结肠癌细胞SW480

结肠癌细胞SW480（共4篇）

结肠癌细胞SW480 篇1

摘要：目的 探讨外源性Pu27序列对SW480结肠癌细胞的作用。方法 设立空白组、Pu27实验组和Mut Pu27对照组, 观察药物摄取, c-myc基因表达, 细胞增殖和凋亡情况。结果 Pu27以非转染方式进入细胞, 下调c-myc基因表达, 抑制细胞增殖促进凋亡。结论 Pu27具有选择性抗肿瘤作用。

关键词：pu27,Mut Pu27,c-myc,结肠癌

G-四链体 (G-quadruplex) 由富含鸟嘌呤核酸序列旋聚而成 (图1) , 结合和稳定G-四链体的药物抑制端粒酶活性和癌基因表达发挥抗肿瘤作用[1]。癌基因c-myc转录的85%~90%由启动子区核酸超敏元件Ⅲ1 (NHEⅢ1) 控制, 也叫Pu27 (图2) , 富含鸟嘌呤可形成G-四链体沉默基因表达[2,3]。

1材料与方法

1.1细胞培养:结肠癌SW480细胞和正常结直肠黏膜FHC细胞, 分别用培养基RPMI 1640和DMEM:F12加10%FBS, 37℃、5%CO2条件下培养, 实验取用对数生长期细胞。

1.2富鸟氨酸寡核苷酸序列的制备:Pu27 5'-TGGGGAGGGTGGGGA GGGTGGGGAAGG-3'和Mut Pu27 5'-TGAGTAGCGTGAGCAGAGTGCG TAACG-3'序列, 上海生工生物工程有限公司合成, 无RNAse/DNAse双蒸水溶解至终浓度200μmol/L, 95℃处理5 min备用。

1.3 FITC标记Pu27和Mut Pu27观察摄取情况:8μmol/L浓度处理SW480细胞, DAPI核染色后观察。

1.4 MTT法检测Pu27对细胞的生长抑制作用:1~10μmol/L浓度梯度处理细胞 (1×105cells/well) , 5%CO2、37℃孵育 (24、48、72、144 h) , MTT法测490 nm各孔吸光度 (OD) 值。

1.5 RT-PCR检测c-myc基因转录活性:8μmol/L浓度处理细胞6、24、48、72 h, 提取总RNA, RT-PCR反应体系参数:95℃5 min, 95℃30 s、54℃30 s、72℃30 s, 40个循环, 72℃5 min, 得出各组CT值。引物序列见表1。

1.6 We s t e r n B o l t检测c-m y c基因蛋白表达:8μm o l/L P u 2 7和Mut Pu27, 处理SW480细胞6、24、48、72 h提取蛋白, Western Blot测蛋白表达, 计算目的与内参蛋白条带灰度值比表示蛋白相对表达量。

1.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡:8μmol/L Pu27和Mut Pu27处理24、72 h收集细胞, 流式细胞仪分析。

1.8统计学分析:数值用均值±SEM表示, SPSS16.0统计学软件分析, 单因素ANOVA分析MTT法测得数据, LSD法两两比较;独立样本t检验进行不同细胞株间的比较;秩和检验分析FCM数据, P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 Pu27和Mut Pu27细胞摄取情况:FITC-Pu27处理细胞24h荧光表达最强达87%, 72 h后摄取率未见较大降低;FITC-Mut Pu27细胞摄取率24 h为22%。见图3。

2.2 Pu27抑制结肠癌SW480细胞增殖:8μmol/L Pu27和Mut Pu27处理细胞48 h, 生长抑制率分别为 (0.50±0.03) ×100%、 (0.11±0.004) ×100%。8μmol/L Pu27处理FHC和HCT116细胞48 h, 生长抑制率分别为 (0.08±0.003) ×100%、 (0.26±0.06) ×100%。不同细胞株对Pu27敏感性不同, SW480细胞组高, FHC细胞组低。见图4。

2.3 Pu27抑制c-myc基因表达:8μmol/L Pu27和Mut Pu27处理细胞48 h, c-myc m RNA相对表达值分别为 (0.48±0.12) ×100%、 (0.85±0.08) ×100%, 蛋白相对表达值为 (0.42±0.09) ×100%、 (0.77±0.07) ×100%。Pu27抑制c-myc基因表达。见图5。

