糖尿病大鼠进行治疗,验证胃脘下俞穴对2型糖尿病的疗效。方法 选用雄性Wistar大鼠,利用高脂高糖饲料喂养4周后将链脲佐菌素(STZ)按35 mg/kg剂量腹腔注射诱导2型糖尿病的大鼠模型。对造模成功的Wistar大鼠采用电针胃脘下俞穴进行治疗,每次20分钟,每周治疗5次,连续4周。结果 与模型组比较,治疗组大鼠血清瘦素水平(P=0.029)及空腹血糖值(P=0.007)显著下降,接近空白对照组水平,而模型组变化不大;治疗组甘油三酯(TG)含量降低,但与空白组比较(P>0.05)差异无统计学意义;治疗组高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)与模型组相比均有升高,但(P>0.05)差异无统计学意义。结论 电针胃脘下俞穴可明显降低2型糖尿病大鼠血糖、血清瘦素及甘油三酯含量,对高、低密度脂蛋白也有调节作用,证明了该穴对2型糖尿病的治疗作用,并通过降低廋素、改善血脂成分含量这一途径产生治疗作用。本实验对探讨胃脘下俞穴的治疗作用及作用机制具有一定的临床意义。

关键词：电针,胃脘下俞,2型糖尿病模型,血糖,血脂

胃脘下俞,别名胰俞,属经外奇穴,古称胃管下俞、胃下俞、内胰俞等,位于第8胸椎棘突下旁开1.5寸,具有和胃化痰、理气止痛的作用,主治消渴、咽喉干等。在选穴方面,《千金翼方》就有消渴喉咙干,灸胃管下俞的记载,把胃管下俞作为治疗糖尿病的重要穴位。古代医家选用针刺胃脘下俞或梅花针叩击脊柱第8至第10胸椎两侧部位,以从阳引阴,使阴阳平衡,对阴虚内热的消渴有良好的治疗作用[2,3]。

瘦素(Leptin)作为一种脂肪细胞产生的激素,被临床用于反映肥胖、高血压、糖尿病病程的一个指标。瘦素的主要功能是引起食欲降低和能量消耗从而减轻体重[3],这种功能是Leptin作用于下丘脑的体重调节中枢,与瘦素受体(Leptin receptor,Leptin R)结合而发挥的。瘦素能调节机体脂肪的稳定[4],它被认为向神经中枢提供了营养状况和脂肪堆积信息,从而调整饮食、行为、食欲和能量消耗[5,6]。

针灸具有调节人整体生理功能,调节神经-内分泌-免疫网络的作用,具体表现为机体接受针灸的刺激信号后促进神经肽类、乙酰胆碱类、氨基酸等多种神经递质的释放及调节肾上腺皮质激素、胰岛素、生长激素等的分泌,通过针刺对胰岛素分泌的影响从而可以调节胰腺功能[7]。为此,课题组选用电针大鼠“胃脘下俞”穴的方法,想进一步探索验证“胃脘下俞”穴对2型糖尿病大鼠的降糖作用以及与瘦素的关系,以期为2型糖尿病的针灸临床治疗增加实验依据。

1 材料与方法

1.1 糖尿病大鼠造模

选用体重为(100+10)g的4周龄雄性清洁级Wistar大鼠35只[购于北京斯贝福公司,批号SCXK(京)2011-0004],随机分为空白对照组9只,2型糖尿病造模组26只。适应性喂养1周后,利用高脂高糖饲料(按1.5%胆固醇、0.25%胆酸钠、10%猪油、5%蔗糖、83.25%基础饲料配制,北京科澳协力饲料有限公司提供)连续喂养4周,于最末一天禁食12小时,将链脲佐菌素(STZ)溶于0.1 mmol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液中(p H值=4.1,在冰浴中新鲜配制),按35 mg/kg剂量腹腔注射诱导2型糖尿病的大鼠模型,72小时后以空腹血糖值≥11.1 mmol/L[8,9]者为造模成功。造模过程中,其中5只血糖未达标准而剔除,1只由于血糖过高而死亡,共成模20只。

1.2 分组与治疗

空白对照组9只,造模成功的大鼠随机分为模型组和电针治疗组各10只。电针治疗组取双侧“胃脘下俞”(参照石学敏等[10]编订的《实验针灸学》),将大鼠固定于自制鼠袋中,将穴位用75%的酒精棉球消毒后用针灸针(中研太和牌,无锡佳健医疗器械有限公司生产,0.22×13 mm)直刺,进针深度约4~6 mm。针柄接通英迪KWD-808型电针仪(单侧胃脘下俞及臀部“非穴”各连一对电极),连续波,频率15 Hz,电流强度4~6 m A左右,以引起大鼠肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜,留针20分钟/次,1次/日,5日/周,连续4周。

1.3 指标的测定及方法

空腹血糖:治疗前后禁食过夜12小时,将大鼠尾尖消毒后快速点刺,用罗氏快速血糖仪及配套试纸测血糖。

血清瘦素:末次治疗后禁食过夜12小时,以1%戊巴比妥钠按40 mg/kg麻醉后腹主动脉取血,静置20分钟后离心,收集血清将其保存于-80℃冰箱中待测瘦素。采用Elisa试剂盒,按试剂盒使用说明进行操作。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析,计量资料以±s表示,多组间资料比较采用单因素ANOVA方差分析。

2 结果

2.1 治疗前后各组大鼠空腹血糖值比较

治疗前空白对照组与模型组、电针组的空腹血糖相比,差异显著均有统计学意义(P<0.05),说明造模成功。模型组与电针组的空腹血糖值比较,差异无统计学意义(P>0.05),说明两组来自同一大样本。

治疗4周后,电针组的空腹血糖值显著下降,接近空白对照组水平,差异无统计学意义(P>0.05),而与模型组相比(P<0.05)具有显著差异,说明电针组降糖效果明显。见表1。

注:与空白对照组对比aP<0.05;与模型组对比bP<0.05(下同)

2.2 治疗后各组大鼠血脂水平比较

治疗4周后,电针组的血清瘦素值显著降低,接近空白对照组水平,与空白对照组相比P=0.529(P>0.05),差异无统计学意义,而与模型组相比,血清瘦素水平明显降低P=0.029(P<0.05)具有显著差异,说明电针组通过电针对大鼠“胃脘下俞”的刺激后能有效改变血清瘦素含量。模型组与空白对照组相比,血清瘦素水平显著升高,P=0.008(P<0.05),差异有显著统计学意义。这一结果提示,瘦素与2型糖尿病的发病可能有一定关联,这与部分文献报道一致[11,12]。电针组的甘油三酯(TG)显著降低,接近空白对照组水平,但与空白对照组相比差异有统计学意义P=0.043(P<0.05),而与模型组相比,TG水平明显降低P=0.009(P<0.01)具有显著差异;电针组高密度脂蛋白(HDL-C)有所升高,接近空白对照组水平(P>0.05),差异无统计学意义,模型组HDL-C与空白组比较有降低,但差异无统计学意义;电针治疗后治疗组LDL-C有所升高,但与模型组和空白组比较(P>0.05),均无统计学意义,模型组与空白组比较(P<0.05),差异有统计学意义。

实验结果显示电针治疗后,大鼠的血脂发生变化,这一变化使大鼠的血脂水平朝着更好的方向发展,从而达到有效控制血糖的作用。见表2。

3 讨论

3.1 电针胃脘下俞对血糖的影响

本实验研究发现,电针“胃脘下俞”可以使糖尿病大鼠的空腹血糖值显著降低,同时也可以明显降低糖尿病大鼠血清瘦素的含量。目前国内大部分学者认为瘦素与胰岛素之间存在双向调节作用[13,14]。课题组通过电针大鼠“胃脘下俞”,使瘦素与其受体结合,调节下游参与血糖调节的神经内分泌递质的分泌(例如:神经肽),从而有效发挥瘦素调节能量代谢、改善胰岛素敏感性和葡萄糖代谢的作用[15]。糖尿病大鼠体内瘦素水平得到有效控制后,可显著改善胰岛素抵抗[16],这可能是针刺调控糖尿病大鼠血糖的重要机制,同时也是瘦素—胰岛素轴的体现。

3.2 电针胃脘下俞对血脂的影响

糖尿病是由于体内胰岛素绝对或相对不足而引起的以糖、脂肪、蛋白质等代谢紊乱为主的一种内分泌疾病[17],因此2型糖尿病患者往往同时存在血脂代谢紊乱。

2型糖尿病因胰岛功能不足,使脂肪细胞内的激素敏感脂酶活性升高,脂肪组织释放大量脂肪酸,因而增加总胆固醇(TC)、TG的合成;同时,胰岛素抵抗可通过抑制脂蛋白酯酶活性,使TG的脂蛋白清除时间延长,进一步促进血脂异常[18]。另一方面,高脂血症又会抑制胰岛素分泌,加剧胰岛素分泌障碍和胰岛素抵抗,而且脂代谢紊乱尤其是LDL-C含量升高可导致内皮下间隙LDL-C的氧化作用及其它修饰作用增强,促进动脉粥样硬化斑块形成,对糖尿病患者发生心血管并发症有显著作用[19,20]。

