热休克蛋白70（精选7篇）
热休克蛋白70 篇1
甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常见的甲状腺恶性肿瘤,约占甲状腺癌的60%～70%。由于甲状腺乳头状癌临床症状、体征不明显,影像学检查也无典型的形态特征,以致于常被误诊为良性病变[1]。PTC转移较早且转移率高,当原发灶甚至不能触及时,即可发生颈部淋巴结转移。对早期PTC的正确诊断和及时治疗,可以最大程度地提高患者的生存率,延长生存时间。热休克蛋白(heat shock protein,HSP)与肿瘤细胞凋亡、肿瘤免疫和肿瘤患者预后的关系已成为肿瘤学和免疫学研究的热点,其中,热休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)和热休克蛋白90α(heat shock protein90α,HSP90α)与肿瘤预后的关系较为密切。目前研究表明,HSP70和HSP90α在胃癌、乳腺癌和前列腺癌等组织内高表达与肿瘤浸润和淋巴结转移有关,是预后不良的标志。但关于PTC中HSP70、HSP90α的表达及二者之间的关系,目前国内外尚未见报道。本文应用免疫组织化学方法研究HSP70和HSP90α在PTC中的表达及二者的相关性,以进一步了解HSP70和HSP90α在PTC发生和发展中的作用以及与肿瘤预后的关系。
1 材料与方法
1.1 实验试剂与标本
兔抗人HSP90α多克隆抗体及免疫组织化学SP-9000试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物试剂公司;鼠抗人HSP70单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;组织标本系郑州大学第一附属医院2005年1月～2007年12月甲状腺手术切除标本,均经病理证实。其中38例为甲状腺乳头状癌(A组),男性4例,女性34例;年龄19～81岁,平均(44.07±15.03)岁;按有无淋巴结转移分为转移组(22例)和无转移组(16例)。另选14例甲状腺腺瘤(B组)及其腺瘤旁正常甲状腺组织(C组)11例。
1.2 方法
不同组织中HSP70和HSP90α的测定,按SP试剂盒说明书进行操作:石蜡组织切片脱蜡,梯度酒精水化,微波抗原热修复,用3步SP法染色,DAB显色,苏木素复染,二甲苯脱水透明,中性树胶封片,显微镜观察。用已知阳性的乳腺癌切片作阳性对照,结果阳性;以正常山羊血清代替一抗作阴性对照,用PBS代替一抗作空白对照,结果均阴性。
1.3 结果判断
以光镜下胞浆或胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞,400倍显微镜下每张载玻片随机选择5个高倍视野计算其中阳性细胞所占百分比。HSP70和HSP90α表达的判定标准:阳性细胞数<5%为-,阳性细胞数占5%～25%为+,阳性细胞数占25%～50%为++,阳性细胞数≥50%为+++。
1.4 统计学处理
采用SPSS 14.0统计软件进行分析处理,两样本率的比较采用四格表资料的χ2检验,多组间比较采用χ2分割检验,条件不满足的用四格表确切概率法,二者的相关性采用Spearman秩相关分析,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 PTC中HSP70的表达
HSP70的表达主要定位于甲状腺滤泡上皮细胞的胞浆,阳性反应颗粒呈棕黄色,在PTC中多呈灶状分布,同时在滤泡间质细胞,如淋巴细胞和血管内皮细胞中也可见少量阳性颗粒(见图1)。HSP70在PTC组织中的阳性表达率为68.42%(26/38),在甲状腺腺瘤组织中的阳性表达率为21.42%(3/14),在正常甲状腺组织中的阳性表达率为18.18%(2/11)。PTC组中HSP70阳性表达率明显高于腺瘤组和正常甲状腺组,差异有统计学意义(P<0.05);HSP70在甲状腺腺瘤组与正常甲状腺组的阳性表达率相比,差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
2.2 PTC中HSP90α的表达
HSP90α呈棕黄色颗粒状,主要定位于甲状腺滤泡上皮细胞的胞浆,在癌细胞中呈弥漫性分布,尤其在乳头状分支多处阳性反应极强(见图2)。HSP90α在PTC组织中阳性表达率为81.57%(31/38),在甲状腺腺瘤组织中的阳性表达率为21.42%(3/14),而正常甲状腺组织中表达率仅为9.09%(1/11)。PTC组中HSP90α的阳性表达率明显高于甲状腺腺瘤组和正常甲状腺组,差异有统计学意义(P<0.01);甲状腺腺瘤组HSP90α的阳性表达率与正常甲状腺组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 HSP70和HSP90α在PTC有无淋巴结转移组中的表达
在有淋巴结转移的PTC中,HSP70和HSP90α阳性表达率显著高于无淋巴结转移组(P<0.05);HSP70和HSP90α在不同年龄、性别组的阳性表达率差别无统计学意义(P>0.05)。见表2。
2.4 PTC组织中HSP70和HSP90α表达的相关性分析
Spearman秩相关分析结果显示,HSP70和HSP90α在甲状腺乳头状癌中的表达呈正相关(rs=0.421,P<0.05),见表3。
注:1)与正常甲状腺组相比,P<0.05;2)与正常甲状腺组相比,P>0.05
注:覮与无淋巴结转移组相比,P<0.05
注:rs=0.421,P<0.05
3 讨论
甲状腺乳头状癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤,在形态上,除了肿瘤组织呈乳头状增生外,其中最主要的诊断依据是细胞核的改变,包括毛玻璃样核、核沟及核内胞质包涵体等特点[2]。但是,在临床病理诊断中,常常遇到不典型病例,尤其是微小癌,而在甲状腺良性病变中也常常可见滤泡上皮的乳头状增生,如结节性甲状腺肿,以及细胞核的毛玻璃样改变等,如桥本甲状腺炎等。由于甲状腺癌临床症状、体征不明显,影像学检查也无典型的形态特征,以致常被误诊为良性病变而延误治疗。对甲状腺癌的早期正确诊断和及时治疗,可以最大程度地提高患者的生存率,延长生存时间[3]。许多学者尝试利用免疫组织化学方法辅助诊断甲状腺乳头状癌。近年研究发现,HSP在大多数肿瘤中的表达水平增高,在不同肿瘤组织中具有特异性的高表达[4,5,6],因而对肿瘤的诊断和风险预报具有重要的提示意义。
正常细胞中HSP70的表达受细胞周期调控,而肿瘤细胞中突变或异常蛋白质的存在刺激HSP70的合成,使其呈持续的高诱导表达[7]。HSP70在大多数生物细胞中含量最多,是目前研究的热点,但其在PTC中的研究目前国内外尚未见报道。本实验检测了腺瘤旁正常甲状腺组织、甲状腺腺瘤和PTC中HSP70的阳性表达率,结果显示,在腺瘤旁正常甲状腺组织中,HSP70有少量的散在的胞浆表达,在甲状腺腺瘤和甲状腺乳头状癌中其表达逐渐由弱至强。HSP70在正常甲状腺组织中和甲状腺腺瘤中阳性表达率分别为18.18%(2/11)和21.42%(3/14),在PTC组织中阳性表达率为68.42%(26/38)。统计学分析表明,PTC组织中HSP70的表达显著高于甲状腺良性腺瘤组织和正常甲状腺组织(P<0.05);甲状腺腺瘤和正常甲状腺组织比较,差异无统计学意义(P>0.05)。有淋巴结转移组的HSP70阳性率(81.81%,18/22)明显高于无淋巴结转移组(50%,8/16)(P<0.05)。以上结果说明,PTC是HSP70的高表达肿瘤,细胞内HSP70蛋白表达增加可能与PTC的发生、发展以及淋巴结转移有关,是诊断和判断PTC预后的一个重要指标。另外,在PTC乳头状分支较多的区域,HSP70表达较多较强,可能是由于肿瘤形成过程中缺氧和营养不足,进而形成应激反应刺激HSP70表达所致。