2.4 P u 2 7诱导S W 4 8 0细胞凋亡:P u 2 7处理细胞4 8 h, 凋亡率为41.34%, Mut Pu27组、未处理组48 h凋亡率分别为16.34%、6.82%, P<0.05。见图6。

3讨论

多种稳定c-myc基因启动子区四链体结构的药物可以下调c-myc基因表达, 表明G-四链体结构作为负调节因子在基因转录中的作用[2,3,4,5]。抑制c-myc基因表达的反义寡核苷酸序列, 易被核酸酶降解, 细胞摄取率低, 对正常细胞有毒性[6]。Pu27抑制c-myc基因表达的同时克服了以上局限, 不需转染易被细胞摄取并稳定存在[7,8,9]。

本文研究的外源性Pu27抑制SW480细胞增殖诱导凋亡, 对正常细胞毒性小, 摄取实验表明Pu27通过非转染进入细胞, 摄取率和稳定性高。MutPu27对比试验证明, Pu27的生物学作用与连续重复鸟嘌吟序列密切相关。Pu27下调c-myc基因mRNA和蛋白水平。这项研究通过基因组DNA序列选择性杀死癌细胞, 对正常细胞毒性小, 作用方式简单, 无需额外辅助, 是很有前途的肿瘤治疗方案。

参考文献

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[3]田明月, 张秀凤, 潘然, 等.原癌基因c-myc启动区G-四链体结构及靶向小分子配体[J].化学进展, 2010, 22 (5) :983-992.

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[5]Mathad RI, Hatzakis E, Dai JX, et al.c-MYC promoter G-quadruplex formed at the end of NHEIII1 element:insights into biological relevance and parallel-stranded G-quadruplex stability[J].Nucleic Acids Res, 2011, 39 (20) :9023-9033.

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[8]Sedoris KC, Thomas SD, Clarkson CR, et al.Miller.Genomic c-Myc Quadruplex DNA Selectively Kills Leukemia[J].Mol Cancer Ther, 2012, 11 (1) :66-76.

[9]Islam MA, Thomas SD, Murty VV, et al.c-Myc Quadruplex-forming Sequence Pu-27 Induces Extensive Damage in Both Telomeric and Nontelomeric Regions of DNA[J].J Biol Chem, 2014, 289 (12) :8521-8531.

结肠癌细胞SW480 篇2

许多研究表明诱导性一氧化氮合酶 (iNOS) 在肿瘤的生长、侵袭和转移过程中起相当重要的作用[5]。在许多实体肿瘤中, iNOS过度表达。而且, iNOS的活性也和肿瘤的分级和细胞的分化有密切的关系。近来有研究显示, 喜树碱能影响病毒转染的鼠巨噬细胞样细胞系 RAW264.7的iNOS蛋白质的表达和活性[6]。而喜树碱是否能影响肿瘤细胞iNOS的表达, 国内外尚无报道。

本实验通过观察喜树碱对人结肠腺癌SW480细胞系一氧化氮 (NO) 的生成量、iNOS mRNA和蛋白质表达的影响, 探讨喜树碱抗肿瘤效应的可能的相关机制。

1材料和方法

1.1 药物和试剂

99%喜树碱:购自美国Sigma公司。50mg喜树碱加入25ml DMSO中, 振荡溶解, 配成2mg/ml的母液, -20℃保存。使用前用DMEM培养基溶解成最终浓度。

1.2 细胞来源和培养

SW480细胞:取自浙江大学医学院病理教研室, 常规传代培养后接种于96孔培养板中, 放入37℃、5%CO2的细胞培养箱培养12小时, 细胞贴壁后小心弃去旧培养基, 每孔加200μl含10%新生小牛血清 (BCS) 、10μg/L的脂多糖 (LPS, 英国FLUKA CHEMIC公司) 、20ng/L的重组人白介素1β (IL-1β, 美国PEPRO TECH公司) 的DMEM培养基, 加入不同终浓度的喜树碱 (见表1) 溶液分别作用于上述细胞。

1.3 SW480细胞NO生成量及细胞毒作用的测定

①取50、100、150、200μmol/L的NaNO2各100μl, 加Griess试剂, 制得标准曲线, 计算标准方程。②按前述准备的细胞分别培养18、24小时, 用Griess法测NO的生成量。③同时用MTT法测定细胞的存活率。

1.4 SW480细胞iNOS mRNA表达的测定

按Trizlo试剂盒 (加拿大Bio Basic Inc.) 说明一步法提取SW480细胞的总RNA, 用紫外分光光度计测定RNA的纯度并定量。取总RNA进行逆转录, 然后再进行PCR反应, 反应产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳, 应用凝胶扫描仪对电泳带进行吸光度扫描, 并以GAPDH校正做相对量分析, 数值以两者积分吸光度的比值表示。

