反相色谱法论文（共10篇）
反相色谱法论文 篇1
在HPLC中最频繁使用的有机溶剂是乙腈与甲醇, 这两者主要在反相色谱中分析使用。有时使用优级纯的, 但最好是使用HPLC级的。与优级纯相比, HPLC级的更多地除去了会吸收紫外线的杂质。因此从检测、柱劣化等方面来看, HPLC级的更为理想。从检测上说无论如何需要HPLC级的情况可分为两种:第一种需要作微量检测, 因此需要尽最大可能降低基线噪声。第二种情况是根据gradient梯度洗提法进行分析时, 前者因为有机溶剂中的杂质会使基线噪声增大, 所以越是等级高的便越理想。
甲醇和乙腈的毒性都非常大, 甲醇沸点64.5℃, 乙腈沸点81.1℃, 都容易挥发。甲醇可以致人失明甚至死亡, 少量吸入会导致视力逐渐退化, 乙腈有致癌性。
那么在使用过程中是选择甲醇还是乙腈?下面来看看两者之间的区别。
一极性不同
甲醇的极性为6.6, 乙腈的极性为6.2, 但是差别不是很大。但是对于企业以及分析人员来说喜欢用甲醇的多, 这和价格有关系, 乙腈, 特别是HPLC级的价格很高。企业考虑成本, 以及乙腈的味道和毒性问题等, 一般分析人员偏爱甲醇多一点。而对于文献或LC厂家所示的条件, 多用乙腈。这是为什么呢?
二吸光度:乙腈HPLC级的小
图1、图2分别是乙腈和甲醇的HPLC级和优级纯的吸收光谱 (实线是优级纯的, 虚线是HPLC级的) 。HPLC级 (不是指绝对纯度高的) 是除去具有吸收UV的杂质, 在规定的波长上吸光度限制在规格值以内。在这四种试剂中乙腈HPLC级吸收最小 (特别是在短波长上小) 。用于流动相的吸收小的有机溶剂, 在UV检测时, 产生的噪声小, 因此在进行UV短波长上的高灵敏度分析时乙腈HPLC级最适宜。另外, 在UV检测中的梯度基线上也是乙腈HPLC级产生鬼峰少。虽然, 其他与水相溶性高的有机溶剂有很多, 但难以找到比乙腈HPLC级吸收更小的。
另外, 甲醇的HPLC级和优级纯, 虽然所得的光谱相差不大, 但是优级纯不能保证吸光度, 有可能产生偏差, 且价格也相差不大, 所以尽量使用HPLC级。另外, 用优级纯检测时取得的数据噪声会比较大。
三压力:乙腈低
柱内承受压力, 根据有机溶剂的种类或混合比例不同而异。甲醇与水混合, 压力增高, 而乙腈同样与水混合压力就低得多。所以, 在使用甲醇和水的混合液而柱压很大的情况下, 可以考虑用乙腈和水的混合液。因为对于乙腈水溶液在同样的流速下不在柱内加上多余的压力。
从上述两项, 可以确认使用乙腈的意义。那么, 甲醇除了价格以外, 还有哪些优点呢?下面不妨再来比较一下。
四洗脱能力:一般而言, 乙腈较强
乙腈和甲醇分别用同样的比例与水混合时, 一般情况下, 乙腈的洗脱能力强。特别是混合比例低时, 从咖啡因和苯酚的洗脱来看, 获得同样的保留时间, 乙腈的比例, 只需甲醇比例的一半以下即可。另一方面, 有机溶剂100%或与此极接近时, 从对胡萝卜素和胆甾醇来看, 常常都是甲醇的洗脱能力强。
混合比在50∶1等较为特殊时, 调制的误差大, 影响保留时间或平衡化的时间长。乙腈遇到这种情况时, 用甲醇的10∶1混合代替乙腈, 这样操作要方便一些。
溶剂受温度影响时, 不采用容器定量, 而采用重量的方法 (考虑比重) , 可使混合比的误差减小。
五分离 (洗脱) 的选择性:两者的差异
乙腈和甲醇在分离的选择性上不同。苯酚和苯甲酸的洗脱顺序改变 (但水比例高时, 用乙腈, 也是苯酚先洗脱) , 这是由于有机溶剂分子的化学性质 (甲醇和乙醇是质子性, 乙腈和四氢呋喃是非质子性) 不同所致。
因此, 在用乙腈类不能获得分离的选择性时, 就用甲醇类试一试。
六峰形:有时出现差异
像水杨酸化合物 (在邻位上具有羧基或甲氧基的苯酚化合物) 等, 用乙腈类时拖尾大, 用甲醇类可抑制。这是由于: (1) 对于硅表面与目标成分有相互作用的流动相的有关方因有机溶剂分子的化学性质不同而异; (2) 对成分溶解能力的不同所致。
在一般情况下, 聚合物类反相柱, 与硅胶柱相比, 更具有峰形宽的倾向。特别是用聚苯乙烯分析柱芳香族化合物等时常见。这在流动相是甲醇时非常显著, 而用乙腈时不明显。为此, 用聚合物类反相用柱时建议采用乙腈类。这是因为乙腈使凝胶膨润。
七流动相的脱气:乙腈类要注意
混合溶剂的置制, 不讨论在LC装置内, 只考虑预先在流动相瓶内进行时 (等浓度系统) 。
甲醇与水混合时发热, 多余的溶解空气较易变为脱出气泡 (脱气容易) 。而乙腈由于吸热冷却, 随着慢慢回到室温, 产生气泡, 所以要考虑脱气 (加温搅拌, 过滤膜、He脱气等) 。
八结论
以上对反相色谱法流动相常用的乙腈和甲醇进行了比较。粗略地讲, 是“使用乙腈HPLC级最好在选择性, 峰形差时试用甲醇HPLC级”。
摘要：HPLC中最频繁使用的有机溶剂是乙腈与甲醇, 但是如何准确选择使用?因两者各自有着很多特点, 需要根据各自的特点进行合理选择。
关键词：HPLC,反相色谱法,甲醇,乙腈,选择
反相色谱法论文 篇2
反相高效液相色谱法测定伤湿气雾剂中丹皮酚含量
建立了反相高效液相色谱法测定伤湿气雾剂中丹皮酚含量的方法.在Polaris C18色谱柱(150 mm×4.6 mm i.d.,5 μm)上,检测波长274 nm,柱温30 ℃条件下,研究了流动相中甲醇的含量对样品分离的`影响.结果表明,V甲醇∶V水=45∶55时,效果最佳.丹皮酚的质量在0.021～0.420 μg之间与峰面积呈线性关系.并测定了不同批号伤湿气雾剂中丹皮酚的含量,测定结果的RSD值(n=5)在0.91%～1.31%之间.对回收率作了试验,其结果在94.6%～98.2%之间.
