日本乙型脑炎病毒

日本乙型脑炎病毒（精选7篇）

日本乙型脑炎病毒 篇1

摘要：为了研究日本乙型脑炎病毒 (JEV) NS1基因工程疫苗、生物免疫活性及细胞因子IL-2对真核表达的影响, 试验采用RT-PCR方法扩增出JEV贵州分离株 (GZ株) NS1 cDNA, 克隆到pMD19-T载体上, 再进行双酶切并回收目的片段, 分别与pET32a (+) 和pcDNA3.1 (+) 载体连接并转化入感受态细胞Top10中, 构建原核表达载体pET32a (+) -NS1和真核表达载体pcDNA3.1 (+) -NS1, 并将NS1基因插入已经构建好的重组质粒pcDNA3.1 (+) -IL-2上, 构建以IL-2融合表达的真核载体pcDNA3.1 (+) -IL-2-NS1, 分别通过抽提阳性质粒酶切鉴定和测序后, 应用DNAStar等生物软件进行序列分析, 最后进行原核表达载体和真核表达载体双酶切及测序。结果表明:JEV GZ株NS1 cDNA全长为1 245 bp, 可编码415个氨基酸。说明JEV GZ株NS1 cDNA克隆成功, JEV GZ株NS1基因的原核表达载体、真核表达载体以及IL-2融合表达的真核载体构建成功。

关键词：日本乙型脑炎病毒,贵州分离株,NS1基因,表达载体,构建

日本乙型脑炎病毒 (JEV) 基因组为单股正链RNA, 其长度约为11 kb, 编码3种结构蛋白:衣壳蛋白 (C蛋白) 、膜前体蛋白 (PrM/M蛋白) 和囊膜糖蛋白 (E蛋白) 以及7种非结构蛋白 (NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5) , 各基因组之间无重叠, 其中NS1基因具有可溶性补体结合活性和较好的免疫原性。NS1不是病毒毒粒的组成成分, 因此无中和活性和血凝活性。NS1蛋白是乙型脑炎病毒的保护性抗原, 免疫动物能抵抗病毒的攻击, 但比E蛋白诱导的抗体保护力低[1]。

试验根据 GenBank中的JEV SA14和SA14-14-2株全基因序列设计并合成1对NS1基因特异性引物, 对JEV贵州分离株 (GZ株) NS1基因进行克隆并构建表达载体, 以期为进一步研究NS1基因的表达及细胞因子IL-2对NS1基因真核表达的影响奠定基础。

1 材料

1.1 病毒、质粒、菌种及细胞

日本乙型脑炎病毒贵州分离株 (GZ株) , 由贵州大学动物科学学院动物生物技术实验中心分离、鉴定;大肠杆菌感受态细胞TOP10, 购自TIANGEN公司;原核表达载体pET32a (+) 、真核表达载体pcDNA3.1 (+) 和BHK21细胞, 由中国兽药监察所赠送, 贵州大学动物科学学院动物生物技术实验中心保存;pcDNA3.1 (+) -IL-2真核表达载体, 由贵州大学动物科学学院动物生物技术实验中心构建。

1.2 主要试剂

RPMI-1640培养基、GoldView, 购自Hyclone公司;TRIzol LS® Reagent, 购自Invitrogen公司;pfuDNA聚合酶, 购自默克生物工程有限公司;pMD19-T载体试剂盒、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶 (Hind Ⅲ、BamHⅠ、EcoRⅠ) 、DL-2 000 Marker、DL-15 000 Marker等, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;Amp、IPTG、X-gal, 均购自美国Sigma公司;凝胶回收试剂盒Gel Extraction Kit (50×) 和质粒提取试剂盒E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒, 购自OMEGA公司。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

根据GenBank上登录的JEV强毒株SA14序列和SA14-14-2序列, 通过比对分析, 运用Oligo6.0和Primer Premier 5.0软件设计1对扩增NS1基因的特异性引物, 预扩增片段1 300 bp, 并分别在引物的5′端和3′端设计BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶位点 (下画线部分) , 引物由宝生物工程 (大连) 有限公司合成, 其序列为P1 5′-CGGGATCCGACACTGGATGTGCCATTGAC-3′, P2 5′-CGGAATTCAGCAGC-GACTAGCACCACATACCTC-3′。

2.2 病毒RNA的提取及RT-PCR

2.2.1 病料的采集和处理

采集贵州安顺某发病猪场疑似患日本乙型脑炎的种公猪肿大的睾丸, 剪碎, 加入3～5倍体积的PRMI-1640营养液研磨后, 转入匀浆器制成匀浆悬液, -20 ℃反复冻融3次, 3 000 r/min离心10 min;取上清液用直径为0.22 μm的一次性滤过器过滤, -80 ℃低温冰箱保存, 备用。