1.5 SW480细胞iNOS蛋白质表达的测定

将实验SW480细胞消化离心后用真核细胞蛋白裂解液试剂盒 (北京博大泰克生物基因技术有限责任公司) 提取总蛋白, 并用蛋白定量试剂盒 (AMERSHAN BIOSCIENCES) 测定蛋白浓度, 上样, 电泳, 然后转移样品至硝酸纤维素膜上。封闭, 加一抗 (兔抗人iNOS多克隆抗体, 北京博奥森生物技术有限公司) 、二抗 (羊抗兔HRP标记IgG, 上海康成生物技术有限公司) 杂交, 用HRP-ECL发光法检测, 见淡绿色荧光条带, 将膜固定于胶片盒中, 曝光后显影, 定影。应用凝胶扫描仪对胶片条带进行吸光度扫描, 并以β-actin校正做相对量分析, 数值以两者积分吸光度的比值表示。

1.6 统计学方法

实验结果用undefined表示, 标准曲线方程使用直线回归分析计算, 两组实验数据间的比较使用单因素方差分析 (SNK法) 。P<0.05认为有统计学显著性差异。所有数据的统计处理均使用SPSS12.0版完成。

2结果

2.1 喜树碱对SW480细胞NO生成量的影响

结果见表1。

与空白组相比*P<0.05

2.2 喜树碱对SW480细胞iNOS mRNA表达的影响

见表2。

与空白组比较*P<0.05;与0.032μg/ml组比较△P<0.05 (下同)

2.3 喜树碱对SW480细胞iNOS蛋白表达的影响

见表3。

3讨论

大量研究表明, 一氧化氮 (NO) 对肿瘤的发生发展、治疗及预后都有重要影响。NOS是NO合成过程中的关键酶, 目前已知有3种异构体, 分别为神经型 (nNOS) 、内皮型 (eNOS) 及诱导型 (iNOS) 。前两者为结构型NOS, 后者为诱导型, 主要存在于巨噬细胞、内皮细胞和多种肿瘤细胞中, 其活性取决于基因转录。多种因素如细胞因子、细菌脂多糖均可诱导其产生高水平的NO。许多研究表明诱导性一氧化氮合酶 (iNOS) 在肿瘤的生长、侵袭和转移过程中起相当重要的作用。在许多原发性实体肿瘤中, 如结肠癌[7]、乳腺癌[8], 诱导性一氧化氮合酶过度表达。而且, iNOS的活性也和肿瘤的分级和细胞的分化有密切的关系。这些都提示iNOS的长期表达可能在肿瘤形成中起重要作用。很多资料显示iNOS表达与肿瘤的转移高度相关, 可能与NO调节血管扩张和血小板聚集促进肿瘤转移等有关[9]。

在本实验中, 喜树碱作用SW480细胞18小时, 2μg/ml的喜树碱能减少NO的生成量, 而所有的实验剂量均不引起细胞存活率的改变;作用24小时, 所有的剂量均能减少NO的生成量, 而0.032μg/ml和0.125μg/ml的喜树碱在不引起细胞存活率改变的同时, 减少NO的生成量, 而0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml的喜树碱既减少NO的生成量, 又降低细胞的存活率。由此可见, 小剂量喜树碱 (0.032μg/ml、0.125μg/ml) 对NO生成量的影响并不完全因为直接的细胞毒作用, 在未引起明显的细胞毒性之前, 已经可以减少NO的生成, 因此喜树碱减少NO生成的作用为特异性, 并且存在一定的剂量-时间效应。由于内生性NO是由NOS合成, 而eNOS和nNOS是结构型酶, 受外界影响不大, 因此本实验着重于研究喜树碱对iNOS的影响。为提高mRNA和蛋白质的提取量, 得到高质量的样本, 选取了0.032μg/ml和0.125μg/ml两个剂量的喜树碱作用24小时。并选取了GAPDH和β-actin分别作为RT-PCR和Western blot的内参照, 校正作相对量的分析。由实验的半定量结果可以看出, iNOS mRNA经喜树碱作用24小时后与对照组相比显著减少, 并随着剂量的增加效果越显著, 由此可见, 喜树碱能特异性地影响iNOS mRNA的表达。同样, 本实验也提示了喜树碱对 iNOS蛋白生成的特异性抑制作用。由于两个剂量的喜树碱并未引起明显的细胞毒作用, 可以认为对iNOS的影响是通过影响基因转录和翻译而实现的。