作 者：赵建文 ZHAO Jian-wen 作者单位：吉首大学,化学化工学院,吉首,416000;吉首大学,分析测试中心,吉首,416000刊 名：理化检验-化学分册 ISTIC PKU英文刊名：PHYSICAL TESTING AND CHEMICAL ANALYSIS PART B:CHEMICAL ANALYSIS年，卷(期)：43(4)分类号：O657.37关键词：反相高效液相色谱 伤湿气雾剂 丹皮酚
反相色谱法论文 篇3
(南京先声东元制药有限公司质量部江苏南京211800）【摘要】目的：建立反相高效液相色潽法测定人血清中头孢他美浓度的方法。方法：选用LiChrosorb 反相色谱柱(4．6 mm×200mm×5μm，Agilent Technologies)，以0.1％冰醋酸溶液-乙腈(75：25)为流动相，检测波长为265 nm，流速1.0ml／min，柱温为室温。结果：该方法下头孢他美的检出限为3.029ng/ml，在0.25μg/ml～10.0μg/ml浓度范围内线性关系良好，方法的重现性、重复性和稳定性良好。结论：利用反相高效液相色谱法测定头孢他美在人血清中的浓度具有高灵敏、线性范围广、重现性好的特点，可以将此方法用于监测头孢他美体内生物利用度情况。【关键词】反相高效液相色谱法;血清浓度;头孢他美 【中图分类号】R96【文献标识码】B【文章编号】1004-5511（2012）04-0270-02 头孢他美酯［1］为第三代口服头孢菌素类药物，口服后在肠道内代谢为头孢他美发挥抗菌作用。对绝大多数的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有较好的抗菌作用，对耐头孢菌素的沙雷菌属、柠檬酸菌属、肠杆菌属具有较强的抗菌活性，且对β-内酰胺酶稳定，为广谱抗生素。临床上应用广泛。本文对反相高效液相色谱法测定血清中头孢他美浓度的方法进行研究，为监测头孢他美血药浓度变化及体内生物利用度情况提供依据。1.仪器及方法1.1仪器与试剂:仪器：Agilent1200高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）试剂：冰醋酸：色谱纯（天津科密欧化学试剂有限公司）乙腈、甲醇：色谱纯（DIKMA TECHNOLOGIES INC）1.2色谱条件及系统适用性试验［2］:选用LiChrosorb 反相色谱柱(4．6 mm×200mm×5μm，Agilent Technologies)，以0.1％冰醋酸溶液-乙腈(75：25)为流动相，检测波长为265 nm，流速1.0ml／min，柱温为室温，进样量20μl。理论塔板数按头孢他美峰计应不低于4000。1.3对照品贮备液的制备:精密称取头孢他美酯对照品（中国食品药品生物检定研究院）32.52mg（约相当于头孢他美25.24mg），置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成1ml含头孢他美252.4μg的溶液作为对照品贮备液。1.4血样处理:精密量取血浆样品0.2ml，置lml离心管中，加6％高氯酸溶液0.2ml，置涡旋振荡器振摇lmin后，以10000转/min的转速离心10min，取上清液作为供试品溶液。2.结果2.1检出限:取对照品贮备液1 ml，定量稀释至信号峰的峰高与噪音峰峰高比值约等于3，即可。计算此时对照品溶液的濃度。经计算该方法下头孢他美的检出限为3.029ng/ml 。2.2线性试验:分别取对照品贮备液0.1ml、0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、4.0ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得含头孢他美0.2524μg/ml、0.5048μg/ml、1.2620μg/ml、2.5240μg/ml、5.0480μg/ml、10.096μg/ml的溶液，分别精密量取20μl，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立平面直角坐标系、计算回归方程和r值。具体结果如下：2.3精密度试验:精密量取对照品贮备液4.0ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密量取20μl，注入高效液相色谱仪，由同一实验员在同一台高效液相色谱仪上，连续进样6针，记录峰面积，并计算相对标准偏差。结果表明：该方法具有较好的精密度，RSD%=0.26，具体结果如下：2.4溶液稳定性试验:去精密度试验项下的供试品溶液，分别于0min、20min、40min、60min、90min、120min时，精密量取20μl，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，并计算相对标准偏差。结果表明：该溶液2小时内稳定，RSD%=0.35，具体结果如下：2.5重复性试验:精密量取同一份含药血清标本作为供试品，精密量取6份，每份0.2ml，分别按照血样处理方法进行处理，得6份供试品溶液，分别量取20μl，注入高效液相色谱仪，采用外标法计算血清样本中含量。6份样品中头孢他美平均含量为2.22μg/ml，相对标准偏差（RSD）为1.88%。结果表明：反相高效液相色谱法用于测定血清中头孢他美的浓度，方法重复性较好。具体结果如下：2.6回收率试验:分别量取头孢他美对照品贮备液0.5ml、1.0ml和2.0ml，置100ml量瓶中，摇匀后，分别精密量取0.2ml于离心管中，加入0.2ml空白血浆，置涡旋振荡器振摇lmin后，以10000转/min的转速离心10min，取上清液作为供试品溶液。分别量取20μl，注入高效液相色谱仪，每个浓度重复测定3次，采用外标法计算血清样本中含量，测得值除以加入值计算回收率，并计算平均回收率和相对标准偏差。具体结果如下：2.7人体血药浓度测定:选取20名健康的自愿者采用盲法进行试验，其中10名空腹服用头孢他美酯胶囊（浙江震元制药有限公司）500mg，另外10名空腹服用相同外观的空白胶囊。与服药后2小时，抽取静脉血2ml，按照血样制备方法至的样品溶液，取各样品溶液20μl分别注入高效液相色谱仪，记录峰面积。代入回归方程，计算此时自愿者体内的血药浓度。结果表明，该方法可以用于测量服药者的血液中头孢他美的含量，空白试验无干扰。具体结果如下：3.讨论