在HSP家族种类中,HSP90被认为是一种抗凋亡伴侣分子,可通过不同作用机制调控凋亡[8]。HSP90可作为分子伴侣与一些甾体激素受体(AR、ER和PR)、蛋白激酶、细胞周期蛋白、癌蛋白等相互作用,维持这些蛋白的正常结构与功能。HSP90与受体相互作用蛋白(receptor interacting protein,RIP)形成复合物并促进核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)相互作用,进而调节肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)诱导的细胞凋亡[9]。HSP90除了参与凋亡信号转导通路外,还与其他抗凋亡蛋白如Survivin相互作用抑制细胞凋亡。HSP90能与多种抑癌基因和癌基因产物结合,增强肿瘤细胞抗凋亡能力,导致细胞增殖[10]。根据HSP90是否含有丰富的谷氨酰胺片段而分为HSP90α和HSP90β两类,两者同源性高达84%[11]。在病毒转化和化学诱导的肿瘤细胞中,HSP90α的表达水平明显升高,而HSP90β基本不变[12]。本文研究发现,HSP90α在人正常甲状腺组织有弱阳性表达,阳性表达率为9.09%(1/11),但在PTC组织中表达明显增强,阳性率为81.57%(31/38),显著高于正常对照组(P<0.05)。在有淋巴结转移组阳性率为95.42%(21/22),明显高于无淋巴结转移组的62.50%(10/16)(P<0.05)。说明HSP90α可能通过影响细胞增殖过程,参与了细胞周期和细胞间信号转导,使肿瘤细胞得以无限增殖。细胞内HSP90α表达增加可能与PTC的发生、发展以及淋巴结转移密切相关。检测HSP90α在PTC的表达有助于对PTC的诊断和预后的判定。
相关分析结果显示:HSP70和HSP90α的表达存在正相关(rs=0.421,P<0.05),这与上述结论相一致,提示HSP70和HSP90α可通过调控细胞增殖而抑制细胞凋亡,影响甲状腺乳头状癌的发生和发展。总之,通过本组实验发现,PTC是HSP70和HSP90α高表达肿瘤,HSP70和HSP90α可能与PTC发生、发展以及淋巴结转移密切相关。因此,联合检测HSP70和HSP90α在PTC的表达有助于对PTC的诊断和预后的判定,笔者认为其可作为甲状腺良恶性病变鉴别诊断以及评估PTC预后较有价值的参考指标。HSP70和HSP90α在其他病理类型甲状腺癌的侵袭转移中的作用,以及HSPs在甲状腺癌发生、发展中的作用尚需更深入研究,从而为甲状腺癌的早期诊断、临床治疗和预后评估提供理论依据。
参考文献
[1]庄岩,赵建勋,杨尹默,等.甲状腺乳头状癌及滤泡状癌Ⅰ型转化生长因子β受体与增殖细胞核抗原的表达状态及意义[J].中国现代医学杂志,2004,14(15):1-3,8ZHUANG Y,ZHAO JX,YANG YM,el at.Expressions of typeⅠredeptor of TGF-βand PCNA in thyroid papiuary and fouicular Carcinomas[J].China Journal of Modern Medicine,2004,14(15):1-3,8
[2]BEESLEY MF,MCLAREN KM.Cytokeratin19and galectin-3 immunohistochemistry in the differential diagnosis of solitary thyroid nodules[J].Histopathology,2002,41:236-243.
[3]LL Z,LIU CP,SHI L,et al.Clinical significance about calcification intrathyroid by Bhltrasonic for diaghosis of papiuary thyroid cancer[J].China Journal of Modern Medicine,2008,18(14):2037-2038.Chinese
[4]曹富民,王小玲,张祥宏,等.食管鳞状细胞癌热休克蛋白27、70中的表达及临床意义[J].中国肿瘤临床,2004,31(8):462-465.CAO FM,WANG XL,ZHANGXH,etal.Expressions and Clinical Significance of Heat Shock Proteins27and70in Esophageal Squamous Cell Carcinomawith Different Post-esophagectomy Sur-vival Period[J].Chinese Journal of Clinical Oncology,2004,31(8):462-465.
[5]CANOZ O,BELENLI O,Patiroglu TE.General features of gastric carcinomas and comparison of HSP70and NK cell immunoreac-tivity with prognostic factors[J].Pathol Oncol Res,2002,8:262-269.
[6]THANNER F,SUTTERLIN MW,KAPP M,et al.Heatshock protein70 as a prognostic marker in node-negative breast cancer[J].Anticancer Res,2003,23(2A):1057-1062.
[7]BIVIK C,ROSDAHL I,OLLINGER K.HSP70protects against UVB induced apoptosis by preventing release of cathepsins and cytochrome c in human melanocytes[J].Carcinogenesis,2007,28(3):537-544.
[8]MALONEY A,WORKMAN P.HSP90 as a new therapeutic target for cancer therapy:the story unfolds[J].Expert Opin Biol Ther,2002,2(1):3-24.
[9]MALONEY A,WORKMAN P.HSP90 as a new therapeutic target for cancer therapy:the story unfolds[J].Expert Opin Biol Ther,2002,2(1):3-24.
[10]ELPEK GO,KARAVELI S,SIMSEK T,et al.Expression of heatshock proteins HSP27,HSP70 and HSP90 in malignant epithelial tumour of the ovaries[J].APMIS,2003,111:523-530.
[11]BAO AH,DAI J,LI SG,et al.The Study of HSP90mRNA Expression in Gawtric Cancer and Large Intestine Carcinoma[J].Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry,2005,14(2):214-216.
[12]TANG W,LI JB.Expressions of HSP70 and HSP90α in human bladder transitional cell carcinoma and the clinical significance[J].Acta Academiae Medicinae Militaris Tertiae,2005,27(6):560-562.