根据Folkman的理论, 肿瘤有两种细胞群共同影响着肿瘤的生长, 一种是肿瘤细胞群, 另一种是内皮细胞群。两种细胞群通过旁分泌相互刺激生长。因此在治疗中同时以两种细胞群为靶点, 比单独针对肿瘤细胞群的细胞毒治疗可能会更有效[10]。肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞产生内源性NO, 在促进肿瘤血管生成和保证肿瘤最大血供方面起重要作用。NO能促进肿瘤血管生成, 增加肿瘤的血供, 而且NO的这种作用能被NOS抑制剂所抑制[11]。根据本实验的研究结果, 我们推测喜树碱可能通过减少NO的生成间接地减少肿瘤组织内血管的生成, 从而抑制肿瘤的生长。

Jenkins等将iNOS基因转染人结肠癌细胞株细胞系, 使之能持续产生NO, 在裸鼠体内, 转染的细胞株细胞系生长比野生型对照组快[12]。有实验将表达iNOS的人结肠癌细胞和鼠乳腺癌细胞移植到小鼠体内, 肿瘤生长明显较对照组快[13]。提示内源性NO可促进肿瘤在体内的生长。本实验结果表明, 喜树碱能减少肿瘤细胞NO的生成, 提示喜树碱可能通过抑制NO的合成而抑制肿瘤在体内的生长。

因此我们推测喜树碱减少NO生成可能是其抗癌作用的一个新的机理。

喜树碱早期采用水溶性钠盐, 由于毒性大而一度终止临床应用。近来, 喜树碱口服剂型的出现, 使其使用出现了新的转机。人们开始研究长期每天小剂量口服喜树碱是否能达到满意的临床效果。探索一个既能起到化疗作用又不引起严重副反应的给药方案, 势在必行。根据本实验的研究结果, 小剂量的喜树碱在没有引起细胞毒性的情况下可减少NO的产量, 而由于NO在肿瘤发生、发展、转移等方面的重要意义, 可以推测服用小剂量的喜树碱可以抑制肿瘤的生长, 起到治疗作用。

摘要：目的:研究喜树碱对结肠癌细胞SW480诱导性一氧化氮合酶 (iNOS) 合成的影响, 以探讨喜树碱抗肿瘤的新的可能的机制。方法:培养结肠癌SW480细胞系, 用脂多糖和IL-1β诱导诱导性一氧化氮合酶的产生。用不同浓度的喜树碱作用于SW480细胞系, MTT法检测细胞毒作用, Griess法检测NO生成量, RT-PCR法检测iNOS mRNA的表达, Western blot检测iNOS蛋白质的表达。结果:喜树碱能减少SW480细胞NO的生成量, 并且呈时间和剂量相关性。SW480细胞经0.032μg/ml、0.125μg/ml的喜树碱处理24小时后, iNOS mRNA转录量和iNOS蛋白表达量减少, 并呈剂量相关性。结论:喜树碱能特异性地减少结肠癌SW480细胞NO的生成量、降低iNOS mRNA和蛋白质的表达, 这可能是喜树碱抗肿瘤的一个新的作用机制。

结肠癌细胞SW480 篇3

莪术醇 (curcumol) 又名姜黄环奥醇, 是莪术油抗癌、抗病毒、抗菌等作用的有效成分之一[1]。从20世纪70年代起, 应用于宫颈癌的治疗, 是一种具有发展前途的抗肿瘤药物[2]。研究发现, 莪术醇对小鼠艾氏腹水癌有一定的直接抑制和破坏作用, 能使癌细胞变性坏死。当剂量为75mg/kg时, 对小鼠肉瘤S37、宫颈癌U 14、艾氏腹水癌ECA的抑制率分别为53.74%～61.95%、45.1%～77.13%和65.8%～78.9%[2]。但莪术醇对人结肠癌SW 1116的作用仍不清楚。本研究中我们利用体外培养的SW 1116细胞株, 观察莪术醇对细胞增殖及凋亡的影响, 初步探讨其抗肿瘤作用的机制, 为莪术醇抗肿瘤药物的进一步研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

DG 3022型酶标仪、美国BioRad公司PAC 300型电泳仪;德国Nuaice公司Nu-3500E型CO2培养箱;吴江市空气净化设备厂YJ.875型医用超净台;MettlerToledo公司P13203-N型分析天平;美国BD公司流式细胞仪。