朱华等人［4］通过对不同剂型、不同生产厂家的盐酸头孢他美酯进行体外溶出度试验，发现一种药物制成不同剂型的药物制剂，其体外溶出度存在显著差异。不同生产厂家因其所使用的原辅料、处方、工艺各不相同使得相同剂型的同种药物体外溶出苏也必然不同。药物体外溶出度是在模拟体内环境的实验条件下进行的，是药物在体内变化情况的一种体现，可见不同剂型、生产厂家的盐酸头孢他美酯一定会出现不同的体内代谢过程。何周康等人［5］对头孢他美酯分散片在人体内的相对生物利用度及生物等效性进行了系统的研究，研究发现药物固有的药动学参数往往会因给药个体间的差异而出现明显的偏差。因此最为合理的给药方案一定是建立在用药后血药浓度监测的结果之上的。有学者经研究表明［6］常用的口服头孢菌素类药物的体内吸收、分布、代谢、排泄过程存在着较大的差异，应根据不同药物的药物动力学特点制定合理的给药方案，以达到最好的治疗效果。作为第三代口服类头孢菌素类药物，头孢他美因其较强的水溶性使得药物的吸收受到影响，将其制成脂溶性较好的头孢他美酯，有助于体内的吸收。药物吸收入血后代谢成具有生物活性的头孢他美，发挥药效。大部分头孢他美通过肾小球的被动滤过作用清除，少量通过肾小管排出体外。明确了药物的体内代谢过程，以及进行血药浓度监测的重要性后，就需要有准确有效的测量方法对患者体内的药物含量进行监测，以确定该药物在具体病例体内的代谢速率。本文对反相高效液相色谱法测定血清中头孢他美浓度的方法进行研究，为制定具体的给药方案提供了数据支持。参考文献［1］曾忠荣，1 756例头孢他美酯干混悬剂的使用分析［J］．中国医药导报，2008，5（17）：119-120．［2］鲜杨 ，龙恩武 ，袁浩宇，反相高效液相色谱法测定盐酸头孢他美酯胶囊中头孢他美含量［J］．中国药业，2010，19（7）：31-32．［3］邓晓彬 ，张献冲，RP-HP LC法测定人血浆中头孢他美浓度［J］．中国药房，2007，18（8）：586-587．［4］朱华 ，许建国 ，蒋丹，盐酸头孢他美酯片剂与胶囊剂体外溶出度比较［J］．抗感染药学，2009，6（3）：182-185．［5］何周康 ，阳利龙 ，祝文兵等，头孢他美酯分散片在人体内的相对生物利用度及生物等效性［J］．抗感染药学，2006，21（6）：541-543．［6］张明发 ，沈雅琴，常用口服头孢菌素的药动学及临床应用评价［J］．抗感染药学，2010，7（2）：78-83．
反相色谱法论文 篇4
1 实验部分
1.1 仪器及试剂
高效液相色谱仪,带紫外可变波长检测器、数据处理机。
进样器 50μL;定量进样环 5μL;超声波振荡器;过滤器。
乙腈色谱纯;经二次蒸馏水;溴氰菊酯标样已知w≥98.0%
1.2 色谱条件
色谱柱,Symmetry C18 250mm×4.6mm(id);流动相,乙腈+水=82+18(体积比);流速,1.2mL/min;柱温,室温;检测波长,240nm;进样量,5μL;保留时间,12min。
1.3 标准溶液的配制
称取溴氰菊酯标样15mg(精确至0.2mg),于25mL容量瓶中,用乙腈溶解,稀释至刻度,摇匀,置于超声波水浴中振荡约10min,取出待降至室温后备用。
1.4 试样溶液的配制
称取含溴氰菊酯15mg的试样(精确至0.2mg),置于25mL容量瓶中,用乙腈溶解,稀释至刻度,置于超声波水浴中振荡约10min,取出待降至室温后用
0.45μm过滤器过滤备用。
1.5 测定方法
在上述色谱条件下,待仪器基线稳定后,连续注入数针标准溶液,计算各针的响应值,待相邻两针的响应值变化小于1.5%时,按照:标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。用两次重复所得数据的平均值计算结果。
1.6 结果计算
样品中溴氰菊酯的质量分数按下式计算。
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式中: A1为标样溶液的峰面积; A2为样品溶液的峰面积; m1为标样的质量,g;m2为样品的质量,g;P为标样中溴氰菊酯的质量分数,%;w为样品中溴氰菊酯的质量分数,%。
1.7 标准曲线的绘制
称取溴氰菊酯标准样品分别为3、6、9、12、15mg(准确至0.2mg)于25mL容量瓶中,用乙腈溶解,稀释至刻度,摇匀后进样分析,以溴氰菊酯的质量浓度ρ为横坐标,以峰面积A为纵坐标作图2。从图2看出,以有效成分计,称样范围在3~15mg,溴氰菊酯的质量浓度ρ与其相对峰面积呈良好的线性关系。
2 结果与讨论
2.1 检测波长及流动相的选择
经过多次试验条件的选择,确定采用检测波长为240nm,流动相为乙腈+水(体积比41∶9)的条件下,分离效果及色谱峰形较好。
2.2 线性关系测定
按本文所述操作条件进行线性关系分析测定。实验表明,以溴氰菊酯的质量浓度ρ为横坐标,以峰面积A为纵坐标作图,得到称样量与其峰面积呈良好的线性关系,线性相关系数为0.99997。
