DPPH清除率（精选4篇）
DPPH清除率 篇1
药材金银花 (Lonicera Japoneca) 为忍冬科忍冬属植物忍冬及同属植物干燥花蕾或带初开的花, 又称银藤、鸳鸯藤、金藤花等, 自古被誉为清热解毒良药, 其性甘寒气芳香、宣散风热, 具有广泛的保健和医疗作用[1]。植物金银花中含有多种对人体有利的活性成分, 如绿原酸、异绿原酸、肌醇、皂甙及微量元素等, 具有抗炎抗病毒、抑菌防癌的良好功效[2]。金银花提取物是以绿原酸和黄酮类物质为主的化合物, 本身具有的酚羟基结构易与自由基发生反应, 使自由基失去活性, 所以其具有很强的抗氧化特性[3,4]。人们对金银花的活性研究主要集中在提取物的中的绿原酸、木犀草素这两种单独成分上, 而对其他重要成分在总的提取物中所起的作用很少做过相关研究。本试验采用电子顺磁自旋共振技术对不同浓度醇的金银花总提取物的抗氧化作用进行研究, 探讨了5 种不同浓度的醇提取物清除DPPH 自由基的能力, 为进行金银花类的保健品和药品的开发提供技术依据。
目前研究自由基的方法很多, 电子自旋共振法 (electron spin resonance, ESR) 被公认为是最安全有效的方法, 也是唯一可直接检测自由基信号的方法。其原理是借助自旋捕集剂和自由基反应生成较稳定的加合物, 再对加合物进行测定。DPPH 是比较常见的一种自由基, 当其遇到自由基清除剂时, DPPH单电子被夺走而使ESR信号减弱, 从而评价待测样品的抗氧化能力[5]。
1 仪器和材料
1.1 主要仪器
JEOL JEX-RE3X ESR 电子自旋共振仪 (Densi Inc.) , BP211D 电子天平 (artorius 公司) , RE252AA 旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂) 。
1.2 材料
金银花购自佳木斯市金天医药公司, 经阴干处理。1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼, 5, 5-二甲基1-吡啶N-氧化物 (DMPO) , 购于日本东京化成工业株式会社。其余甲醇、乙醇均为分析纯。
2 实验方法
2.1 样品溶液制备
准确称取约5g金银花5份, 分别选取5种浓度的乙醇 (0%、25%、50%、75%、95%) 作为溶剂, 各加入20 倍量上述溶剂, 提取温度为40 ℃, 回流提取3次, 每次2h, 过滤, 合并各滤液, 旋转蒸发仪蒸干、称重, 以适量无水甲醇溶解配成不同浓度的样品溶液, 备用。
2.2 ESR 检测条件
磁场范围 (336±10) mT, 微波功率:5mW, 调制频率9.46Hz, 响应时间0.03S, 扫描时间1min, 增益值1×103, 温度为室温。
2.3 DPPH 自由基测试
2.3.1 DPPH 溶液配制:
称取DPPH 质量约为3mg, 用无水甲醇定容于10mL棕色量瓶中, 密封, 置于4℃冰箱中备用。
2.3.2 空白试验:
取甲醇溶液200μL和DPPH 300umol/L 100μL充分混合后, 吸入石英毛细管内, 再放入谐振腔内, 1min内在上述测定条件下测定DPPH自由基信号, 所有样品均需平行测定3次, 同时记录ESR谱图。
2.3.3 样品溶液DPPH的测定:
精密称取5种不同金银花提取物E1, E2, E3, E4, E5配制不同浓度 (0.10mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL) 。按 "2.3.2" 项下方法, 准确量取不同浓度的样品溶液200μL和DPPH 100μL充分混合后, 从吸入石英毛细管开始, 进行测定DPPH自由基, 记录ESR 谱图, 平行测定3次。
3 结果
3.1 提取物对 DPPH 自由基清除作用
实验中, DPPH 自由基的图谱信号主要有5个峰, 其特征谱线的第3个峰值代表的就是DPPH自由基的浓度, Mn2+的峰高作为外标, 抗氧化剂的加入只会使峰的高度降低, 不会改变形状。通过计算加入自由基清除剂前后第3个峰高和Mn2+峰高的比值, 得到样品清除DPPH自由基的能力, 见图1。而且随着样品溶液浓度浓度的增加, 其ESR 信号强度递减。清除率= [ ( HDPPH/HMn) control - ( HDPPH /HMn ) sample ] / ( HDPPH / HMn ) control ×100 %, 结果见表1和表2。
