RDA研究述评

2024-06-13

RDA研究述评（精选2篇）

RDA研究述评篇1

自1982年徐怀恕等人提出细菌“活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态”概念至今[1],大量研究结果证明,很多细菌包括许多重要病原菌均可进入VBNC状态,部分处于该状态的病原菌仍具有致病性[2,3]。已有试验证明,传统的检测方法并不能检测到处于VBNC状态的沙门菌,而“逃避”检测的细菌在一定条件下可能复苏造成沙门菌病的大范围流行。因此,找到一种灵敏、特异、针对特定病原微生物VBNC状态的检测方法是十分必要的。本研究用cDNA-RDA技术[4,5]从基因水平探索VBNC状态沙门菌与正常状态沙门菌之间存在的差异基因,为从基因水平建立一种具有高效特异性的针对VBNC状态沙门菌的检测方法提供新的思路。

1 材料

1.1 菌株

鸡白痢沙门菌CVCC578标准株,购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂

RNeasy Mini试剂盒、 RNA Protect Bacteria试剂、QIA PCR快速纯化试剂盒,均为QiAgen公司产品;M-MLV Rtase cDNA Synthesis试剂盒、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0试剂盒、LA Taq酶、dNTP、豆芽核酸酶、pMD18-T载体,均为TaKaRa公司产品;PCR清洁试剂盒,AXYGEN公司产品;DpnⅡ内切酶,美国NEB公司产品;T4 DNA连接酶,TOYOBO公司产品;LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability试剂盒,Probes Molecular 公司产品;大肠杆菌DH5α感受态细胞、氨苄西林,上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

2 方法

2.1 引物

参照参考文献[6]中的引物序列(见表1)设计引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2.2 VBNC状态沙门菌的诱导

将沙门菌纯培养物接种于50 mL LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min通气振荡培养过夜;取1 mL菌液于无菌离心管中,6 000 r/min离心5 min;弃上清液,用灭菌生理盐水清洗2次;接种于液体LB培养基中,调整细菌数至1×108 cfu/mL,于4 ℃诱导;每隔4 d检查1次细菌数的变化,同时进行荧光染色观察;35 d后每隔2 d观察1次,约50 d沙门菌进入VBNC状态。

2.3 RNA的提取与纯化

将处于对数生长期的正常状态沙门菌与进入VBNC状态沙门菌离心,收集处理后按照RNeasy Mini Kit 及RNA Protect Bacteria Reagent试剂盒说明书提取总RNA并进行纯化,用紫外分光光度计测定其纯度与浓度。

2.4 cDNA的提取与纯化

先按照M-MLV Rtase cDNA Synthesis Kit说明书合成双链cDNA,然后纯化。纯化方法:取适量合成cDNA,加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液剧烈振荡,室温条件下12 000 r/min离心5 min;取上层水相于新离心管,并加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),剧烈振荡混匀溶液;加入2.5倍乙醇混匀,室温静置10 min;4 ℃、15 000 r/min离心15 min;弃上清液,用70%乙醇清洗沉淀;加入适量TE缓冲液溶解后,用紫外分光光度计测定其浓度,置于-20 ℃保存,备用。

2.5 cDNA-RDA检测

2.5.1 扩增子(driver)的制备

取1～2 μg cDNA,酶切体系的体积为50 mL,用DpnⅡ酶于37 ℃水浴6 h;酶切产品用酚和氯仿抽提后加入2.5倍无水乙醇,-20 ℃沉淀过夜,12 000 r/min离心10 min;弃上清液,纯化产物用适量TE溶解,经紫外分光光度计测定浓度后备用。将纯化后酶切产物加入R接头,于50 ℃处理5 min后按照每分钟下降1 ℃的频率降低温度,直至10 ℃,于10 ℃保持1 h;加入T4 DNA连接酶,于16 ℃连接18 h;连接产物按上述方法纯化,经LA Taq酶处理后PCR扩增。PCR体系为100 mL,72 ℃处理5 min去掉Bgl-12接头;加入2 μL LA Taq酶处理5 min补平DNA片段3′末端;95 ℃ 1 min,72 ℃ 3 min,共20个循环;72 ℃ 10 min。将产物纯化即得到RDA所用扩增子(包括驱动扩增子和检测扩增子)。

2.5.2 检测子(tester)的制备

将扩增子与DpnⅡ酶作用去掉R-Bgl 24接头,酶切产物按照2.5.1中方法纯化后进行J接头连接。连接产物用QIA Quick PCR Purification Kit纯化处理后备用。

