β"氧化铝（精选3篇）
β"氧化铝 篇1
引言
近年来,人们发现β-偏磷酸钙(β-Ca(PO3)2,简称β-CMP)材料具有高力学强度和良好的生物相容性。玻璃熔体结晶法制备偏磷酸钙晶须主要是利用磷酸盐玻璃结晶形成β-Ca(PO3)2的特性,以及超磷酸钙玻璃的化学不稳定性,将玻璃体在一定温度下结晶,再采用浸渍方法使不稳定的可溶性玻璃与晶体分离。有学者认为采用TiO2,SiO2,Al2O3,CeO2作为晶核促进剂能够显著降低固相反应活化能,除去偏磷酸钙的玻璃光泽,使磷酸盐玻璃的机械性能和生物相容性得到提高[1]。以磷酸二氢钙为主要原料,Melba Navarroa[2]等选用CaCO3,NH4H2PO4,Na2CO3和TiO2为原料在1350℃下熔融,然后把混合物注入已在530℃预热的金属模中,随后使玻璃缓慢退火,制成钙磷酸盐玻璃多孔支架材料。由于玻璃熔体结晶法制备的β-Ca(PO3)2纤维含有微量的Ca2P6O17,所以可直接将β-偏磷酸钙纤维粉末压制成型,在高温下烧制成高强的多孔磷酸钙陶瓷,其孔隙率可大于60%,且具有较大的应变。陈琳等[3]研究了原料钙磷比,热处理,碱液浸渍对制备β-CMP的影响,表明在钙磷比为0.85,热处理时间和洗滤时间分别为36和48小时的实验条件下可以得到主晶相为β-Ca(PO3)2的陶瓷晶须。
动物植入及组织培养研究表明,偏磷酸钙具有良好的生物相容性,亦未发现毒性反应,其降解产物经三羧酸循环代谢[4]。Sungsu Chun等[5]对比了无定性态和晶态CMP在人体模拟体液中浸泡3周的降解性能,从样品的重量损失结果知道晶态CMP的降解速度远小于非晶CMP。Hollinger等[6]把多孔偏磷酸钙陶瓷异位植入无胸腺小鼠皮下组织,材料降解过程中,细胞增殖分化良好,且能成骨,认为偏磷酸钙材料是一种有应用前景的组织工程支架材料。偏磷酸钙晶须增强聚左旋乳酸材料具有良好的力学性能[7],但在以前的实验研究中发现如何提高产品中β-CMP的产率是一个难题。本试验以氧化铝作为主晶核剂,研究它对β-偏磷酸钙晶须的含量、成分和形貌的影响,以及对制备过程的贡献,试图寻求适合β-偏磷酸钙晶须生长的晶核促进剂,提高产率。
1 实验
所有化学试剂均为分析纯,应用时不需要进一步纯化。
1.1 玻璃熔体结晶法制备偏磷酸钙晶须
将CaCO3,Ca(H2PO4)2,H3PO4和晶核剂按钙磷比(n(CaO):n(P2O5))为0.85在刚玉坩埚中混合均匀,在1150℃下保温1h,然后把熔融物迅速浇到石墨上冷却得到玻璃体。将收集到的玻璃体置于电阻炉中,在690℃(玻璃体的非晶态-晶态转变温度,由DSC测试确定)条件下热处理48h后研磨成粉末。采用40℃的0.1mol/LNaOH溶液浸泡粒径范围为65.5μm~111μm的粉末40h,取出后用去离子水洗涤、干燥后得到含β-偏磷酸钙晶须的粉末样品。
采用α-Al2O3作为晶核剂,控制加入量分别为4%(质量百分比含量,以下同)、7%、10%,所得样品编号分别为A4、A7、A10。由于TiO2作为添加剂可以降低氧化铝的熔点,能与氧化铝复配形成复合晶核剂,按4%Al2O3-2%TiO2、4%Al2O3-1%TiO2添加到原料中,所得样品编号分别为A4-T2、A4-T1。
1.2 偏磷酸钙晶须的表征
X射线荧光光谱仪(XRF,S4 Explorer,德国Bruker AXS公司)分析样品元素含量。NICOLET6700型红外光谱分析仪测试样品成分。采用扫描电镜(SEM,JSM-6301F,JEOL)表征样品形貌。
2 结果与讨论
2.1 Al2O3晶核剂对制备晶须的影响
分别采用4%、7%、10%Al2O3为晶核剂添加到原料中,得到的样品经X-射线荧光光谱仪检测,将元素含量折算为化合物含量后其结果如表1,其中空白样为不添加晶核剂样品。
α-氧化铝属于三方晶系(),偏磷酸钙单斜晶系有差异()。当氧化铝的质量百分含量为4%时,粉体能有效的被磷酸溶液润湿,良好的分散性能确保晶核剂与其它原料的表界面充分接触,以便在熔融过程中发挥晶核作用,促进磷酸钙盐晶体的形核和生长,从而提高β-偏磷酸钙的产率。实验发现当氧化铝的质量百分含量为4%时,样品的β-偏磷酸钙含量比A7样品高约9%。张淑霞等[9]曾报道当玻璃体达到钙磷比值为1∶1时,玻璃相含量较多,并呈现连续的基体,使彼此孤立的晶相均匀地分布其中,此时容易实现晶须同玻璃的分离。由于β-Ca(PO3)2的钙磷比为0.5,所以如果粉末样品的钙磷比值接近0.5则可推测产物中的偏磷酸钙含量较高。A4样品的钙磷比为2.50,是化合物钙磷比值的5倍,表明在此制备条件下中含有部分含钙化合物杂质。提高晶核剂百分含量后,A7的钙磷比值进一步增加为A4的1.08倍,说明此时产物收率下降。