由上述数据看出金银花不同浓度的醇提物对DPPH具有不同的清除效果。金银花水提取物的清除能力相对较弱, 金银花75%醇提物清除能力相对较强, 在浓度为1.0mg/L时清除率就已达到89.75%。
4 讨论
电子顺磁共振 (EPR或ESR) 因其灵敏度高 (理论值比NMR高230倍) , 对自由基不产生破坏作用, 是目前自由基检测的首选方法[6]。本试验采用ESR 技术测定了金银花不同浓度醇提物对DPPH自由基的清除作用, 结果表明, 金银花不同浓度醇提物能有效清除DPPH 自由基, 清除自由基的活性为:75%醇提取物>95%醇提取物>50%醇提取物>25%醇提取物>水提取物。笔者已通过对金银花不同浓度醇提取物产率及其主要活性成分绿原酸含量进行了研究, 表明金银花水提取物的产率最高、75%醇提取物绿原酸含量最高。所以笔者认为金银花的抗氧化作用可能与其绿原酸的含量有关。本实验研究, 为开发金银花在预防治疗体内自由基过剩引起的各种疾病的药物和保健品提供了思路和理论依据, 可提高金银花的药用价值, 具有广泛的应用前景。
摘要：目的:研究金银花不同醇浓度提取物对DPPH自由基的清除作用。方法:利用不同浓度的乙醇 (0%、25%、50%、75%、95%) 进行回流提取得到5种提取物。通过电子自旋共振 (ESR) 和自旋捕集技术, 以1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基 (DPPH) 体系, 检测金银花不同浓度醇提物清除DPPH自由基的能力。结果:金银花不同浓度醇的提取物, 0%乙醇 (水) 、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇提取物清除DPPH自由基能力, IC50值分别为897.12、404.31、353.28、195.75、319.42μg.mL-1。结论:通过比较金银花的不同浓度醇提物对DPPH自由基清除能力, 可知金银花75%醇提物清除DPPH自由基的能力最强。
关键词：金银花,电子自旋共振技术,自由基
参考文献
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DPPH清除率 篇2
关键词：大血藤；总黄酮；紫外-可见分光光度法；抗氧化性；自由基
中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0356-03
中药大血藤是木通科植物大血藤[Sargentodoxacuneata（Oliv.）Rehd.etWils.]的干燥藤茎，具有清热解毒、活血、祛风止痛等功效，主治肠痈腹痛、热毒疮疡、经闭、跌扑肿痛、风湿痹病等症，主要产自湖北省、四川省、江西省、浙江省、江苏省、福建省等地。大血藤在不同地区名称不一，《中药大辞典》记录的别名有：血藤、过山龙、红藤、千年健、血竭、血通、大活血、活血藤等10多种[1]。研究表明，大血藤含有多种化学成分，包括黄酮类、酚类、有机酸、木脂素、三萜皂苷、蒽醌类、糖苷类等物质，具有抑菌、抗炎、抗病毒、抑制血小板聚集、增加冠脉血流量、抗心肌等功效[2-6]。黄酮类化合物具有较强的抗氧化、抗肿瘤、抗炎镇痛、抗病毒、保肝护肝、保护心血管系统、抑菌、抗衰老、提高免疫力等功效。大血藤中黄酮类化合物受到很多研究者的关注[7-13]。本研究以中药材大血藤的乙醇提取物为对象，提出一种基于比色法的大血藤总黄酮测定方法，同时考察了提取物对DPPH自由基的清除能力，旨在为开发利用大血藤资源提供依据。
1材料与方法
1.1材料
大血藤药材购于福建省漳州市某中药店。槲皮素与芸香苷标准品均购于中国食品药品检定研究院。DPPH购于梯希爱（上海）化成公司；无水乙醇、氯化铝、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、维生素C等药品均为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂公司。RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；AR124CN电子分析天平（美国奥豪斯公司）；超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）；UV-1750紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）；MultiskanGO全波长酶标仪（美国Thermo公司）；ZWY-2102C全温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）；万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。