热休克蛋白70 篇2
1 材料
1.1 实验对象
Wistar大鼠56只, 雌雄不限, 体重 (210±10) g (佳木斯大学动物中心提供) , 随机分成对照组和损伤组。其中损伤组分为2h、6h、12h、24h、48h、72h组, 每组8只大鼠。
1.2 主要仪器与试剂
①小鼠抗兔HSP70多克隆抗体 (武汉博士德生物工程公司) ②羊抗小鼠 IgG (武汉博士德生物工程公司) ③低温高速离心机 (上海仪表厂) ④电泳槽及转移槽 (北京六一仪器厂) ⑤电热恒温水浴箱 (上海仪表厂) ⑥分光光度计 (上海机密仪器仪表厂) ⑦计算机图像分析系统 (苏州仪表仪器有限公司) 。
1.3 大鼠脊髓损伤模型制备
损伤组大鼠用改良Allen法[2]制备大鼠脊髓损伤模型。以3%戊巴比妥钠 (30mg/kg) 腹腔注射麻醉, 俯卧固定, 背部去毛, 常规消毒, 铺无菌单, 大概在第10胸椎正中切开皮肤皮下, 用咬骨钳咬开椎板, 暴露脊髓, 用重10g、直径2mm的重锤自10cm垂直打击放在脊髓上的圆片, 制成大鼠损伤模型, 术后肌注青霉素, 每8h给大鼠排尿一次。对照组采取相同方法咬开椎板后直接缝合。
1.4 标本采集、制备、west-blot免疫印迹测HSP70
取不同时间点的大鼠深度麻醉后处死, 立即以损伤处为中心取出脊髓, 冲洗掉血液, 做好标识后马上放入-80℃冰箱保存。做West-blot时每个标本取少量称重匀浆后, 裂解30min, 离心后取上清, 蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳后, 制作“凝胶三明治”, 将其夹好, 安放在电泳槽里, 添加转移缓冲液接电后过夜转膜。免疫印迹:把NC膜放在丽春红溶液中染5min, 放在脱色摇床上摇。蛋白带出现后, 用水冲洗掉未被染上的染液。将NC膜放放在保鲜袋上, 可使用自配的脱脂奶粉液体封闭, 常温孵育1h。封闭后, 使用PBS漂洗多次。将NC膜放进小鼠抗兔HSP70抗体的杂交液中用孵育, TBST在摇床上洗两次, 再用TBS洗一次。相同方法在加入酶标记羊抗小鼠IgG, 漂洗方法相同。显色:将膜放入DAB显色液中, 在常温下用手慢慢摇晃, 显色后立即用PBS液冲洗膜, 终止反应。扫描仪获取图像。最后图像处理用计算机图像分析系统处理HSP70电泳条带的光密度。
1.5 统计学分析
采用SPSS11.0统计软件。计量资料以均数±标准差undefined表示, 均数间比较采用独立样本t检验。P<0.05判定为差异具有显著性。
2 结果
对照组脊髓基本没有HSP70表达, 或者有很少量表达。脊髓损伤组大鼠在脊髓损伤后2h即有HSP70开始表达, 并随着时间增加表达也随之增多, 24h表达达到最高峰, 维持到72h。之后表达较少, 低于6h水平。总之, 损伤组HSP70表达较正常组和手术对照组明显增加, 但是对照组也有表达, 可能是手术创伤较大, 应激反应导致。West-blot免疫印迹结果如图1, 定量分析见表1, West-blot结果见表1, (数值越大, HSP 70表达越强) 。
A代表对照组b～g代表2h、6h、12h、24h、48h、72h时间点
注:与对照组相比, *P<0.05。
3 讨论
HSP70作为一种生物体在应激状态下产生的一种蛋白, 有着特殊的作用, 应激状态下能产生应激蛋白几乎存在于整个生物界。HSP70是此类反应蛋白中最常见的一类, 而且在进化上高度保守, 说明它对生物体保持应付突发事件有着重要作用和意义。研究发现, 在非应激状态下基本没有HSP 70的基础性表达, 这与HSP70作为机体的应激反应蛋白的身份是相一致的。但是在本实验的手术对照组中, 由于手术操作必然造成大鼠机体一定程度的应激反应也加速损伤细胞的修复, 也就造成了有一定量的表达。研究表明, 缺血再灌注后HSP70表达30min就出现, 消失时间延后[3], 然而严重创伤表达均减少。
研究表明, HSP70对细胞保护作用, 其诱导的数量与保护作用的强弱呈正相关[4]。从以下机制在中枢神经系统中发挥作用:可作为细胞内的“分子卫士”, 通过分子伴侣作用来实现的, 它可使蛋白质正确折叠、组装及转位, 从而维护细胞功能和维持细胞存活[5], 认识和清除异常蛋白质, 促进细胞膜上Na-K-ATP酶活性的修复并加速损害严重且不能修复蛋白的降解;HSP70为修复应激所致细胞损伤所必需。蛋白质合成旺盛, 也是与HSP的“分子卫士”作用有关。HSP70还可为细胞色素C传递电子, 使其保持还原状态[6], HSP70还可提高内源性抗过氧化酶如SOD的活力;研究表明在氧化应激等刺激下, 通过细胞的信号传递可激活SAPK/JNK3, 启动特定程序引发细胞凋亡, 同时发现增加细胞HSP70的水平能防止应激诱导的SAPK/JNK3激活, 从而减少细胞凋亡;抑制凋亡激活基因p53、Bax的表达及诱导抗凋亡基因BCL-2的表达;HSP70诱导的数量与抗凋亡保护作用的强弱呈正相关[7]。Kitamura等[8]研究发现, c-Jun N-terminal kinase (JNK) 信号通路是导致创伤后细胞凋亡的重要途径之一, 而HSP70是其中的一种抑制分子; HSP70可以和一些凋亡前效应因子 (包括Apaf-1、AIF) 和一些信号分子 (JNK-1、p53、c-myc) 进行中和性的相互作用[7], 从而在半胱天冬酶 (caspase) 和非caspase依赖性的细胞凋亡中通过影响凋亡相关的线粒体事件的上游和下游事件来影响凋亡的发生。通过上述作用机理HSP70在细胞的应激反应中发挥重要的作用。
因此, 当脊髓遭遇打击损伤后, 生物体应激可以产生HSP70, 这些HSP70可能通过其中某些机制发挥着其对脊髓神经细胞起保护作用。
参考文献
[1]管华清, 顾晓晖, 杨惠林, 等.热休克蛋白对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用[J].脊柱外科杂志, 2004, 12 (6) :363-367
[2]Allen AR.Surgery of experimental lesion of spinal cordequivalent to crush injury of fracture dislocation of spinalcolumn[J].JAMA, 1911, 57 (10) :878-880
[3]张韬, 段志泉, 毛羽, 等.缺血预处理对犬脊髓损伤及热休克蛋白70表达影响的研究[J].中华外科杂志, 2004, 42 (22) :1353-1356
[4]Sale hi AH, Morris SJ, Ho WC, et al.AEG3482 is an anti-apoptotic compound that inhibits Jun kinase activity and celldeath through induced expression of heat shock protein70[J].Chem Bio, 2006, 13 (2) :213-223
[5]Bowers DJ, Calvano JE, Alvarez SM, et al.Polymorphisms of heatshock protein-70 (hspa1b and hspa1lLoci) do not influenceinfection or outcome risk in critically ill surgical patients[J].Shock, 2006, 25 (2) :117-122
[6]Jayakumar J, Suzuki K, Sammut IA, et al.Heat shock protein 70gene transfection protects Mitochondrial and ventricular functionagainst ischemia-reperfusion injury[J].Circulation, 2001, 104:1303-1307