表1中A10样品的铝元素含量为2.24%,分别比A4和A7的对应的含量值高出1.18、0.68个百分点,同时钙磷比值上升很快,远高于A4、A7和空白试样的值。高铝含量的原料配比造成了β-CMP含量的迅速下降,主要原因在于氧化铝热稳定高,当过量的氧化铝粉体包裹在钙-磷混合物表面时会阻挡热流充分作用于原料,使钙磷玻璃的结晶化过程受阻,结果显示高浓的氧化铝固体氛不利于钙磷玻璃体化。
图1a是加入氧化铝前空白样品的傅立叶红外光谱图,在3431.5cm-1处出现的吸收峰为典型的羟基吸收峰。β-CMP在图中1065cm-1附近出现了磷酸盐基团的特征峰,而在940cm-1、562cm-1处的吸收峰对应于PO43-离子的特征峰。图1b和图1c分别为添加氧化铝晶核剂后所得A4、A7的FT-IR图谱。由于偏磷酸钙中含有P-O-P,所以在图1b、图1c中波数为1067~941cm-1之间均出现强谱带,表明偏磷酸钙的生成,并且能够通过振动峰的强弱初步判断粉末中偏磷酸钙的含量,进一步证实了A7中β-偏磷酸钙的产率比A4低。
采用4%Al2O3、7%Al2O3和10%Al2O3作为晶核剂制备的粉末样品的SEM照片如图2。已报道的研究表明,在晶核促进剂的晶型与β-Ca(PO3)2晶型相似条件下,晶须容易形成,而且微观形貌也会随晶核剂种类不同而发生改变。
本研究采用4%Al2O3作晶核剂,控制热处理时间为48h时,从图2a中发现在片层状物质中出现了晶须形貌特征明显的晶体,观察其直径大约3μm,长度约为25μm。图2b是样品A7的形貌照片,对比图2a发现不仅晶粒的长度显著减小,并且微观形貌已经由条状变成四方体颗粒状,表明A7已不是晶须,不能有效起到晶须的增强作用。之前已得出,加入4%Al2O3晶核剂与加入7%Al2O3晶核剂的钙磷比值相差0.08倍,但检出的铝元素折算为氧化铝含量后有较大差别,前者约为后者的70%,估计这一点是导致晶须形貌、数量差异的主要原因。由于高温固相反应的复杂性使得产物中含有较多杂质,所以在图1的红外光谱中因为P-C的伸缩振动而引起的多个强吸收峰在790~681cm-1范围内出现。
图2c为添加10%Al2O3晶核剂所得产物A10的SEM照片。从图中明显看到无晶须生成,整个试样上零星分布一些杂碎的块体,估计在固相反应过程中过量的氧化铝包覆在玻璃体表面,致使玻璃的结晶化进程变得缓慢,最终阻碍晶体的形核和长大,也就不可能在这种条件下制备晶须。在试验中发现淬冷的A10玻璃体为乳白色不透明固体,表明已明显发生结晶化。当玻璃相含量较少时,玻璃分布于晶体网架之间,晶体之间易形成化学键,呈现团聚状,难以得到分散的纤维,不利于纤维间的分离。不同配方的玻璃,在结晶化温度相同时,随着α-Al2O3含量的增大,玻璃化倾向显著降低。
以4%Al2O3为晶核剂,分别热处理32h、16h后取样以观察钙磷玻璃体的晶化过程。图2d是热处理32h时的SEM照片,从中发现在直径约为10μm的粗大的长条块体上面长出少量长径比为4~8的晶须。缩短热处理时间到16h样品的扫描电镜照片如图2e,图中几乎没有完全成形的晶须,但仔细观察时发现在起伏不平的玻璃表面上有一些纤维状露头,表明晶体已开始形核。所以偏磷酸钙晶须的生长历程分为:形核→长大→成形三个阶段,符合一般晶体材料的生长机制。
2.2 Al2O3-TiO2复合晶核剂对制备晶须的影响
TiO2是一种多晶型化合物,其质点呈规则排列,具有格子构造。它有三种结晶形态:板钛型、锐钛型和金红石型,本试验采用金红石型TiO2。二氧化钛促进玻璃晶化的机理有两种:一种是通过分相形成成分富集区;另一种是直接从玻璃中析出金红石晶体作为主晶相的异质形核基底。
使用XRF测试复合晶核剂配比对元素含量的影响结果见图3,以4%Al2O3-2%TiO2为晶核剂生成的样品钙磷比为2.24,表明在复合晶核剂条件下晶须钙磷比相对于单独使用氧化铝时低。分析其原因,一方面是四方晶系的TiO2能与三方晶系的Al2O3互配,比单一的Al2O3诱导晶须形成的能力更强,加速钙磷玻璃体转变为β-Ca(PO3)2,促进结晶过程;另一方面在于TiO2的晶格常数与Al2O3接近,并且二氧化钛为变价氧化物,由于变价作用,使Al2O3产生缺陷,活化晶格,能与氧化铝形成固溶体,致使高温固相反应更均匀、完全。图3中Ca和P元素含量均随TiO2含量减少而降低,说明二氧化钛会干扰晶须的生长过程,使用1%TiO2与氧化铝复合时的诱导作用比2%TiO2时弱。