1.2样品溶液的制备
用粉碎机将大血藤药材充分粉碎，准确称取药材粉末0.5g，置于烧杯中，加入60%乙醇50mL，封口后放入全溫摇床120r/min60℃振荡浸提24h。浸提结束后超声破碎提取30min，超声破碎程序设定为超声15s，间歇15s，超声频率40Hz，功率1000W。超声结束后抽滤取过滤液，用60%乙醇定容至50mL，得到10g/L样品溶液。
1.3黄酮标准品溶液的配制
称取芸香苷、槲皮素标准品各5mg，分别置于50mL容量瓶中，加适量无水乙醇将其完全溶解，纯水定容，得到0.1mg/mL芸香苷标准液、槲皮素标准液。
1.4黄酮3种定量测定方法
1.4.1直接测定法分别取大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，用紫外分光光计在300～800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇作基线处理，记录吸光度。
1.4.2三氯化铝法分别取1mL大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，加入3支10mL具刻度试管中，依次加入1mL0.1mol/LAlCl3溶液及1mLpH值为5.5的醋酸钠-醋酸缓冲液，用60%乙醇定容至刻度，在300～800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇同样显色后作扫描基线，记录吸光度。
1.4.3亚硝酸钠-硝酸铝法分别取1mL大血藤提取物溶液、芸香苷标准液、槲皮素标准液，加入3支10mL具刻度试管中，加60%乙醇定容至5mL，加5%NaNO2溶液300μL，静置6min后加入10%Al（NO3）3溶液300μL，静置6min后再加入4mL1.0mol/LNaOH溶液，最后用60%乙醇定容至10mL，30℃水浴静置20min，在300～800nm波长范围内进行光谱扫描，60%乙醇加显色剂管作扫描基线，记录吸光度。
1.5亚硝酸钠-硝酸铝显色法考察
根据以上3种方法的光谱扫描结果，筛选出合适的标准品为芸香苷，采用亚硝酸钠-硝酸铝法显色进行试验。
1.5.1标准曲线绘制分别取芸香苷标准液0、1、2、3、4、5mL至6支10mL具刻度试管中，加60%乙醇稀释至5mL，按照“1.4.3”节的方法显色，在510nm波长处测定吸光度，以标准品质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
1.5.2精密度试验精确移取标准品液1mL，样品液1mL（5个平行样），按亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行操作，测定510nm波长处吸光度，计算样品相对标准偏差（RSD）。
1.5.3稳定性试验将芸香苷标准品及样品按亚硝酸钠-硝酸铝法操作，每隔10min于510nm波长处测定1次吸光度，共测60min，计算样品测定值相对标准偏差（RSD）。
1.5.4重现性考察精确称取大血藤粉末4份，每份0.5g，按照“1.2”节方法制成大血藤提取液，按亚硝酸钠-硝酸铝法进行操作，于510nm波长处测定吸光度，计算4份大血藤提取物的总黄酮浓度，计算4份样品相对标准偏差（RSD）。
1.5.5加标回收率试验用移液管精确移取5mL样品液置于烧杯中，加入60%乙醇溶液稀释至20mL，精确吸取1mL稀释后的样品液置于3支10mL具刻度试管中，按照亚硝酸钠-硝酸铝法于510nm波长处测定吸光度，将吸光度代入标准曲线，求得1mL提取液中黄酮浓度，取平均值。另取4支干净试管，精密吸取1mL上述已测定黄酮浓度的样品液，分别加入1、2、3、4mL芸香苷标准液，按亚硝酸钠-硝酸铝法操作，于510nm波长处测定吸光度，计算加标回收率。
nlc202309032136
1.6DPPH自由基清除能力测定