HDL-C是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白,HDL-C对判断血脂是否异常具有重要临床意义[21]。本课题研究发现电针胃脘下俞能有效改善2型糖尿病大鼠的胰岛功能,从而影响胰岛素的分泌,调节血糖;通过电针胃脘下俞调节2型糖尿病大鼠的瘦素、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等的含量来改善脂代谢紊乱的状况。关于电针胃脘下俞调节血糖血脂的进一步机制将在今后的实验中深入探讨。

实验性糖尿病模型 篇2

1 材料与方法

1.1 动物

雄性Wistar大鼠90只,10周龄,体重(170±20) g,购自山东省试验动物中心,质量合格证号 SCXK(鲁)20050004。饲养于山东中医药大学动物试验中心。基础饲料热卡配比:碳水化合物占60%,蛋白质占22%,脂肪占10%,维生素及矿物质等成分占8%,高脂饲料:碳水化合物占30%,蛋白质占12%,脂肪占52%(动物脂肪为主),维生素及矿物质等成分占6%。

1.2 药品

清热祛湿方药由潍坊市中医院制剂室煎制。方剂组成:川黄连12 g,炒苍术15 g,厚朴10 g,炒枳壳15 g,茵陈30 g,佩兰12 g,当归15 g,薏苡仁20 g,玄参12 g,丹参15 g。以上方药加500 mL清水浸泡30 min,文火煎煮至150 mL,煎煮2次,混合煎取液,水浴浓缩成剂量为2.5 g/mL的药液,4℃冰箱储存备用。对照组予二甲双胍(格华止,中美上海施贵宝制药有限公司生产,每片500 mg,生产批号:国药准字H20023370)。二甲双胍溶入生理盐水中配成混悬液,4 ℃冰箱储存备用。以上2种药液均按《人和动物间按体表面积折算的最小剂量比值表》换算。

1.3 试剂和仪器

STZ(美国Califonia chemistry公司),TNF-α(上海晶美生物技术公司的ELISA试剂盒),大鼠专用胰岛素放免试剂(北京北方生物技术研究所)。Accuchek advantage Ⅱ 型血糖仪由罗氏公司提供,高速低温离心机(RC5C型,美国Beckman公司),γ-计数器(FJ-2003150型,瑞典Pharmacia),752型分光光度计(上海分析仪器厂),Elecsys 2010型化学发光仪,7170型自动分析仪,冰箱,恒温振荡器等。

1.4 方法

1.4.1 造模及给药方法

采用喂养高脂饲料加腹腔注射STZ的方法复制IR模型[2]。90只雄性Wistar大鼠随机分为6组,其中,正常组10只普食饲养,其余每组16只,饲以高脂饲料。1月后,高脂饲料饲养的大鼠给予STZ 30 mg/kg腹腔注射,1周后以空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L为2型糖尿病IR大鼠造模成功。正常组腹腔注射0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5)2 mL～3 mL,1周后空腹血糖处于正常范围内为正常组大鼠。取50只模型大鼠随机分为清热祛湿方低、中、高剂量组,二甲双胍组,模型组,每组10只,与正常组一起纳入研究。清热祛湿方低、中、高剂量组分别以清热祛湿方溶液按4 ml/(kg·d)、8 ml/(kg·d)、16 ml/(kg·d)加蒸馏水至4 mL灌胃,二甲双胍组以二甲双胍100 mg/(kg·d)溶于4 mL水中灌胃。正常组和模型组均以4 mL蒸馏水灌胃。每2周剪尾取血监测血糖1次,以禁食6 h的非空腹血糖下降至正常组平均水平或与造模成功时相比有统计学意义为治疗有效。于给药2月后禁食12 h,腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉,腹主动脉取血,分离血清,放入-80 ℃冰箱待检。整个试验过程中,数据保留完整的大鼠分别为正常组10只,清热祛湿方低剂量组7只,中剂量组8只,高剂量组7只,二甲双胍组7只,模型组7只。

1.4.2 监测项目及方法

分别测定体重、FBG、空腹胰岛素(FINS)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、TNF-α,计算胰岛素敏感指数(IAI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。

1.4.3 统计学处理

所有数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,组间比较采用完全随机分组方差分析,治疗前后资料的比较采用配对 t 检验。所有统计学分析采用SPSS 10.0软件包处理。

2 结 果

2.1 模型大鼠一般情况

2型糖尿病IR大鼠造模成功后,模型大鼠体重增加,活动减少,进食量、饮水量增加,对外界反应能力下降。各组大鼠治疗前后体重比较结果显示:与治疗前比较,清热祛湿方中、高剂量治疗组及二甲双胍组均可明显降低大鼠体重(P<0.05),治疗后各组比较,中、高剂量组与二甲双胍组比较无统计学意义(P>0.05)。提示清热祛湿方治疗及二甲双胍治疗干预均可减轻模型大鼠体重,且中、高剂量组减轻体重的作用与二甲双胍组无统计学意义。详见表1。

2.2 各组大鼠治疗前后TNF-α、TC、TG比较

模型大鼠血清TNF-α水平明显升高,血脂显著升高,且以TG升高为主。治疗后清热祛湿方治疗组及二甲双胍组血TNF-α、TC、TG下降(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,血清TNF-α、TC、TG下降差异有统计学意义(P<0.05);治疗后与二甲双胍组比较,中、高剂量组血清TNF-α、TG水平降低(P<0.05)。清热祛湿方可降低血清TNF-α、TC、TG水平,而且随着剂量的增大,疗效增加。与二甲双胍治疗比较疗效更加显著。详见表2。

2.3 各组大鼠FBG、FINS、IAI、HOMA-IR比较

造模成功后,大鼠FBG及FINS明显升高,胰岛素敏感性降低,加重了胰岛素抵抗。治疗后中、高剂量组及二甲双胍组FBG、FINS、IAI、HOMA-IR均有统计学意义(P<0.05),并以中、高剂量组下降最明显;与模型组比较,中、高剂量组及二甲双胍组FBG、FINS、IAI、HOMA-IR比较均有统计学意义(P<0.05);与二甲双胍组比较,FBG变化无差异,但中、高剂量组FINS、IAI、HOMA-IR变化有统计学意义(P<0.05)。清热祛湿方可明显降低糖尿病大鼠血糖及胰岛素水平,增加胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗,且随着剂量的增加,疗效更加显著。详见表3。

3 讨 论

2型糖尿病属中医学“消渴”范畴。在中医经典论著中没有与IR相对应的专门论述,但其临床表现多属于中医“肥满”“眩晕”“消渴”等范畴[3]。如《素问·通评虚实论》指出“消瘅,肥贵人,则膏粱之疾也”。祖国医学对糖尿病、IR多从阴虚燥热、痰浊血瘀立论。近年来,随着生活方式及饮食结构的改变,2型糖尿病IR患者多见湿热中阻者[4]。中医学认为消渴病的主要病因为长期食用肥甘厚腻之品,复因运动减少,而致脾失健运,运化水湿功能下降,食滞中焦郁而化热,导致湿热中阻,津液敷布失常,可见口干多饮,多尿等症,久而发为消渴。脾失健运,湿热内蕴是其主要病机。脾虚为本,湿热为标,故清热祛湿,健脾行气是其治疗大法,脾气得健则湿热自除,在IR的治疗中尤为重要。遵“法从证立,方从法出”的组方原则,组成清热祛湿方。方中川黄连、苍术、厚朴清热健脾燥湿行气为君药;佩兰、枳壳化湿行气,茵陈清热祛湿,加川黄连清热祛湿作用为臣药;当归、薏苡仁、玄参、丹参活血健脾利湿为佐使药。诸药合用共奏清热祛湿,健脾行气之功。

TNF-α与IR密切相关[5],而关于中药改善TNF-α所致IR的报道较少。实验研究证明,清热祛湿、健脾行气治疗可明显降低血TNF-α水平,同时可减轻体重,有效改善糖、脂代谢异常,从而增加胰岛素敏感性,改善IR,且随着剂量的增加疗效更加显著。清热祛湿治疗可明显改善湿热内阻型糖尿病患者的IR,其治疗作用是多途径、多靶点、多环节的。该疗法为中医药防治2型糖尿病IR提供了新的思路和靶点。但上述研究仅限于实验动物,推广用于临床治疗尚有待于进一步的研究。

摘要：目的研究清热祛湿方对2型糖尿病模型大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,以观察清热祛湿方治疗对胰岛素抵抗(IR)的影响。方法雄性Wistar大鼠90只,采用高脂饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法,建立2型糖尿病IR大鼠模型,取50只造模成功的大鼠,与正常组一起纳入本研究。模型大鼠随机分为5组,分别为清热祛湿方低剂量组、中剂量组、高剂量组,二甲双胍组,模型组。于给药2月后,各组大鼠治疗前后分别测定TNF-α、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、血脂,计算胰岛素敏感指数(IAI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。结果清热祛湿方可明显降低模型大鼠血清TNF-α水平,同时有降低血糖、血脂作用,治疗后IAI、HOMA-IR均明显改善,与对照组相比有统计学意义。结论清热祛湿方治疗可明显降低2型糖尿病IR模型大鼠TNF-α水平,增加胰岛素敏感性,改善IR。而且随着剂量的增大,疗效更加显著。

关键词：清热祛湿方,糖尿病模型,胰岛素抵抗,肿瘤坏死因子-α

参考文献

[1]熊曼琪,朱章志.中医中药治疗非胰岛素依赖性糖尿病必须研究IR[J].中医杂志,1995,36(1):47-48.