[7]屈纪富, 史春梦, 江德鹏, 等.热休克蛋白70在创伤愈合中的作用[J].创伤外科杂志, 2006, 8 (6) :551-552
热休克蛋白70 篇3
1 HSP70在转基因小鼠中的神经保护作用
Vander等[1]利用磁共振技术对大脑中动脉永久缺血后的HSP70过表达的转基因小鼠与野生型小鼠对比进行研究, 24 h T2加权图像显示转基因小鼠的损伤体积较之野生型小鼠显著减小, 表现弥散系数提示前者损伤区域的损害较轻。结果表明HSP70过表达可减小总的损伤面积, 并可控制损伤区域内的组织损伤。本实验不但证实了HSP70的神经保护作用, 也进一步在活体中证明了HSP70的作用。Rajduv等[2]制作永久性局灶性脑缺血模型, 缺血后6 h, 用 Nissl 染色测定脑梗死面积, 发现转基因小鼠较野生型小鼠梗死面积明显较小;24 h后, 在转基因小鼠中仍发现有保护大脑、减轻脑梗死的作用。表明HSP70能够显著地保护大脑免受缺血损伤。Tsuchiva等[3]研究发现HSP70过表达的转基因小鼠较野生型小鼠能够减轻短暂性局灶性脑缺血后的神经损伤和细胞凋亡。但Olsson等[4]通过检测全脑缺血后HSP70诱导形式的表达和可能的神经保护作用, 观察到在缺血的易损部位海马CA1～CA3区缺血诱导了HSP70的显著表达。而亚低温可抑制细胞损伤而无显著的HSP70表达。认为脑缺血后HSP70的高表达是细胞应激的指示物, 同时, 结构性的HSP70高表达并不足以有效地影响鼠全脑缺血后的细胞死亡。
2 HSP70的神经保护机制
HSP70作为一种伴侣蛋白, 对于保护大脑免受缺血损伤的潜在作用已经被广泛研究。Giffard等[5]认为蛋白质聚集体是神经变性疾病例如Huntington's and Alzheimer's的病因之一, 最近的数据表明卒中动物模型中也存在蛋白质聚集体, 他们观察到海马CA1区HSP70过表达, 神经细胞存活增加的同时蛋白质聚集体减少。并在体外证明了共伴侣蛋白Hdj-2的保护作用, 阐明这是伴随着泛素免疫染色识别的蛋白质聚集体的减少而实现的。此外, HSP70还能降低低糖低氧引起的细胞凋亡和坏死。因此, 伴侣蛋白在缺血后的保护作用至少包括抗细胞凋亡、抗坏死和抗蛋白质聚集机制。Tsuchiva等[6]用大脑中动脉永久闭塞造脑缺血模型, 4 h后测得线粒体释放入细胞质的细胞色素C显著降低, 而且转基因小鼠较野生型小鼠相比, 皮层和纹状体中细胞色素C的免疫反应性也显著降低。实验结果与HSP70过表达、细胞色素C释放减少和随后的DNA断裂之间的联系相符合。这可能是脑缺血后HSP70介导的神经保护作用的某些因素。HSP70除了作为伴侣分子协助蛋白的正确折叠外, HSP70阻止细胞死亡尚有其他几个机制, HSP70不仅能够干扰诱导细胞凋亡的几种蛋白的作用而直接调节细胞凋亡, 还可以提高抗死亡蛋白bcl-2的水平而间接的调节细胞凋亡[7]。
3 HSP70与脑缺血损伤的中医药干预研究
3.1 补阳还五汤
邓常青等[8]采用沙土鼠双侧颈总动脉夹闭脑缺血模型, 分别腹腔注射补阳还五汤及其有效部位组方, 结果显示沙土鼠脑缺血再灌注后, 脑组织HSP70 mRNA和蛋白表达显著增加, 补阳还五汤及其有效部位组方可使脑缺血再灌注后HSP70 mRNA表达减少, 补阳还五汤的抑制作用强于有效部位组方, 但两者对脑缺血再灌注后 HSP70蛋白表达的增加均无明显影响。由此推断补阳还五汤及其有效部位组方可能通过抗缺血作用而抑制了缺血后 HSP70 mRNA的表达。谢建军等[9]通过实验观察到缺血再灌注后48 h, HSP70 mRNA及蛋白表达明显增强 , 补阳还五汤可明显抑制其转录外, 还可轻度降低HSP70的翻译。补阳还五汤对脑缺血损伤后神经功能的保护作用可能与抑制缺血脑损伤HSP70基因的过度表达作用有关。
3.2 川芎嗪
李源等[10]采用大鼠左侧颈总动脉结扎并滴注生理盐水制作脑缺血-再灌注CIRI模型 , 以免疫细胞化学法检测鼠脑CIRI及川芎嗪干预CIRI脑组织HSP70表达, 结果显示非缺血侧脑组织无HSP70表达, 缺血30 min缺血侧大脑皮层可见HSP70表达;再灌注30 min组仅1只大鼠 (1/6) 缺血侧大脑皮层有HSP70表达。与单纯缺血大鼠相比, 川芎嗪干预组缺血侧大脑皮层HSP70表达明显增强, HSP70免疫阳性细胞数, 两组间差异非常显著。脑缺血时可诱导缺血脑细胞部分HSP70表达, 川芎嗪干预可使缺血大脑皮层HSP70表达明显增强。
3.3 黄芪
王沙燕等[11]用Northern blot和 Western blot分别检测补阳还五汤和黄芪对沙土鼠脑缺血再灌注后HSP70基因及蛋白的表达, 结果在脑缺血再灌注后48 h, HSP70mRNA及蛋白表达明显增强, 补阳还五汤可明显抑制HSP70的转录, 而黄芪则除了可明显抑制其转录外, 还可轻度降低 HSP70的翻译。因此推测补阳还五汤和黄芪对脑缺血再灌注后 HSP70的抑制作用有可能对于脑缺血引起的损伤具有保护作用。
3.4 葛根素
桑韩飞等[12]发现HSP70表达主要在缺血半暗带, 死灶中央未见HSP70表达, 推测HSP70可能与半暗带神经元损伤的可逆性有关 。与对照组相比, 葛根素组于脑缺血再灌注后6 h、12 h、18 h、48 h时间点HSP70表达明显增多且表达高峰提前至再灌注后18 h, 而病理组织学观察表明葛根素组皮层神经细胞缺血损伤明显减轻, 说明葛根素对脑缺血损伤有保护作用。
3.5 丹参
匡培根等[13]采用大鼠大脑中动脉线栓模型, 以免疫细胞化学及病理组织方法在同一动物中进行研究, 结果发现在缺血90 min再灌注24 h后, 丹参组较缺血组HSP70免疫反应增强, 而相应皮层神经细胞的缺血性损伤则较轻。提示丹参对局灶性缺血再灌注损伤的保护作用, 可能与影响HSP70合成机制有关。
3.6 复方阿魏酸
陈莉芬等[14]采用大鼠双侧颈总动脉阻断和尾部放血并重缺血再灌注的脑缺血模型。应用免疫组织化学方法检测大鼠脑组织HSP表达, 并与病理组织学改变进行对照研究。结果复方阿魏酸可促使缺血大脑皮层HSP70表达增强, 减轻皮层神经细胞缺血损伤, 对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
3.7 脑络欣通
中药复方制剂脑络欣通是老中医王乐匐教授治疗缺血性脑血管病的经验方, 王键等[15]研究发现, 脑络欣通预防组和治疗组缺血侧脑组织 HSP70的表达明显升高, 且脑络欣通对 HSP70的作用优于脑安胶囊。推测脑络欣通可能通过促进缺血侧脑组织神经元 HSP70的表达而发挥其神经保护作用。
3.8 三七三醇甙
三七三醇甙是从人参中提取的有效成分, 通过减轻脑水肿, 上调HSP70的表达, 下调运铁蛋白和维持血脑屏障来发挥局灶性脑缺血后的神经保护作用[16]。
3.9 其他
研究发现电针可影响HSP70的表达, 余晓慧[17]采用免疫组化法检测大鼠脑局灶性缺血 24 h后HSP70表达, 以及电针干预后 HSP70表达的变化。结果显示大鼠局灶性脑缺血后 HSP70大量表达, 电针可上调 HSP70的表达。提示电针促进缺血后HSP70基因的表达, 可能是其抗缺血性脑损伤的机制之一。此外, 电针具有抵抗脑缺血/再灌注损伤后的细胞凋亡作用, 实验表明其机制也可能与HSP70诱导性表达升高有关[18]。以往的研究发现重复电针刺激百会穴行预处理可诱导脑缺血耐受, 减轻随后的脑缺血损害。路志红等[19]通过实验观察重复电针刺激百会穴预处理对脑缺血再灌注大鼠脑皮质 HSP70表达的影响, 探讨重复电针预处理保护脑损伤的机制。结果表明, 电针组皮层 HSP70表达明显强于对照组。电针组组织病理学损害轻于对照组, 重复电针刺激百会穴预处理减轻脑缺血再灌注损伤与皮层 HSP70表达增强有关。
4 展 望
热休克蛋白70 篇4
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料