将大血藤样品母液分别配制成药材干质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1g/L的6个浓度梯度。取96孔酶标板，每6个测定孔为1组，依次加入不同浓度的大血藤提取物100μL，然后选其中1组分别加入100μL0.06mmol/LDPPH溶液，另外1组分别加入100μL无水乙醇作为对照组，混匀，室温下放置30min后，在全波长酶标仪中517nm波长下测定各孔的吸光度，加入DPPH组测定值为As，加入无水乙醇组测定值为At，同时设置100μL60%乙醇加100μLDPPH反应组，其吸光度作为空白对照Do，DPPH自由基清除率（I）计算公式如下。维生素C作为阳性对照。
2结果与分析
2.1光谱扫描结果
由图1可知，芸香苷在368nm波长处、槲皮素在336nm波长处有最大吸收峰，样品在434nm波长处有较大吸收峰，在近300nm波长处吸光度达到最大，该区间与标准品没有很好地重叠，且大血藤提取物肉眼观察呈现红色，因此在紫外区-近紫外区吸光度较大，且紫外区测定易受蒽醌、酚类物质的干扰，该方法不适合大血藤黄酮的定量测定。由图2可知，AlCl3显色体系中，槲皮素在430nm波长处、芸香苷在414nm波长处吸光度最大，大血藤样品在420nm波长附近并没有明显吸收峰，该方法不能用于大血藤黄酮的定量测定。由图3可知，在亚硝酸钠-硝酸铝显色体系中，芸香苷在510nm波长处吸光度最大，样品在502nm波长处吸光度最大，二者吻合度较高，槲皮素可见光区未观察到明显的吸收峰，所以本研究确定芸香苷为测定标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色方法，测定波长为510nm进行下一步试验。在该显色方法下，加入NaOH后，溶液中出现肉眼几乎难以察觉的细小悬浮物，长时间静置后变成沉淀析出，用滤纸将溶液过滤后进行测定，后续试验均需将测定溶液静置20min后用滤纸过滤后测定。
2.2标准曲线绘制
芸香苷标准品溶液的线性回归方程为y=1.2354x+0.0015，r=0.9998，线性范围为0～0.5g/L。
2.3精密度试验结果
由表1可知，芸香苷标准品溶液吸光度RSD为2.51%，样品溶液吸光度RSD为1.58%，精密度良好。
2.4稳定性试验结果
由表2可知，芸香苷标准品溶液吸光度RSD为0.26%，样品溶液吸光度RSD为2.28%，说明在60min内吸光度稳定性好。
2.5重现性试验结果
重现性考察结果表明，4次平行提取大血藤提取物中黄酮含量分别为0.580、0.570、0.602、0.562g/L，平均值为0.5785g/L，RSD为2.99%，重现性好。
2.6加标回收率试验结果
稀释后大血藤样品黄酮平均含量为0.150mg/mL，加标回收率在97.7%～101.0%，平均回收率为99.3%（表3），说明该法准确度高。
2.7大血藤DPPH自由基清除能力
由图4可知，随着大血藤提取物浓度和维生素C浓度的增大，DPPH自由基清除率均逐渐升高。
3结论与讨论
大血藤药材中黄酮种类较为复杂，有数十种[10]。目前，不同学者采用不同的方法对大血藤药材中总黄酮含量进行测定，有采用HPLC方法测定的[8]，有采用紫外法即低濃度氯化铝显色后在275nm处测定的[7]，有采用氯化铝显色后在420nm处测定的[9]，有采用亚硝酸钠-硝酸铝显色后在510nm处[13]测定的。本研究结果表明，大血藤乙醇提取物AlCl3显色后在420nm附近并没有明显的光吸收峰，直接在紫外光范围内测定易受大血藤中蒽醌类、酚类化合物干扰，且对样品制备条件及机器性能要求比较高，二者不适合用于大血藤黄酮的比色法定量，因此笔者选择了亚硝酸钠-硝酸铝显色法进行下一步试验。笔者在试验过程中发现，加入NaOH溶液后，会形成一些肉眼难以观察到的细小悬浮物，将溶液放置8h以上，在试管中能看到明显的沉淀物（同时进行的芸香苷标准液显色中未出现沉淀现象）。曾凡骏等用同样的方法测定银杏叶总黄酮时也观察到这种沉淀[14]。本试验将静置时间延长至20min，让原花色素类物质在碱性条件下充分沉淀，取滤纸过滤溶液用于测定，60min内吸光度稳定性很好。大血藤黄酮类化合物组成比较复杂，药材来源、提取工艺、测定方法、标准品选择等诸多因素对测定结果均有较大影响。本研究中基于分光光度计的亚硝酸钠-硝酸铝显色法的精密度、稳定性、重现性、线性关系、加标回收率均较高。DPPH在有机溶剂中是1种较稳定的自由基，在517nm波长处有强吸收，其结构中1个氮原子上有1个孤对电子，当自由基清除剂存在时，该孤对单电子被配对而导致其颜色变浅，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数呈化学剂量关系，因此DPPH被广泛用于检测自由基的清除情况以及评价样品的抗氧化能力。大血藤乙醇提取物具有很强的DPPH自由基清除能力。