TiO2是通过分相而促进玻璃晶化的,分相形成的玻璃区域粘度小,扩散激活能低,原子易于迁移,从而使得磷酸钙系晶体在这些区域首先成核并长大。从图3中可以得出,加入A4-T1复合晶核剂生成的晶须中钙磷比为2.66,比使用A4-T2复合晶核剂时的钙磷比高,说明产物中含有更少的β-Ca(PO3)2。
将2%TiO2和4%Al2O3复合后添加到原料中,得到的粉末样品A4-T2的SEM照片如图4。从图4中发现采用复合晶核剂时,棒状磷酸钙系晶须的长度大约为20μm,长径比接近10。与A4相比较两者的形貌差别不大,但实验发现A4-T2制备时玻璃熔体的流动性变好,这说明在相同的玻璃化转变条件下,二氧化钛能够起到一定的促熔作用。如果继续增大Ti O2含量时,固相熔融温度增加,熔体变得黏稠,使试验操作困难。氧化铝与二氧化钛的配比对熔融体的微观结构和反应机理的影响还需要进一步试验研究。
3 结论
采用4%α-Al2O3作晶核剂时,能够生成β-偏磷酸钙含量为32.52%的晶须材料,随着原料中氧化铝含量的增加,玻璃化倾向显著降低,产物中的β-Ca(PO3)2含量减少。将2%TiO2与4%Al2O3互配形成复合晶核剂,二氧化钛起促熔作用,加速钙磷玻璃体转变为β-Ca(PO3)2,促进结晶。
参考文献
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β"氧化铝 篇2
关键词：钛合金,阳极氧化,纳米形貌,成骨细胞,细胞附着
纯钛和Ti- 6Al- 4V是目前临床应用最广泛的骨种植体材料,然而它们的弹性模量远大于骨组织,容易造成种植体界面应力屏障。此外,Ti- 6Al- 4V中铝(Al)和钒(V)的潜在毒性令人担忧。Ti- 5Zr- 3Sn- 5Mo- 15Nb (TLM)为近β钛合金,其弹性模量较纯钛和Ti- 6Al- 4V低且不含Al和V,弹性模量、强度及可塑性等机械性能匹配优于其它已报道的β钛合金[1],前期试验已证明其有较好的生物相容性[2],有望成为新一代骨植入材料。为了进一步提高骨种植体的骨结合性能,学者们尝试不同的方法对种植体进行表面修饰,希望提高其与骨组织的结合。材料表面性质如表面形貌等对材料的生物活性有较大影响,近年来的研究表明纳米级的表面形貌可能更有利于促进材料的骨结合[3]。阳极氧化可以在材料表面形成一层垂直于表面的有序排列的纳米管阵列,且所形成的纳米管的相关参数如管径、管长等可通过调节氧化电压、氧化时间、电解液浓度等条件来控制,是一种在材料表面生成纳米级形貌的简单、快捷、廉价的方法。国内已有相关研究发现阳极氧化可以改善钛合金的生物相容性和生物活性并赋予钛合金一定的骨传导性[4]。本试验在2 个不同电压下对TLM进行阳极氧化处理,观察表面形貌、晶相及表面能的变化,以及这些表面特性变化对成骨细胞在TLM表面附着的影响。
1 材料方法
1.1 试样制备
TLM试样(10 mm×10 mm×0.6 mm,西北有色金属研究院提供)共66 个,表面用碳化硅砂纸800号至1 500号顺序抛光。阳极氧化处理之前试样依次采用丙酮、乙醇及去离子水各超声清洗15 min, 空气中干燥。阳极氧化电解液成分为0.5% 氢氟酸,阴极采用铂电极,电源为直流电源(DH1719A,北京大华无线电仪器厂),试样室温下阳极氧化处理30 min。根据所采用电压不同,试样分为3 组,每组22个试样。抛光组:作为对照; 5 V组:阳极氧化电压为5 V;20 V组:阳极氧化电压为20 V。阳极氧化后,试样依次用丙酮、乙醇及去离子水各超声清洗15 min,然后在马弗炉中450 ℃退火,退火后再次超声清洗。接种细胞前紫外线照射灭菌30 min。
1.2 试样表面特性分析