2.3 回收率测定
采用标样添加法,在已知含量的样品中加入一定量的标样分别在选定的色谱条件下测定,测得溴氰菊酯平均回收率为100.1%。
2.4 分析方法的精密度测定
在上述色谱条件下,对同一样品平行测定6次,计算溴氰菊酯含量,其RSD值为1.23%。
3 结论
反相色谱法论文 篇5
反相高效液相色谱法分离测定烟草中的多酚类化合物
对植物中9种多酚类化合物的色谱分离条件进行了优化,分别探讨了流动相组成、流动相中醋酸浓度、醋酸溶液与甲醇的比例对保留时间的影响,确定了梯度分离条件,并对9种天然多酚类化合物进行了定量分析.该方法的检测限为13.26～59.29 mg/kg(S/N=3).在3.0～100.0 mg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数r2为0.997 9～0.999 9.9种待测化合物的加标回收率为96.8%～108%,相对标准偏差(RSD)小于3.8%(n=3).用80%甲醇超声提取烟草样品,并通过优化的色谱条件对其进行分析,测定了实际烟草样品中芸香苷和绿原酸的.含量.结果表明,该方法具有一定的实用价值.
作 者：李福娟 蔡文生 邵学广 LI Fujuan CAI Wensheng SHAO Xueguang 作者单位：南开大学化学系分析科学研究中心,天津,300071刊 名：色谱 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY年，卷(期)：25(4)分类号：O658关键词：反相高效液相色谱 超声波提取 多酚 烟草
反相色谱法论文 篇6
目前,不法商人添加碱性橙的食品有辣椒粉[1]、小黄鱼[3]及豆制品[4]。2008年12月,某质检部门在一红糖厂车间发现了碱性橙染料,怀疑其所生产的红糖中添加有碱性橙染料要求检测,而目前国内尚无成熟的测定红糖中碱性橙的方法,因此作者建立了RP-HPLC法测定红糖中碱性橙的方法。
1 检测原理
试样经乙醇溶解,超声提取,离心机分离, 上清液过滤后经C18 分离柱分离,UV检测器检测,外标法定量。
2 实验部分
2.1 主要仪器及试剂
1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司),紫
外检测器及配套0.45 μm抽滤装置一套;针头式过滤器,0.22 μm微孔滤膜; H1850型离心机; AS20500BDT超声波清洗仪。
4个红糖样品,每个500 g(某质检部门提供),其余样品为市场上购得。
乙腈(色谱纯), 无水乙醇(分析纯),去离子水,碱性橙标准品(纯度99%)。碱性橙标准储备液:1000 mg/L。称取0.1000 g碱性橙于100 mL容量瓶,用无水乙醇溶解并定容至刻度,摇匀,备用。碱性橙标准使用液:临用前将储备液用无水乙醇稀释至20 mg/L。
2.2 测定条件
色谱柱: VenusilASB C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);检测波长:443 nm;流动相:V(乙腈) ∶V(水)=60 ∶40;流速:1.0 m L/min;进样量:20 μL; 柱温25℃。
2.3 工作曲线
用碱性橙标准使用液配制0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/L的系列标准溶液,在443 nm波长处测定色谱峰面积,用峰面积与碱性橙含量绘制标准工作曲线。
2.4 样品处理
称取充分切碎的红糖10 g(精确至0.0001 g)置于150 mL具塞锥形瓶中,用移液管加入20.00 mL无水乙醇,充分混匀 ,超声60 min后静置20 min。取10 mL溶液转移至10 mL离心管中,8000
r/min离心10 min,取上清液1.5 mL经0.22 μm微孔滤膜过滤,得上机待测液。同时做空白实验。
3 结果与讨论
3.1 分离色谱图
选择乙腈/水即V(乙醇)∶V(水)=80∶20、60∶40两种比例流动相实验。
在80∶20时保留时间较短,但样品中一杂质峰(0')无法与碱性橙峰分开,当选择60∶40的比例作流动相时,该杂质峰可与碱性橙峰达到较好的分离,因此本实验选择60∶40的流动相。所得色谱图见图1。
3.2 方法的线性关系和检测限
按照2.4节配制标准溶液,进行色谱分析。用EXCEL软件将峰面积对标准溶液浓度作图,建立标准曲线并得回归方程及相关系数,y=66.28x+0.57,r=0.9999;同时配制一定浓度溶液做定性定量检出限(以10倍噪音计算定量检出限),得定量检出限为0.10 mg/kg,线性范围为0.05～4.00 mg/L。
3.3 添加回收率及精密度实验
通过对4个红糖实际样品添加碱性橙,多次平行处理并测定,以计算方法精密度及回收率(n=5)。所得结果如表1。
注:因样品中未检出碱性橙,因此本底值表示为0.00。
3.4 其它实际样品检测结果
应用所建方法对另外大量样品进行了检测,结果均为未检出碱性橙。
4 结论
通过利用实验室现有条件,建立了红糖中碱性橙含量测定的反相高效液相色谱法。可为其它类似样品中的碱性橙测定提供参考方法。
摘要：建立了高效液相色谱法测定红糖中碱性橙含量的测定方法。采用C18分离柱,以乙腈和水[V(乙醇)∶V(水)=60∶40]为流动相,检测波长为443 nm。检出限为0.10 mg/kg,回收率为84.0%107.0%,测定结果标准偏差2.0%5.3%。
关键词：红糖,HPLC法,碱性橙
参考文献
[1]铁晓威,黄百芬,任一平.RP-HPLC法测定染色黄鱼中的碱性橙含量[J].中国卫生检验杂志,2004,(1):63-64.
