分离和提取

分离和提取（精选11篇）

分离和提取 篇1

银杏 (Ginkgo biloba L.) 是中国传统的名贵中药, 其叶入药在中国已有上千年的历史。银杏叶提取物的主要有效成分为黄酮苷和内酯类化合物。黄酮以山柰酚 (kaempferal) 、槲皮素 (quercetin) 、异鼠李素 (isohamnetin) 的苷类化合物为主;内酯主要包括二萜内酯和倍半萜内酯。二萜内酯有5种, 即银杏内酯 (ginkgolides) A、B、C、M和J, 简称GA、GB、GC、GM、GJ;倍半萜内酯有1种, 即白果内酯 (bilobalide) , 简称BB。银杏内酯具有专属性的抗血小板活化因子 (platelet activating factor, PAF) 活性, 是天然的PAF拮抗剂, 其中尤以GB的活性最高, 白果内酯为神经精神病药物, 能抗神经末梢的衰老, 为真正的抗衰老物质[1]。

自20世纪80年代开始, 许多国家采用现代分离技术对银杏叶的主要活性成分银杏内酯进行研究, 传统分离方法主要有溶剂萃取分离法和柱色谱分离法[2,3]。传统方法存在着步骤多、过程复杂和生产成本高等问题。本文将溶剂萃取和柱色谱分离技术结合起来, 对提取溶剂和柱色谱条件进行了考察, 成功开发出一种程序简单、成本低且稳定可靠的银杏内酯分离提取工艺。

1 材料、试剂及仪器

材料:浙江康恩贝集团产标准银杏叶提取物EGB (粒度100-200目, 总黄酮醇苷>24%, 总内酯>6%) 。

试剂:乙醇、乙酸乙酯、丙酮、层析用酸性A1203 (分析纯) ;层析用硅胶 (青岛海洋化工厂分厂) ;银杏内酯A对照品 (SIGMA公司, 批号G4028) , 银杏内酯B对照品 (SIGMA公司, 批号G6910) , 银杏内酯C对照品 (SIGMA公司, 批号18309) 。

仪器:Waters2695高效液相色谱仪 (美国Waters公司) , 数据处理软件Waters Millennium 2010 色谱工作站。

2 实验部分

2.1 提取溶剂的选择

取EGB粉末4份, 每份10 g, 分别用乙酸乙酯、乙醇、丙酮和水各300 mL搅拌溶解30 min, 其中对乙酸乙酯、乙醇加热促溶, 其余溶剂在室温下进行。过滤, 蒸干滤液, 照2.4项下HPLC方法分析银杏内酯含量, 结果见表1。

结果表明, 使用水作溶剂时效果较差, 使用另外3种有机溶剂所得到的银杏内酯纯度较高。由于银杏内酯A、B、C 的分子极性依次增强, 而不同极性的有机溶剂对其具有不同的选择溶解性。因此, 分别选用丙酮、乙酸乙酯和乙醇依次溶解EGB, 可分别溶出GA、GB、GC。

2.2 不同梯度洗脱液的选择

取EGB 10 g, 分别用丙酮、乙酸乙酯、乙醇依次溶解。丙酮浓缩液上酸性氧化铝柱, 以丙酮—乙酸乙酯混和液梯度洗脱;乙酸乙酯浓缩液上酸性氧化铝柱, 以乙醇—乙酸乙酯混和液梯度洗脱;乙醇浓缩液上硅胶柱, 以乙酸乙酯—石油醚梯度洗脱。收集洗脱液, 蒸干, 照2.4项下HPLC方法分析洗脱液, 结果分别见表2、表3和表4。

由表2可知, 丙酮浓缩液上酸性氧化铝柱, 以丙酮体积分数为20%的丙酮—乙酸乙酯混和液洗脱较为合适。

由表3可知, 乙酸乙酯浓缩液上酸性氧化铝柱, 以乙醇体积分数为10%的乙醇—乙酸乙酯混和液洗脱较为合适。

由表4可知, 乙醇浓缩液上硅胶柱, 以乙酸乙酯体积分数为60%的乙酸乙酯—石油醚混和液洗脱较为合适。

2.3 银杏内酯提取、分离、纯化方法总结

通过以上分析, 可将银杏内酯的提取、分离、纯化方法总结如下:EGB粉末经丙酮、乙酸乙酯、乙醇依次溶解后, 再经柱层析分离、纯化。具体工艺流程见表5。

2.4 HPLC法定量测定银杏内酯纯度

2.4.1 色谱条件

色谱柱:Hypersilbds C18 (4.6 mm ×200mm, 5 μm) ;流动相:水-甲醇 (70∶30) ;检测器:DAD;检测波长:220nm;流速:0.8 mL/min;柱温:25℃;进样量:20μL。

2.4.2 溶液的制备

①对照品溶液的制备:分别精密称取银杏内酯A、B、C对照品, 用甲醇制成每1mL中各含1mg的混和液, 作为对照品溶液。②供试品溶液的制备:取上述柱层析样品0.15 g, 加水10 mL, 置水浴中温热使溶解, 加2%盐酸溶液2滴, 用乙酸乙酯振摇提取3次 (10 mL、10 mL、10 mL) , 合并提取液, 用5%的醋酸钠溶液20 mL洗涤, 分取醋酸钠溶液, 再用乙酸乙酯10 mL洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗液, 用水洗涤2次, 每次20 mL, 分取水液, 用乙酸乙酯10 mL洗涤, 合并乙酸乙酯液, 回收溶剂至干, 残渣用甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中, 加甲醇至刻度, 摇匀, 过滤, 续取滤液, 即得。

2.4.3 测定法

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL, 分别注入液相色谱仪, 测定峰面积, 按外标法分别计算银杏内酯A、B、C的含量。

2.4.4 测定结果

5批银杏叶提取物样品测定结果见表6, 对照品及供试品色谱见图1。

(n=5)

注:图中峰自左至右依次为银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C

3 讨论

本文根据3种银杏内酯在不同极性的有机溶剂中具有不同的溶解性和溶解速度, 分别用丙酮、乙酸乙酯和乙醇对标准EGB进行三级溶解, 并为每级溶解液选择了合适的柱层析吸附剂和洗脱液, 成功开发出一种程序简单、成本低且稳定可靠的银杏内酯分离提取工艺。利用柱层析分离技术从银杏提取物中分离纯化银杏内酯是一种廉价高效的方法, 值得推广。

摘要：目的:建立银杏提取物中银杏内酯的分离、纯化方法。方法:银杏内酯A、B、C (简称GA、GB、GC) 分子极性依次增强, 分别用丙酮、乙酸乙酯、乙醇依次溶解银杏提取物, 并选择合适的柱层析吸附剂与洗脱液, 以分离、纯化银杏内酯。采用高效液相色谱 (HPLC) 法检测, 对所得银杏内酯A、B、C进行测定。结果:本方法可将银杏内酯的纯度由6%以下提高至80%以上, 并将其逐一分离。结论:该方法廉价、高效, 可用于银杏内酯的提取、分离及纯化。

关键词：银杏内酯,柱层析,高效液相色谱法

参考文献

[1]KALTAI M, HOSFORD D, GUINNOT P.Platelet activationgfactor (PDF) A review of its effects antagonists and possiblefutrue clinical implications[J].Drugs, 1991, 42 (2) :643.

[2]VAN BEEK T A, LELYVELD G P.Preparative isolation andseparation procedure for Ginkgolides A, B, C and bilobalide[J].Nat Prod, 1997 (60) :735-738.

[3]田季雨, 刘澎涛, 李斌.银杏叶提取物化学成分及药理活性研究进展[J].国外医学:中医中药分册, 2004, 26 (3) :142.