采用场发射扫描电子显微镜(FE- SEM,JSM- 6700F, Jeol公司,日本)观察TLM的表面形貌,每组3个试样。用X射线衍射仪(Siemens D- 500 diffractometer,西门子公司,德国)分析TLM的表面晶相,每组3个试样。通过测量去离子水和二碘甲烷在材料表面的接触角,对材料表面的分散成分、极化成分及表面能进行计算分析。室温下每种液体滴10 μl在TLM试样表面,接触角度用接触角测量系统及其配套软件(EasyDrop Standard,Kruss公司,德国)采集图像并进行分析测量,然后用Owens- Wendt- Rabel- Kaelble法计算表面能,每组8 个试样。
1.3 细胞培养
成骨细胞由胰酶-胶原酶连续消化新生1 d SD大鼠头盖骨获得。机械方法轻柔地去除头盖骨表面及骨缝处的软组织。为了降低成纤维细胞污染,骨片先用胰酶消化60 min并弃上清。细胞培养液为DMEM、100 ml/L新生牛血清(Gibco公司,美国)、10 ml/L青霉素、10 ml/L链霉素。成骨细胞表型由ALP及矿化结节染色验证。37 ℃、50 ml/L CO2 湿润条件下培养,2～5 代用于细胞实验。
1.4 细胞附着试验
TLM试样置于24 孔培养板内(Corning Costar公司,美国),每组8 个试样,细胞接种密度为2×104 /孔,细胞培养液为1 ml。细胞接种30、 60、 120 min后,PBS漂洗2 次洗掉未附着的细胞。细胞用95%乙醇固定,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后在荧光显微镜下随机选择4 个视野拍片,进行细胞计数。
1.5 统计学分析
采用SPSS 14.0统计软件进行数据处理,用方差分析和SNK检验比较组间差别,取α=0.05。
2 结 果
2.1 试样表面形貌
各组TLM试样的表面形貌如图1所示。抛光TLM表面光滑,经阳极氧化处理后表面形成纳米多孔结构。当阳极氧化电压为5 V时,表面形成多孔结构,孔径8.0～12.0 nm,孔隙邻接紧密;当电压升高到20 V,表面形成较疏松分布的管状结构,管径80～100 nm,管壁厚6～9 nm,管间隙较大约40～60 nm。
a: 抛光组; b: 5 V组; c: 20 V组
2.2 试样表面晶相
试样表面晶相分析结果如图 2所示。可以看到退火处理后20 V阳极氧化TLM的谱线有明显的锐钛矿波峰,表明其表面二氧化钛晶相为锐钛矿。而退火处理的5 V阳极氧化及抛光TLM的XRD谱线上未见明显的锐钛矿波峰。
2.3 试样表面能
表 1列出了各组试样表面2 种液体的接触角,以及根据其算出的表面能。可见20 V阳极氧化组的水接触角最小, 5 V组居中,抛光组最大。而表面能结果显示20 V组的总表面能、分散成分和极化成分均高于其他组, 5 V组略小,抛光组最小,但它们之间的差异不明显。
2.4 成骨细胞在试样表面的附着
大鼠成骨细胞在TLM表面的附着结果如图 3所示。在3 个检测时间点上,所有经阳极氧化处理的TLM试样表面的细胞附着数量均高于抛光试样表面,但只有20 V组与抛光组的差异有统计学意义(P<0.05)。 在30 min时,不同电压阳极氧化表面的细胞附着数量无差异(P>0.05);在60和120 min时,阳极氧化20 V组表面的细胞附着数量均显著高于5 V组(P<0.05)。
*P<0.05 vs抛光组; # P<0.05 vs 5 V组
3 讨 论
种植体的松动脱落多数是因为种植体骨诱导能力差,致使骨结合不良,骨组织结构单元的大小为几十个纳米,而许多临床应用的种植体组成单元的尺寸为微米级,其表面形貌在纳米级水平几乎是光滑的,这可能致使纤维性骨痂形成从而影响骨组织与种植体的结合[4]。为了解决以上的问题,使种植体更好地模拟生物体骨组织的特点,促进骨与种植体结合,学者们将更多的目光投到了纳米结构表面。所谓纳米结构是对表面结构形貌或材料组成单元的尺寸至少一个方向上在1～100 nm之间的一类材料的总称。对于金属种植体来说,在其表面制备纳米级形貌有利于保持金属的机械性能,是较为可取的方法,所以越来越多的研究者致力于如何在种植体表面构建更利于骨结合的纳米形貌。
3.1 阳极氧化对TLM表面形貌改变的影响