[2]崔松林,周宇,孙蕊,等.高效液相色谱法测定辣椒粉中碱性橙、玫瑰精含量[J].分析测试技术与仪器.2006,12(4):202-204.
[3]冯济富,黄明.一起使用碱性橙浸染小黄鱼案的评析[J].中国卫生监督杂志;2003,(6):33-34.
反相色谱法论文 篇7
关键词：奋乃静片,HPLC,含量测定
奋乃静（perphenazine）为化学合成的吩噻嗪类抗精神病药。抗精神病作用较氯丙嗪强5～10倍，而镇静、安定作用较弱，主要用于精神分裂症症状性精神病，临床上除应用于严重精神病患者的治疗外，还用于镇吐、抗组胺以及帕金森综合征的治疗[1]。虽然其药理作用尚未完全清楚，但普遍认为奋乃静的作用机制主要与其阻断中脑边缘系统及中脑皮层通路的多巴胺受体有关。《中国药典》2005版分别采用滴定法和分光光度法对奋乃静原料药和片剂进行分析[2]，还可采用流动注射化学发光法、褶合光谱法、极谱法、二阶导数光谱法、毛细管电泳法-安培检测法、分子印迹-后化学发光法、高效液相色谱法等方法[3,4,5,6,7]进行分析。本文在文献报道的色谱系统的基础上进行优化，建立了反相高效液相色谱法测定奋乃静片含量的方法，该方法灵敏、准确、简便、快速，为更好地控制该药品的质量提供了依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Alliance高效液相色谱仪，包括Waters 2695分离单元（四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机，可容纳120个进样瓶的自动进样系统），Waters 2996二级管阵列检测器，柱温箱，Empower色谱工作站；Mettler AE163电子分析天平；PS-100超声仪；Millipore Q超纯水仪；MP200 pH计；UV-1三用紫外分析仪。
1.2 试药
奋乃静对照品（中国药品生物制品检定所，批号为100133-200602）；奋乃静片（苏州天力士帝盟药业有限公司，批号为200805181；江苏黄河药业股份有限公司，批号为061226；广东彼迪制药有限公司，批号为20080701D；规格均为2 mg片）；色谱纯甲醇（天津市四友精细化学品有限公司）；分析纯醋酸铵及冰醋酸（广州化学试剂厂）；水为Millipore18兆净化的超纯水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件及相关考察
2.1.1 色谱条件的考察
2.1.1. 1 检测波长的选择
从紫外二极管阵列检测器提取的光谱图（图1）可见，奋乃静在255.7 nm波长处有最大吸收，因此选择256 nm波长作为检测波长。
2.1.1. 2 流动相系统的优化
文献[6]采用0.03 mol醋酸铵-甲醇（23∶77）的色谱分离系统测定奋乃静的含量。本文在该色谱条件的基础上进行优化，应用于奋乃静的测定，效果良好，重点考察pH值和盐浓度对分离分析的影响，以优化最佳色谱系统。
(1)pH值的影响：用磷酸调节0.03 mol/L的磷酸二氢钾溶液至不同的pH值（3.0、3.5、4.0、5.0、6.8），分别与甲醇配成流动相。固定流动相配比为0.03 mol醋酸铵-甲醇（30∶70），流速为1.0 ml/min，柱温为40℃。分别进样，记录色谱图，比较流动相的pH值对保留时间、峰形（拖尾因子）和柱效（理论塔板数）的影响（表1）。结果显示，随着流动相pH值的增大，奋乃静峰的保留时间延长，拖尾因子增大，理论塔板数减小，考虑到色谱柱对pH值的耐受程度，选择流动相的pH值为3.0。
(2)盐浓度的影响：配制不同浓度的醋酸铵溶液（0.01、0.03、0.06、0.09、0.10 mol/L），用冰醋酸调节pH值至3.0，并分别与甲醇配成流动相。固定流动相配比为醋酸铵-甲醇（30∶70），流速为1.0 mol/L，柱温为40℃。分别进样，记录色谱图，比较醋酸铵浓度对保留时间、峰形（拖尾因子）和柱效（理论塔板数）的影响（表2）。结果显示，醋酸铵浓度对保留时间影响较小，拖尾因子随着醋酸铵浓度的增加而降低，而理论塔板数则随之增大，综合考虑色谱柱的寿命及拖尾因子，不采用0.1 mol/L的浓度，因此选择醋酸铵的浓度为0.09 mol/L。
2.1.2 色谱条件
色谱柱为Diamonsil TM C18(4.6 mm×250 mm,5μm），流动相为0.09 mol/L醋酸铵（用醋酸调至pH 3.0）-甲醇（30∶70），流速为1.0 ml/min，检测波长为256 nm，柱温为40℃。
2.2 系统适用性试验
精密称取对照品适量，加甲醇制成浓度为0.1 mg/ml的溶液，在上述色谱条件下进样20μl，记录色谱图（图2），理论板数大于2 000。
2.3 专属性试验
2.3.1 酸破坏溶液
取奋乃静对照品1 mg，加甲醇1 ml使溶解，加1 mol/L盐酸1 ml，放置30 min，加1 mol/L氢氧化钠溶液1 ml，用甲醇定容至10 ml。
2.3.2 碱破坏溶液
取奋乃静对照品1 mg，加甲醇1 ml使溶解，加1 mol/L氢氧化钠1 ml，放置30 min，加1 mol/L盐酸溶液1 ml，用甲醇定容至10 ml。
2.3.3 氧化破坏溶液
取奋乃静对照品1 mg，加甲醇1 ml使溶解，加1%过氧化氢溶液1 ml，放置30 min，用甲醇定容至10 ml。
2.3.4 高热破坏溶液
取奋乃静对照品1 mg，加甲醇定容至10 ml，于90℃加热放置2.5 h。
2.3.5 光照破坏溶液