[2]马海港,张汝学,贾正平.IR动物模型的研究进展[J].国际内分泌代谢杂志,2008,28(1):33-36.

[3]仝小林,段军.代谢综合征的中医认识和治疗[J].中日友好医院学报,2002,16(5-6):347.

[4]丁学屏,陆灏,虞芳华,等.非胰岛素依赖型糖尿病中医辨证分型与胰高糖素、胰岛素敏感性相关研究[J].上海中医药杂志,1999,33(9):18.

实验性糖尿病模型 篇3

1 脑缺血模型的制备

1.1 大鼠全脑缺血模型

1.1.1 双血管闭塞法

1972年由Eklof等首先建立, 方法为结扎大鼠双侧颈总动脉 (CCA) , 并控制动脉血压为50mmHg, 缺血5~20分钟, 即可造成全脑缺血模型[2]。制造低血压有两种方案:通过尾动脉放血降低血压, 或使用降压药酚妥拉明把血压降到50mmHg。以后又做了一些改良, 如颈部软组织加压, 或通过剪尾放血、腹腔注射硝普钠、颈总静脉处置管抽血等方法降低血压。优点是操作简单方便, 失败率低, 动物存活率相对较高;缺点是常因存在侧支循环而造成缺血不完全, 血压的轻微波动会影响实验结果。

1.1.2 三血管闭塞法

由Kameyama等[3]建立, 用电凝切断基底动脉, 并通过阻断与开放双侧CCA, 实现全脑-缺血再灌流。此法手术损伤稍大, 操作不当易造成动物死亡;但模型稳定性好, 可通过阻断CCA的时间长短来控制缺血程度, 模型成功率高。

1.1.3 四血管闭塞法 (4-VO)

1979年由Pulsinlli等[4]首先建立, 后正中切口, 用小的单极电凝针电凝双侧椎动脉, 造成永久性闭塞;前正中切口, 夹闭双侧CCA, 建立全脑缺血模型。此模型优点是可产生严重的脑缺血, 放松动脉夹可进行再灌注实验;缺点是成功率低, 对动物损伤极大, 动物死亡率高。Todd在此基础上进行了改进, 采用了钻透第一颈椎小孔的方法直视下直接烧灼椎动脉, 成功率几乎100 %[5]。也有学者将Pulsinlli法使用的单极电凝针改为双极电凝针, 并且用钢丝插入翼突孔间接烧灼椎动脉, 改进后的方法更简单、实用、成功率高。张更等[6]取颈正中切口烧灼椎动脉, 这种单纯腹侧手术入路的4-VO法使动物创伤明显减少, 死亡率大幅下降。

1.1.4 七血管闭塞法

阻断包括双侧颈外动脉 (ECA) 、颈内动脉 (ICA) 分支翼腭动脉 (PPA) 、基底动脉和双侧CCA, 造成全脑缺血。

1.1.5 Levine低氧性缺血模型

结扎大鼠一侧CCA, 次日将大鼠放入逐渐降低的低氧环境中, 历时45分钟, 结果引起脑蛋白质灰质和海马损伤[5]。

1.1.6 心脏猝停致全脑缺血模型

最常用的模型是通过心导管注射冷的氯化钾溶液导致心脏猝停, 经过一定时间后, 给予心肺复苏, 就可造成暂时性全脑缺血模型。另一种方法为通过窒息导致心脏猝停。

1.2 沙土鼠全脑缺血模型

蒙古种沙土鼠缺少连接ICA和椎-基底动脉系统的后交通动脉, 而在双侧大脑前动脉近端有近1/3也无衔接的血管, 因此利用沙土鼠的这个独特的解剖特性, 结扎双侧CCA即可造成全脑缺血模型。此模型手术简单, 创伤小;缺点是沙土鼠体积小, 生理反应不稳定, 操作技术要求高[7]。

1.3 局灶性脑缺血模型

1.3.1 开颅机械闭塞大脑中动脉法

大脑中动脉 (MCA) 供血区是人类脑卒中的多发部位, 闭塞大脑中动脉 (MCAO) 模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型, 而造成MCAO的最直接方法即为开颅闭塞法。目前较常用的是经颞下入颅和经眼眶入颅。经颞下入颅是Tamura等首先使用, 经眼眶入颅以O’Brien等的方法比较常用[8]。后来此模型又被广泛应用并进一步改良, 如:电凝闭塞MCA所有可见分支, 使梗死率大大提高;合并降低动脉血压以减少伴行血管对梗死区的血供, 可扩大梗死面积等等。此模型的优点是直视下操作, 梗死成功率较高, 是目前梗死灶最为可靠、缺血效果最好、国际上应用最经典的MCA缺血模型;缺点是开颅创伤大, 易感染, 不可避免地引起脑脊液外流, 并需要较高的外科手术技巧。

1.3.2 线栓法MCAO

1986年Koizumi等首次报道了不用开颅闭塞大鼠MCA的可逆性模型的制备方法, 开创了MCAO模型的新途径, 进而成为MCAO模型的经典方法[9]。1989年Zea Longa对该方法进行了改进, Traystman[10]在脑缺血动物模型综述中给予详尽介绍, 即颈正中切口分离CCA、ECA和ICA, 阻断CCA、ECA及其分支和ICA的分支PPA, 从ECA或CCA插入尼龙线, 经ICA到大脑前动脉, 以阻断MCA发出处的血供。尼龙线的插入一般有两种方式:一种是从ECA残端插入至ICA颅内段, 另一种是从CCA或ICA切口插入尼龙线。线栓法制作MCAO模型十分常用, 很多学者在Longa的基础上进行了改进。何学令[11]用提线法阻断血流和在ECA上剪小口进行插线。龚彪等[12]采用预先在CCA、ICA套线, 可以方便有效地控制出血。刘富东等[13]采用左侧颈部切口, 这样手术视野暴露较好, 并且认为不结扎PPA有利于防止ICA血栓形成。线栓法中栓线的制作与造模成功与否息息相关。目前大多数研究认为, 采用直径0.25~0.30mm、置入长度自CCA分叉处 (18.5±0.5) mm的栓线最为适宜。处理栓线的方法也有很多改进, 如栓线用固体石蜡[14]、硅橡胶和多聚赖氨酸[15]、硝基漆[16]或指甲油[17]处理, 或头端稍微加热、变粗[18], 这些方法均使其头端光滑圆钝, 减少了刺破血管的机率, 提高了成功率。总体看来, 线栓法制备的MCAO模型已成为目前应用最广泛的局灶性脑缺血模型。该模型无需开颅, 重复性较好, 尤其是能准确控制缺血及再灌注时间;不足之处是插线入颅的操作过程系在非直视下进行, 易诱发出血及血管痉挛等并发症, 血流阻断与否无法直接判断, 影响模型成功率。

1.3.3 栓塞法MCAO

手术分离CCA、ECA, 微动脉夹暂时关闭CCA, 由ECA注入栓子后将ECA结扎, 开放CCA, 使栓子自ICA进入MCA而建立MCAO模型。栓子制作是该模型成功与否的关键。碳素颗粒、空气、石蜡、树脂微粒等都曾作为栓子从ICA注入到MCA主干及分支引起MCA供血区缺血, 其中以血凝块最为常用[19]。现在有很多改进方法, 如向大鼠MCA注入聚乙烯硅氧烷[20]、十二酸酯钠[21]、经ICA注入真丝线段[22]或利用大鼠自体血栓结合线栓法[23]均可成功制备MCAO模型。栓塞法的优点是不需要开颅, 制作简单, 缺血效果可靠;缺点是由于栓子的随机性, 无法预测栓塞的部位和大小。

1.3.4 血栓法

从CCA插管处将凝血酶注入ICA, 复制出MCAO模型。该方法简便, 但栓塞部位不恒定。

1.3.5 光化学法

通过大鼠尾静脉注射光敏染料如玫瑰红, 暴露颅骨用特定波长 (560nm) 的光照射后可形成血栓, 使血管阻塞。此模型最大优点为可在任何需要的皮层部位产生脑梗死, 手术操作简单, 动物可长期存活;其缺点为显著的微血管损伤。

1.3.6 FeCl3化学诱导法

开颅暴露一段MCA, 将吸有50 %FeCl3溶液的小片定量滤纸贴于该段血管上并保留30分钟, 术后24小时形成由血小板、红细胞和纤维蛋白构成的混合血栓。本模型为抗血栓药的筛选研究提供了较好的途径, 缺点是需开颅手术及不能再灌注。