在众多的用于种植体表面的纳米结构中,二氧化钛纳米管是目前的一个研究热点。二氧化钛纳米管的制备设备简易,方法简单,而且纳米管的管径和管长可较精确控制。目前对二氧化钛纳米管的形成机制已经有较清楚认识。开始阳极氧化后,材料表面快速生成一层致密的氧化膜阻挡层,随着电场强度急剧增大,在F-离子和电场的共同作用下发生随机击穿溶解、逐渐形成分布均匀的小孔,孔与孔的交界处有小坑,小孔与小坑均不断地向下溶解,这样未发生溶解的氧化膜就逐渐形成纳米管的管壁,而纳米管的变长实际上是氧化层不断向钛基体推进的结果[5]。电压是影响阳极氧化过程的一个重要因素。目前的研究结果表明只有一定范围的氧化电压才能制备出纳米管,这个电压范围被称为电压窗口(potential window)[6]。本实验电镜观察结果显示5 V组试样表面形成的并非典型的管与管之间分隔明显纳米管结构,而是纳米孔结构。5 V组试样表面形成的纳米孔的孔径小于20 V组试样表面形成的纳米管的管径,说明随着阳极氧化电压的升高,电场强度增大,氧化溶解加剧,从而使得纳米管的管径也随之增大。
3.2 阳极氧化对TLM表面性能的影响
XRD结果显示在空气中450 ℃退火1 h 后,20 V组试样表面二氧化钛转化为锐钛矿,这与以前的文献报道是一致的[7]。而5 V组和抛光组表面未检测到锐钛矿晶相,其原因可能是它们表面氧化钛层较薄,XRD不能检测到。但由于所有试样退火条件完全一致,所以可以推测这2 种试样表面的二氧化钛也应该是锐钛矿相。据报道锐钛矿在模拟体液中可以促进钙磷复合物的沉积,因此可能具有更好的骨诱导能力[8]。
接触角及表面能分析结果与已有文献的报道规律一致,阳极氧化组的表面能明显大于抛光组,原因可能是表面的孔隙增大了材料表面的润湿性;另外,20 V阳极氧化组的表面能略大于5 V组,这可能与表面微孔或微管的直径有关[9]。
3.3 阳极氧化对成骨细胞在TLM表面早期附着的影响
种植材料在植入生物体内后会与周围组织发生一系列的相互作用,其中较早发生的细胞在材料表面的附着对于之后的材料与组织结合过程具有重要影响[10]。细胞的早期附着受到材料表面性能的影响,如表面能[11]和表面形貌[12]等。但至今为止,哪种表面特性对细胞在材料表面附着过程起决定性的影响及其具体机制尚不明确。本试验结果显示原代成骨细胞在TLM 20 V阳极氧化组的纳米管表面附着的数目明显高于5 V组和抛光组,而5 V组和抛光组无明显差异。目前关于纯钛表面阳极氧化后纳米管的细胞相容性的报道是不一致的,这些试验中所用的成骨细胞的表型不同可能是结果不一致的一个原因。本课题组之前的实验发现,纯钛经5 V和20 V阳极氧化处理后其表面能较抛光表面大幅提升,但原代成骨细胞在这三者表面的附着差异却无显著性[13]。因此我们推测,细胞在纳米材料表面的附着与材料表面能大小相关性较小而更多的与表面形貌相关。在本实验中,5 V阳极氧化组纳米孔表面的总表面能和分散、极化成分虽都只是略小于纳米管表面、大于抛光表面,但成骨细胞在其表面的早期附着与抛光表面没有差异,且在60、120 min 2 个时间点显著低于纳米管表面。而且5 V阳极氧化TLM表面与同样处理的纯钛表面的表面形貌十分相似,其细胞早期附着与纯钛表面5 V阳极氧化组的结果也一致,均与对照组相比无明显差异[13]。本实验中TLM表面在20 V阳极氧化后与纯钛在相同条件下20 V阳极氧化之后所形成的纳米管形貌有很大不同。TLM表面氧化钛纳米管分布稀疏,管间有一定的间距,而纯钛表面二氧化钛纳米管排列紧密,管间几乎没有空隙[13]。对组织基底膜的观察发现基底膜上分布有许多直径大约70～100 nm的小孔,而且这些小孔是稀疏分布的[14]。所以我们认为TLM 20 V阳极氧化组表面稀疏分布的管径为80～100 nm的纳米管相对纯钛表面二氧化钛纳米管能更好地模拟生物体内的细胞环境,所以细胞在其表面的早期附着数量较多。
4 结 论
β"氧化铝 篇3
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级健康新生SD大鼠10只，雌雄不限，实验动物合格证号：SCXK（京）20043008，使用许可证号SYXK（京）20040012，由中国医学科学院药物研究所动物实验中心提供。
1.2 实验试剂
二苯基溴化四氮唑（MTT）均购自美国Sigma公司，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠微管相关蛋白2多克隆抗体购自美国Chemicon公司；β-TublinⅢ单克隆抗体购自美国Sigma公司；Hoeschst33258购自北京中杉金桥生物技术公司；FITC-Annexin-V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京碧云天生物公司；多克隆兔抗鼠TrkB、Bcl-2、Bax抗体购自美国Abcam公司；兔来源多克隆抗体PGC-1α（Lot#B2510）、SIRT1(Lot#K0309）购自美国Santa Cruz公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。