(1)取奋乃静对照品1 mg，于紫外光下照射8 h，加流动相定容至10 ml。(2)取奋乃静对照品1 mg，加流动相定容至10 ml，于紫外光下照射2.5 h。
取上述溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样20μl，记录色谱图，以考察奋乃静峰与杂质峰的分离情况。结果表明，各破坏条件下的降解产物峰对奋乃静峰无干扰，分离效果良好，说明该方法专属性良好（图3）。从图中也可以看出，奋乃静对酸、碱和热均较稳定，无杂质峰出现；氧化破坏后，有杂质峰出现，说明奋乃静对氧化剂不稳定，应避免其氧化；固体奋乃静经光照破坏8 h后，无杂质峰产生，而奋乃静溶液经光照破坏后，出现明显的杂质峰，说明奋乃静溶液对光极不稳定，应避光保存。
2.4 线性关系考察
避光操作（以下实验均避光操作）。精密称取奋乃静对照品约100 mg于100 ml容量瓶中，加甲醇60 ml使溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备液1、5、1、5、5 ml于100、100、10、25、10 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/ml的奋乃静对照品溶液，分别进样20μl，记录色谱图，以浓度C(mg/ml）对峰面积A进行线性回归，得线性方程为A=98 953 254C+259 369,r=0.999 9。结果表明，奋乃静的浓度在0.01～0.50 mg/ml范围内与峰面积线性关系良好。
2.5 精密度试验
取同一份对照品溶液连续进样6次，峰面积RSD为0.2%。
2.6 重复性试验
取同一批号供试品溶液6份，按“2.10”项下操作，平均含量为96.2%，RSD为0.9%。
2.7 回收率试验
精密称取奋乃静对照品约100 mg，置100 ml容量瓶中，加甲醇60 ml使溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。取供试品50片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于奋乃静5 mg），置100 ml量瓶中，共9份。分别精密量取对照品溶液3、5、7 ml各3份于供试品量瓶中，各加入甲醇60 ml使溶解，并稀释至刻度，按“2.10”项下条件测定，测得平均回收率为99.0%，RSD为1.8%（n=9）。
2.8 稳定性试验
取同一份样品溶液，分别于0、1、2、3、4、5、6、8 h取20μ进样，记录色谱图，奋乃静的峰面积基本不变，RSD为0.7%。结果表明，奋乃静注射液在8 h内稳定性良好。
2.9 检测限和定量限
以信噪比为3∶1，测得系统的最低检测浓度为0.2μg/ml，即最低检测限为4 ng；以信噪比为10∶1，测得系统的最低定量浓度为0.6μg/ml，即最低定量限为12 ng。
2.1 0 样品含量测定
精密称取奋乃静对照品约10 mg，置100 ml容量瓶中，加甲醇60 ml使溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液。取供试品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于奋乃静5 mg），置50 ml量瓶中，加甲醇60 ml使溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。取上述两种溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，结果厂家为苏州天力士帝盟药业有限公司、江苏黄河药业股份有限公司、广东彼迪制药有限公司的供试品含量测定结果分别为94.9%、97.5%、96.0%。
3 讨论
奋乃静在水中几乎不溶，因此配制对照品和供试品溶液时，选用甲醇使溶解并定容。本文建立的色谱系统具有流动相组成简单，对色谱柱损伤小的优点，用于奋乃静的含量测定，快速、准确、专属性强。
参考文献
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反相色谱法论文 篇8
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
HP-1100液相色谱仪:具UV可变波长检测器, 浙大N2000色谱工作站, 迪马公司C18 (200mm×4.6mm i.d) 色相色谱柱 (带保护柱) 。
甲醇、KH2PO4、磷酸、四丁基溴化铵 (均为AR) ;二次蒸馏水;四氟苯甲酸标样:含量≥98.0% (sigama公司提供) ;四氟苯甲酸样品:自制。
磷酸盐缓冲溶液B:称取2.712g KH2PO4及1.05g四丁基溴化铵于1L容量瓶, 加入双蒸水溶解后再用双蒸水定容, 用磷酸调至pH=2.3, 经0.45μm滤膜过滤后备用。
1.2 色谱条件
流动相:甲醇/磷酸盐缓冲溶液B=15/85 (V/V) ;
流速:1.0mL/min;
紫外检测波长:276nm;
进样量:25μL。
1.3 标准溶液的配制
准确称取98.0%的四氟苯甲酸标样0.0575g (准确至0.0002g) , 置于25mL容量瓶中, 用流动相溶解, 稀释至刻度, 摇匀;用移液管分别准确移取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL上述溶液于10mL容量瓶中, 用流动相容, 摇匀, 待测。
2 结果与讨论