1.3.7 内皮素 (ET-1) 刺激法

由内皮细胞产生的ET-1是迄今为止发现的作用最强的血管收缩活性物质。有人将定向导管预先置于MCA处, 然后在无麻醉的情况下经定向导管向MCA管腔周围灌注微量ET-1, 从而在清醒的SD大鼠上成功复制出MCAO模型。该方法在清醒动物身上复制脑缺血模型, 便于观察缺血即刻出现的神经功能变化;不足之处为存在开颅带来的弊端。

1.3.8 CCA加压夹闭法

Nishimura等[24]取沙土鼠做颈正中切口, 暴露并分离CCA, 以400g力将CCA夹于一副未完全切断的聚乙烯管之间持续2分钟, 减压后5分钟内加压处有白色血栓形成。

1.3.9 负电流电解损伤法

应用机械收缩器使CCA血流减少, 将不绝缘负电极在25号皮针引导下穿入血管, 并使负电极与一个双道方波产生器的正极相连接, 持续30分钟, 电流直接损伤血管内皮细胞, 引发血栓形成, 阻塞血管腔, 使脑血流量减少造成脑缺血。

1.3.10 机械压迫皮质梗死法

Watanabe等[25]结扎大鼠一侧CCA后, 用圆柱形黄铜压迫对应皮质的硬脑膜, 成功建立了皮质梗死模型。

此外, 王世民等[26]认为椎-基底动脉系统的缺血占ICVD的一半或更高, 于是用将大鼠两侧基底动脉凝闭, 制作了很好的大鼠脑干缺血模型。

2 模型制备的影响因素

2.1 动物的选择

2.1.1 体重

在线栓法制备的MCAO的模型中, 多数人认为该模型的最佳体重范围为280~350g的大鼠[12,13,14], 超出此范围的大鼠则不适宜进行模型的制备。

2.1.2 性别

因雌激素对脑损伤有保护作用, 所以不可雌雄动物混用, 目前多选择雄性动物[5,13,18]。

2.1.3 年龄

尽管脑梗死多发于老年人群, 但由于老年大鼠的CCA、MCA等动脉发生了不同程度的迂曲、粥样硬化、管腔狭窄等解剖及病理上的改变, 致使造模效果很差。故选用壮年大鼠制备模型, 成功率较高[7,18]。

2.1.4 品系

最常用的是Wistar大鼠和SD大鼠[5,13,18]。

2.2 麻醉

全身麻醉直接或间接地影响血流、颅内压、脑代谢、神经递质的传递, 甚至破坏细胞膜的结构, 所以麻醉剂的选择尤为重要。常用的麻醉药中, 苯巴比妥钠对体温和呼吸的影响最大, 水合氯醛和乌拉坦次之, 戊巴比妥钠相对较小。目前国际通行的气体麻醉剂是氟烷 (halothane) 。Theodorsson等[27]观察到通过气管插管和氟烷混合气体麻醉可明显减少实验大鼠的死亡。

2.3 梗死时间

大鼠脑缺血后梗死体积与时间相关性进行研究发现, 梗死体积的渐趋扩大与时间有显著相关性。

2.4 体温

实验中温度过高或过低均会影响神经细胞损伤。一般将动物的体温维持在37 ℃, 并在温度传感器涂上润滑膏或凡士林, 插入直肠记录身体深部体温的变化[11,16,18]。

2.5 血压和血气

血压对脑梗死模型有一定影响, 高血压的动物缺血改变出现早, 而全身低血压也会加重脑损伤, 因此实验应常规监测平均动脉压以供参考;还应对血气进行监控, 通常给动物进行颈动脉或股动脉置管进行监测[5,7]。

2.6 血糖

脑缺血时动物血糖轻度升高, 而高血糖本身就可使脑梗死的面积明显增加。为了控制动物血糖水平, 在实验前禁食12~24小时, 但不禁水[12,16]。还有学者使用胰岛素调节大鼠血糖水平以缩小脑梗死体积[28]。

此外, 有报道说脑血流量小可加重脑缺血损伤, 因此应用激光多谱勒血流仪监测脑血流量是必需的[5,16]。

3 评价指标

3.1 神经功能缺损评分

MCAO一般多采用改良Longa评分, 评分标准为, 0分:无神经功能缺损症状;1分:不能伸展对侧前爪;2分:身体向对侧转圈;3分:身体向对侧倾倒;4分:意识丧失, 不能自发行走。神经功能缺损是评价局灶性脑缺血以及缺血性脑损害最重要的终末指标之一[12,13,14,29]。

3.2 脑电图改变

局灶性脑缺血会引起脑电波的抑制, 缺血区脑电图出现波幅降低, 频率减慢。因此, 可利用脑电图仪, 通过对脑电监测来判断阻塞成功与否[29]。

3.3 脑血流测定

在缺血后脑血流很快下降。在局部缺血时, 测定脑血流的改变十分重要。最常用激光多谱勒血流仪进行监测[16,26,29]。

3.4 CT灌注成像

功能CT灌注成像是评价急性脑局部缺血模型的一种准确、敏感的方法。CT灌注成像在脑缺血的早期即可显示脑血流异常区域, 灵敏度很高[16]。

3.5 磁共振成像

该技术提供了一种非创伤性研究脑的解剖、生理及生化改变的新手段, 是一种确定缺血早期改变的敏感的检测方法[29]。

3.6 水迷宫测试

应用Morris水迷宫对动物进行定向航行试验, 由测试软件记录大鼠在池中找寻平台的各项指标。是用以评价大鼠学习记忆能力的指标[30]。

3.7 TTC染色

TTC (氯化三苯基四氮唑) 染色是评价脑缺血损伤的金指标, 有助于脑梗死体积的测定。染色后正常组织呈白色, 梗死组织呈红色。结合图像分析技术观测梗死范围, 通过测量梗死体积来衡量脑缺血的严重程度[12,14,16,23,29]。

3.8 组织病理学观察

3.8.1 光镜观察

光学显微镜与染色技术相结合可观察到脑缺血后脑组织病变区域间质疏松, 神经细胞肿胀明显、变形、轮廓不清, 胞浆深染, 胞核固缩, 核周体消失, 有神经细胞自溶及坏死等一系列病理形态变化, 从而对缺血损害作出评价[12,16,23,29]。

3.8.2 电镜观察

电子显微镜的应用使形态学研究进入了超微水平, HE染色后光镜下可见到神经细胞核染色浓缩、聚集、周边化, 线粒体肿胀, 嵴减少或消失呈空泡状, 内质网池扩张变形等结构改变, 并且随缺血时间延长, 突触结构异常, 突触密度下降[16,29]。

3.9 脑组织含水量测定

用以观察脑缺血损伤后脑组织水肿情况。用天平称取脑组织湿重后放入干燥箱中干燥, 24小时后称取干重。脑组织含水量= (湿重-干重) /湿重×100 %[23]。

3.10 脑代谢测定

脑缺血后乳酸很快升高, 随之出现ATP及磷酸肌酸下降、自由脂肪酸积累及其他一些代谢改变, 代谢改变与缺血程度平行。

3.11 基因方面

随着对脑缺血研究的深入, 很多研究人员发现很多基因在脑缺血的发生发展过程中起了重要的作用。如用免疫组化法可以研究Bcl-2、Bax、核转录因子 (NF-KB) 、P53蛋白、JNK、p-JNK、Bim、Na+-K+-ATP酶活性、TGF-β1等在脑缺血过程中的变化;用原位杂交技术观察Caspase-3和Caspase-9基因表达在介导细胞凋亡过程中的重要作用。

3.12 其他

有学者在评定局灶性脑缺血时, 动物的体重下降可作为评价脑缺血模型成功的一个辅助指标[31]。

糖尿病线性判别诊断模型的建立 篇4

1 研究资料

1.1 资料来源

研究病例来自兰州大学第一医院病历库, 所收集的资料均为医院内分泌科、普外科2007年全年出院患者。

1.2 研究对象

均由有经验的内分泌科医师诊断。糖尿病病例352例, 非糖尿病病例389例;男性428例, 女性313例;年龄8~84岁, 平均年龄 (58±14) 岁。录入信息包括患者基本情况 (年龄、性别、入院日期、出院日期等) 、血常规检查指标 (白细胞、红细胞等) 、生化检查指标 (天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶等) 。

1.3 纳入及排除

分别以1型、2型糖尿病, 其他特异性糖尿病及妊娠期糖尿病的临床诊断标准为纳入标准收集病例。由有经验的内分泌科医师诊断为糖尿病的出院患者、普外科出院患者, 排除其中基本情况、血常规检查、生化检查指标不齐全者, 其余均纳入研究。

2 研究方法

2.1 线性判别分析

判别分析是用于帮助研究者寻找区别各组差异的变量, 将对象较准确地判入各组的方法[4]。判别分析最常见的应用是为了判定哪些变量具有组间判别效力而对研究对象中多个测量变量进行选择[3]。经过判别分析之后就会得到判别函数。判别分析适用于2组以上, 且每个病例必须有2个以上变量的分类分析。