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DPPH清除率 篇3
关键词：木犀草素,锌配合物,DPPH自由基,HPLC
木犀草素 (Luteolin) 是3′, 4′, 5, 7-四羟基黄酮类化物, 主要存在于菊花、透骨草、络石藤、金银花、羊乳等植物中[1]。其生物化学及药理作用具有多样性, 近年来研究表明其具有抗炎、抗肿瘤[2]、心脏保护作用[3]、呼吸系统影响[4]、免疫调节等活性。其金属配合物可增强原配体的生物活性[5], 而微量元素Zn具有许多药理、生物功能活性也是众所周知的。为此, 本文以木犀草素为原料, 合成木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物, 并利用高效液相色谱法对木犀草素及木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物抗DPPH自由基的活性进行研究。有关木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物的抗氧化活性的研究鲜见文献报道。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
79-1磁力加热搅拌器 (山东鄄城华鲁电热仪器有限公司) ;SARTORIUS PB-S型酸度计 (Sartorius公司) ;DZF-6030A型真空干燥箱 (上海一恒科技有限公司) ; UV7501型紫外可见分光光度计 (无锡分析仪器有限公司) ;VERTEX70傅里叶变换红外光谱仪 (Bruker公司) ;Agilent 1100高效液相色谱仪 (美国Agilent) ;Vario El元素分析仪 (德国, Elementar公司) 。
木犀草素98% (南京苏朗医药有限公司) ;1, 1-苯基-2-苦味苯肼DPPH (Sigma公司产品) ;除甲醇为色谱级外, 其他均为分析纯。
1.2 木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物的合成及其结构表征
在30mL无水乙醇溶剂中加入0.5mmol木犀草素和0.5mmolZn (Ac) 2固体, 在60℃下搅拌溶解至溶液完全澄清时, 用1mol·L-1的NaOH溶液调节pH值为9.76, 再升高温度至80℃, 水浴回流磁力搅拌4h, 使其产生沉淀, 静置后离心, 沉淀用少量的乙醇及水分别洗涤数次, 将沉淀物于40℃真空干燥, 得到相应的配合物, 再称重并计算其产率。
产率 (%) =W/W0×100% (1)
式中:W—配合物的实际重量;W0—配合物重量的理论值
对所合成的木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物, 通过紫外光谱分析、红外光谱分析、热重差热分析及元素分析进行表征, 并确定其结构。
1.3 溶液的配制
样品溶液的配制:分别准确称取4.0mg木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物, 碱水溶解后, 将pH值调至7左右, 并用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中, 得浓度为0.04g·L-1的样品溶液, 分别将其配制成0.04、0.03、0.02、0.008、0.004、0.002g·L-1系列浓度的溶液。
对照液的配制:准确称取4.0mg木犀草素标准品, 用甲醇溶解后, 定溶于100mL的容量瓶中, 得浓度为0.04g·L-1的木犀草素甲醇溶液, 再将其配制成0.04、0.03、0.02、0.008、0.004、0.002g·L-1系列浓度的溶液。