1.2 药品与试剂

莪术醇购于中国药品与生物制品检定所;噻唑蓝 (MTT) 、二甲基亚砜 (DMSO) 、苯甲基磺酰氟 (PMSF) 、亮抑酶肽 (1eupeptin) 、牛血清白蛋白 (BSA) 、十二烷基磺酸钠 (SDS) 、丙烯酰胺、N, N'-亚甲双丙烯酰胺、四甲基乙二胺 (TEMED) 、过硫酸铵均为Sigma产品;DMEM、胰蛋白酶及胎牛血清为Gibco产品。Bcl—2、Bcl—XL多克隆抗体, Ecl化学发光试剂盒购自SantaCruz公司;β-actin单克隆抗体购自Sigma公司;Caspase-3比色试剂盒购自Promega公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.3 细胞培养

SW 1116细胞株为本室传代保株, 细胞培养使用DMEM高糖培养基 (含10%灭活的小牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素) , 置于37℃、5%的CO2培养箱中培养, 取对数生长期细胞进行实验。

1.4 对肿瘤细胞的抑制作用

采用MTT法测定, 取处于对数生长期的细胞进行实验。SW 1116细胞用0.25%的胰酶溶液消化, 制成单细胞悬液, 调整细胞浓度为5×107/L, 接种于96孔培养板, 每孔100μL, 在37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养12h。试验设阴性对照组、DM-SO溶剂对照组、不同浓度给药组。每个培养孔加入2、6、20、60、200μg/mL的莪术醇 (用DMSO溶解, 终浓度≤0.5%) 100μL, 使终浓度为 (1～100) μg/mL, 每个浓度设8个复孔, 37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内培养24h、48h或72h, 每孔加入MTT液 (5g/L) 20μL, 培养4h后, 吸弃培养液, 每孔加入200μL二甲基亚砜, 振荡溶解结晶, 置自动酶标仪570nm波长处测吸光度 (OD) 值, 按下列公式计算细胞生长的抑制率:细胞生长抑制率/%= (1-给药组OD值/对照组OD值) ×100%, 实验重复3次。

1.5 AnnexinV/PI标记染色测定凋亡细胞

取对数生长期的细胞以每瓶2×106的密度接种于培养瓶中, 细胞贴壁后, 弃上清, 各组分别加入0、10、30、100μg/mL的莪术醇。孵育72h后用0.25%胰酶收集所有悬浮及贴壁细胞, 用预冷的PBS洗1遍后置0℃冰浴中, 加入结合缓冲液, 轻轻混匀细胞后加FITC-Annexin V和PI, 避光孵育30min后立即进行流式细胞仪检测。

1.6 比色法测定Caspase-3活性

根据试剂盒说明书按以下操作。0、10、30、100μg/mL的莪术醇作用细胞48h或72h后, 收集细胞, PBS缓冲液洗涤1次, 加入预冷的细胞裂解缓冲液后置冰上裂解15min, 4℃、12 000g离心10min, 收集上清, 加入酶标板的每个孔中, 每孔加入适量检测缓冲液, 37℃、水浴1h后在405nm波长下读取OD值。

1.7 Westernblot检测Bcl—2和Bcl—XL蛋白的表达

取对数生长期的细胞以每瓶2×107的密度接种于培养瓶中, 细胞贴壁后, 弃上清, 各组分别加入0μ/mL、10μ/mL、30μ/mL、100μg/mL的莪术醇。孵育72h后收集所有细胞, 4℃PBS洗涤2次。加入预冷的细胞裂解缓冲液, 裂解30min, 4℃12 000g离心15min。上清液测定蛋白浓度。等量样品以15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。电泳后将蛋白转印至硝酸纤维素膜上, 将膜用5%脱脂奶粉溶液37℃封闭2h后, 分别与Bcl—2或Bcl—XL一抗37℃反应2h, PBST清洗2次, 再与辣根酶标记的二抗37℃反应1h, 用PBST充分洗涤后, 以Ecl化学发光检测。

1.8 统计学分析

数据以±s表示, 采用SPSS软件进行方差分析。P<0.05表示两组差别具有显著性意义。

2 结果

2.1 莪术醇对人结肠癌SW 1116细胞增殖的抑制

作用

MTT法测定结果见表1。莪术醇可以剂量和时间依赖性的关系抑制SW 1116细胞的增值。100μg/mL莪术醇作用72h, 抑制率可达 (76.7±6.9) %。

2.2 莪术醇对SW 1116细胞凋亡的影响

通过流式细胞分析可见, 莪术醇对SW 1116细胞的凋亡诱导作用具有剂量依赖性。10、30、100μg/mL的莪术醇作用72h后细胞凋亡率分别为 (4.8±0.9) %、 (13.3±3.1) %和 (25.9±5.7) %, 均高于对照组[ (1.1±0.4) %]。