一般说来, 我们可对2组间的判别拟合一个线性方程:Y=a+b1X1+b2X2+...+bnXn式中a为常数, b1到bn为回归系数。判别函数对2组判别问题的解释较直接, 具有最大相关系数的变量对预测组别的贡献最大[3]。本实验为了研究方便, 定义糖尿病病例为1, 而非糖尿病病例为-1。

2.2 逐步判别原理

逐步判别分析是根据多元方差分析中的wilk′s统计量及F值进行变量的筛选。每一步选一个判别能力最大的指标进入判别函数, 直到被引入模型的变量没有一个符合进入模型的条件时, 变量引入过程结束。逐步判别分析以wilk′s统计量最小者入选, 本研究中模型引入变量的最小F值为10, 剔除变量的最大F值为2.71。这样得到的判别函数所包含的指标都很重要。

2.3 病例收集与分类

按上述纳入与排除标准收集病例, 结合临床检验结果与有经验临床医生的诊断对所收集病例进行分类, 同时建立相应数据库。

2.4 训练集和测试集的选择

研究对象共741例, 所有收集的病例以4∶1比例分为训练集样本和测试集样本。为使计算机能更合理地从资料中获取信息, 训练集样本应能很好地代表患者真实情况, 因此, 运用数据库中已知其类别的样本作为训练集, 从741例样本中选择594例 (糖尿病病例281例, 非糖尿病病例313例) 样本组成训练集。为了检验从训练集中得到识别函数的可靠程度, 可利用一些未包括在训练集中的样本构成测试集, 以检验其识别的可靠性, 因此, 将剩余147例 (糖尿病病例71例, 非糖尿病病例76例) 样本构成测试集, 以验证模型的预测能力。

2.5 判别函数的建立

通过训练集获得判别函数建立模型。将训练集患者的基本情况、血常规检查及生化检查信息从Microsoft-Excel数据库导入SPSS数据库。然后用SPSS统计软件提供的判别分析方法对这些数据进行判别分析, 选出对预测组别贡献较大的变量, 建立判别函数。

2.6 模型的评价

用训练集与测试集的误判率对模型进行判别效果评价, 并引入特异性和敏感性指标进一步判断LDA的预测能力。

3 结果与讨论

3.1 特征变量及判别函数

经LDA法进行判别分析后, 逐步选出8项对区别各组贡献较大的变量。判别函数的变量及Wilk′s值, 见表1。

在疾病诊断中常需根据就诊者的检查指标、体征等的分析, 作出是否患有某种疾病的诊断, 这种问题就可用判别分析解决[5]。逐步判别分析可以筛选出对于鉴别2类具有不同属性的人群有较大贡献的变量, 从而使其结果具有较好的区分度。表中F的绝对值越大就意味着该变量对模型的贡献越大。由表1中的F值可知, 变量总胆固醇比其他变量相对重要, 这些变量所代表的临床意义与诊断模型之间的关系有待进一步研究。由8个特征变量相对应的判别函数系数建立的糖尿病与非糖尿病分类判别函数如下。

糖尿病判别函数:Y=-55.570+0.168X1+3.610X2+0.413X3+0.004X4-0.030X5+2.278X6+0.083X7+1.405X8

非糖尿病判别函数:Y=-42.9820+0.115X1+2.849X2+0.372X3+0.008X4-0.010X5+2.149X6+0.071X7+0.871X8

3.2 判别结果及判别正确率

将741例合格病例以4∶1比例分为训练集样本和测试集样本, 经交互检验法验证可得训练集的预测情况, 见表2。

由表2可知, 训练集和测试集的预测准确率分别是85.7%和81.6%, 模型总判别准确率为84.9%。

3.3 特异性和敏感性

LDA对于糖尿病和非糖尿病的判别效果较好, 为了进一步判断LDA的预测能力, 实验引入了特异性 (Specificity) 和敏感性 (Sensitivity) 指标。

其中TP指真阳性数, FN指假阴性数, TN指真阴性数, FP指假阳性数。在LDA法判断结果中, 测试集的假阳性病例是31例, 假阴性病例是54例。由此求得测试集样本的敏感性是0.75, 特异性是0.88。

4 结论

本文是首次源于临床常规检查指标 (血常规、生化) 与机器学习算法相结合建立计算机辅助糖尿病诊断模型。逐步判别分析的总判别准确率达到84.9%, 虽然判别效果较好, 但还可通过进一步扩大样本量, 或采用更加适合的机器学习算法提高判别能力。

参考文献

[1]陈文彬.诊断学[M].第5版.北京:人民卫生出版社, 2004.

[2]Kemal Polat, Salih Gunes, Ahmet Arslan.A cascade learning systemfor classification of diabetes disease:Generalized Discriminant Analysisand Least Square Support Vector Machine[J].Expert Systems with Appli-cations, 2008 (34) :482～487.

[3]J Liang, R Du.Model-based Fault Detection and Diagnosis of HVACsystems using Support Vector Machine method[J].International Journal ofRefrigeration, 2007 (30) :1104～1114.

[4]Kemal Polat, Salih Gune.Breast cancer diagnosis using least squaresupport vector machine[J].Digital Signal Processing, 2007 (17) :694～701.

[5]Tim W, Nattkemper, Bert Arnrich, et al.Evaluation of radiological fea-tures for breast tumour classification in clinical screening with machinelearning methods[J].Artificial Intelligence in Medicine, 2005 (34) :129～139.

[6]Weida Tong, Qian Xie.Using Decision Forest to Clissify Prostate CancerSamples on Basis of SELDI-TOF MS Data:Assessing Chance Correlationand Prediction Confidence[J].Environmental Health Perspectives, 2004 (112) :1622～1627.

[7]Kemal Polat, Salih Gunes.Computer aided medical diagnosis systermbased on principal component analysis and artificial immune recognitionsysterm classifier algorithm[J].Expert Systems with Applications, 2008 (34) :773～779.

糖尿病并发症模型研究进展 篇5

关键词：糖尿病,并发症,模型

糖尿病是一种最常见的内分泌代谢疾病, 具有遗传易感性, 在环境因素的触发下发病。症状可分为2大类:一大类是与代谢紊乱有关的表现, 尤其是与高血糖有关的三多一少, 多见于1型糖尿病, 2型糖尿病常不十分明显或仅部分患者表现;另一大类是各种急性、慢性并发症的表现。2型糖尿病, 又名非胰岛素依赖型糖尿病 (NIDDM) , 以慢性并发症多见, 常见慢性微血管并发症有视网膜病变, 肾脏病变, 周围神经及植物神经病变, 大血管并发症有动脉粥样硬化性心脏病, 外周血管病变[1]。糖尿病慢性并发症后果严重, 足病 (足部坏疽、截肢) 、肾病 (肾功能衰竭、尿毒症) 、眼病 (模糊不清、失明) 、脑病 (脑血管病变) 、心脏病、皮肤病、性病等是糖尿病最常见的并发症, 是导致2型糖尿病患者死亡的主要因素[1,2,3,4,5,6,7,8]。现经展开糖尿病并发症的多种模型研究并试着用药物进行干预控制。现将2型糖尿病并发症的多种动物模型方法及特点进行综述, 以期为拓展该并发症基础研究和临床治疗。

1 2型糖尿病大鼠模型的建立

糖尿病是一种体内胰岛素相对或绝对不足或靶细胞对胰岛素敏感性降低, 或胰岛素本身存在结构上的缺陷而引起的碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱的一种慢性疾病。其主要特点是高血糖、糖尿。因糖尿病的发病率增长很快, 基础和临床对糖尿病的研究需求增大促成了糖尿病模型的建立。刘欣秋等[9]人选用小剂量链脲佐菌素 (STZ) 给大鼠尾静脉注射造成大鼠的糖耐量异常, 在此基础上加喂高热量食物 (含胆固醇, 胆酸盐, 白糖等) 引起大鼠肥胖, 8周后取鼠血测甘油三酯、胆固醇、胰岛素等指标并测量体重变化。结果表明由于糖耐量的异常, 这些大鼠具有NIDDM患者的典型特征。这种造模方法简单易行、重复性好, 是研究NIDDM机制及其并发症较为理想的模型。而糖尿病的并发症模型, 也基本是在此模型之上进行手术或药物干预而建立。

2 恒河猴糖尿病性视网膜并发症模型的建立

糖尿病视网膜病变简称“糖网”。糖尿病会引起视网膜血管失调。病症的发生率随着患糖尿病时间增加而提高。分为背景性视网膜病变, 增殖性视网膜病变, 黄斑点水肿。唐东红等[10]用灵长类动物进行糖尿病视网膜并发症造模, 选用健康成熟的恒河猴, 分别以剂量为60mg/kg、45mg/kg静脉一次注射及30mg/kg静脉二次注射链脲佐菌素, 造成了胰岛素依赖性糖尿病及慢性持续性高血糖症2种类型的模型, 从而诱导出不同程度的糖尿病视网膜并发症, 分别显示早期眼底微血管动脉扩张, 视网膜出血瘤, 微血管瘤及新生血管、晚期白内障等糖尿病性视网膜并发症模型。在此模型的基础上进行药物干预或手术治疗, 可有效探讨糖尿病视网膜并发症的可能治疗方案。