DPPH溶液的配制:精密称取DPPH自由基7.8864g, 用甲醇溶解, 并定容在100mL容量瓶中, 摇匀得浓度为0.2mol·L-1的DPPH储备液, 冷藏备用, 使用前用甲醇稀释至浓度为0.02mol·L-1。
1.4 UV法测定DPPH自由基的清除率
准确吸取浓度为0.02mol·L-1 DPPH甲醇溶液2mL置于试管中, 再取对照品溶液、甲醇 (空白溶剂) 和不同浓度的样品溶液2mL, 并迅速混匀, 于37℃避光反应30min, 在波长517nm处测定各溶液中吸光度, 按下列公式计算清除率。
清除率:undefined
式中:Ai—加样液时DPPH溶液的吸光度;Aj—样液与空白溶剂的吸光度;A0—DPPH溶液与空白溶剂的吸光度。
1.5 HPLC法测定DPPH自由基的清除率
1.5.1 HPLC色谱条件
色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18, 250mm×4.6mm id;流动相:甲醇-水=80∶20;柱温:25℃;流速:1.0mL·min-1;检测波长:517nm。
1.5.2 标准曲线的线性关系
以甲醇作为溶剂, 准确称取适量的DPPH, 将其分别配制成2mmol·L-1, 4mmol·L-1, 8mmol·L-1, 20mmol·L-1, 40mmol·L-1不同浓度的甲醇溶液, 在色谱条件下, 每个浓度平行进样3次, 以DPPH的浓度 (mmol·L-1) 对平均峰面积进行线性回归。
1.5.3 重复性和稳定性试验
准确吸取DPPH甲醇溶液, 重复进样5次, 测定DPPH峰的峰面积, 计算其 RSD%;每隔2h进样, 检测8h内DPPH峰的峰面积, 计算其RSD%。
1.5.4 DPPH自由基的清除作用
准确吸取浓度为0.02mol·L-1DPPH甲醇溶液2mL置于试管中, 再取不同浓度的样品溶液2mL, 并迅速混匀, 于37℃下避光反应30min, 立刻用0.45μm有机滤膜过滤, 20μL进样, 检测DPPH的峰面积, 空白组不加样品溶液, 按下列公式计算其清除率, 并计算木犀草素及其配合物的IC50值。
清除率:undefined
式中:
A0—体系中DPPH自由基的原始浓度
Aj—加入试样溶液后的DPPH自由基浓度
2 结果与讨论
2.1 木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物的产率及表征结果
按公式 (1) 计算, 所合成木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物的产率为68.76%;通过一系列的表征手段确定了该配合物的组成为:C15H9O6Zn (COOCH3) (H2O) ·H2O, 结构见图1。
2.2 UV法测定DPPH自由基清除率的结果
按公式 (2) 计算, 利用UV法测得木犀草素及其锌配合物对DPPH自由基的清除率, 见图2。
2.3 HPLC法检测对DPPH自由基的清除能力
2.3.1 三种化合物的HPLC检测图谱
在该色谱条件下DPPH自由基有色谱峰, 而木犀草素及其配合物则无色谱峰, 见图3。
2.3.2 标准曲线的线性关系考察结果
回归方程:Y=0.0587X+0.054;相关系数r=0.9996, 线性范围:2～40mmol·L-1。见图4。
2.3.3 重复性和稳定性试验结果
重复进样5次, 检测DPPH峰的峰面积, 求得RSD%为0.92%;每隔2h进样, 检测8h内DPPH峰的峰面积, 求得其RSD%为0.87%。结果说明该分析方法在8h内很稳定, 方法的重复性也很好。
2.3.4 HPLC法测得DPPH自由基的清除率
按公式 (3) 计算, 利用HPLC法测得木犀草素及其锌配合物对DPPH自由基的清除率, 见图5。
2.4 UV法与HPLC法的结果比较
两种方法对DPPH自由基的清除率结果见表, 比较两种方法所测的结果不难发现, UV法检测的结果要比HPLC法检测的结果偏高, 其主要原因是由于UV法在一定的波长下对反应体系进行检测, 检测的是吸光物质的总吸收, 而HPLC法则具有分离及分析两种功能, 能较好地避免体系中其他吸光物质的干扰, 准确地测定体系中真实的DPPH自由基的浓度。
2.5 抗DPPH自由基的测定结果分析