2.3 莪术醇对Caspase-3活性的影响

本实验检测了0μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL的莪术醇作用于SW 1116细胞48h或72h后Caspase-3的活性变化 (图2) 。从结果可见, 随着莪术醇浓度的增加, Caspase-3的活性明显增加。

*P<0.05, 与同时间对照组比较

2.4 莪术醇对Bcl—2和Bcl—XL蛋白表达影的响

10μg/mL、30μg/mL、100μg/mL的莪术醇分别作用于SW 1116细胞72h后Bcl—2和Bcl—XL蛋白表达的变化见图2。从结果可见, 随着莪术醇浓度的增加, Bcl—2和Bcl—XL蛋白的表达均明显降低。

3 讨论

莪术醇是1976年从姜黄属莪术 (CurcumaPhaeocaulisVal) 的挥发油中分离出的倍半萜类化合物, 占莪术挥发油的6.24%—16.2%左右[3]。研究发现莪术醇具有多种药理作用, 如抗菌、抗病毒、抗纤维化、抗血栓[4]、抗肿瘤等。其中抗肿瘤作用尤其受到关注。体内外实验证实, 莪术醇能够抑制宫颈癌、肝癌、结肠癌、肺癌、胃癌、白血病等的发生[5]。Johnson等[6]研究了莪术醇及其衍生物对Ehrlich腹水癌的抑制机制, 发现莪术醇可作用于癌细胞膜上的受体蛋白, 通过改变通道蛋白的通透性使膜电位发生变化, 进而影响细胞代谢, 最终杀死癌细胞。近年来, 越来越多的研究发现莪术醇可通过诱导肿瘤细胞的凋亡产生抗肿瘤的作用。

林海等[7]研究发现莪术醇可诱导白血病L1210细胞凋亡, 作用呈时间、剂量依赖性;高艳娥等用50μg/mL、100μg/mL莪术醇作用于宫颈癌CASKI细胞24h, 发现莪术醇可剂量依赖性阻滞细胞周期于G2/M期, 并诱导部分细胞凋亡[8]。此外, 研究还发现莪术醇对胃癌SGC—7901细胞的增殖有显著抑制作用, 并能诱导细胞凋亡[9];可明显诱导HepG 2细胞凋亡, 其机制可能是通过抑制HepG 2细胞COX-2和VEGF基因表达而发挥作用的[10]。

细胞凋亡学说是20世纪70年代Kerr等病理学家提出的。细胞凋亡是一种由基因调控的, 主动而有序的细胞自我消亡过程, 又称程序性细胞死亡。细胞凋亡是一个非常复杂的过程, 其中Caspase家族在细胞凋亡中发挥重要作用[11], Caspase-3处于枢纽地位, 是细胞凋亡的主要效应因子[12]。Caspase-3蛋白的改变受很多因素的影响, 其中Bc l—2家族是目前研究最深入的凋亡调控基因。Bc l—2/Bcl—XL是细胞内抗凋亡因子, 有稳定线粒体膜, 阻止线粒体释放Caspase, 阻遏氧自由基诱导凋亡信号通路的作用[13]

在本研究中, 我们对莪术醇抑制人结肠癌细胞SW 1116增殖的作用进行了测定, 发现莪术醇能明显抑制SW 1116细胞的增殖, 抑制率随着药物浓度的增加和作用时间的延长而增大, 具有剂量依赖关系。通过流式细胞仪测定细胞的凋亡率, 发现莪术醇能明显诱导SW 1116细胞的凋亡, 凋亡率随着药物浓度的增加而增大。提示莪术醇的抗肿瘤作用与其诱导肿瘤细胞凋亡有关。

为了进一步证明莪术醇诱导肿瘤细胞凋亡的机制, 我们测定了Caspase-3蛋白酶的活力, 发现, 莪术醇作用SW 1116细胞48h和72h后可剂量依赖性的增强Caspase-3的活性。进一步用Westernblot法检测Bcl—2和Bcl—XL蛋白的表达, 结果表明, 莪术醇可以明显抑制SW 1116细胞Bcl—2和Bc l—XL蛋白的表达。从而证明莪术醇可通过调节Bc l—2和Bcl—XL的表达, 激活Caspase-3诱导细胞凋亡。