2.1 检测波长的选择
通过对四氟苯甲酸紫外吸收扫描可看出, 四氟苯甲酸有两个吸收峰分别在217nm和276nm, 在217nm处吸收最强, 但在217nm处, 本底吸收大, 会对结果造成一定影响, 经实验最终确定检测波长为276nm。四氟苯甲酸的紫外吸收光谱图如图1。
2.2 流动相的选择
有机酸样品的液相色谱分析, 流动相关系重大, 针对四氟苯甲酸的特性, 我们发现由于其极性很大, 而流动相中水的比例又很高, 会发生酸的离解而很难在固定相上保留, 或保留很差出分叉峰。
由图2可见, 峰形不单一, 对称性差, 拖尾严重, 更换不同种类及比例的反相流动相均不见改观, 通过查阅相关资料, 我们了解到出现这种状况的原因为:介质酸在流动相中被离解, 不是以本身分子的形态存在, 因此出现多峰并存的分叉峰。针对这种情况实验采取调节流动相的pH值, 提高流动相中H+的浓度的方法, 这样可有效的抑制四氟苯甲酸离解而以单一形式存在于流动相中, 从而得以在反相固定相上保留。此外为了调整保留时间, 改善峰形采取在流动相中添加甲醇的方法, 通过对一系列实验的探索我们得到了上述优惠分析条件, 采用外标法定量样品得到了较为令人满意的结果, 在此条件下四氟苯甲酸的色谱图如图3。
2.3 方法的验证
2.3.1 线性实验
按照1.3中的方法配制一系列浓度的标准溶液按上述色谱条件、外标法定量测定, 以四氟苯甲酸浓度为横坐标, 四氟苯甲酸峰面积为纵坐标绘制标准曲线, 得到此方法的线性关系为Y=ax+b, (其中a=4.51E-007, b=7.38E-002) , 线性相关系数R=0.9992, 四氟苯甲酸的校正曲线如图4。
2.3.2 精密度实验
将一已知浓度的四氟苯甲酸样品在上述条件下连续进样六次进行平行测定, 得到此方法的标准偏差及变系数, 结果如表1。
2.3.3 准确度实验
称取五个已知含量的样品, 分别加入一定量的四氟苯甲酸标准品, 在上述条件下测定, 平均回收率为99.60%。
3 结 论
(1) 采用上述条件分析四氟苯甲酸样品线性、精密度、准确度都很好, 用于分析样品可以取得令人满意的结果;
(2) 有机酸的液相色谱分析中, 缓冲溶液的配制相当重要, 缓冲溶液的PH值控制在使介质酸在缓冲溶液中不离解而以单一分子形式存在的状态, 这样有利用我们的分离分析;
(3) 缓冲溶液中加入一定量的甲醇, 可起到调节峰形与保留时间的作用。
参考文献
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反相色谱法论文 篇9
1 材料和方法
1. 1 仪器与设备
高效液相色谱仪(Laballiance公司)、FA1604S型电子天平(上海天平仪器厂)、RE-5203A型旋转蒸发仪(上海振捷实验设备有限公司)、SS230-A型粉碎机(顺德市容桂区家成电器厂)
1. 2 试剂
玉米黄质标准品为Roche Co.公司产品;其他试剂及溶剂为国产色谱纯或分析纯。
1.3 标准液的配制
称取1.0 mg的玉米黄质,以少量四氢呋喃溶解,再用石油醚:异丙醇体积比3:1 定容于5 mL容量瓶,备用。标准液质量浓度为0.2 g·L-1。
1.4 试样溶液的制备
具体实验操作是:收集鲜花,除去草、叶等杂质,放在避直射阳光通风处风干,分离出黄色花瓣备用。以80 mL丙酮多次冲洗,布氏漏斗抽滤,至花瓣发白。滤液移至分液漏斗中,加入50 mL石油醚抽提,同时用水冲洗促其分层,然后水洗石油醚4次。重复石油醚抽提2次,将上部石油醚层液转入三角瓶,加无水硫酸钠30 g,暗处静置1 h。将石油醚液于旋转蒸发器30℃真空蒸发至干,最后以石油醚异丙醇液(同1.3)将提取物定容至5 mL。
1.5 色谱条件
软件:Laballiance色谱工作站;色谱柱:Kromasil (C18 4.6 mm ×150 mm,填充粒度5μm);检测器:500型紫外检测器;泵:双seriesIII型;柱温:23℃;流动相体积比为乙腈︰甲醇︰二氯甲烷=70:20:10, ;流速:0.7 ml·min-1;检测波长:450 nm。根据标样的保留时间进行定性,用外标法计算处理液中玉米黄质的含量。
1.6 回收率测定
把一定量的玉米黄质加入已知玉米黄质含量的样品中,按前述的玉米黄质提取方法进行提取,测定并扣除未加标准品之前所测样品中玉米黄质的量,计算所加玉米黄质回收率。
2 结果
2. 1 标准工作曲线的绘制及检出限
以玉米黄质标准液,采用0、6、10、16、20、26、30 μL不同的进样体积,即玉米黄质的量为0.0、1.2、2.0、3.2、4.0、5.2、6.0 μg,得到玉米黄质的峰面积,求玉米黄质峰面积与对应标样进样量之间线性相关性。结果显示,玉米黄质的线性相关系数为0.9999,呈现出良好的线性关系,其线性回归方程为:Y= 16572+ 326415X。标准曲线如图1。
2.2 高效液相色谱法分析玉米黄质的含量
玉米黄质标准品及样品的HPLC图谱如图2和图3所示。由玉米黄质浓度、吸收峰面积的回归方程以及稀释度等计算出万寿菊中玉米黄质的质量分数为0.158%。
2.3 精密度试验
在试验的色谱条件下,对玉米黄质进行5次重复试验,进行统计分析。结果表明,5份同一批的样品中玉米黄质的质量分数分别为0.158%、0.160%、0.157%、0.161%、0.155%,平均值(X)为0.158%,其RSD =1.36%。
2.4 回收率试验
玉米黄质的回收率为94.7%～98.1%。平均回收率为96.4%。由上述研究结果显示,所测样品的精密度、重复性以及回收率试验均符合分析要求,试验结果准确可靠。因故本研究未进行最低检出限试验。结果如表1。