1.3 大鼠皮层神经元细胞原代培养
大鼠麻醉后取出双侧大脑皮层置于D-hanks培养皿中，解剖显微镜下剥离血管及脑膜。加0.25%胰蛋白酶2 m L,37℃消化5 min。2500 r/min离心2 min，弃上清液。加接种培养液4 mL，反复吹打至细胞分散。10μL细胞悬液调整细胞密度为1×105个/cm3后，接种96孔板中，培养12 h，待细胞贴壁后更换为神经元细胞培养基。每3天换液1次，培养7 d后备用。培养过程中采用倒置相差显微镜观察细胞培养过程中的形态变化。
1.4 染色神经元细胞鉴定
细胞培养7 d,4%多聚甲醛固定15 min,1%H2O2处理10 min。0.3%Triton X-100透化10 min，封闭液封闭1 h，β-TublinⅢ抗体（1∶50)4°C过夜。FITC标记IgG二抗（1∶200）孵育1 h避光。滴加1∶4000稀释的Hochest 33258 1滴，孵育5 min。荧光显微镜下观察神经元细胞鉴定染色结果。
1.5 神经元细胞分组
神经元细胞分组处理：空白对照组（在培养基中加入终浓度为0.1%的DMSO作用48 h);Aβ25～35组（在空白组处理基础上加入Aβ25～35，使其终浓度为20μmol/L，诱导细胞24 h);1μg/L BDNF+Aβ25～35组、10μg/L BDNF+Aβ25～35组和100μg/L BDNF+Aβ25～35组（在培养基中分别加入终浓度为1、10、100μg/L BD-NF作用48 h后培养基中加入Aβ25～35，使其终浓度为20μmol/L，与细胞作用24 h);BDNF+siRNA-TrkB+Aβ25～35组，BDNF+siRNA-SIRT1+Aβ25～35组，BDNF+siR-NA-scramble+Aβ25～35组（使用Lipofectamine 2000转染siRNA-TrkB、siRNA-SIRT1、siRNA-scramble 24 h，其余处理同BDNF组）。
1.6 MTT法检测细胞存活率
调整细胞浓度以5×104个/mL接种于96孔板中，同时设定阴性对照孔（即不加细胞按照同步骤处理），每组各细胞孔中加入20μL的MTT溶液（5 mg/L),37℃下培养4 h，弃去上清后，加150μL的DMSO溶液，振荡反应10 min，酶标仪上测定各孔在590 nm处的光密度（OD）值。每组同时设置5个重复孔。各组神经元细胞的存活率（%）=（处理组OD-阴性对照孔OD）/（空白对照组OD-阴性对照孔OD）×100%。
1.7 检测各组细胞凋亡率
取出200μL浓度为1×106个/mL的细胞悬液，FITC标记的Annexin-V和PI各5μL混匀后避光孵育20 min，低速离心收集细胞，150μL PBS重悬细胞，用流式细胞检测仪上样检测各组神经元细胞凋亡率变化。
1.8 各组细胞中MDA含量和SOD活力测定
按照试剂盒说明分别以硫代巴比妥酸法和黄嘌呤氧化酶法测定细胞中MDA含量和SOD活性。
1.9 qRT-PCR检测各组细胞中TrkB、SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax mRNA表达
根据按照GREEN spin组织/细胞RNA快速提取试剂盒步骤提取细胞总RNA。按照Takara RNA PCR Kit(AMY)Ver 3.0说明书操作进行反转录。RT试剂盒将RNA反转录为c DNA，然后以c DNA的第1链作为模板进行PCR扩增。PCR循环反应条件：95°C预变性30 s;95℃5 s,60℃34 s,40个循环。溶解曲线分析：95℃15 s,60℃60 s,95℃15 s。所用引物均由上海生工技术有限公司合成，引物序列见表1。全部反应结束后，FTC-3000实时荧光定量PCR仪附带的分析软件自动分析、计算出样品的△CT值，以比较域值法将其与同一样本内参基因β-actin的ΔCT值比较，即ΔΔCT=待测基因ΔCT值-内参ΔCT值，而检测基因m RNA表达的相对量=2-ΔΔCT。