3 糖尿病复合脑缺血大鼠模型

糖尿病患者血黏度增高, 红细胞聚集增强, 血小板对血管壁的黏附或血小板相互间的凝集机能增强, 血液第Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ凝血因子增加, 纤维蛋白原增高等可能是促进糖尿病脑病形成的主要因素。陈莲珍等[11]采用在大鼠腹腔注射链脲佐菌素 (60mg/kg) 引起糖尿病的基础上, 再行双侧颈动脉缺血再灌手术从而建立糖尿病脑病动物模型, 用Morris水迷宫实验对动物行为学进行评价, 观察到糖尿病复合脑缺血模型大鼠到达站台游动时间比正常对照组增长, 推测糖尿病复合脑缺血模型大鼠存在认知功能障碍。体内血糖的升高, 很可能导致脑病的发生, 导致这种认知功能障碍。此类模型的建立, 不仅有助于研究糖尿病脑病的形成机制, 也有助于对糖尿病影响脑认知能力的效果评估。

4 糖尿病肾病大鼠模型

糖尿病肾病 (DN) 是糖尿病引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症, 是糖尿病全身性微血管病变表现之一, 临床特征为蛋白尿, 渐进性肾功能损害, 高血压, 水肿, 晚期出现严重肾功能衰竭, 是糖尿病患者的主要死亡原因之一。关欣等[12]用高糖高脂饲料喂养大鼠1个月后, 腹腔注射链脲佐菌素建立早期糖尿病肾病大鼠模型。采用生化法、放射免疫法和蛋白质印迹杂交法等分析血糖、尿微量白蛋白、α1微球蛋白、血清肌肝、尿素氮水平, 观察肾皮质转化生长因子β1、赢小板衍化生长因子B蛋白表达。发现模型组血糖均明显高于正常组, 模型组尿微量白蛋白、尿α1微球蛋白均高于正常组;模型组血尿素氮、血清肌肝均高于正常组;早期糖尿病肾病大鼠肾皮质转化生长因子β1和血小板衍化生长因子B蛋白表达增加。结果说明了此糖尿病肾病大鼠模型几乎具备了糖尿病肾病的全部特征。由于糖尿病肾病的病死率较高, 肾脏出现问题后许多药物的效果不一定能得到正常发挥甚至因为肾脏的损坏还会导致药物的不良反应加重, 故而将动物体制成糖尿病肾病模型能更好的帮助相关药物的开发和治疗方案的确立, 此模型在基础研究中非常值得推广。

5 2型糖尿病大鼠并发非酒精性脂肪肝模型

糖尿病患者体内由于胰岛素分泌不足或相对缺乏易引发肝脏的脂代谢紊乱[13]。因肝脏对糖的利用减少, 释放增加, 会导致脂肪肝的引发。陈玉华等[14]用高糖高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素腹腔注射建立并非酒精性脂肪肝大鼠模型, 检测肝功能、空腹血糖、血清胰岛素和血脂水平, 光镜下观察大鼠肝脏组织学形态, 分别以免疫组织化学法和逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 法检测肝组织UCP-2蛋白和UCP-2mRNA的表达情况。结果模型组大鼠血清转氨酶、空腹血糖、血清胰岛素及血脂水平均较正常组明显升高, 胰岛素敏感指数较正常组明显下降;肝脏出现不同程度脂肪变性甚至严重脂肪变性;肝组织UCP-2蛋白表达高于正常组, UCP-2mRNA表达于第16周末和20周末均高于正常组, 以20周末更为明显。其检测指标符合人类的脂肪肝的特征且制造模型的成功率较为稳定, 在研究中有一定实际意义。

6 糖尿病性勃起功能障碍大鼠模型

垂体前叶细胞糖的代谢是依赖于胰岛素的, 糖尿病患者胰岛素缺乏, 从而使垂体前叶细胞糖的利用发生障碍, 致合成促性腺激素的功能受损, 血中促性腺激素降低。糖尿病时血管硬化涉及阴茎海绵体小动脉时, 便可影响阴茎的勃起功能。男性糖尿病患者阳痿的发生率高达40%~60%, 症状随病情的加重而逐渐加重。李煜罡等[15]以STZ 40mg/kg、STZ 60mg/kg、STZ 80mg/kg注射大鼠, 按时间点分别记录空腹血糖、阿朴吗啡 (APO) 诱导阴茎勃起次数及体质量, 结果空腹血糖及体质量在不同4个时间点和不同处理组间差异均有显著性, APO诱导阴茎勃起实验的勃起次数在注射STZ 40mg/kg组与注射STZ 60mg/kg组间差异存在显著性。得出结论STZ致大鼠DM模型的最佳注射剂量应为60mg/kg, APO诱导剂量以100μg/kg作为筛选阴茎勃起功能障碍模型的标准。

7 2型糖尿病血管并发症细胞研究模型

糖尿病的血管病变是常见的糖尿病并发症之一, 这也是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一, 最常见的血管病变有心血管病变, 脑血管病变, 肾脏、视网膜及皮肤的微血管病变等。为了在分子阶段对糖尿病血管并发症进行研究[16], 葛金文等[17]将生长融合状的血管内皮细胞 (ECV-304) 分别施加不同浓度的葡萄糖、胰岛素和ox-LDL条件液, 培养24h后观测细胞活性、细胞一般形态学和超微结构改变及细胞凋亡情况.结果发现3因素对细胞有协同损伤作用, 可诱导细胞凋亡和细胞器结构发生变化:显微镜下见模型组细胞回缩变圆, 轮廓分明, 细胞内出现粗糙颗粒样变化;线粒体肿胀, 嵴丢失, 内质网结构模糊、肿胀, 呈小泡状;琼脂糖凝胶电泳可见模型组有明显的细胞凋亡典型的阶梯状区带电泳图谱。进过反复试验, 发现含100mg/L ox-LDL、20mmol/L葡萄糖和100U/L胰岛素的混合条件培养液对细胞的损伤最显著, 在该条件下, 更能建立起好的糖尿病血管并发症模型。

8 糖尿病痛风大鼠模型

糖尿病与痛风均是体内代谢异常所引起的疾病, 两者有共同的发病基础, 营养过剩是其发病因素之一, 发病基础均可由于胰岛素抵抗引起[18]。有人认为肥胖、痛风和糖尿病是三联征, 肥胖可诱发高尿酸血症和高血糖。一般来说血糖值高者, 尿酸值也较高。虽二者临床表现不同, 但有共同的发病基础, 并且互相关联, 互为因果, 互相影响。故而糖尿病并痛风模型非常有研究的实际意义。叶飞成[19]将链脲佐菌素 (STZ) 配制成2%浓度的溶液, 将大鼠40mg/kg单次腹腔注射。在72h后测大鼠空腹尾静脉血糖并以空腹血糖>13.8mmol/L作为糖尿病成模的标准。选大鼠右踝关节外侧后方为穿刺点, 向关节腔注入0.2ml尿酸钠溶液并以关节囊对侧鼓起为注入标准, 诱导痛风模型从而建立起糖尿病痛风大鼠模型。通过大鼠同型半胱氨酸 (HCY) 、血常规、血糖和血尿酸的测定发现T2DM合并痛风大鼠体内同型半胱氨酸水平升高。同型半胱氨酸的控制, 也是治疗糖尿病痛风的关键。同型半胱氨酸水平升高的糖尿病痛风大鼠模型应该是针对相应疾病基础研究的比较好的选择之一。

9 链佐星-弗氏完全佐剂制作大鼠糖尿病眼病并发症模型

李璇等[20]将大鼠腹腔注射链佐星30mg·kg-1·d-1, 每只腹腔注射弗氏完全佐剂 (CFA) 0.1ml, 链佐星和CFA均每周1次, 连续3周, 血糖稳定升高后给予高脂饲料喂养.造模成功后血糖保持>16mol/L以上达12周, 模型动物出现明显白内障, 晶状体内山梨醇含量明显升高, 视网膜毛细血管密度显著增加, E/C比值升高, 视网膜、晶状体病理变化明显.结论此模型与临床糖尿病眼病并发症有一定相似之处, 可作为糖尿病眼病并发症的动物模型。