3 讨论
用HPLC法对玉米黄质定性、定量。测得样品中玉米黄质的质量分数为0.158%,经过检验,加样回收率(SES)为96.4%,精密度(RSD)为1.36%,本实验建立了一种准确测定万寿菊中玉米黄质含量的方法。
摘要：用反相高效液相色谱法测定万寿菊中的玉米黄质。以丙酮与石油醚提取色素,色谱柱Kromasil(C184.6 mm×150mm),乙腈∶甲醇∶二氯甲烷(体积比为70:20:10)为流动相,在450 nm下检测玉米黄质。结果表明,玉米黄质的质量分数为0.158%,玉米黄质的回收率是94.7%98.1%,平均回收率为96.4%(RSD=1.36%)。该方法简便、准确,有良好的重现性,技术参数指标符合食品理化分析的要求。
关键词：万寿菊,玉米黄质,反相高效液相色谱法
参考文献
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反相色谱法论文 篇10
1 高效液相色谱法在药物动力学中的应用研究
对于高效液相色谱测定方法, 其能够对人体肌肉中的药物浓度进行测定, 同时结合对应的统计学分析对药物在人体内的动力学进行一定的研究。通过郭瑞臣等人的研究可以得知, 通过HPLC-ESI-MSD的联合使用, 能够对人体内的泥素地平药物的含量进行准确的测定, 同时了解该药物成分的动力学内容。对于该药物, 其比当前治疗高血压疾病的药物药效要更强, 通过测定药物在人体内的动力学能够对该药物的使用具有更好的效果。但由于该药物在使用时的剂量较小, 加上其遇光后结构容易发生改变, 传统的测定方法无法对其进行准确的检测。而采用反相高效液相色潽法能够对该药物进行准确的检测, 由于该检测方法的灵敏度较高, 能够达到0.15ng/ml的检测准确度, 通过该方法的检测能够对人体内的低浓度药物进行准确的检测。而在张祚新等人的研究中, 通过HPLC能够对氧氟沙星药物进行准确的测定, 其通过对鲤鱼内不同时间段的药物浓度进行测定, 准确的把握了药物的动力学变化。同时采用MCPKP软件对该药物的动力学进行分析, 了解到该药物在鲤鱼体内能够被迅速吸收, 且鲤鱼内药物的浓度峰值达到的时间非常短, 血药的峰值较高, 且能够持续较长的时间, 即该药物在鲤鱼内的存留时间较长, 且杀菌效果较好。
而在李可等人的研究中, 其通过反相高效液相色谱法的建立来对地尔硫卓药物在人体内的血药浓度进行准确的检测。对于血样, 其采用的是正己烷和氯仿等的混合物, 然后通过C18的化学键作为固定相, 而甲醇和水等作为流动相, 将测定光波的波长设定在239nm。对于该药物的检测, 当血药的浓度范围在15到300μg/L时, 其测定曲线的效果是最好的。
对于高效液相色谱法, 其在药物代谢动力学中的应用主要是为了能够为药物的代谢动力学提供对应的检测数据, 然后通过该软件的处理对药物的相关动力学进行研究。其中的动力学参数主要包含为吸收半衰期以及达峰时间等, 通过对这些参数进行处理能够对药物的代谢动力学进行有效的研究, 然后根据数据结果对该药物的使用进行有效的开发。
2 在抗生素类药物分析中的应用研究
对于反相高效液相色潽法, 其对抗生素类药物的分析主要集中在氨基糖苷类抗生素药物, 这是当前比较常用的一类抗生素药物, 对于该类药物, 其制定主要是通过微生物的发酵等, 通过分糖基对氨基环醇类化合物中的一些成分进行替换, 比较常见的药物有链霉素、卡那霉素和阿米卡星等, 其在进行含量的测定时, 往往采用的是微生物分析法, 但微生物分析法存在着一定的缺陷, 其无法对药物中的组分进行准确的反映, 导致药物在使用过程中受到一定的影响, 为了能够对这一缺点进行有效的解决, 国外采用ELSD方法来对该药物中的成分进行分析。
而在王明娟等人的研究中, 其采用的是LC-ELSD方法对庆大霉素的成分进行测定, 包括C组分等, 同时对我国当前第一批异帕米星药物的标准药品含量进行了准确的测定。而在对庆大霉素中的相关成分进行测定时, 其采用的是随行标准曲线法, 该方法在测定时的时间较短, 而对于该测定方法中的响应因子, 其同传统的微生法测定结果相一致。而对于异帕米星药物中的物质含量测点, 并同阿米卡星药物的药物成分进行对比分析, 可以发现对照分析方法和ELSD测定方法之中的响应因子也基本上一致, 通过对比得知, 采用反相高效液相色潽法能够对新药物的成分测定提供新的测定方法, 且其测定结果同传统的测定方法结果相似度较高。
3 展望
随着反相高效液相色潽法的快速发展, 其已经成为当前药物分析的重要测定方法, 其一方面能够不通过高温等操作对药物进行衍生化处理, 同时, 该药物在测定的过程中具有较多的固定相种类, 然后根据固定相的选择确定流动相, 并对药物的组成成分以及相关比例进行确定, 能够对当前的大多数药物成分进行分析。在本文中对当前高效液相色谱技术在药物分析中的应用进行了简单的分析, 并对该测定方法的在药物动力学以及抗生素类药物的成分测定中的应用进行了简单的分析, 其具有适用范围广, 且分离的效率较高等优点, 是当前发展前景较好的测定技术之一。
摘要：对于高效液相色谱法, 其是当前应用较多的一种分离分析技术, 主要是应用在医药和食品等各个领域中, 在本文中主要是研究该测定方法在西药中的测定应用, 下面对该测定应用进行了简单的分析。
关键词：反相高效液相色谱,药物分析,西药
参考文献
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