胰腺癌细胞株Bxpc-3购自上海细胞所, 小鼠抗人HSP70单抗为北京中杉金桥公司产品, 10%胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品, RPMI1640培养基为美国GIBGO 公司产品、胎牛血清购自天津血液研究所、0.25%胰蛋白酶购自夏新公司, 四氮唑蓝 (MTT) 、碘化丙啶 (PI) 为Sigma公司产品。
1.1.2 仪器
流式细胞仪为美国BD公司产品, 酶标仪为美国Bio-rad公司产品, CO2恒温培养箱等。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
Bxpc-3细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中, 置37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养, 2～3 d传代1次。
1.2.2 MTT法检测细胞生长抑制率
将对数生长期的细胞按5×104/ml, 200 μl完全随机平行接种于96孔板, 每孔约1×104个细胞, 贴壁后, 加入效价为1:100的HSP70单抗, 终浓度为10、20、40 μl/ml, 实验设6个复孔, 以不含单抗的完全培养基为空白对照, 分别培养24, 48 h后去培养液, 每孔加MTT液 (5 g/L) 20 μl, 37℃、5% CO2培养箱内继续培养4 h, 弃上清液, 每孔加DMSO 150 μl, 震荡10 min, 用酶标仪测570 nm处吸光度 (A) 值。计算抑制率= (1-实验组A值/对照组A值) ×100%。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
取对数生长期的细胞6×105/ml, 接种于6孔板, 每孔1 ml, 细胞贴壁后, 弃去原培养液, PBS洗2次, 加入含不同浓度HSP70单抗 (10、20 、40 μl/ml) 的培养基, 每组设3个复孔, 培养48 h后, 胰酶消化、收集细胞, 以70%冷乙醇固定, 4℃保存。检测时用RNaseA消化后, PI染色30 min, 500目尼龙网过滤后上机检测, 每孔收集10 000个细胞, MODFIT软件进行分析。
1.3 统计学方法
所有数值均以
2 结果
2.1 HSP70单抗可抑制胰腺癌BXPC-3细胞增殖
经不同浓度HSP70单抗分别作用24, 48 h后, Bxpc-3细胞的增殖情况用MTT法检测 (见表1) 。HSP70单抗可以抑制胰腺癌BXPC-3细胞的增殖, 且呈浓度和时间依赖性。随着单抗浓度的提高细胞抑制率增加, 各浓度组与对照组相比差异具有统计学意义 (P<0.05) , 48 h组与24 h组之间相比差异也具有统计学意义 (P<0.05) 。48 h的抑制率高于24 h的抑制率, 故之后实验在48 h进行。
注:与对照组比较, ▲P<0.05;与24 h组比较, △P<0.05
2.2 细胞凋亡率检测结果
流式细胞仪检测空白对照组、10、20、40 μl/ml的凋亡率, 结果表明, 随着单抗浓度的提高, 细胞的凋亡率增加, 各单抗组与对照组相比差异具有统计学意义 (P<0.05) (见表2, 图1) , 呈剂量依赖性。
注:与对照组比较▲P<0.05
3 讨论
胰腺癌是一种主要来源于胰腺导管上皮的恶性肿瘤, 是消化系统常见的恶性肿瘤之一, 其发病率占全身恶性肿瘤的1%～2%, 好发年龄为50～60岁, 男性多于女性 (1.7: 1) [1,2]。近年来国内外报道其发病率均有增长趋势, 每年大约有30 000胰腺癌的新发病例[3], 我国胰腺癌的年发病率为5.1/10万人, 较20年前升高了3倍[4]。胰腺癌一经诊断多属晚期, 手术切除率低, 即使有机会接受手术者, 术后5年生存率仅为5%左右, 且其对常规放化疗相对不敏感, 故寻求一种新的疗法十分必要。
热休克蛋白70 (HSP70) 是生物有机体在各种应激因素作用下产生的一种具有保护自我、防御侵害的蛋白质。HSP70具有多种生物学功能, 包括分子伴侣功能, 参与免疫反应, 抗细胞凋亡功能, 抗氧化功能, 提高细胞的应激耐受性, 促进细胞增殖, 参与细胞骨架的形成和修复等, 广泛的生物学功能使其成为当今生命科学研究中的热点。1993年, Ciocca等[5]发现原发性乳腺癌患者的HSP70表达与肿瘤进展密切相关, 因而认为, HSP70可以作为肿瘤进展的标志物。2002年, Beer等[6]显示HSP70在早期肺腺癌中过表达是一个不良预后的分子标志物。2003年, Kanazawa等[7]认为:大肠癌组织对HSP70和HSP40表现出特殊的免疫反应性, 分别为84%和14%;与正常组织相比较, HSP70和HSP40在癌组织标本中过表达;但HSP的表达与各种临床病理参数之间无显著的相关性。Li Zhong等[8]在研究非小细胞癌血清中HSP70抗体时发现, HSP70抗体较正常显著增高 (P=0.0002) , 表明HSP70抗体是NSCLC适度的 (灵敏度0.74, 异性0.73) 标志物。金实等[9]研究发现在胰腺癌组织中HSP70明显增高。
肿瘤的发生是细胞的恶性增殖与细胞凋亡之间平衡失调的结果, HSP70的高表达增强了肿瘤细胞抗凋亡能力, 使细胞的生长抑制效应和死亡减弱。HSP70可能通过下调细胞凋亡相关基因、蛋白和蛋白酶活性 (如SAPK/JNK和Caspase) 起到拮抗细胞凋亡作用[10]。许多研究证实, 大多数恶性肿瘤细胞的HSP70表达增高, 与其获得抗凋亡的能力密切相关, 而降低肿瘤细胞HSP70的表达水平, 则可以使瘤细胞不能维持其正常代谢、导致其生长抑制以及凋亡。HSP70单抗已在体外成功的诱导了宫颈癌和胃癌细胞的凋亡[11,12]。
热休克蛋白70 篇5
1 材料与方法
1.1 动物
雄性新西兰大白兔25只,体重2.5～3.0 kg,由上海医学实验动物研究中心提供。随机分为5组(n=5):(1)假手术组(SO组):手术同其它组,但未行静脉移植等;(2)手术Ⅰ组:移植术后第3天取材;(3)手术Ⅱ组:移植术后第7天取材;(4)手术Ⅲ组:移植术后第14天取材;(5)手术Ⅳ组:移植术后第28天取材。
1.2 方法
1.2.1 建立模型
3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉(30～35 mg/kg),剪毛、消毒后,固定于手术台并铺巾。取颈正中切口,游离出右侧颈外静脉及左颈总动脉,在颈总动脉的上、下两端用无创动脉夹阻断血流后,横断血管,取右侧颈外静脉约2.0 cm间置于对侧颈总动脉之间,以9-0缝线采用间断外翻法行端端吻合,每个吻合口缝12针。检查无出血及吻合口漏血后即缝合伤口。麻醉时及术毕腹腔各注射青霉素80万U,术后皮下注射肝素6 250 U。
1.2.2 标本的收集与处理
动物麻醉后打开原切口,寻及搏动良好的移植桥,予以切取,对照组直接切取颈静脉。标本一部分用中性福尔马林固定,备行苏木精-伊红染色与免疫组化检查,一部分置于液氮内,备行PCR与Western blot检测。
1.2.3 形态学检查
血管标本中性福尔马林固定后,切片用苏木精-伊红染色,行光镜检查。
1.2.4 R eal-Time PCR检测HSP70 mR NA表达