以上结果提示莪术醇具有抑制结肠癌细胞增殖的作用, 可以进行进一步深入的研发。目前研究发现莪术醇具有诱导结肠癌细胞凋亡的作用, 但其具体的分子机制还有待深入的研究。

结肠癌细胞SW480 篇4

1 材料及方法

1.1 主要试剂及仪器

人结直肠癌细胞SW620购自中国科学院上海细胞库;小白菊内酯(Parthenolide)购自sigma公司,顺铂购自齐鲁制药厂;胎牛血清、RPMI-1640培养基为Hyclone产品Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物;cellTiter 96 AQ单溶液细胞增殖检测试剂为Promega公司产品;SYBR Green qPCR SuperMix购自Invitrogen公司。流式细胞仪BD公司生产;定量PCR仪型号是:ABI PRISMR7500 Sequence Detection System;酶标仪生产商是Thermo Fisher Scientific,型号是multiscan MK3。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及处理

SW620细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,置37℃5%二氧化碳培养箱中培养,常规胰酶消化传代。将小白菊内酯和顺铂稀释到合适的浓度,使用终浓度顺铂5μmol/L,小白菊内酯为10μmol/L。实验分组情况为溶剂对照组、小白菊内酯组(10μmol/L)、顺铂组(5μmol/L)、小白菊内酯+顺铂组(10μmol/+5μmol/L)。

1.2.3 荧光定量PCR检测

将SW620细胞接种于6孔板,处理24 h后收集细胞样品,加入1 m L Trizol溶液,吹打混匀,使细胞充分裂解,静置5 min;加入200μL氯仿,沉淀蛋白;离心去上清,加入等体积的异丙醇沉淀RNA,用75%乙醇洗涤两次,加入15~60μL DEPC水溶解沉淀。取1μL RNA样品50倍稀释,在BioPhotometer plus艾本德核酸蛋白测定仪上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。在RNase free的PCR管中进行RNA的逆转录,得到的c DNA用于PCR实验。各因子检测引物如表1所示。扩增条件是:95℃预变性5 min,95℃15 s,50℃15 s,72℃32 s,30个循环,72℃后延伸5 min。

1.2.4 Western Blot检测

将SW620细胞接种于6孔板,实验分为溶剂对照组、小白菊内酯组(10μm)、顺铂组(5μmol/L)、小白菊内酯+顺铂组(10μmol/L+5μmol/L))。处理48 h后收集细胞样品,RIPA裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。BCA法测定蛋白总浓度,每孔上样量为30μg,8~12的分离胶分离总蛋白,转膜至PVDF膜,5的脱脂奶粉室温封闭1 h,PBS稀释一抗(Caspase-3,1∶1 500;Caspase-9,1∶1 000;RARP,1∶1 000;Bcl-2,1∶1 000)4℃孵育过夜,次日,TBST洗膜3次,每次5 min;合适二抗室温孵育1 h;TBST洗膜3次,每次5 min;于暗室中进行曝光。

2 结果

2.1 荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达

将小白菊内酯和顺铂单药或者联合处理SW620细胞后,检测凋亡相关基因caspase 3、caspase 9、PARP、Bcl-2及Bax的m RNA水平的表达。荧光定量PCR结果如图1A所示:小白菊内酯和顺铂的单独作用可以明显下调Bcl-2的表达量,降低Bax的表达水平,二者联合作用时效果更明显。顺铂处理SW620细胞后,caspase 3、caspase 9及PARP的m RNA水平的表达量出现了明显上调;小白菊内酯处理后,caspase 3、caspase 9及PARP的m RNA水平的表达量也出现了上调,与顺铂相比,上调的幅度更明显;联合作用后,三个凋亡相关基因的m RNA水平的表达较单用组上调更明显,如图1B所示。

A和B均为凋亡相关基因m RNA水平的表达

2.2 Western blot检测凋亡相关蛋白的表达

使用小白菊内酯和顺铂处理后的细胞,使用western blot的方法检测凋亡相关基因的表达,检测蛋白的表达均出现了不同程度的改变,结果如图2所示。小白菊内酯作用后细胞中的Bcl-2蛋白的表达水平明显降低,而Bax蛋白的表达水平则明显增高;小白菊内酯处理后,SW620细胞中caspase 3、caspase 9及PARP的蛋白水平的表达量也出现了上调。与小白菊内酯处理后的蛋白表达谱相比,使用顺铂处理的细胞,检测蛋白的表达趋势与小白菊内酯是一致的,但表达水平的变化相对较小。二者联合作用后,caspase 3、caspase 9、PARP、Bcl-2及Bax的蛋白水平的表达水平的变化,与单药作用相比更明显。