木犀草素及木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物对DPPH均有清除作用, 且随着浓度的增大清除作用也随之增加, 当浓度达到一定程度时, 清除率也趋于平衡状态, 木犀草素及其锌配合物的最大清除率分别为62.51%、79.01%, 其IC50值分别为0.014g·L-1、0.003g·L-1, 说明锌配合物对DPPH的清除作用要强于配体本身。
2.6 结构与抗DPPH自由基的关系
木犀草素及其配合物均以供氢的方式来终止自由基链式反应, 故木犀草素与其配合物在与DPPH自由基反应后所形成的苯氧自由基的稳定性决定了其抗氧化活性的大小。木犀草素与Zn2+配合后, 其分子的电子云分布发生离域, 更有利于B环上羟基的供氢, 从而使得配合物与DPPH自由基作用后, 形成了更加稳定的自由基中间体, 因此木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物抗DPPH自由基的活性要比配体木犀草素本身高。
3 结论
HPLC法比UV法能够更为准确地评价物质对DPPH自由基的清除能力;根据HPLC法的测定结果可知, 木犀草素及其锌配合物对DPPH自由基均有较强的清除能力, 但所合成的木犀草素-Zn (Ⅱ) 配合物对DPPH自由基的清除能力要强于其配体木犀草素本身。因此, 木犀草素与Zn2+进行络合后, 增强了配体本身抗DPPH的生物活性。
参考文献
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DPPH清除率 篇4
1 材料与方法
1.1 供试植物与微生物
苍耳子采自湖北省襄阳市古隆中风景区,采集时间为5～6月份。采回后苍耳子置阴凉处晾干,粉碎后过40目筛后密封干燥保存。绿色木霉Trichoderma viride,黄瓜灰霉菌Botrytis cinerea,黑曲霉Aspergillus niger,终极腐霉Pythium ultimum,尖镰孢菌黄瓜转化型Fusarium oxysporum f. sp cucumber,以上五个菌株由襄樊学院鄂西北植物资源研究所提供。
1.2 仪器与试剂
微型植物粉碎机,天津泰斯特;旋转蒸发仪,上海亚荣;紫外-可见分光光度计,日本岛津;冰箱,青岛海尔;显微镜,北京泰克;高压灭菌锅,上海博迅;光照培养箱,广东医疗;电子分析天平,梅特勒-托利多;空气恒温摇床,太仓华利达;索氏抽提器;丙酮、甲醇、乙醇(上海国药,分析纯)、DPPH,美国SIGMA;葡萄糖、琼脂粉,上海国药,生化纯。
1.3 苍耳子活性物质的粗提
苍耳子活性物质的提取采用连索氏抽提法,将粉碎的样品50 g装入滤纸筒中,在索氏抽提器中用甲醇提取36 h,提取液用旋转蒸发仪浓缩,得浸膏,用丙酮定容为每毫升1g,4℃密封保存备用。
1.4 苍耳子甲醇粗提物对病原物菌丝生长的抑制试验
菌丝生长的抑制活性用生长速率法测定。在无菌条件下,取提前配制的不同浓度粗提物溶液1 mL与融化的PDA培养基9 mL混合,摇匀,趁热倒入培养皿中制成平板(使供试药终浓度分别达到每毫升0.004 g、0.002 g、0.001 g)。同时,用丙酮设置对照组。待平板凝固后接入生长一致的菌饼(Φ=6.0 mm,菌丝面朝下),每皿接1个菌饼,每处理重复3次。置平板于光照培养箱24℃培养至24 h后,用十字交叉法测定供试真菌菌落生长直径,用下列公式计算菌丝生长的抑制率。
抑制率(%) =(对照菌落直径-处理菌落直径)÷对照菌落直径×100%
菌落直径(mm) = 测量菌落直径平均值-6.0
1.5 苍耳子甲醇粗提物对病原物孢子萌发的抑制试验
用无菌生理盐水冲洗长满孢子的培养基,将孢子冲进锥形瓶中,用纱布滤去杂质。在4个装有17 mL液体PDA培养基的锥形瓶中加入1 mL孢子悬浮液,再向其中3瓶加入2 mL不同浓度苍耳提取液,使药液终浓度达到每毫升0.004 g、0.002 g、0.001 g。另1瓶加2 mL对照液(丙酮),每个处理重复3次,置空气摇床中振荡培养。孢子萌发(以孢子芽管长度大于孢子短半径者为萌发)后,用无菌水稀释到适当浓度(以10×10低倍镜下,每个视野30～40个孢子为宜),加到血细胞计数板上,在10×10倍显微镜下观测。重复以上步骤,对4种供试菌种分别定时进行观测。孢子萌发抑制率的计算方法:
孢子抑制率(%)=(对照萌发数-处理萌发数)÷对照萌发数×100%
1.6 苍耳子甲醇粗提物清除DPPH自由基能力的测定