分离和提取 篇2

1.教材地位及作用

这节内容承接前面捕获光能的色素和结构的内容，紧接着安排实验：色素的提取与分离，既突出了生物实验及其实验基本技能在中学生物教学中的基础性地位，又很好地加深了学生对上节知识的理解和升华，真是恰到好处。本实验按常规教学它是个验证实验，验证叶绿体中色素的种类、含量及颜色。为了适应新课改的理念，我们将此实验改成探究性实验，对很多问题进行了对比和扩展。

2.教学目标

知识目标：掌握色素提取和分离的原理，了解叶绿体中的色素组成、颜色。

能力目标：掌握色素的提取与分离的基本操作方法，培养学生积极思考与创新能力，提高学生观察、分析和解决问题的能力。

情感态度价值观目标：通过实验探究，发展学生学习生物的兴趣，激发学生创造性思维。培养学生严谨的科学态度，学会根据实验的现象和结果，进行分析，推出结论。形成善于交流、合作、反思、评价的学习品质。

3.教学重、难点

重点：色素提取与分离的操作。

难点：色素提取与分离操作的具体步骤和注意事项。(如，菠菜叶的研磨，层析液的配制，滤液细线的画法等)

二、教法分析

1. 学情分析

经过初高中化学和生物的学习，学生已具有一定自学、观察、质疑能力，了解了进行探究性学习的一些基本方法，在课前我布置了对本实验的预习，学生已了解了基本情况。

2.授课理念

学生在实验探究过程中学生物，体验探究学习的过程与乐趣，从生活走进生物，从生物走向社会。

3.教学方法

实验探究法：“探讨——实践”实验教学法 ，即探究性教学方法。通过每组同学对每一步不同的做法与探究相结合，引导学生在探究过程中自己找出答案，突破难点。

多媒体辅助教学法：教师借助于视频等多媒体，规范学生实验操作。

三、学法分析

分学习小组以问题为中心，学生经过实验探究，并通过对问题的解决，提高分析、归纳能力，学会评价与反思。

四、教学程序

分离和提取 篇3

关键词： 凝胶色谱法；凝胶电泳法； 血红蛋白

G633.91

DNA和蛋白质技术包括DNA的粗提取与鉴定、PCR技术和血红蛋白的提取和分离等，是开展分子生物学研究的基本技术。蛋白质是生命活动不可或缺的物质。血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中的氧气和二氧化碳的运输。

一、血红蛋白蛋白质提取和分离的原理

血红蛋白蛋白质提取和分离的原理是根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以分离不同种类的蛋白质。

二、血红蛋白蛋白质提取和分离技术方法有凝胶色谱法和电泳法。

凝胶色谱法是根据分子量的大小来分离蛋白质的，而电泳法是根据各种分子带电性质的差异以及分子本身形状、大小的不同来把蛋白质分离开的。

1. 凝胶色谱法

凝胶色谱法分离蛋白质的原理：在多孔球体的凝胶内，蛋白质相对分子质量的大小不同，大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子通过凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。相对分子质量的不同蛋白质因此得以分离。凝胶材料是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。

2.凝胶电泳法

电泳法是带电颗粒在电场中向电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳法原理是：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向和阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同，因而可聚集形成不同的条带，因而达到分离的目的。影响蛋白质分子运动速度的因素中，蛋白质的电荷性质决定蛋白质运动方向，蛋白质带电荷量的多少决定电场作用力的大小，分子形状和大小形成阻力大小，蛋白质的运动速率由电荷量、分子形状和分子大小共同决定。

实验探究 蛋白质为什么带有带电荷？

蛋白质是由氨基酸组成的，还有一个羧基和一个氨基，在一定的PH下，蛋白质可解离的基因会带上电荷。

三、实验操作步骤

蛋白质的提取和操作一般分为五个阶段：材料的选择和预处理、粗分离（细胞的破碎）、提取、纯化（包括盐析，层析，有机溶剂提取，有机溶剂沉淀等）和浓缩干燥及保存。我们取哺乳动物红细胞（猪的新鲜血液）为材料，来进行血红蛋白的分离方法。

1.样品处理及粗分离

⑴样品前处理 包括细胞的破碎有机械方法、物理方法和化学及生物化学方法。

⑵ 细胞器的分离 从样品水溶液中提取、用有机溶剂提取、利用表面活性剂提取和对提取物进行保护。

①样品分离器材：离心机，0.9%的NaCl溶液和20mmol/L的磷酸缓冲液。

②步骤包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心（500r/min离心2min），然后用胶头吸管吸上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的0.9%的NaCl溶液，缓慢搅拌10min，低速短时离心，如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色为止。将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。然后转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min，就可以明显看到试管中溶液分四层，从上往下数，第一层为无色透明的甲苯层，第二层为白色波层固体，是脂溶性物质沉淀层，第三层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的分层液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，静置后分出下层的红色透明液体。取1mL血红蛋白溶液装入透析袋子中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度20%mmol/L的磷酸缓冲液中（PH为7.0），透析12h即可。

⒉ 凝胶色谱操作

⑴凝胶色谱柱的制作 取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端磨平。玻璃管两端色上合适的橡皮塞，中间打孔，孔径为0.5mL插入移液管，在色譜柱下端用移液管头部作出口部位，连接一细的尼龙管，用螺旋塞控制尼龙管的打开与关闭，尼龙管的另一端放入收集色谱液的收集器内。

⑵凝胶色谱柱的装填凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成配成凝胶悬浮液，在于下端连接的

尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，轻轻敲动色谱柱使凝胶装填均匀。并立即用20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤，使凝胶装填紧密。

⑶血红蛋白样品的加入和洗脱 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平，关闭出口。用吸管小心地将透析后的样品加到色谱柱的顶端，并打开下端出口，是样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，并加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当的高度，连接洗脱瓶，打开下边出口，进行洗脱。待红色色谱柱接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，连续收集。

⒊ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

⑴原理 蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。

聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。

⑵具体操作包括：①红细胞的洗涤 ；②色谱柱填料的处理；③凝胶色谱柱的装填；④蛋白质的分离。

⑶小结

分离和提取 篇4

拓展实验一观察叶绿素的荧光现象

【原理】当叶绿素分子吸收光量子后，就由最稳定最低能的基态跃迁到一个不稳定的高能状态的激发态。由于激发态极不稳定，发射光波，消耗能量，迅速由激发态降回到基态。这时发射的光波就称为荧光。因色素分子由低能状态到高能状态再放出光子变为低能状态时消耗一部分能量(一般不超过吸收能量的5%)，因此，放出的光波能量降低，主要为红光或红外光。在叶片或叶绿体中发射荧光很弱，肉眼难以观测，色素溶液则不同，由于溶液中缺少能量受体或电子受体，在照光时色素会发射较强的荧光，可被肉眼观测。

【操作步骤】取上述色素的乙醇提取液少许置于试管中，观察反射光和透射光，反射光观察到的溶液颜色，即为叶绿素产生的荧光颜色。

【分析】本实验操作极其简单，只要掌握好几个要点很容易成功：色素提取液不能久置，最好获得滤液之后立即实验;不能采用散射光源，如教室的日光灯等，可选用聚光较好的大功率手电筒之类;观察时可采用深色背景，比如黑板，可清楚地观察到色素提取液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。叶绿素的荧光现象说明叶绿素能被光所激发，而叶绿素分子的激发是将光能转变为化学能的第一步。这个拓展实验的完成，有助于学生通过事实理解叶绿体中的色素具有吸收和转换光能的作用。

拓展实验二红叶中色素的提取和分离

【原理】红色叶片除叶绿素a、叶绿素b、叶黄素和胡萝卜素外还含有花青素，主要存在于液泡内。与其它四种色素不同的是，花青素是一种水溶性色素，而其它四种表现出较强的脂溶性。在层析液中，可根据各种色素在滤纸条上的扩散速度不同将它们分开。