1.1 0 Western blot检测各组细胞中TrkB、SIRT1、PGC-1α、Bcl-2、Bax蛋白表达
收获各组细胞，加裂解液提取蛋白，BCA法总蛋白定量。调整上样量为25μg总蛋白/样本，上样，电泳，转膜，封闭过夜。封闭完毕后PBS洗膜5次，分别加一抗（所用的一抗稀释比例分别为TrkB抗体1∶1000、SIRT1抗体1∶2000、PGC-1α抗体1∶1000、Bcl-2抗体1∶1000和Bax抗体1∶1000),37℃反应1.5 h,PBS洗膜5次，加辣根过氧化物酶标记二抗，37℃反应1 h,PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR凝胶成像系统依次显影、定影，Quantity One Basic软件分析胶片蛋白条带。
1.1 1 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间比较采用最小显著差法（least significant difference,LSD），以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原代培养皮层神经元形态学观察与纯度鉴定
刚接种时，神经元细胞大多数呈圆球形，悬浮于培养基中；接种6～10 h细胞贴壁，大部分神经元细胞开始发出细丝样突起（图1A）。培养24 h后几乎全部细胞已贴壁，胞体呈圆形或椭圆形，神经元细胞周围有其特有的光晕（图1B）。培养3 d后，神经元呈锥体形或梭形且细胞体积增大，突起增多伸长并增粗（图1C）。培养5 d，神经元胞体明显增大呈锥体形，立体感较前增强，突起增多伸长呈丝带状（图1D）。培养7 d，神经细胞生长良好，胞突主干和分枝明显延长并增粗，其突起形成稠密的神经网络（图1E）。细胞免疫荧光结果显示绿色荧光为神经元β-TublinⅢ染色，可见整个视野内神经元均匀分布，神经元纯度高达95%（图1F）。
2.2 各剂量BDNF对神经元细胞存活率的影响
将空白对照组细胞存活率设定为100.00%，由OD值计算出其他组的相对细胞存活率。Aβ25～35处理使OD值明显下降，与空白对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；不同浓度BDNF升高细胞OD值，各组间差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
注：与空白对照组比较，*P<0.05；与Aβ25～35组比较，#P<0.05；与1μg/L BDNF+Aβ25～35组比较，△P<0.05；与10μg/L BDNF+Aβ25～35组比较，▲P<0.05;BDNF：脑源性神经营养因子
2.3 各剂量BDNF对神经元细胞凋亡率的影响
与空白对照组凋亡率[（7.69±1.46）%]比较，Aβ25～35组细胞凋亡率[（41.94±2.56）%]明显增加；与Aβ25～35组比较，1μg/L BDNF+Aβ25～35组、10μg/L BDNF+Aβ25～35组和100μg/L BDNF+Aβ25～35组细胞凋亡率依次为（32.24±2.52）%、（22.37±2.98）%和（16.37±2.54）%，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
2.4 各剂量BDNF对神经元细胞MDA及SOD含量影响
Aβ25～35组细胞内MDA含量上升，SOD活力下降，差异有统计学意义（P<0.05）。不同浓度BDNF降低细胞MDA含量，升高SOD活力，各组间差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
注：与空白对照组比较，*P<0.05；与Aβ25～35组比较，#P<0.05；与1μg/L BDNF+Aβ25～35组比较，△P<0.05；与10μg/L BDNF+Aβ25～35组比较，▲P<0.05;MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；BDNF：脑源性神经营养因子
2.5 各剂量BDNF对TrkB、SIRT1、PGC-1α、Bcl-2及Bax表达的影响