(1)总RNA抽提:100 mg血管组织机械匀浆,用Trizol试剂盒(Invitrogen公司),按说明书介绍的方法提取RNA,用分光光度计测OD260/280值。电泳鉴定后,-80℃保存。(2)c DNA的制备:采用Promega公司的反转录试剂盒按说明书进行。取4μg总RNA、2μL的随机引物(Random primer,50μM),加去离子水32μL。70℃变性5 min,置于冰上冷却。再加入脱氧核糖核苷酸(dNTP,2.5 m M)2μL,抑制剂(Ta Ka Ra40U/μL)1.5μL,M-MLV(Promega 200 U/μL)2.5μL,M-MLV5×缓冲液10μL。37℃反应2 h,-20℃保存。(3)引物序列:设置β-Actin为内参照,根据GenBank设计引物。HSP70上下游引物分别为:5'-ATGTCAGCAGCATCCAAGTGTT,5'-TGGAGAA GATCAACCAAAGCAA。β-Actin:上下游引物分别为:5'-GGGCCGGACTCGTCATACT,5'-CCTGGCAC-CCAGCACAAT。引物由Invitrogen公司合成。(4)Real-Time PCR扩增:反应在TP800荧光定量PCR仪(Ta Ka Ra公司)上进行。体系为c DNA 2.0μL,HSP70、β-actin特异上下游引物各0.5μL,SYBR Premix Ex Taq 12.5μL(Ta Ka Ra公司),去离子水补至25μL。PCR循环条件为:95℃2 min,94℃10 s,60℃30 s,40个循环后进行熔解曲线的测定。(5)Real-Time PCR的数据处理:以前12个循环的荧光值作为荧光本底信号,第4～12个循环的荧光信号的标准差的10倍设定为阈值,以β-Actin(ACTB)为管家基因,校正每个样品Ct值,数据分析按照文献[2]提供的方法进行:每个基因在每个模板中做3次重复实验,得到的Ct值取平均值。Ct平均值减去对应模板的ACTB的Ct平均值,得到ΔCt,实验组的ΔCt减去对照组的ΔCt,得到ΔΔCt值,对照组和实验组中的待测基因的倍数关系用2-ΔΔCt表示。1.2.6 HSP70蛋白的检测血管组织100 mg在液氮研磨成粉末,待液氮挥发干以后,移至1.5 m L离心管中,加入0.5 m L新鲜配置组织裂解液充分裂解后,置100℃水浴中加热10 min,离心10 min取上清,-20℃保存备用。用BCA蛋白定量试剂盒(PIERCE公司,23225)测定蛋白浓度。取60μg的蛋白样品,加入等体积的2×SDS上样缓冲液混匀,置100℃水浴中加热3 min,12 000 g离心5 min,取上清,上样于10%SDS-PAGE胶中电泳分离。将胶上的蛋白质通过电泳转移印迹至硝酸纤维素NC膜上。于室温下用封闭液(5%脱脂奶粉,0.1%Tween-20溶解于PBS中)封闭2 h。加入用封闭液稀释的一抗(1∶500,购自Sant Cruz公司),4℃反应过夜;加入相应的HRP-标记的二抗,室温反应30 min;NC膜沥干后加ECL Plus试剂(Amersham公司,#RPN2132),反应1min以后,于暗室中压X光片,置自动洗片机中显影定影。
1.3 统计学处理
实验数据均用均数±标准差(x±s)表示,用SPSS11.5统计软件包进行资料的t检验与方差分析,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 形态学
光镜下见正常静脉内膜为单层内皮细胞,中膜薄,由2～3层血管平滑肌细胞及少量胶原组成。移植后3 d可见内膜受损,有炎性细胞浸润。移植后1周可见明显内膜增生,随着时间的延长,并渐见内膜增厚,有较多的平滑肌细胞。
2.2 Real-Time PCR法检测mRNA
从图中结果可见,在移植后的第3天,HSP70m RNA表达明显升高(3.066±0.144vs1,P<0.01),而后渐降至正常(图1)。
2.3 Western blot检测蛋白结果
HSP70表达在移植后第3天时明显增高,而后渐下降(图2)。
3 讨论
热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是细胞在高温或应激情况下产生的一组序列高度保守的细胞蛋白,根据分子量大小和同源程度的不同,可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子量HSP等几个家族。每个家族又有多个成员,HSP70是HSP中最保守的一类。HSP70具有多种生物学功能,包括参与免疫反应、抗氧化功能、提高细胞的应激耐受性、参与细胞骨架的形成和修复等,在细胞的信息传递、生长、分化中具有重要的调控作用[3]。
在本实验中,我们发现自体静脉移植后的第3天出现了HSP70的表达增高。这可能与移植后的静脉受到血管内压力改变,以及局部的炎症反应等有关。既往的研究发现,急性高血压可诱导大鼠的主动脉平滑肌细胞表达HSP70增高与血管内张力改变有关[4]。体外的实验发现,机械性张力刺激可诱导血管平滑肌细胞表达HSP70增高,并受Rac/Ras GTP偶联蛋白调节[5]。此外,移植血管的缺血、缺氧与再灌注损伤导致的炎症反应,也可诱导HSP70的产生[6]。
HSP70的表达是细胞经受损伤刺激后的一种保护性反应,它参与了细胞的损伤修复。应用球囊导管损伤颈动脉模型,可见到损伤后血管平滑肌细胞内表达HSP70增高[7]。本文发现,术后的第3天,移植血管内膜受损,局部有炎症细胞浸润,而此时的HSP70升高与之相对应,可能与其保护作用有关。另外,表达增高的HSP70可能还参与了移植静脉的平滑肌细胞的迁移与增殖,因此随后出现了血管平滑肌增多、内膜增厚。既往的研究发现,球囊导管引起颈动脉损伤后,局部表达增高的HSP70可引起免疫反应,从而导致动脉壁的平滑肌细胞增生[8]。
总之,本文发现在自体静脉移植后早期,血管的HSP70表达见升高,这可能与平滑肌细胞的增殖有关,但其具体的机制仍有待进一步的研究确定。
参考文献
[1]POCKLEY AG.Heat shock proteins,inflammation,and cardio-vascular disease[J].Circulation,2002,105:1012-1017.
[2]LIVAK KJ,SCHMITTGEN TD.Analysis of relative gene expres-sion data using real-time quantitative PCR and the2[-Delta Delta C(T)]Method[J].Methods,2001,25(4):402-408.
[3]JULIANN GK,GEORGE CT.Heat shock protein70kDa:molecular biology,biochemistry and physiology[J].Pharmacol Ther,1998,80(2):184-185.
[4]XU Q,LI DG,HOLBROOK NJ,et al.Acute hypertension in-duces heat-shock protein70gene expression in rat aorta[J].Cir-culation,1995,92:1223-1229.
[5]XU Q,SCHETT G,LI C,et al.Mechanical stress-induced heat shock protein70expression in vascular smooth muscle cells is regulated by mall G proteins but not mitogen-activated protein kinases[J].Circ Res,2000,86:1122-1128.
[6]MESTRI R,CHI SH,SAYEN MR,et al.Isolation of a novel inducible rat heat-shock protein(HSP70)gene and its expression during ischaemia/hypoxia and heat shock[J].Biochem J,1994,3:561-569.
[7]GREENBERG GJS,BARSHACK I,SINGH M,et al.Accelerated intimal thickening in carotid arteries of balloon-injured rats after immunization against heat shock protein70[J].J Am Coll Cardi-ol,2001,38,1564-1569.