精密称取8.0 mg 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)于50 mL容量瓶中,用95%乙醇溶解。取样品溶液1 mL加入到离心管,再加入3 mL的DPPH溶液配成样品溶液。95%乙醇溶液1mL加入到离心管,再加入DPPH溶液3 mL配成未加样品液的DPPH溶液。取样品溶液1 mL加入到离心管,再加入3 mL的95%乙醇配成样品空白溶液。上述溶液在室温下离心20 min后用紫外-可见分光光度计在517 nm下检测。测定样品溶液吸光度Ai,未加样品液的DPPH溶液吸光度Ac,样品空白溶液吸光度Aj。根据下列公式计算清除率及半清除率(即IC50值):清除率=[1-(Ai-Aj)÷Ac]×100%
IC50=50%×消耗的DPPH质量/加入的试样溶液中溶质的质量
2 结果与分析
2.1 苍耳子粗提物对病原菌生长的抑制
苍耳子甲醇粗提物对5种病原真菌的菌丝生长都具有一定抑制作用(见表1),同一菌种粗提物浓度越高,抑菌作用越明显。随着稀释比例的增大,抑菌作用逐渐减小。在设置的最大质量浓度为4 g·L-1时,最大抑制率分别是40.63%、39.73%、61.01%、44.55%、66.36%,其中,对尖镰孢菌黄瓜专化型的抑制活性最高,为66.36%;对黑曲霉的抑制作用最显著、效果最均一,即使在设定的最小质量浓度1 g·L-1时,抑制率仍然达到43.67%,而此时对另外4种病原真菌的抑制率却很低,最高不到30%。
注:菌落直径为5 次试验的平均值。
2.2 苍耳子粗提物对病原真菌孢子萌发的抑制试验
由表2可知,苍耳子甲醇粗提物对绿色木霉、黄瓜灰霉菌、黑曲霉、终极腐霉、尖镰孢菌黄瓜专化型5种真菌孢子萌发均有一定的抑制作用,在设置的最高质量浓度4 g·L-1时,对上述真菌孢子的抑制率分别达到55.00%、89.19%、67.74%、94.12%,其抑制活性和抑制趋势与表1中的菌丝生长抑制作用相一致。
注:孢子萌发数目为3 次试验的平均值。
2.3 苍耳粗提物对DPPH的清除能力
·DPPH是一种稳定的自由基,其结构含有三个苯环、一个带孤对电子的氮原子,醇溶液呈紫红色,在515 nm处有强吸收。当有自由基清除剂存在时,·DPPH的孤对电子被配对而使溶液颜色变浅(黄色),最大吸收波长处的吸收减弱。这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学剂量关系的,因此可用于评价自由基的清除情况,从而评价试验样品的抗氧化能力[2]。不同浓度粗提物清除·DPPH能力见表3。
IC50值即清除50%自由基时,所需要的苍耳甲醇粗提物浓度。故IC50值越小,苍耳粗提物清除自由基的能力越强。由表3可知,苍耳子不同浓度粗提物对·DPPH均有清除能力,但其清除能力随着浓度的增加而增强,苍耳甲醇粗提物清除DPPH自由基的IC50为0.468 g·L-1。
3 结论与讨论
利用植物体产生的次生代谢物质来开发“环境友好型农药”是现代农药开发的重要途径。本文采用生长速率法、孢子萌发法、DPPH自由基清除法,对产自鄂西北的野生植物苍耳子甲醇粗提物体外抑菌活性及抗氧化性进行了初步测定。结果表明,苍耳甲醇粗提物对绿色木霉、黄瓜灰霉菌、黑曲霉、终极腐霉、尖镰孢菌黄瓜专化型五种病原真菌均有一定的抑制作用,其中无论是抑制菌丝生长还是孢子萌发,均对黑曲霉显示出了显著的抑制作用;同时,苍耳甲醇粗提物对DPPH自由基具有较强的清除能力,IC50为0.468 g·L-1。
鄂西北产苍耳子甲醇粗提物是一种混合物,到底由哪些成分组成?究竟是哪一种或几种物质在起抑菌作用?这些都有待继续深入研究。同时,混合物中某些成分可能会对某些病菌具有促进生长作用。若对粗提物进一步分离纯化,可能会得到只对病菌具有抑制作用的化学物质,且抑菌作用会在很大程度上提高。
摘要：采用生长速率法、孢子萌发法及DPPH自由基清除法,对产自鄂西北的野生植物苍耳子粗提物体外抑菌活性及抗氧化性进行了初步测定。结果表明,苍耳子甲醇粗提物对绿色木霉、黄瓜灰霉菌、黑曲霉、终极腐霉、尖镰孢菌黄瓜专化型五种病原真菌均有一定的抑制作用,其中无论是抑制菌丝生长还是孢子萌发,均对黑曲霉显示出了显著的抑制活性。实验结果也表明,苍耳子甲醇粗提物对DPPH自由基具有较强的清除能力I,C50为每毫升0.000468 g。
关键词：苍耳子,抑菌活性,DPPH,评价
参考文献
[1]谭道鹏,吴志瑰,褚小兰等苍耳属植物化学成分研究进展[J].时珍国医国药.2007,18(2):501～502