【操作步骤】：同“绿叶中色素的提取和分离”，只是材料选取红色叶片，如红米苋、鸡爪槭等。

【分析】这个实验可以作为教材实验的对照实验让学生选做。用红色叶片做材料，提取液呈棕色。用层析液分离色素时会发现花青素仍停留在滤液细线处，未随层析液在滤纸条上移动，滤液细线的位置呈红色。如果用蒸馏水做层析液，则现象相反———花青素随水上移，而其它四种色素停留在滤液细线处，呈墨绿色。教师可在实验前准备若干红色叶片和绿色叶片，由学生自己选取实验材料完成实验，自己分析实验现象，得出相应的结论。类似的，如果选用黄色叶片作为材料，在完成色素的分离实验后，学生也能发现黄叶在色素种类上和绿叶存在差异，甚至可以通过色素带的宽窄分析叶片由绿到黄在色素含量上还发生了什么变化。比起简单的重复经典实验，学生的探究活动有助于对知识深入理解，同时也是灵活运用所学知识解答新情境下的生物学问题的成功尝试。

拓展实验三叶绿素的稳定性

【原理】高等植物的叶绿素主要是叶绿素a和叶绿素b，两者结构上的差别仅在于叶绿素a的B吡咯环上一个甲基(—CH3)被醛基(—CHO)所取代。叶绿素较不稳定，强光照射和遇酸都能使叶绿素褪色。

【操作步骤】(1)取两支试管，分别加入色素提取液2ml，一支置于暗处，一支暴露在强光下2～3小时，观察两只试管内提取液的颜色。

(2)取色素提取液4ml置于试管中，逐滴加入浓盐酸，直至溶液呈褐色。再加入醋酸铜晶体少许，并在沸水浴中加热，提取液变为鲜绿色。

【分析】叶绿素是一种酯，分子中有一个卟啉环的“头”和一个叶绿醇的“尾”。卟啉环由四个吡咯环以四个甲烯基连接而成，吡咯环的中央络合着一个镁原子，卟啉环上的共轭双键和中央镁原子容易被光激发而引起电子的得失，于是上述步骤(1)完成后可观察到强光照射2～3小时后，色素提取液的绿色变淡。当镁被H+置换后，即形成褐色的去镁叶绿素;去镁叶绿素中的H+如再被Cu2+取代，就形成铜代叶绿素，颜色比原来的叶绿素更鲜艳稳定。学生完成这个拓展实验后，可以理解为什么几天后自己的滤纸条上绿色会消失，教师还可以告知学生，根据这一原理可用醋酸铜处理来保存绿色标本，拓宽学生的视野。

“绿叶中色素的提取和分离”这个实验几乎被所有高中生物教材收入，可见其经典之处。这个实验本身验证性很强，但因编写方式和教学方法的不同也可以增加它的可探究部分，而不仅仅停滞于对简单现象的观察。以上拓展性实验的设计思路是强调生物现象的关联性和同类事物的类比，倡导学生由一般探究特殊，用已知的实验方法研究未知事物。从实验材料到实验步骤，再到进一步的探究实验，每一个环节都有发展空间供广大师生进行拓展研究。

探究性学习作为教育科研领域中的一个崭新的课题，是培养学生的创造能力和创新意识的有效的学习方式，将这种学习方式与生物教学相结合，将会改变现有的教学模式，代之以全新的教学面貌。在探究性实验中，学生是否掌握某项具体的知识或技能很重要，但更重要的是能否对所学知识有所选择、判断、解释、运用，从而有所发现，也就是说，探究不是目的，只是完成培养目标的一种重要手段。探究性学习的过程本身就是他所追求的结果。学有余力的学生可通过拓展实验学习并获得新的生物学基础知识，加深理解和巩固已学得的理论知识，掌握基本技能，培养观察能力、实验操作能力，分析问题和解决问题的能力，并能提高学习兴趣和学习的主动性、积极性。

分离和提取 篇5

(一)溶剂提取法：

1.溶剂提取法的原理：溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。当溶剂加到中草药原料(需适当粉碎)中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。

中草药成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲本性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同。

有机化合物分子结构中亲水性基团多，其极性大而疏于油;有的亲水性基团少，其。极性小而疏于水。这种亲水性、亲脂性及其程度的大小，是和化合物的分子结构直接相关。一般来说，两种基本母核相同的成分，其分子中功能基的极性越大，或极性功能基数量越多，则整个分子的极性大，亲水性强，而亲脂性就越弱，其分子非极性部分越大，或碳键越长，则极性小，亲脂性强，而亲水性就越弱。

各类溶剂的性质，同样也与其分子结构有关。例如甲醇、乙醇是亲水性比较强的溶剂，它们的分子比较小，有羟基存在，与水的结构很近似，所以能够和水任意混合。丁醇和戊醇分子中虽都有羟基，保持和水有相似处，但分子逐渐地加大，与水性质也就逐渐疏远。所以它们能彼此部分互溶，在它们互溶达到饱和状态之后，丁醇或戊醇都能与水分层。氯仿、苯和石油醚是烃类或氯烃衍生物，分子中没有氧，属于亲脂性强的溶剂。

2.溶剂的选择：运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：①溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小;②溶剂不能与中药的成分起化学变化;③溶剂要经济、易得、使用安全等。

常见的提取溶剂可分为以下三类：

1)水：水是一种强的极性溶剂。中草药中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及甙类等都能被水溶出。为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。酸水提取，可使生物碱与酸生成盐类而溶出，碱水提取可使有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素以及酚类成分溶出。但用水提取易酶解甙类成分，且易霉坏变质。某些含果胶、粘液质类成分的中草药，其水提取液常常很难过滤。沸水提取时，中草药中的淀粉可被糊化，而增加过滤的困难。故含淀粉量多的中草药，不宜磨成细粉后加水煎煮。中药传统用的汤剂，多用中药饮片直火煎煮，加温可以增大中药成分的溶解度外，还可能有与其他成分产生“助溶”现象，增加了一些水中溶解度小的、亲脂性强的成分的溶解度。但多数亲脂性成分在沸水中的溶解度是不大的，既使有助溶现象存在，也不容易提取完全。如果应用大量水煎煮，就会增加蒸发浓缩时的困难，且会溶出大量杂质，给进一步分离提纯带来麻烦。中草药水提取液中含有皂甙及粘液质类成分，在减压浓缩时，还会产生大量泡沫，造成浓缩的困难。通常可在蒸馏器上装置一个汽一液分离防溅球加以克服，工业上则常用薄膜浓缩装置。

2)亲水性的有机溶剂：也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，如乙醇(酒精)、甲醇(木精)、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好，对中草药细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中的溶解度也较大。还可以根据被提取物质的性质，采用不同浓度的乙醇进行提取。用乙醇提取比用水量较少，提取时间短，溶解出的水溶性杂质也少。乙醇为有机溶剂，虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，而且乙醇的提取液不易发霉变质。由于这些原因，用乙醇提取的方法是历来最常用的方法之一。甲醇的性质和乙醇相似，沸点较低(64℃)，但有毒性，使用时应注意。

3)亲脂性的有机溶剂：也就是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃(氯仿除外)，一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分，因此，大量提取中草药原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。

3.提取方法：用溶剂提取中草药成分，、常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。同时，原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑。

1)浸渍法：浸渍法系将中草药粉末或碎块装人适当的容器中，加入适宜的溶剂(如乙醇、稀醇或水)，浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行，但浸出率较差，且如用水为溶剂，其提取液易于发霉变质)须注意加入适当的防腐剂。

2)渗漉法：渗漉法是将中草药粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法小当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止。或当渗滴液颜色极浅或渗涌液的体积相当于：原药材重的10倍时，便可认为基本上已提取完全。在大量生产中常将收集的稀渗淮液作为另一批新原料的溶剂之用。