1:溶剂对照组;2:顺铂组(5μmol/L);3:小白菊内酯组(10μmol/L);4:小白菊内酯+顺铂组(10μmol/L+5μmol/L)。

3 讨论

结肠癌是人体常见的恶性肿瘤之一,在欧美及中国都有很高的发病率。目前,针对该病的治疗主要是采用手术治疗。而对于中晚期结肠癌患者,手术配合化疗等综合治疗则是较好的治疗选择。但仍有较多结肠癌细胞因对化疗药物敏感性较低,化疗的毒副反应的影响,临床疗效并不理想。因此,在对结肠癌等恶性肿瘤患者进行化疗时,人们期待化疗药物的敏感性高,减少药量、降低化疗毒副反应。随着分子肿瘤学的迅猛发展,抗肿瘤药物筛选研究的热点是寻找新的作用靶点及疗效显著、细胞毒性小的药物。小白菊内酯是一种从菊科植物中提取的倍半萜内酯,近年来,该提取物也逐渐被应用到肿瘤研究领域。研究发现,小白菊内酯具有较强的抗肿瘤活性,在体外可抑制多种肿瘤细胞株的生长增殖,并诱导其凋亡,比如肝癌、胆管癌及多发性骨髓瘤等[1,2,3]。另外,小白菊内酯还可以增强某些肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,如小白菊内酯可以增强肝癌细胞对顺铂的敏感性[4]。但其对结肠癌细胞的影响研究较少。

本文以SW620细胞作为研究对象,加以小白菊内酯及顺铂处理,研究二者对细胞凋亡影响的机制。凋亡是细胞的程序性死亡过程,中间牵涉到很多抗凋亡细胞因子和促凋亡细胞因子。已有的研究结果表明,线粒体是细胞凋亡的主要执行者,而Bcl-2家族成员与线粒体介导的凋亡途径密切相关[5,6]。抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax与多种人类肿瘤的形成及发展密切相关,例如胰腺癌、肝癌、和肺癌。当肿瘤细胞受到凋亡诱导因子的刺激后是否存活取决于Bcl-2/Bax的比率,两者之间的平衡可以抑制细胞色素C从线粒体中释放,反之,抑制Bcl-2或诱导Bax的表达均可导致线粒体功能紊乱,促使细胞色素C的释放,而这正是线粒体介导的细胞凋亡中关键的一步[5,6]。Caspase家族属于半胱氨酸蛋白酶,在执行凋亡的过程中扮演了极其重要的角色[7]。Caspase家族成员的激活或者抑制受多个上游基因的调控,其中细胞色素C就是重要的一员。已有的研究表明[8,9],这条通路的调控通路是:外界凋亡信号刺激肿瘤细胞,引起Bcl-2/Bax的比值下降,导致线粒体功能紊乱,导致细胞色素C从线粒体中释放到胞浆里,和转接分子Apaf-1形成凋亡复合体,此复合体可以激活easpase-9,进而激活Caspase-3,Caspase-3蛋白能使许多与细胞结构、细胞周期及DNA修复相关的蛋白或激酶失活,从而导致凋亡的发生。本实验运用荧光定量PCR和Western Blot的方法检测小白菊内酯和顺铂处理后一些凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 9和PARP m RNA水平和蛋白水平的表达变化。结果显示,小白菊内酯及顺铂单药作用时可上调Bax、Caspase 3、Caspase 9和PARP m RNA水平和蛋白水平的表达量,下调Bcl-2m RNA水平和蛋白水平的表达量,联合作用时对凋亡基因的影响作用更明显。以上凋亡基因的变化和线粒体凋亡信号通路的变化一致,提示小白菊内酯和顺铂诱导细胞凋亡的机制可能与线粒体途径密切相关,即小白菊内酯和顺铂可能通过影响Bcl-2/Bax的表达失衡,从而使线粒体功能紊乱,进而激发Caspase级联反应,促使凋亡。但由于细胞的细胞凋亡的调控途径十分复杂,小白菊内酯和顺铂诱导细胞凋亡是否与其他途径联合作用从而调控细胞凋亡,需要进一步探讨。

参考文献

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