热休克蛋白70 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
TCE(纯度99.5%)购自天津威晨化学试剂公司。达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)细胞培养液、胎牛血清、D-Hank’s液、二甲亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)购自美国Sigma-Aldrich公司。IP细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司。丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、人HSP 70酶联免疫试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司。主要仪器设备:二氧化碳培养箱(SHELLAB 3552-2)、超净工作台(鑫贝西BBS-SDC-A)、台式离心机(Sigma 3K15)、酶标仪(BIO RAD i Mark)、电热恒温水浴箱(DK-600)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
Hep G2细胞株来自美国模式培养物集存库(ATCC),用含10%胎牛血清的DMEM培养液在5%CO2、37℃条件下培养。以DMSO为溶剂配置TCE储备液,用细胞培养液稀释至试验所需浓度,DMSO的终浓度为1%(体积分数)。TCE染毒浓度按Hu等[6]91报道初设为0~10 mmol/L,后根据MTT试验结果调整为0~8 mmol/L。每个染毒浓度设3个重复样本,并独立重复1次试验。每次试验均包括含1%DMSO和不含DMSO 2种对照,二者结果无统计学差异,图表结果中0 mmol/L表示含1%DMSO的对照。细胞染毒培养24 h后移除培养液,用IP细胞裂解液裂解细胞并收集至EP管,4℃条件下10 000×g离心5 min取上清,-20℃保存备用。
1.2.2 细胞活力试验
在96孔板内染毒培养Hep G2细胞24 h后,每孔加入5 mg/ml MTT试剂20μl继续培养4 h,移除培养液后每孔加入DMSO 150μl,孵育10 min,用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的吸光度(A)值(以%表示细胞活力)。
1.2.3 MDA、GSH和HSP 70水平检测
采用商品化的酶联免疫试剂盒检测,严格按相应的使用说明操作。
1.3 统计学分析
所有数值结果以±s表示。使用STATA 13.0对数据进行单因素方差分析和组间比较(bonferroni法)、回归分析。所有统计学检验均为双侧检验,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 不同浓度TCE暴露后的细胞活力
如图1所示,TCE浓度为0.25~8.00 mmol/L时,Hep G2细胞活力与TCE浓度为0 mmol/L时比较,差异无统计学意义;细胞形态无明显变化(图2 A-D)。TCE浓度为10 mmol/L时,Hep G2细胞活力低于TCE浓度为0 mmol/L时的活力,差异有统计学意义(t=-26.44,P<0.01),部分细胞形态呈细长梭形,折光性发生改变,并出现一定数目未贴壁的悬浮细胞(图2 E)。
注:黑点表示细胞活力均数,短垂线表示标准差,*表示与TCE浓度为0 mmol/L时细胞活力比较,P<0.01
注:A—TCE浓度为0.00 mmol/L;B—TCE浓度为0.50 mmol/L;C—TCE浓度为2.00 mmol/L;D—TCE浓度为8.00 mmol/L;E—TCE浓度为10.00 mmol/L
2.2 TCE暴露浓度与细胞内MDA水平的关系
不同浓度TCE染毒组间MDA水平差异有统计学意义(F=13.51,P<0.01);随着TCE浓度增高,MDA水平呈上升趋势(β=20.59,P<0.01)。进一步两两比较,当TCE浓度为2.00、4.00、8.00 mmol/L时,MDA水平高于TCE为0.00 mmol/L时的水平,差异均有统计学意义(t=163.26,150.24,140.10,均P<0.01)。见表1。
2.3 TCE暴露浓度与细胞内GSH水平的关系
不同浓度TCE染毒组间GSH水平差异有统计学意义(F=26.03,P<0.01);随着TCE浓度增高,GSH水平呈下降趋势(β=-0.98,P<0.01)。进一步两两比较,当TCE浓度为2.00、4.00、8.00 mmol/L时,GSH水平低于TCE为0.00 mmol/L时的水平,差异均有统计学意义(t=-7.49,-7.31,-8.03,均P<0.01)。见表1。
2.4 TCE暴露浓度与细胞内HSP 70水平的关系
不同浓度TCE染毒组间HSP 70水平差异有统计学意义(F=12.13,P<0.01);但随着TCE浓度增高,HSP 70水平无明显变化趋势。进一步两两比较,TCE浓度为0.25 mmol/L时,HSP 70水平高于TCE浓度为0 mmol/L时的水平,差异有统计学意义(t=22.66,P<0.05)。见表1。
注:TCE—三氯乙烯;MDA—丙二醛;GSH—谷胱甘肽;HSP70—热休克蛋白70。与TCE染毒浓度为0.00 mmol/L组比较,aP<0.05,bP<0.01。
3 讨论
Hep G2细胞与原代肝细胞相比易于获得和培养,并且保留了生物转化过程中的I相和II相酶。虽然它在代谢酶的水平和活力方面与原代肝细胞存在一定差距,但先前HU等[6]的研究表明,用TCE染毒Hep G2细胞研究相关作用机制是可行的,因此,本研究用Hep G2细胞作为体外模型探讨TCE在不显著影响细胞活力情况下对机体的氧化损伤,以及细胞内HSP 70在TCE所致氧化损伤中的可能作用。研究结果显示,细胞内MDA和GSH水平随TCE暴露浓度增高分别呈上升和下降趋势,而细胞内HSP 70水平则未随TCE浓度升高呈明显趋势变化。
TCE通过机体代谢形成以三氯乙酸、三氯乙醇、水合氯醛、S-二氯谷胱甘肽为主的大量产物[7,8],TCE及代谢产物可能具有多种不同的作用模式,因此,TCE的毒作用机制十分复杂。研究表明,氧化应激可能是TCE发挥毒作用的重要途径。例如文献[9,10,11]表明氧化应激及氧化代谢产物可能介导TCE所致肝毒性反应和肝损伤。TCE引起氧化应激水平增高还与抗核抗体、抗DNA单链/双链抗体水平升高有关[12]。本研究用脂质过氧化损伤指标MDA和抗氧化指标GSH反应细胞氧化应激水平,结果显示细胞脂质过氧化水平增高而抗氧化能力降低,说明TCE在不显著影响细胞活力情况下即可导致细胞发生氧化应激,并且TCE暴露浓度与氧化应激水平呈剂量—效应关系。
TCE引起的氧化应激不仅导致细胞发生脂质过氧化损伤,而且导致蛋白质分子羰化和硝化[13],脂质过氧化损伤产生的醛类如MDA又能与蛋白质形成加合物,影响细胞的正常功能。当机体发生应激反应时HSP能帮助细胞维持稳态,在冠心病、癌症、败血症等疾病和衰老中均发现HSP水平升高与氧化应激有关[14]。BARTOSIEWICZ等[15]用基因芯片筛查的方法发现TCE特异性引起HSP基因表达上调。HSP可能通过降低脂质过氧化引起的蛋白变性,以及辅助蛋白酶降解羰化和硝化蛋白而减轻TCE导致的肝细胞损害和自身免疫反应等。目前为止,HSP在TCE所致氧化应激中的作用尚无研究报道。本研究首选在细胞内表达量丰富、功能重要的HSP 70为研究对象,结果发现,随着TCE浓度增高HSP 70水平与对照组比较无显著差异。根据结果认为,在细胞活力未受显著影响的情况下HSP 70可能不参与TCE所致氧化应激反应,HSP 70在TCE浓度为0.25 mmol/L时升高可能是毒物兴奋效应。