分离和提取 篇6

关键词：泡沫分离；有机磷；核磁共振；NaOH-EDTA萃取法

磷是水体富营养化的限制性影响因子，水体中磷浓度高于0.02 mg/L[1]时，很容易引起水体富营养化。减少外源磷污染进入水体能够显著降低水体磷的浓度[2]，改善水体的富营养状况，改善水质。但是底泥所释放的内源磷成为阻碍河流、湖泊等水体生态系统修复的主要因素[3]。来自于欧洲的Carvalho.L[4]、Scharf.W.[5]和北美的Welch et al.[6]、Larsen et al.[7]等分别详细报道了湖泊内源磷污染现象。当外源磷污染减少时，藻类数量并没有降低，内源磷负荷推迟或阻止了水体生态系统的修复进程。另外据Jensen H.S.[8]报道即使底泥在有氧环境中，其释放磷可占到进入水体总磷量的99%，所以由底泥所释放的磷污染，即内源磷负荷不容忽视。

目前，底泥磷的核磁共振分析普遍采用NaOH-EDTA萃取法，限于萃取物中有机磷含量，虽然经过了冷冻干燥来富集有机磷，但是溶液中有机磷含量仍然不能满足测定需要，底泥的31P-NMR测定需要很长时间，一般需要12～72 h[9-10]，且谱图的分辨率和信噪比较低。

底泥中有机磷主要有磷酸单酯（phosphate monoester）、磷酸双酯（phosphatediester，DNA-P、膦酸（phosphonate）等，其中磷酸单脂和磷酸双脂是生物体细胞膜的主要组成部分具有表面活性，膦酸含有疏水的脂肪族链烃以及亲水的磷酸头部，也具有两性。DNA-A虽然是亲水性高分子聚合物，但是在细菌细胞内DNA分子上结合有很多表面结合蛋白，形成的生物大分子也具有不同程度的表面活性，所以理论上可以利用泡沫分离法来进行底泥有机磷的富集，目的是提高用于核磁共振分析底泥萃取液样品中有机磷的浓度。

1实验装置和方法

1.1实验装置

泡沫分离器是由空气压缩机，气体流量计，气体分布器，泡沫分离塔，泡沫收集装置组成。空气压缩机将压缩的空气通过胶管输送到气体流量计，气体流量计用于调节进入泡沫分离塔的气速。从气体流量计出来的空气通过胶管进入泡沫分离塔底部的空气分布器，空气通过空气分布器进入泡沫分离塔，底阀用于调节泡沫分离塔中待分离溶液的液位高度。泡沫分离过程中，可以看到泡沫分离塔中液面以上部分的泡沫，泡沫层高度为0.6～0.8 m，随着空气持续通入泡沫分离塔，塔中泡沫流入泡沫分离塔上部放置的泡沫收集装置，泡沫收集装置中的泡沫自然破裂形成溶液即为泡沫分离收集的有机磷溶液。泡沫分离塔的材质为有机玻璃管，直径为50 mm。装置如图1。

1.2实验方法

取同一采样点底泥样品，分为两份，其中一份采用分级萃取法提取底泥无机磷，另外一种用泡沫分离方法富集有机磷。

泡沫分离的方法，将底泥真空冷冻干燥24 h，取干燥泥样300 g，添加到3 L 0.25 mol/L NaOH溶液中，将溶液置于25 ℃恒温摇床上，震荡萃取16 h[11]。将制得的底泥混合液4 000 r/min离心10 min，去除大部分底泥杂质，然后将离心所得上清溶液以10 000 r/min离心30 min，用0.45 μm滤膜过滤，收集滤液。滤液中含有大量的氢氧化钠，pH呈强碱性，不利于泡沫的形成，需要调节溶液的pH，用3 mol/L HCl调节溶液的pH值到8.0。应用泡沫分离器，对萃取液中的样品进行泡沫分离，空气流速设定为20 mL/min，收集泡沫流出液体积20 mL。将泡沫分离法得到溶液于-50 ℃，小于20 pa真空度下进行真空冷冻干燥，待样品干燥后，刮取干燥后的有机层，取600 mg重新溶解于约2 mL 10 mol/L的NaOH溶液中，而后10 000 r/min离心去除不溶物质，取上清加入核磁共振管中，再加入0.1 mL重水D2O，进行核磁共振分析。

核磁共振试验温度为环境温度约20～25 ℃。采用德国BRUKER400核磁共振仪，外磁场强度为161.976 MHz，采样时间0.4 s，延迟时间12 s[12]。

2实验结果与分析

从图2和图3中可以看到，采用泡沫分离法，在化学位移为1.14 mg/L处出现了两个吸收峰，这是传统NaOH-EDTA萃取法检测不到的。从两个图中可以看到，都可以检测到正磷酸额信号，虽然正磷酸不具有表面活性，理论上不会被泡沫分离法所富集，但是由于其含量较高，容易混入富集分离溶液中，所以两种分离液都检测到了。另外泡沫分离法检测到了更多的磷酸单脂吸收峰。总测定时间，传统方法测定需要12 h，采用泡沫分离方法测定需要8 h。

总之，相比传统方法NaOH-EDTA萃取法，泡沫分离法富集有机磷的能力更强，用于底泥有机磷核磁共振分析的样品中有机磷含量更高，且泡沫分离方法富集的有机磷检测到了一个磷酸二脂信号峰，而传统方法检测不到，且测定所需时间缩短到传统方法的2/3。

参考文献：

[1]

Hayes，C.R.，Green，L.A. The evaluation of eutrophication impact in public water supply reservoirs in East Anglia[J].Water Pollution Control， 1984，83：42-51

[2] Ahlgren，I.Response of Lake Norrviken to reduced nutrient loading. Verhandlungen.Internationale Vereinigung furtheoretische and angewandte Limnologie，1987，20：846-850

nlc202309032121

[3] Williams， V.P. Effects of point-source removal on lake water quality ：a case history of Lake Tohopekaliga[J]， Florida.Lake Reservoir Manage，2001，17（4）：315-329

[4] Carbalho，L.， Beklioglu，M. ， Moss，B. Changes in a deep lake following sewage diversion a challenge to the orthodoxy of external phosphorus control as a restoration strategy[J].Freshwater biology，1995，34：399-410

[5] Scharf ，W. resotration of the highly eutrophic Lingese Reservoir[J].Hydrobiologia，1999，416：85-96

[6] Welch， E.B.， Rock，C.A.， Howe ，R.C.， Perkins ，M.A. Lake sammamish response to wastewater diversion and increasing urban runoff[J].Water Resource， 1980，14：821-828

[7] Larsen， D.P.， Schultz ，D.W.， Malueg， K.W. Summer internal phosphorus supplies in Shagaw Lake ， minnesota[J].Limnology Oceanography， 1981，26：741-753

[8] Jensen， H.S.， Andersen， F.Q. Importance of temperature ，nitrate ，and pH for phosphate release from aerobic sediments of four shallow ，eutrophic lakes[J]. Limnology Oceanography，1992，37（3）：577-589

[9] Barbara J， C.-M.， Claudia R， Benitez-Nelson.， Perry， Pellechia.， Adina， Paytan .Refining 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy for marine particulate samples： Storage conditions and extraction recovery[J]. Marine Chemisitry，2005，97：293-306.