10 糖尿病性肢端坏疽大鼠模型

糖尿病坏疽大多发生于中老年人, 一般为下肢, 有严重的神经损害, 疼痛可轻可重, 局部轻度损伤, 发生皮肤局限性小水泡。以后皮下组织变成暗红色或黑色, 严重四肢手足发生溃烂坏死, 干枯变黑, 化脓感染等。是糖尿病致残的重要原因之一。孙江涛等[21]将大鼠禁食6h后左下腹腹腔注射链脲佐菌素55.0mg/kg制造模型。第3周末, 成模大鼠禁食12h, 麻醉后处死取血测血糖、血脂和胰岛素水平;实验过程中记录各组大鼠的每天饮水量。以皮肤颜色发黑、皮肤轻度开放性病灶、病灶已侵入深部肌肉组织3个等级对糖尿病性肢端坏疽大鼠的四肢进行评分, 计算每只大鼠的总积分。实验前后大鼠饮水量、体质量、三酰甘油、胆固醇、空腹血糖、血脂和胰岛素水平的变化来确定模型的可靠性。发现模型组的大鼠四肢评分明显异于对照组, 而实验前后大鼠饮水量、体质量等指标也明显不同。表明此方法的成模有一定可靠性, 而造出的糖尿病性肢端坏疽大鼠也为临床研究提供了材料。

11 小结

实验性糖尿病模型 篇6

甘草(Glycyrhiza)是一种被广泛应用的中草药,其中富含甘草酸、甘草次酸、黄酮、生物碱和氨基酸等活性成分[1]。长期以来,对于甘草有效成分及其药效作用的研究一直集中在甘草酸上。近年来,随着人们对甘草药理作用研究的深入,发现甘草黄酮类物质是一种非常有效的活性成分,具有抗氧化、抗肿瘤、抑菌抗炎、抗艾滋病病毒等作用。已有研究表明,甘草黄酮(LF)显著抑制KK-Ay雌性小鼠血糖、体重的升高,并抑制腹部脂肪的积累,可有效地预防糖尿病和肥胖[2];LF也可抑制高脂饮食诱导的肥胖C57BL/6 J小鼠的体重增加、降低胰岛素和瘦素水平、提高胰岛素敏感性,并有改善脂肪肝的作用[3]。LF还可降低LDL-C被氧化的易感系数[4]。然而,迄今为止对LF抗糖尿病的药效和药理机制的系统研究尚属空白。本研究旨在探讨LF对高脂高糖饮食结合小剂量链脲佐菌素(STZ)所致大鼠实验性糖尿病的预防作用,探讨其可能的药理学机制,为开发预防糖尿病的药物提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料

清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重200~230 g,由宁夏医科大学实验动物中心提供。饲养于通风良好,相对湿度40%~70%,室温18~22℃,12 h光照周期。普通饲料与高脂高糖饲料(10%猪油、20%蔗糖、2.5%胆固醇、0.5%胆酸钠、基础饲料67%)均由宁夏医科大学实验动物中心配制。

1.2 药品与主要试剂

甘草黄酮(40%)购自上海康久化工有限公司;链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司;1,2-丙二醇(AR)购自天津化学试剂有限公司;甘油三酯(TG)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒购自温州东瓯津玛生物科技有限公司;低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒购自中生北控生物科技股份公司;总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;其它试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器

ONE TOUCH血糖仪及随手测型血糖试纸由强生(中国)医疗器材有限公司生产;DU-800核酸蛋白检测仪由Beckman公司生产;高速冷冻离心机由Sigma公司生产。

1.4 动物分组与处理

实验大鼠分为正常对照组(control,10只)、正常给药组(CLF,10只)、模型组(model,12只)和预防给药组(PLF,14只)。control组和CLF组以普通饲料饲养,model和PLF组以高脂高糖饲料饲养。同时,CLF组和PLF组以剂量为300 mg/(kg body·d)的LF灌胃,control和model组以溶剂(1,2-丙二醇)灌胃。每周称一次体重,根据体重及时调整给药量。6周后停止给药,禁食12小时,检测实验大鼠FBG,并以35mg/Kg的剂量一次性腹腔注射STZ(溶于0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液,p H4.2)。

1.5 取材

注射STZ六天后,实验大鼠禁食12 h,于尾静脉取血检测大鼠FBG。戊巴比妥钠麻醉实验动物,心脏取血,分离血清。取大鼠肝脏、肾脏、腹腔脂肪(大网膜脂肪、肾周脂肪、双侧附睾脂肪)并称重。

1.6 观测指标及检测方法

1.6.1 一般情况

试验期间观察并记录大鼠一般情况,包括取食、饮水、精神状况、毛发、活动、粪便等,每周称体重一次。

1.6.2 生化指标

酶偶联比色法测定血清中TG和TC水平;直接法测定HDL-C水平;聚乙烯硫酸沉淀法测定LDL-C水平;同时,测定血清的T-AOC。具体操作均按试剂盒相关说明进行。

1.6.3 肝体比、肾体比和脂体比

根据肝脏、肾脏、腹腔脂肪的重量,计算肝体比(肝脏重量/体重)、肾体比(肾脏重量/体重)和脂体比(腹腔脂肪重量/体重)。

1.7 数据分析

所有数据用均数±标准差的形式表示。组间比较分析采用SPSS17.0统计软件,行t检验分析,以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 LF对实验大鼠一般情况的影响

注射STZ之前,所有实验大鼠的一般情况和FBG水平均未表现出差异。STZ注射之后,model组大鼠表现出精神状态低迷,活动减少易扎堆。自注射STZ第5天开始,model组大鼠饮水量明显多于PLF组大鼠,多尿现象十分明显;毛发干枯、杂乱、易脱落。注射STZ后,model组大鼠体重显著下降(P<0.05,表2所示)。PLF组大鼠的一般情况明显优于model组,control组和CLF组大鼠在上述一般情况观察中未表现出差异。

2.2 LF对实验大鼠FBG的影响

LF对实验大鼠FBG的影响如图1所示。注射STZ前,各组间大鼠的FBG无明显差异。六天后,与注射STZ前相比,model组大鼠在注射STZ后FBG水平显著升高(P<0.01)。PLF组大鼠的FBG虽有小幅升高,但与注射STZ前相比差异无显著性,未达到糖尿病的血糖水平。注射STZ六天后,PLF组大鼠的FBG水平显著低于model组(P<0.01)。

2.3 LF对实验大鼠血脂水平的影响

LF对实验大鼠血脂水平的影响如表1所示。control和CFL 2组间大鼠的TG、TC、HDL-C和LDL-C均未表现出显著差异。与control组相比,model组的TG、TC和LDL-C水平显著升高(P<0.01),HDL-C水平显著降低(P<0.01)。与model组相比,PLF组的TG、TC和LDL-C水平显著降低(P<0.05);HDL-C呈升高趋势,但无显著差异。

注:1)与model组相比,P<0.05;2)与control组相比,P<0.01

2.4 LF对实验大鼠血清T-AOC的影响

LF对实验大鼠血清T-AOC的影响如图2所示。与control组相比,CFL组的T-AOC未表现出显著差异。与model组相比,PLF组大鼠的T-AOC显著升高(P<0.05)。与control组相比,PLF组大鼠的T-AOC虽有所升高,但无明显差异。

2.5 LF对实验大鼠体重、肝脏、肾脏及腹腔脂肪的影响

LF对实验大鼠体重的影响结果如表2所示。注射STZ后,model组大鼠的体重较注射前显著降低(P<0.05)。PLF组大鼠的体重较注射前有所升高,达到了与control组极其接近的水平,但注射前后体重的差异不显著。各组间大鼠的体重在注射STZ后无明显差异。

注:与model组注射STZ前相比,覮P<0.05

计算大鼠的肝体比、肾体比和脂体比,并进行统计学分析,结果如表3所示。control组和CFL组大鼠的肝体比、肾体比及脂体比均未表现出显著差异。与control组相比,model组大鼠的肝体比和肾体比显著升高(P<0.01),脂体比显著下降(P<0.01)。与model组相比,PLF组大鼠的肝体比显著降低(P<0.05);脂体比显著升高(P<0.01),达到极其接近control组的水平;肾体比差异没有显著性。

注:1)与model组相比,P<0.05;2)与对照组相比,P<0.01;3)与其他组相比,P<0.01

3 讨论

本研究采用高脂高糖饲料喂养结合一次性小剂量腹腔注射STZ的方法,建立了T2DM实验大鼠模型,并用其探讨了LF对T2DM的预防作用。本研究表明,该方法是研究T2DM发病机制和药物学评价的理想模型[5]。注射STZ 6 d后,model组大鼠的FBG、TG、TC和LDL-C水平显著高于control组,HDL-C水平显著降低;同时,实验动物出现多饮、多尿、毛发干枯杂乱、倦卧、活动减少和体重减轻等明显的糖尿病病理特征。PLF组大鼠的一般情况和对血糖及血脂的控制明显优于model组,未表现出明显的糖尿病症状,表明LF显著抑制了T2DM的发生。

本研究结果表明,LF显著抑制了PLF组大鼠FBG的升高,这与已报道的研究结果[6]相吻合。同时,本研究还发现,LF显著预防了TG、TC和LDL-C的升高,并显著提高了血清的T-AOC,这是有关LF预防T2DM的研究中对LF影响这些指标的首次报道。