2.5.3 差减杂交

将扩增子和检测子按50∶1混合后加入2.5倍无水乙醇,于-20 ℃沉淀过夜;12 000 r/min离心10 min;弃上清液,晾干,在反应管中加入8 μL EE缓冲液[10 mmol/L N-2羟乙基哌嗉-N-3 丙磺酸(EPPS),1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),pH值为8.0],于98 ℃作用6 min;加入5 mol/L NaCl 1 μL,67 ℃杂交24 h,杂交完成后,取适量TE缓冲液稀释;对稀释后的杂交产物进行PCR扩增,PCR产物纯化后用豆芽核酸酶处理去掉非线性扩增片段,再次进行PCR扩增富集得到第1次差减杂交差异片段;将扩增子和检测子比例扩大到400∶1和8 000∶1,进行第2轮、第3轮差减杂交,得到正常状态与VBNC状态沙门菌的差异基因片段。

2.6 差异基因的克隆与测序

将第3轮差异片段纯化产物与pMD18-T载体连接,加入大肠杆菌DH5α感受态细胞进行热激法转化;将转化产物涂于氨苄西林平板,于37 ℃培养18～20 h;挑取阳性克隆,提取质粒测序并对测序结果进行分析。

3 结果

3.1 RNA的提取与纯化结果

正常状态沙门菌与VBNC状态沙门菌总RNA的OD260、OD280值分别为1.82和1.85,表明所提取的RNA未降解,浓度较高。1%琼脂糖凝胶电泳显示其条带清晰,可用于cDNA的合成,结果见图1。图1可见清晰的23S及16S,由于5S太小看不清楚。

1.VBNC状态沙门菌;2.正常状态沙门菌;M.DL-2 000 Marker。

3.2 cDNA的提取与纯化结果

合成正常状态沙门菌与VBNC状态沙门菌cDNA后用DpnⅡ酶消化,再用苯酚-氯仿抽提,无水乙醇沉淀纯化后获得100～500 bp的酶切片段,用2%琼脂糖凝胶电泳分析,结果见图2。

1.正常状态沙门菌;2.VBNC状态沙门菌;M.DL-2 000 Marker。

3.3 cDNA-RDA检测结果

以正常状态沙门菌为扩增子,VBNC状态沙门菌为检测子进行差减杂交,经过2轮杂交后,差异片段明显减少,第3轮杂交后可见较清晰条带,结果见图3～5。

M.DL-2 000 Marker;1.DP1。

1.DP2;2.DP3;M.DL-2 000 Marker。

1.DP3;M.DL-2 000 Marker。

3.4 差异基因的克隆与测序结果

3.4.1 差异基因的克隆结果

第3轮差减杂交产物与pMD18-T载体连接,经大肠杆菌DH5α感受态细胞转化后,提取阳性克隆进行PCR验证,电泳检测结果见图6。

M.DL-2 000 Marker;1～15.依次为转化子1～15。

3.4.2 差异基因的测序结果

3轮差减杂交后所得差异基因经凝胶电泳分析后,得到约10条的差异片段,选取阳性克隆测序。将测序得到的8条差异片段经DNAMan 软件分析其同源性,可知在8条差异片段中,有2对存在部分重叠,经分析重叠部分不存在DpnⅡ酶酶切位点,不是酶切不完全所致,可能是细菌基因转录形成。

对所得基因进行Blast比对分析发现,片段1,3同源性基因的功能均与合成腺苷酸环化酶相关。而腺苷酸环化酶是膜整合蛋白,是生物膜的基本结构成分,VBNC状态沙门菌出现该类片段很可能与其菌体形态变化有关。而片段7,8合成的蛋白则可能与严谨反应(stringent response)有关,可能是当细菌处于恶劣条件下某些基因转录异常表达所致。片段2经分析其功能与氨基酸操纵子相关,推测可能与VBNC状态基因调控有关。综合以上分析,当沙门菌进入VBNC状态后其基因转录水平发生异常,与VBNC相关基因转录增加,合成新蛋白;或由于基因转录紊乱导致合成某些异常蛋白。据此推测差异片段1,2,3,7,8可用于后续VBNC鉴别诊断,而片段4,5,6经分析可能不具备鉴别诊断意义。

4 讨论

细菌VBNC状态[3,7]的发现对于生物遗传学、微生态学、流行病学、公共卫生检测等方面的研究有着重要的意义。原核生物由于其mRNA缺少Ploy(A),因此要获得其足够的mRNA是非常困难的[8,9]。目前,虽然已有一些富集原核生物mRNA的试剂盒,但由于RNA本身特点所致其富集mRNA效率不是很高[10,11,12]。本试验借鉴P.Becker等[13]在2001年改良的RDA方法,得到的差异基因片段1,3的功能与膜整合蛋白相关,这可能是导致VBNC状态细菌形态变化的因素之一,细菌无法从恶劣环境中获得如氨基酸之类的营养物质,导致某些相关蛋白合成受阻,因此造成其形态萎缩。差异基因片段7,8的功能与合成严谨反应相关蛋白有关,这可能是因为当细菌处于恶劣环境时,其基因调控紊乱,从而合成某些异常蛋白;也可能是由于面对生存压力时,VBNC机制相关基因转录水平增加,因此合成某些新蛋白来适应环境的变化。