[10] Kuo. Methods of phosphorus analysis ：Total Phosphorus in Soil.1996

[11] Cade-Menum， B.J. ，Preston，C.M. A comparison of soil extraction procedures for 31P-NMR spectroscopy[J]. Soil science， 1996， 161：770-785

[12] Kasper， R.， Joakim ， Ahlgren.， Heidi， Debrabandere.， Monica， Waldebak.， Adolf， Gogoll.， Lars， Tranvik.， Emil， Rydin. Degradation rates of organic phosphorous in lake sediment[J]. Biogeochemistry， 2007，82：15-28

（收稿日期：2014-10-31）

分离和提取 篇7

一、提取色素的实验改进

(一)绿叶的选取。

为了获得较多含量的色素,取材时要选取新鲜的颜色较深的叶片,高中课本原实验中色素的提取和分离,用的是5g新鲜菠菜叶和少许的二氧化硅、碳酸钙和提取液混合研磨制取滤液,但是,在实验过程中我们发现菠菜叶含水分较多,易受季节的限制且不宜储存,实验时需现用现买,若班级多,学校离菜市场又远,那就显得十分麻烦。因此我选用了三角梅叶片做实验材料,三角梅在我校随处可见、生长旺盛,这就便于学生亲自取材,现采现用,体验本实验从取材到得出实验结果的全过程,增强了实验的趣味性。三角梅的叶片颜色深绿,色素含量较多,尤其是菠菜叶中很难提取到的胡萝卜素,含量也明显高于一般绿叶,能让学生从实验结果中清楚的看到四条明显的色素带。

(二)研磨剂的选取。

在研磨时加入二氧化硅的目的是为了研磨得充分,更有效地破坏细胞结构;二氧化硅,呈白色特细的粉末状,学生在使用时不能很好的控制用量,往往加多,使滤液中含有较多二氧化硅,导致滤液颜色变浅。实验证明,滤液中杂质越多,实验现象越不明显。因此我改用白细河沙(洗净干燥后用)代替化学试剂二氧化硅粉末,这样既使研磨充分又经济易控制。研磨过程还需加入少许碳酸钙,其目的是为了防止在研磨过程中,叶绿素受到破坏。

(三)提取液的选取。

原教材中用丙酮作为提取液,新教材中用无水乙醇,其结果大致相同。在实验中我发现,如果用量改为先加入丙酮5 ml后,再加入2ml石油醚,可以提高胡萝卜素提取效果,色素带分离现象更明显。考虑到丙酮有一定的毒性,对中学生的身体健康有不利影响,因此,经反复实验,我选择用无水乙醇作为提取液,将10ml无水乙醇,分两次倒入研钵中,第一次加入5ml,待叶片初磨碎后再加5ml,稍加研磨,后用挤压方法收集滤液即色素提取液,效果较好,此过程要保证迅速,防止色素被部分分解挥发。

二、分离色素的实验改进

(一)制备层析材料。

色素分离制备层析材料时,原实验将滤纸剪成长与宽略小于试管长与宽的滤纸条,把滤纸条一端的两角剪去,并在距这端1cm处用铅笔划一线,然后在此线上画滤液线。但是,在实际操作中,学生制备的滤纸条不规范,由于滤纸条不够硬,滤液线又距层析液太近,有好多学生对“不让滤液细线触及到层析液”这一点做的不是很好,很容易使滤液线浸入层析液中,使色素溶解,致使实验失败。因此,我选用白粉笔代替滤纸条,粉笔僵硬,下端平整,层析时能直立放置与层析容器中,避免了滤液线浸入层析液的问题。

(二)划滤液线。

我选用粉笔代替滤纸条来做实验,所以在用毛细吸管画滤液细线的步骤上也做了相应的改进:在距粉笔头大的一端1cm处用铅笔划一细线,用盖玻片边缘蘸取少量滤液,然后在粉笔的铅笔线处迅速按压旋转一周,重复2- 3次即可。此方法简便,且避免了学生画出的滤液细线粗且弯等的问题,即使是用滤纸条做层析,也可用此方法来画滤液细线,细线笔直,效果佷好。

(三)分离色素。

将层析液放入小烧杯中,把制备好的粉笔条画有滤液细线的一端朝下竖直放进烧杯深入层析液中,用一玻璃器皿盖好。几分钟后,在白色的粉笔身上,就会出现四个鲜明的色素环。

以上就是我对本实验的一些改进措施和具体做法,现将完整的实验步骤总结如下:学生自行采集新鲜的三角梅叶片,称取3克,剪碎,放入研钵中。向研钵中加入少许白细河沙、碳酸钙和5ml无水乙醇进行迅速研磨,待叶片初磨碎后再加入5ml无水乙醇继续研磨,待研磨充分后迅速用纱布挤压过滤收集滤液至小烧杯中,即得色素提取液,用培养皿盖好烧杯。取白色粉笔,在距粉笔头大的一端1cm处用铅笔划一细线,作为画滤液细线的基准线,用盖玻片边缘蘸取少量滤液,沿铅笔线处迅速轻轻按压旋转一周画出滤液细线,待干后重复画线2- 3次即可。将适量的层析液(20份汽油,2份丙酮,2份石油醚,1份苯)加入小烧杯中,液面高度为0.5cm左右,待液面平静后将制备好的粉笔条和未处理的粉笔条大的一端朝下同时竖直放进烧杯插入层析液中,注意不能让滤液细线触及层析液,用培养皿盖好,动作要迅速且平稳,观察烧杯内两条粉笔条出现的变化。

分离和提取 篇8

绿叶中的色素主要包含四种:胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b。这些色素根据在层析液中的溶解度不同体现在滤纸条上的层析带不同, 在滤纸条上层析出来的色素带从上往下依次为橙色的胡萝卜素、黄色的叶黄素、蓝绿色的叶绿素a、黄绿色的叶绿素b。在这个实验中, 最理想的结果是能同时区分出不同的条带。因此, 我们将每种材料进行试验, 将结果进行分析对比。

一、材料准备

南方的冬天材料很是很充足的, 在市场上可购置的蔬菜有很多。准备了西洋菜、西兰花、芥菜、茼蒿、白菜心、豌豆苗、油菜心、菠菜、小叶茼蒿、韭菜、莴笋叶、生菜、黑藻、茴香、香菜、薄荷、枸杞叶、红薯叶、春菜等十九种蔬菜。由于提取叶绿素要破碎细胞, 所以考虑的材料有几个要点, 第一要求叶绿素含量丰富, 叶片色泽较深。第二要求叶片纤维素含量较少, 易于破碎, 便于释放叶绿素。这些蔬菜都符合要求, 而且新鲜易于采购。

二、实验步骤

1、材料用具

新鲜的绿叶, 干燥的定性滤纸条, 培养皿, 研钵, 盖玻片, 剪刀, 药勺, 硬纸片、量筒 (10ml) , 天平, 小烧杯, 小漏斗, 铁架台, 镊子, 丙酮, 碳酸钙, 二氧化硅, 层析液。