综上所述,在本研究TCE暴露水平范围内,细胞脂质过氧化水平增高而抗氧化能力降低,HSP 70可能不参与这一过程。但不排除细胞内其他重要应激蛋白如HSP 60、HSP 90等可能参与较低水平TCE引起的氧化应激反应,我们将在后续实验中进一步探索这些蛋白的作用。
作者声明
热休克蛋白70 篇7
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级雄性Wistar大鼠39只,体重200～250 g,购自中国科学院上海实验动物中心。
1.2 实验药品
乌司他丁(Ulinastatin,UTI)50 000 U/支,广东天普生化医药股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 动物模型的制备与分组
39只Wistar大鼠,分为3组:假手术(sham)组9只,ALI组15只,乌司他丁(UTI)组15只。本实验参照文献[4]的方法,以大鼠盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症模型。以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定,腹正中切开1.5 cm长的切口,在盲肠根部结扎,用18号针在游离端穿通2次,轻挤出少量肠内容物,留置2 cm皮瓣防止针孔闭合,送回盲肠于腹腔,缝合切口,术毕皮下注射生理盐水30 mL/kg抗休克。UTI组于造模前30 min腹腔注射UTI(20 000 U/kg),ALI组于造模前30 min腹腔注射生理盐水2 mL。在假手术后6、12、24 h这3个时间点sham组分别处死大鼠3只,ALI组和UTI组分别处死大鼠5只。
1.3.2 标本的制备
分别于各时间点取抗凝腹主动脉血0.5 mL,行动脉血气分析,测定大鼠动脉血氧分压(PaO2),取每只大鼠左肺上叶测定肺组织湿/干重比值(W/D),取右下肺组织置于-80℃保存,用于测定肺组织中的HSP70 mRNA含量。另取左肺下叶置于10%中性甲醛溶液中固定,制成病理切片,采用苏木精-伊红(HE)染色。
1.3.3 实时荧光定量PCR
(realtime-PCR)检测肺组织HSP70 mRNA含量取肺组织50 mg,按Trizol法常规提取细胞总RNA并反转录合成cDNA,进行实时PCR扩增(Stratagene M×3 000实时荧光定量PCR仪)。HSP70引物序列:上游5′-GCA CCA GCA GCC ATC AAG AGT-3′,下游5′-GTG TGC AAG CCG ATC ATC AGC-3′,扩增产物为180 bp。HSP70实时PCR条件:95℃3 min,95℃30 s,60℃30 s,72℃45 s,共32个循环。所有待检标本每组设3个平行孔,各重复3次。标准化HSP70基因的表达量为各标本HSP70基因CT值与相应内参基因β-actin CT值的差值。
1.4 统计学方法
应用SPSS 11.0软件包分析,计量资料数据以均数±标准差表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动脉血气分析变化
ALI组大鼠动脉血氧分压(PaO2)随CLP术后时间的延长而降低,与sham组比较,显著降低(P<0.05),UTI组PaO2各时间点较ALI组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
注:与sham组比较,*P<0.05;与ALI组比较,#P<0.05
2.2 肺组织湿/干重比值(W/D)比值变化
ALI组大鼠W/D比值随CLP术后时间的延长而上升,较sham组显著升高(P<0.01),UTI组治疗后W/D比值明显低于ALI组同时间点,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
注:与sham组比较,*P<0.05;与ALI组比较,#P<0.05
2.3 肺组织的病理形态学变化
sham组大鼠肺组织结构完整,肺泡腔清晰,肺间质无水肿、无炎症,且各时间点无明显差异。ALI组大鼠造模后6 h可见肺泡内水肿渗出,伴有出血及炎症细胞浸润,随时间的延长病变程度加重,至造模后24 h可见肺泡隔增宽,肺泡内严重的充血、出血及肺间质见大量炎性细胞浸润。UTI组大鼠肺组织病理变化较ALI组轻,造模后6 h可见部分肺泡内少量水肿渗出伴有少量出血,至造模后24 h可见大鼠肺泡隔略有增宽,部分肺泡内见渗出、水肿、出血,肺间质见少量炎症细胞浸润,见图1。
2.4 肺组织HSP70 mRNA的表达
ALI组大鼠肺组织HSP70 m RNA的表达水平随着CLP术后时间的延长显著升高(P<0.05),至CLP术后12 h达到高峰。UTI组大鼠各时间点肺组织HSP70 m RNA的表达水平又显著高于ALI组(P<0.05)。见表3。
注:与sham组比较,*P<0.05;与ALI组比较,#P<0.05
3 讨论
脓毒症常见的并发症为ALI,其病理特征是肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤,中性粒细胞在肺内聚集,表现为广泛的肺水肿和微小肺不张,临床上表现低氧血症[5]。本实验采用较经典的盲肠结扎穿孔(CLP)制作大鼠脓毒症性ALI模型。实验研究发现,ALI组大鼠动脉血氧分压(PaO2)随着时间的延长而下降明显,W/D比值随着时间的延长而增高。同时光镜下观察发现,ALI组大鼠造模后6 h可见肺泡内水肿渗出,伴有出血及炎症细胞浸润,随时间的延长病变程度加重,至造模后24 h可见肺泡隔增宽,肺泡内严重的充血、出血及肺间质见大量炎症细胞浸润。
HSP是一具有多个成员的蛋白质家族,根据分子量的大小可以分为多个亚家族,其主要功能与蛋白质代谢有关。在各种应激反应中防止蛋白质变性、聚集,对细胞具有保护作用。其中HSP70与肺脏生物学关系较为密切,是HSP中最保守的一族,在细胞应激后生成最为显著,提高机体组织对各种应激损伤的耐受性。HSP70主要是作为分子伴侣,参与蛋白质的折叠、组装和转运,清除细胞内变性的蛋白质,稳定细胞结构[6]。有研究发现,脓毒症大鼠进行呼吸机正压通气导致机械张力可诱导肺组织HSP70的表达增加,改善肺损伤[7]。将载有HSP70的腺病毒基因注入动物体内可缓解ARDS的进展[8]。HSP70可能通过多种机制防止肺损伤的发生和发展:(1)抗炎症,使炎症介质的产生减少,抗炎细胞因子的表达增加;(2)抗氧化,可抑制氧阴离子的生成,直接或间接地促进释放自身的抗氧化酶,提高抗氧化酶类的活性;(3)调节细胞内蛋白的修复与合成,减轻应激或损伤刺激引起的细胞膜蛋白的变性,保护细胞蛋白质r RNA及DNA的合成途径免受损伤;(4)抗细胞凋亡,上调细胞内Bcl-2的表达[9,10]。本实验结果显示,ALI组大鼠各时间点肺组织HSP70 mRNA表达水平较sham组显著升高,至CLP术后12 h达到高峰,后开始下降。
UTI是一种广谱的蛋白水解酶抑制剂,对多种蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用,具有抑制过度的炎症反应、改善休克时组织循环与器官灌注、对溶酶体酶具有稳定作用。UTI在过度炎症反应、缺血和缺氧等造成的心、肺、肝、肾等组织细胞损害中具有保护作用。有研究表明,UTI可作用于ALI的早期环节,在转录水平通过P38MARK信号通路抑制TNF-α,改善促炎性介质/抗炎性介质失衡状态,减轻LPS诱导的ALI[11]。另外,UTI可以抑制肺泡内皮细胞表面蛋白质的分解,减小肺毛细血管的通透性[12]。临床上运用UTI治疗ALI/ARDS综合征患者,可以改善患者通气功能,减轻肺水肿,显著缓解患者的缺氧状态,减少多脏器功能衰竭的发生[13]。本实验结果显示,应用UTI治疗后,UTI组大鼠各时间点PaO2较ALI组上升,增高的W/D比值下降,HSP70 mRNA表达显著增加,同时肺组织病理形态学表现均有明显改善。提示UTI可能通过上调HSP70的表达,改善脓毒症大鼠肺组织的损伤。