T2DM患者由于胰岛素的生理调节作用下降,常伴有脂质代谢紊乱,出现脂质代谢异常,表现为TG、TC、LDL-C和极低脂密度脂蛋白水平升高,以及HDL-C水平下降。在T2DM发生的两个主要机制,即胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能损伤中,脂代谢异常均发挥重要的作用。高脂血症不仅能够促进T2DM发生,也会加速糖尿病患者动脉硬化的进程,从而增加心血管疾病的发生率。本研究结果表明,LF显著预防了PLF组大鼠TG、TC和LDL-C水平的升高,并具有升高HDL-C水平的趋势,表明LF具有抵抗脂代谢紊乱的作用。已有研究表明,LF可降低高胆固醇病人血浆中LDL-C被氧化的易感系数[4],进而防止LDL被氧化为氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),最终阻止被氧化的脂质在血管壁的凝集、滞留。本研究结果提示,LF对动脉粥样硬化及心脑血管疾病的发生可能具有良好的预防作用。本研究中,LF有使HDL-C水平升高的趋势,但与model组相比,HDL-C升高的程度未形成显著差异,这可能与给药时间较短有关。如果延长疗程可否提高药效,尚待探究。

STZ是一种含亚硝基的化合物,可以诱导NO的合成,通过NO和自由基(·OH)途径损伤胰岛β细胞,通过增加对胰岛β细胞的氧化损伤特异性破坏胰岛β细胞[7],这是STZ致糖尿病的机制之一。越来越多的证据表明,糖尿病与氧化应激相关[8]。已有报道,糖尿病患者体内自由基升高与血糖升高有关,而自由基、脂质过氧化和LDL-C氧化性的改变,参与了糖尿病的进一步发展[9]。本研究表明,LF显著提高了实验大鼠血清的T-AOC,并显著抑制了高脂高糖诱导结合一次性小剂量腹腔注射STZ引起的血糖升高。其作用机制可能是:由于LF具有较强的抗氧化能力,可清除STZ诱导产生的自由基,通过保护胰岛β细胞、抑制胰岛β细胞凋亡,维持了正常的胰岛素水平,进而防止血糖的升高。当然,LF也可能是通过抑制脂代谢的紊乱而保护胰岛β细胞免受脂毒性的伤害,实现预防血糖升高的作用。共同土壤学说认为,氧化应激是胰岛素抵抗、糖尿病和心血管疾病的共同发病基础[10],LF对于血糖及血脂的调节作用机制之一,可能是其显著的抗氧化作用。

除了对上述生化指标的影响外,LF还显著降低了PLF组大鼠的肝体比,表明LF对建模引起的糖尿病大鼠的肝脏肥大[11]有明显的抑制作用。其可能的药理机制为:(1)LF减少了脂肪在肝脏中的积累。肝脏病理学切片(结果未出示)表明,LF对肝脏肥大的改善作用,主要是由于LF减少了脂肪在肝脏中的积累,这与已报道的结论[3]相吻合;(2)LF可能通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)促进脂肪细胞分化,减少肝脏脂肪化。有研究表明,LF可通过激活PPAR-γ促进人脂肪细胞分化[2]。在激活PPAR-γ促进脂肪细胞分化过程中,血液中的脂质更多的进入脂肪组织储存,从而减少肝脏脂肪化,抑制了肝脏肥大。

PLF组大鼠的脂体比显著高于control组,这与已报道的LF可抑制高脂饮食诱导的实验小鼠腹部脂肪积累的结论[2,3]不一致。可能的原因有以下两方面:(1)实验动物模型不同。已报道的结果来自于自发性糖尿病动物模型KK-Ay[2]和C57BL/6J[3]小鼠,而本研究则采用高脂高糖饮食结合化学诱导的方法建立的T2DM动物模型;(2)LF抑制了建模引起的糖脂代谢紊乱。由于糖尿病大鼠葡萄糖的转运和利用出现障碍,能量主要靠来自体内脂类的大量代谢,使得model组大鼠极度消瘦,脂体比显著低于control组。本研究结果表明,PLF组大鼠的脂体比显著高于model组,达到了接近control组的水平,提示LF可能是通过抑制糖脂代谢紊乱,保持对外源能量的正常利用,从而减少体内脂类分解,维持正常的脂体比水平。

LF对肾脏肥大未表现出改善作用,推测其对肾脏的保护作用可能不明显。该结论是否确切及其原因尚待进一步研究。

注射STZ六天后,各组间大鼠的体重无明显差异,但model组大鼠的体重显著低于注射前;而PLF组大鼠体重显然比注射前有所升高,但无明显差异,表明LF能够预防由于STZ的化学损伤而导致的体重下降。虽然PLF组大鼠的体重有所升高,但只是达到接近control组大鼠的体重,不同于噻唑烷二酮类引起患者体重增加的副作用[12]。在本研究检测的所有指标中,control组与CLF组均未表现出显著差异,表明至少在实验期限(6周)内LF对正常大鼠没有毒副作用,这与AOKI等[13]报道的LF具有临床安全性的结论相吻合。

本研究结果表明,LF可有效预防糖尿病的发生,具有开发成预防糖尿病新药或保健品的潜力,但其具体的药理学机制尚有待于进一步研究。

客车模型的主动降噪实验研究 篇7

1 实验组成

1.1 硬件组成

实验系统中所用的客车模型是由厚度为16mm的木工板组成, 因此边界条件可以近似看成是刚性的, 模型的内尺寸与仿真模型一致。初级声源信号和四个次级声源信号均通过直径为100mm的普通扬声器发出, 该扬声器功率为3 W, 阻抗为8, 处在汽车发动机位置的扬声器发出的信号作为初级声源, 用来模拟汽车发动机发出的噪声, 这也被认为是车内噪声的主要来源, 该信号由信号发生器 (B&K Sine Random Generator 1027) 发出, 通过B&K功率放大器 (Type 2718) 驱动扬声器输出。实验系统所用的四个传感器的位置分别在靠近乘客耳边处, 用来监测该处声压水平, 并将测得的模拟信号通过A/D转换为数字信号输入微机进行分析处理, 将调整后的数字信号由D/A转换为模拟信号, 通过功率放大器驱动次级声源达到好的降噪效果。A/D和D/A转换用数据采集板 (NI PCI-6014) 来实现。主动控制系统框图, 如图2所示。

实验中使用的主要仪器和传感器为:

1.1.1 传感器

传感器由MA201 ICP型前置放大器, MP201传声器组成, 测得的信号通过一个四通道声学振动分析仪调理后输出。MA201 ICP型前置放大器技术指标:频率响应:10～100k Hz:<±0.2dB (参考频率:25 Hz) 输出阻抗:>50 GO输出阻抗:<100最大输出电压:7.0VMP201传声器技术指标:断路灵敏度:-27.8dB re 1V/Pa或40.7mV/Pa。

1.1.2 NI PCI-6014数据采集板技术指标

A/D转换电路部分:16路单端输入或8路差分输入通道2路模拟输出输出电压范围:±10V D/A分辨率:16bit非线性误差:±1LIB。

1.2 软件组成

控制系统软件采用的是NI公司提供的行业标准图形化编程软件LabVIEW, 该软件既是功能完整的软件开发环境, 同时也是功能强大的编程语言。它编程简单, 针对数据采集、仪器控制、信号分析和数据处理等任务, 设计提供了完善的功能图标供用户直接调用。它可以方便地与各种软件连接, 与其它软件通过相应的接口实现软件间的接口通信, 完善Lab VIEW的编程功能;还可以方便地与各种硬件连接, 种类包括数据采集、信号调理、声音和振动测量、视觉、运动、仪器控制等, 并且提供强大的后续数据处理能力, 设置数据处理、转换、存储的方式, 并将结果显示给用户;它还包括许多其它的测量分析工具:

例如曲线拟合、信号生成、峰值探测及概率和统计。测量分析函数可以决定信号特征, 如DC/RMS水平, THD/SINAD (total harmonic distortion) , 脉冲响应, 频率响应, 互功率谱等;还可以通过LabVIEW解决微分方程、优化计算、求根及其它各种数学问题。

实验系统通过在LabVIEW中编程, 将数据采集卡采集到的信号通过相应的处理得到需要的参数, 然后作出调整, 并由数据采集卡模拟输出, 取得相应的结果。

2 实验研究

图3、4是频率为181.2Hz、356.5Hz的两个声模态的声压幅值的变化 (以次级声源S1、S2单独作用为例, 传感器位置在驾驶员左耳边) , 其中 (a) 为初级声源P作用下的声压幅值。 (b) 为在次级声源S1作用下的声压幅值。

3 结论

从图中我们可以发现在次级声源作用以后, 在这两个频率上的声模态取得了明显的降噪量。频率为181.2Hz的声模态在次级声源S1作用下, 大约各降低了13.3dB。频率为356.5Hz的声模态在次级声源S2作用下, 大约各降低了9.7dB。由于实验设备, 实验环境等因素的制约, 取得的降噪量可能并不是最理想的。但是总体而言, 通过理论分析, 仿真模拟和实验验证, 降噪的趋势基本是一致的。

参考文献

[1]邱亚宇.车内噪声主动控制研究[D].南京:南京林业大学, 2005, 7.

[2]陈克安.有源噪声控制[M].北京:国防工业出版社, 2003, 10.