2、破碎

(1) 将各种新鲜叶片洗净、擦干水分, 去掉梗和较粗的叶脉, 称取5g, 用剪刀剪碎, 放入研钵。

(2) 研钵中分别加入二氧化硅及碳酸钙, 进行迅速、充分的研磨到基本破碎, 加入5ml丙酮, 继续研磨, 直至成糊状。过滤, 取滤液。

3、划滤液线

将干燥的定性滤纸条一端的两角剪去, 在距这一端1cm用盖玻片直接蘸取滤液印上, 重复5到6次, 风干待用。本实验中每种蔬菜进行5组实验, 每组制备两根滤纸条。

4、层析

小烧杯中加入层析液, 将滤纸条放入, 盖上培养皿开始层析。

三、实验结果

1、研磨及划线

西洋菜:叶子小, 去梗较繁琐, 易研磨, 研磨液丰富、有点粘稠, 滤液颜色深。

西兰花:不易研磨, 研磨液含量很少, 含有大量纤维素, 滤液呈黄绿色。

芥菜:易研磨, 研磨液含量丰富, 呈黄绿色并且粘稠。

茼蒿菜:易研磨, 研磨液丰富、呈深绿色。研磨液细腻均匀, 有点粘稠。

白菜心:叶片纤维多, 不易研磨, 研磨液丰富, 呈浅绿色。

豌豆苗:含少量纤维素, 叶片薄, 因此研磨液少, 较不易研磨, 研磨液呈浅绿色。

油菜心:叶子少, 以茎和花为主, 材料浪费严重。叶子含一定量纤维素, 较不易研磨, 但是研磨液呈墨绿色, 丰富。

菠菜:叶片颜色深浓, 易研磨, 研磨液丰富, 呈深绿色。

小叶茼蒿:易研磨, 含有少量纤维素, 研磨液丰富, 呈深绿色。

韭菜:比较不易研磨, 研磨液较丰富, 色浅, 呈黄绿色。

莴笋叶:不易研磨, 含有大量纤维素, 研磨液含量不多, 色浅。

生菜:易研磨, 研磨液丰富, 色浅。

黑藻:含有较多纤维素, 较不易研磨。研磨时最好将水分擦干, 研磨液少、色浅。

茴香:易研磨, 研磨液丰富, 呈深绿色。

香菜:较易研磨, 研磨液含量不多, 颜色呈深绿色。

薄荷:较易研磨, 研磨液含量不多, 颜色呈墨绿色, 最为深浓。

枸杞叶:较易研磨, 研磨液含量丰富, 呈绿色。

红薯叶:材料易取得, 较易研磨, 含有少量纤维素, 研磨液含量丰富, 呈绿色。

春菜:易研磨, 研磨时最好去中间的叶脉, 研磨液含量丰富, 呈鲜绿色。

2、层析结果

基本上橙色和蓝绿色都能分辨出, 黄色和黄绿色较难分辨, 所以就成为最关键的部分, 以下结论主要列出了黄色和黄绿色两种色素带。

西洋菜:黄色浅、看出与黄绿色与蓝绿色的区别, 各色素带清晰, 叶黄素含量较少。

西兰花:其余的颜色无法区分, 仅见一条绿色的色素带。

芥菜:黄色、黄绿色很难分辨出, 无完整色素带。

茼蒿:黄色无法分辨, 清晰可见黄绿色, 色素带很窄, 无完整色素带。

白菜心:黄色、黄绿色无法分辨, 无完整色素带。

豌豆苗:黄色、黄绿色无法分辨, 无完整色素带。

油菜心:黄色颜色较浅, 不过依然清晰可辩。黄绿色颜色较浅, 但能分辨出, 可辨认出完整色素带。

菠菜:黄色条带很明显, 而且很宽, 能明确分辨黄绿色, 各色素带清晰、均匀分布。

小叶茼蒿:能分辨出黄色, 但较浅、窄, 黄绿色色素带较窄。能分辨出各色素带。

韭菜:黄色条带较窄、浅, 黄绿色较难分辨, 比较窄。各色素含量不均匀, 叶黄素与叶绿素b较少。

莴笋叶:黄色很浅, 难于分辨, 黄绿色较难分辨, 比较窄。各色素含量不均匀, 无完整色素带。

生菜:黄色和黄绿色无法分辨, 无完整色素带。

黑藻:黄色、黄绿色完全无法分辨, 几乎无法层析出颜色。

茴香:黄色无法分辨, 能明显分辨出黄绿色。无完整色素带。

香菜:黄色无法分辨, 黄绿色色素带明显。无完整色素带。

薄荷:黄色很浅, 不易分辨, 黄绿色难分辨。叶黄素和叶绿素b含量很少。

枸杞叶:明显的分辨出黄色, 宽约2mm, 黄绿色色素带清晰。各色素含量均匀, 层析效果明显。

红薯叶:黄色、黄绿色较浅和窄, 但各色素均能层析出来。

春菜:黄绿色无法分辨, 无完整色素带。

3、结论

作为实验原料的这十九种蔬菜, 他们的叶子含水量和纤维素含量各不相同。其中, 含纤维素较多的蔬菜有西兰花、白菜心、莴笋叶、黑藻等。其余的蔬菜含有少量纤维素或者纤维素极少, 对研磨没有太大影响。

有部分的蔬菜含有的水分很少, 在研磨时加入的丙酮一旦挥发完全, 则研磨液所剩无几, 西兰花、莴笋叶、韭菜、黑藻等蔬菜就属于这一类。

一部分蔬菜的研磨液颜色较浅, 将研磨液划到滤纸条之后叶绿素含量更少, 层析的效果就很不明显, 甚至不能层析出色素带, 这些蔬菜是生菜、春菜等。

还有一部分研磨液颜色深浓, 滤液线清晰, 但是叶黄素和叶绿素b含量很少, 因此层析出的色素带中, 黄色和黄绿色就不易分辨, 不能清晰的展示四条色素带, 这些蔬菜是茼蒿、芥菜、茴香、薄荷、莴笋叶、韭菜、豌豆苗等。

最后, 在所有蔬菜中, 易研磨, 研磨液丰富, 颜色深绿, 画出的滤液线较为深浓清晰, 并且能层析出明显的四条色素带的蔬菜是西洋菜、油菜心、菠菜、小叶茼蒿、枸杞叶还有红薯叶。

在这些可以采用的蔬菜中, 最为理想的材料是菠菜, 各色素带分层非常清晰, 并且叶子大, 叶脉少, 易于破碎, 不可采用的部分不多, 较为经济实用。其次是小叶茼蒿、枸杞叶、红薯叶, 这些蔬菜效果也明显, 但是叶黄素的含量没有菠菜的多, 黄色的色素带没有菠菜的清晰。最后是油菜心和西洋菜, 因为油菜心以油菜花和茎为主, 叶子较小而且不多, 实验中所不能采用的部分占了大多数, 对原料是一种极大地浪费, 因此并不是十分推荐采用油菜心作为这个实验的材料。西洋菜叶片很小, 并且特别娇嫩, 在运输过程中容易受到破坏, 取材时除去茎的步骤较为繁琐, 所以也不是特别推荐。

经过这个实验, 筛选出的几种蔬菜都可以作为《绿叶中的色素提取和分离》实验的材料, 保证了实验的开展。

参考文献

分离和提取 篇9

1 试验材料与方法

1.1 材料和设备

苯酚、硫酸、氯仿、正丁醇、95%乙醇、葡萄糖、氢氧化钠、盐酸、活性炭粉末、双氧水、а-萘酚、茚三酮、碘化钾和氯化钠等, 均由上海化学试剂公司提供。发酵菌种Gr UV03本试验室保存。含灰树花粗多糖的菌丝 (灰树花菌种Gr UV03揺瓶培养获得, 使用含米糠的培养基, 本试验室提供) 。

UV-1601紫外/可见光分光光度计, 北京瑞利分析仪器公司;透析袋 (截留分子量100 000) , 上海化学试剂公司;DBS-100电脑全自动部分收集器、层析柱 (1.6cm×50cm) 、DHL-A电脑恒流泵, 上海沪西分析仪器厂有限公司;DEAE-52纤维素, Whatman公司;傅里叶变换红外光谱仪, 美国Nicolet仪器公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌丝多糖的提取

对影响灰树花菌丝多糖的浸提因素如浸提时间、浸提温度、乙醇浓度和浸提次数进行单因素试验, 得到局部较优的工艺。

1.2.2 菌丝体多糖的分离纯化

(1) 粗多糖的去除蛋白质处理。本试验采用Sevage法脱蛋白, 将灰树花多糖溶解于适量蒸馏水中, 加入适量抽提液 (三氯甲烷∶正丁醇=4∶1, v/v) 振荡25min后, 3 000r/min离心20min, 取上层清液。反复进行抽提, 直至中间的蛋白质层消失, 得到脱蛋白后的灰树花多糖溶液。

(2) 粗多糖的脱色处理。采用活性炭吸附法脱色。活性炭吸附法是将2g粗多糖溶于100m L蒸馏水中, 加入2%活性炭, 置于60℃水浴中并搅拌30min, 3 000r min离心30min, 即可获得脱色后的灰树花多糖。

(3) DEAE-52纤维素柱层析。将DEAE–52纤维素溶胀、洗涤、除杂和活化, 灌柱, 平衡24h, 使层析柱达到离子平衡状态。将上样液加入DEAE-52层析柱后, 依次用蒸馏水、0.025、0.05、0.1、0.3和2.0mol/L Na C水溶液各250m L洗脱, 控制流速为0.4m L/min, 用自动部分收集器收集。10min收集1管, 每管收集4m L, 收集液用苯酚-硫酸法跟踪检测, 绘制洗脱曲线。合并各吸收峰的洗脱液, 透析至无Cl-, 冷冻干燥, 得到灰树花粗多糖。多糖含量采用苯酚-硫酸法在分光光度计490nm处测得。