Aβ25～35降低细胞内TrkB、SIRT1、PGC-1α和Bcl-2mRNA表达和蛋白表达，升高Bax表达，差异有统计学意义（P<0.05）；不同浓度BDNF升高细胞中TrkB、SIRT1、PGC-1α和Bcl-2 mRNA表达和蛋白表达，降低Bax表达下调，各组间差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。
2.6 SIRT1/PGC-1α信号通路参与BDNF保护神经元细胞氧化损伤
BDNF处理减少细胞凋亡率，降低细胞内MDA含量，升高SOD活力，差异有统计学意义（P<0.05）；沉默SIRT1增加细胞凋亡，升高细胞MDA含量，降低SOD活力，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4、图4。
2.7 沉默TrkB阻断BDNF激活SIRT1/PGC-1α信号通路
BDNF上调细胞内TrkB、SIRT1和PGC-1α表达，差异有统计学意义（P<0.05）；沉默TrkB减少TrkB、SIRT1和PGC-1α表达，差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。
与空白对照组比较，*P<0.05；与Aβ25～35组比较，#P<0.05;BDNF：脑源性神经营养因子
注：与空白对照组比较，*P<0.05；与Aβ25～35组比较，#P<0.05；与100μg/L BDNF+Aβ25～35组比较，△P<0.05;MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；BDNF：脑源性神经营养因子
3 讨论
AD发病的氧化应激学说受到越来越多学者的重视[6,7]。氧化应激是各种神经损伤及各种中枢神经系统功能退行性紊乱的最后共同通路，抗氧化损伤成为防治AD的重要策略之一[8]。BDNF是重要的神经保护剂，在神经系统中起着重要作用[9,10]。BDNF在AD模型大鼠海马组织中表达量减少[11]，体外实验证实BD-NF对神经元细胞具有保护作用[12]。研究也证明BDNF能够通过提升心肌细胞抗氧化和清除氧自由基的能力以减轻缺氧/复氧损伤[13]。因此，本研究探讨了BD-NF对Aβ25～35诱导大鼠皮层神经元细胞氧化损伤的影响及作用机制。
MDA作为机体脂质过氧化反应终产物，能够反映细胞受氧自由基损伤的程度，而SOD作为抗氧化酶，其活性高低反映机体抗氧化能力[14]。本研究中发现，Aβ25～35诱导神经元细胞凋亡率增加，细胞存活率明显下降，细胞内MDA含量上升，SOD活力下降，证实离体环境下Aβ25～35诱导神经元细胞氧化损伤。不同浓度BDNF预处理，细胞存活率上升，凋亡率下降，MDA含量逐渐下降，SOD活性上升，并且呈现剂量依赖性关系。这表明BDNF能够通过提升神经元细胞抗氧化和清除自由基的能力以减轻Aβ25～35诱导细胞凋亡。
寡聚态的Aβ可在体内和体外诱导大鼠和小鼠的神经元凋亡[15]。同时有研究表明AD动物中Bcl-2蛋白家族的基因表达发生了改变[16]。Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡的一个关键的调节因素[17]，促凋亡蛋白Bax、Bak等蛋白的激活将进一步直接或间接的钝化抑制凋亡的Bcl-2蛋白[18]。为了探究BNDF抑制神经元细胞凋亡的机制，本研究从转录水平和蛋白水平同时检测了神经元细胞中Bcl-2和Bax基因的表达情况。结果显示，不同剂量BNDF均能够显著升高Bcl-2表达和下调Bax表达来减少细胞凋亡。
SIRT1通过去乙酰化激活很多非组蛋白成分来调节细胞增殖、分化、衰老和凋亡，其中PCG-1α与氧化应激的关系最为密切[19]。本研究提示BNDF能够激活SIRT1/PGC-1α信号通路拮抗氧化应激导致细胞损伤和凋亡，沉默SIRT1表达则拮抗BDNF对Aβ25～35诱导的神经元细胞凋亡的保护作用。TrkB是BDNF的功能性受体，BDNF和TrkB结合后，受体通过二聚体化及胞内激酶特异性酪氨酸磷酸化而激活，发挥各种生理作用[20]。同样本研究结果显示，沉默TrkB表达之后抑制BNDF激活SIRT1/PGC-1α信号通路，降低Bcl-2表达和上调Bax表达。因此，BDNF通过TrkB受体调控SIRT1/PGC-1α信号通路拮抗Aβ25～35诱导的神经元细胞凋亡。
综上所述，BDNF预处理能够减轻Aβ25～35诱导的神经元细胞凋亡，这对临床上采用补充大脑外源性BDNF治疗AD患者提供了理论支持。