1.2.3 菌丝体多糖理化性质的检测

(1) 碘-碘化钾反应。将多糖样品制成溶液 (1mg m L) , 取1m L分别加入碘-碘化钾溶液, 观察颜色变化。以蒸馏水作阴性对照, 淀粉溶液 (lmg/m L) 作阳性对照。若反应均呈阴性, 则说明样品中不含淀粉类物质。

茚三酮反应。分别取lmg/m L的多糖溶液1m L, 加入0.5m L的0.1%茚三酮乙醇溶液, 混匀, 煮沸1~2min, 冷却, 观察颜色变化。以蒸馏水作阴性对照, 0.5%甘氨酸溶液作阳性对照。在加热条件下, 氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色化合物的反应。若反应均呈阴性, 则说明样品中不含氨基酸、多肽和蛋白质。

(2) Molish反应。取lmg/m L的多糖溶液1m L, 加入2滴Molish试剂 (10%а-萘酚和95%乙醇溶液) , 摇匀, 沿壁慢慢加入1m L浓硫酸, 观察浓硫酸和糖交界面颜色的变化。以蒸馏水作阴性对照, 淀粉溶液 (lmg/m L) 作阳性对照。若反应均呈阳性, 则说明样品中含有糖类化合物。

1.2.4 菌丝体多糖的红外光谱分析

称取纯化后干燥的灰树花多糖1mg, 用KBr 100mg混合压片法在4 000~400cm-1波长范围内进行扫描。

2 结果与讨论

2.1 灰树花多糖提取工艺条件

2.1.1 提取时间对灰树花多糖含量的影响

由图1可知:随着提取时间的增加, 灰树花多糖含量随之增加, 当浸提时间分别为120min后, 多糖含量的变化趋于平缓。考虑到提取时间过长, 可能会引起多糖结构的变化和破坏, 甚至造成多糖的生物活性的损伤, 选择提取时间为120min左右为适宜。

2.1.2 提取温度对菌丝体多糖含量的影响

由图2可知:随着提取温度的增加, 灰树花菌丝多糖含量随之增加, 在提取温度为90℃时, 多糖含量达到最大值, 为215mg/100m L。研究表明:提取温度高会破坏多糖的活性, 一般不提倡高温, 故选择提取温度为60℃左右为适宜。

2.1.3 提取次数对菌丝体多糖含量的影响

由图3可知:随着提取次数的增加, 灰树花多糖含量随之增加, 在提取次数为3次后, 菌丝体多糖提取量的变化趋势趋于平缓, 故选择提取次数为3次较适宜。

2.1.4 乙醇浓度对菌丝体多糖含量的影响

由图4可知:随着乙醇浓度的增加, 灰树花多糖含量随之增加, 当乙醇浓度为67v/v时, 多糖多糖含量的变化趋势开始变缓。故选择乙醇浓度67v/v时较适宜。

由此可得局部较优条件为:提取时间120min、提取温度为60℃、提取次数为3次和乙醇浓度为67% (v/v) 。

2.2 菌丝体多糖的分离纯化

用苯酚-硫酸法对灰树花多糖的洗脱情况进行跟踪测试, 得到洗脱曲线如图5所示。

由图5可知:DEAE-52纤维素层析柱对灰树花多糖的分离效果较好, 得到了峰型比较对称的3个组分分别为蒸馏水溶液洗脱组分GFP1 (17~81管) 、0.025mol/L Na Cl溶液洗脱组分GFP2 (97~113管) 和0.3mol/L Na Cl溶液洗脱组分GFP3 (241~289管) 。

2.3 菌丝体多糖理化性质的检测

多糖理化性质的检测结果显示:GFP1、GFP2和GFP3碘-碘化钾反应均为阴性, 茚三酮反应均为阴性、Molish反应反应均为阳性, 表明所得样品确为多糖样品, 且均不含淀粉、氨基酸、多肽和蛋白质。

2.4 菌丝体多糖的红外光谱分析

对3种纯化的灰树花多糖GFP1、GFP2、GFP3和未纯化的多糖GFP进行4 000~400cm-1区间红外光谱扫描分析, 结果如图6、图7、图8和图9所示。

出峰区域位于3 300cm-1左右和1 650cm-1左右。在4 000~2 500cm-1为氢键区, 含有O-H、C-H和N-H基团的伸缩振动, 由图6、图7、图8和图9可知:出峰区域高于3 000cm-1, 可以认为存在不饱和C-H伸缩振动吸收。在2 000~1 300cm-1为双键区, 含有C=C, C=O基团的伸缩振动, 出峰区域1 650cm-1左右。综上可以看出在4 000~400cm-1区间, 具有一般多糖类物质的特征吸收峰。通过OMNIC软件对上述结果进行基础红外谱图解析, 发现均含有脂肪族伯胺 (Aliphatic Primary Amides) 和脂肪族伯醇 (Primary Aliphatic Alcohols) , 产物为复合多糖, 即糖与其他非糖物质共价结合形成的结合多糖 (复合多糖) 或糖缀合物 (glycoconjugates) 。

3 结论

分离和提取 篇10

一、教材中实验存在的主要不足

在“绿叶中色素的提取和分离”的实验教学中,常常会遇到下列问题,一是研磨时学生加入的碳酸钙和二氧化硅量过多,导致研磨过的菜叶自然过滤很难得到滤液,或过滤后得到的色素提取液量过少,沾在试管上的多,毛细吸管吸到的少。二是学生在研磨中发现,提取液被研磨的绿叶及加入的碳酸钙和二氧化硅吸收的差不多就再次加入提取液,过多的提取液使研磨后得到的色素提取液浓度太低,导致层析后效果不佳。三是用毛细吸管画滤液细线很难做到又细又平。一节课下来准备的毛细吸管有20% 会被损坏。如没有准备大批量的毛细吸管替换,等到14个班实验做下来,所谓的毛细吸管已跟普通的滴管差不多粗了。滤纸还常常被损坏的毛细吸管划破。要画出理想的又细又平的滤液细线实在很困难。这样就使部分学生做出的实验效果不理想,或几条色素带重叠不能分开,或各色素带的宽窄不均匀。四是由于滤纸不够长,试管中层析液太少,滤纸碰不到层析液,增加层析液量后,试管中层析液高度超过1cm,操作过程中滤液细线易碰到层析液, 结果导致实验失败。

为使滤液细线做到细而整齐,我们曾尝试用自动铅笔管、牙签和蘸水笔代替毛细吸管画滤液细线,其效果比用毛细吸管略好一些,但对同学们的操作技术有较高的要求。往往是前粗后细,有的甚至就是前一大滴,后面越来越细或是没画上。越想细、齐、均匀,越画不细、不齐、不均匀,这样,既浪费很多实验材料,增加了实验用具,又花费了很多时间,还不容易得到理想的实验结果。为此笔者运用逆向思维进行生物实验改进。画不上去就用滤纸来吸滤液。对实验步骤作了改进后,取得明显的效果。

二、实验改进的主要步骤

1. 提取绿叶中的色素 。

( 1) 称取、剪碎3g菠菜叶片( 约两片) ,放入研钵中。

( 2) 加入少许( 五分之一药匙) 二氧化硅、碳酸钙、5ml无水乙醇。

( 3) 快速、充分地研磨。

2. 用“擦沾法”得到又细又平的色素细线。将1cm宽的滤纸条剪角并在剪角端离滤纸条底端1cm处折180°, 将折处在研磨锤上轻轻擦过沾取色素提取液。( 见图1) 这样可轻松得到一条又细又平的色素细线,如感觉色素不够量,等待色素液干后再重复一次。

3. 用“盖印法”得到理想的色素细线。将1cm宽的滤纸条剪角并在剪角端离滤纸条底端1cm处折180° 后展平。取一载玻片直接到研钵中沾蘸色素提取液,在折痕处像盖印一样用载玻片的棱边按一下,就得到了一条又细又平的色素细线。( 见图2) 如感觉色素不够量,等待色素液干后再重复一次。

4. 色素的分离方法。将滤纸条有色素细线一端朝下放入有少许( 4ml—5ml) 层析液的小烧杯( 50ml) 中,根据烧杯的高度将滤纸折180°后挂在烧杯口上,盖上培养皿。( 见图3)

5. 观察。层析后,取出滤纸条,观察色素分离情况。

三、改进前后的实验步骤对比

四、改进后的实验优点分析

1. 减少了实验材料、用具配备和操作程序。因“擦沾法”和“盖印法”用的色素液很少,所以菠菜叶可从5g减少到3g( 大约两片) ,提取液无水乙醇也从10ml减少到5ml。不用毛细吸管画滤液细线就不怕毛细吸管堵塞,色素液不必过滤,减少了过滤程序就不需要使用漏斗、尼龙布过滤和试管收集。也不用担心得不到滤液或滤液太少减化了操作程序。减掉了制毛细吸管的过程( 毛细吸管不太好制作) ,避免了毛细吸管大量损坏的浪费。不用铅笔和直尺先画线以保证滤液细线的平直。

2. 简化了画滤液细线方法,得到的色素细线又细又平。“擦沾法”和“盖印法”学生极好掌握,且成功率相当高。我们用相同的色素提取液对几种方法进行比较,图4中的1号滤纸用“擦沾法”,2号滤纸用“盖印法”,3号滤纸用“毛细吸管画线法”。三种方法比较,“擦沾法”得到的色素细线最细,“盖印法”次之,“毛细吸管画线法”效果最差( 粗且不平) 。

3. 用小烧杯( 50ml) 层析可保证层析液不浸没色素细线,且可多组共用一个烧杯层析( 见图5) 。用培养皿加盖既方便又可防止层析液挥发。如按照改进前的方法,在试管中倒入3ml层析液插入滤纸条,再用棉塞塞紧试管口层析,碰到的问题是滤纸条太短碰不到层析液,如取小号试管又常常会因滤纸条过宽不能平整放入试管。如为使滤纸条能顺利放入小试管改用小于1cm宽的滤纸层析,又会出现看不清楚四条色素带的尴尬。

总之,改用“擦沾法”和“盖印法”后,“绿叶中色素的提取和分离”实验操作简便、效果好。省去了过滤这一烦琐的步骤,避免了尼龙布用后水洗造成的提取液含水量增加问题。由于研磨液浓度高,滤纸条上的色素带含色素多,且得到的色素细线又细又平,纸层析效果好,层析得到的四条色素带整齐、明显。在实验中我们还发现新鲜的菠菜叶由于含水量高,得到的提取液浓度较低。放置一天后或稍风干些的菠菜叶含水量下降,得到的提取液浓度较高,纸层析后四条色素带较新鲜的菠菜叶明显。

摘要：“绿叶中色素的提取和分离”实验步骤烦琐,使用器械多,用毛细吸管画滤液细线很难做到又细又平,纸层析效果不理想。改用“擦沾法”和“盖印法”后,实验操作简单易行效果好。省去了过滤这一烦琐的步骤,减少了材料用具的使用。得到的色素细线又细又平,纸层析效果好,四条色素带整齐、明显。

分离和提取 篇11

1 实验材料

口虾蛄(购于湛江港口,由广东海洋大学鉴定);METTLER AE240电子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计

为系统考察液液萃取法对乙酸乙酯提取物浸膏得率的工艺参数,经过多次单因子对比试验结果分析,选用提取温度(A)、提取次数(B)、液料比(C)3个因素作为考察因素,以测得的乙酸乙酯浸膏得率为评价指标,选用L9(34)正交表进行实验,见表1。

2.2 供试品的制备

精密称取口虾蛄乙醇粗提物20 g,按1∶3的比例(浸膏冰)加入相应体积的蒸馏水,充分搅拌,使其分散成均匀的乳浊液。将此乳浊液倒入分液漏斗中,再往其中加入一半体积的石油醚Ⅱ,充分振荡,静置,分去石油醚层。之后加入一半体积的乙酸乙酯,其萃取步骤同石油醚Ⅱ。上层浅黄色澄清的溶液为乙酸乙酯层,合并提取液,过滤,蒸干,即得乙酸乙酯浸膏。

2.3 浸膏得率的测定

精密吸取以上供试品10 ml于干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干后真空干燥3 h,冷却30 min,迅速精密称重,计算浸膏得率,结果见表2。

2.4 正交试验结果

表3的直观分析结果表明,口虾蛄乙醇提取物的影响因素大小为A>B>C;采用SPSS 13.0进行方差分析,结果见表3,显示温度对提取效率影响显著(P<0.05),提取次数、液料比两因素对提取效率无显著影响(P>0.05)。综合分析,最佳的提取工艺条件为A1B2C2,即温度60℃,提取2次,料液比为1∶5。

2.5 液液萃取法与系统溶剂法的比较

液液萃取法:精密称定口虾蛄乙醇粗提物20 g,加入石油醚Ⅱ60 ml,萃取3次,弃去醚层,加入60 ml乙酸乙酯,萃取3次,合并萃取液,过滤后蒸发称重。

系统溶剂法:精密称定口虾蛄乙醇粗提物20 g,依次加入石油醚Ⅱ,乙酸乙酯各60 ml,提取3次,合并提取液,过滤后蒸发称重。

结果显示,按浸膏得率测定乙酸乙酯浸膏得率,采用液液萃取法和系统溶剂法的乙酸乙酯浸膏得率分别为7.4%和5.1%,表明用液液萃取法提取乙酸乙酯浸膏效果更高。

2.6 验证试验

为确保提取工艺的重现性及可行性,按最佳提取工艺条件进行了3次验证试验。结果乙酸乙酯浸膏得率分别为7.3%、7.6%、7.2%,平均值为7.4%,RSD为2.82%,重现性较好,说明提取工艺条件基本稳定。

3 讨论

本实验在保证口虾蛄乙酸乙酯提取物抗肿瘤活性不变的前提下,所进行的正交试验结果表明,温度对提取物得率影响显著。升高萃取温度可以提高萃取物的挥发度,从而使得率提高,但是升高温度对抗肿瘤活性成分的稳定性有一定影响。随着萃取次数增加,乙酸乙酯提取物得率亦增加,超过2次时,萃取得率趋于稳定。由于溶解溶质需一定的时间才能达到溶解平衡,溶解达到平衡后,再增加萃取次数,萃取得率不会增加太大,因此,最佳萃取次数选择2次。料液比越小提取率越高,料液比太大,萃取液浓度则大,所以在保证一定提取率的基础上选择料液比为1∶5较为合适。

综合考虑,口虾蛄乙醇提取物的最佳提取工艺为温度60℃,提取2次,料液比为1∶5。通过优化实验,有效地提高了口虾蛄乙酸乙酯提取物的得率,为进一步试验提供依据,同时,3批验证试验结果表明该工艺稳定可行。

摘要：目的:优选口虾蛄乙醇提取物的分离提取工艺。方法:采用L9(34)正交设计法,考察提取温度(A)、提取次数(B)、液料比(C)3个因素,以乙酸乙酯浸膏得率为评价指标。结果:最佳的提取工艺条件为A1B2C2,即温度60℃,提取2次,料液比为1∶5。结论:3批验证试验结果表明,该工艺重现性良好,稳定可行。

关键词：口虾蛄,提取工艺,正交设计

参考文献

[1]李明勇,黄培春,孔霞.MTT法测定口虾蛄提取物的体外抗肿瘤活性[J].现代肿瘤医学,2005,13(3):336-337.

[2]李明勇,黄培春,孔霞.口虾蛄提取物对人鼻咽癌CNE-2Z细胞的抑制作用[J].实用癌症杂志,2006,5(2):241-243.

[3]顾帝水,黄培春,孔霞.口虾蛄提取物对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响[J].现代中西医结合杂志,2005,14(14):1825-1827.