2.2.2 细胞的培养

取1 mL处理好的病毒悬液上清液接种于生长旺盛的BHK21细胞, 待细胞出现70%～80%的细胞病变 (CPE) 时收毒。

2.2.3 总RNA的提取

将上述出现70%～80% CPE的细胞悬液于-20 ℃反复冻融3次, 12 000 r/min离心10 min;收集细胞沉淀及悬液250 μL, 按TRIzol LS® Reagent试剂盒操作说明提取总RNA, 并在生物安全柜中干燥15～20 min;加入0.1 mol/L DTT 2 μL、DEPC水7 μL、RNA酶抑制剂1 μL, 充分混匀, 65 ℃ 溶解5 min;冰浴1 min;进行RT-PCR。

2.2.4 RT-PCR

RT反应体系为总RNA5 μL、5×Superscript Ⅲ Buffer 2 μL、0.1 mol/L DTT 0.5 μL、10 mol/L dNTPs 0.5 μL、RNase-Inhibitor 0.25 μL、Superscript Ⅲ反转录酶0.5 μL、10 mol/L下游引物1.25 μL, 42 ℃ 1 h, 即得cDNA模板。PCR反应体系:10×pfu PCR Buffer 5 μL, 10 mol/L dNTP 1 μL, 上、下游引物各2.5 μL, pfuDNA聚合酶1 μL, cDNA 2 μL, 加ddH2O至50 μL。扩增NS1基因的反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸90 s, 共35个循环;72 ℃终延伸10 min。反应结束后将50 μL PCR产物与10 μL 6×loading Buffer混合, 用1%琼脂糖凝胶、100 V、30～50 min电泳观察结果, 并按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书回收目的基因片段。

2.2.5 pfuDNA聚合酶扩增产物的加A反应

取NS1基因的pfuDNA聚合酶扩增回收产物30 μL、10×PCR Buffer 5 μL、10 mol/L dATP 2 μL、TaqDNA聚合酶1 μL, 加ddH2O至50 μL。反应条件:72 ℃ 30 min。反应结束后取50 μL PCR产物与10 μL 6×loading Buffer混合, 用1%琼脂糖凝胶、100 V、30～50 min电泳观察结果, 并按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书回收目的基因片段。

2.3 目的基因的克隆与鉴定

将回收的目的基因片段连接到pMD19-T载体上, 连接反应体系为pMD19-T载体1 μL、目的DNA片段4 μL和SolutionⅠ5 μL, 16 ℃过夜后, 转化大肠杆菌感受态细胞TOP10, 涂布于含IPTG和X-gal的2×YT琼脂平板 (含50 μg/mL Amp) 上, 37 ℃恒温培养12～16 h, 挑取单个白色菌落接种于2×YT液体培养基 (含Amp 50 μg/mL) 中, 37 ℃、180 r/min振荡培养, 提取质粒DNA, 经 BamHⅠ、 EcoRⅠ双酶切鉴定正确后, 将阳性克隆菌液送Invitrogen公司测序。

2.4 基因的序列分析

应用DNAStar等生物软件对JEV NS1基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析。

2.5 表达载体的构建

对构建成功的pMD19-T-NS1质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定并用胶回收试剂盒回收NS1基因条带, 再对pET-32a (+) 、pcDNA3.1 (+) 空载体及pcDNA3.1-IL-2重组质粒用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切并用胶回收试剂盒回收线型载体, 分别将NS1基因与线型pET-32a (+) 、pcDNA3.1 (+) 空载体及线型重组质粒pcDNA3.1 (+) -IL-2进行连接, 转化至大肠杆菌感受态细胞TOP10, 取100 μL 均匀铺于2×YT琼脂平皿 (含70 μg/mL Amp) , 37 ℃恒温培养8～12 h;挑取数个白色菌落接种于 (含70 μg/mL Amp) 2×YT琼脂平皿 (含70 μg/mL Amp) , 同时做菌落PCR, 37 ℃培养5～6 h;取出, 封口, 4 ℃保存。PCR鉴定含有目的条带的菌落接种于2×YT琼脂平皿 (含70 μg/mL Amp) , 37 ℃振荡培养12 h;提取质粒, 再用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切鉴定pET-32a (+) -NS1、pcDNA3.1 (+) -NS1 2种重组质粒, 同时用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ三酶切鉴定pcDNA3.1-IL-2-NS1重组质粒。取鉴定正确的重组质粒送Invitrogen公司进行序列测定。

3 结果与分析

3.1 RT-PCR扩增结果

取RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳得到1条约1 245 bp片段的目的条带, 见图1。加A后电泳检测得到预期目的条带, 见图2。

M.DL-2 000 Marker;1, 2.NS1 基因RT-PCR扩增结果。

M.DL-2 000 Marker; 1.NS1基因加A产物。

3.2 pMD19-T-NS1重组质粒的鉴定结果

将pMD19-T-NS1重组质粒进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定, 得到了与目的基因大小一致的片段, 初步证明pMD19-T-NS1重组质粒构建成功, 见图3、图4。

M.DL-2 000 Marker;1～10.菌落PCR产物。

M1.DL-2 000 Marker; 1.质粒双酶切产物;2.对照;M2. DL-15 000 Marker。

3.3 序列分析结果

重组质粒pMD19-T-NS1经Invitrogen公司测序, 得到了完整的JEV NS1基因cDNA序列, 全长为1 245 bp, 编码415个氨基酸, 与预期结果相符, 说明pMD19-T-NS1构建成功。

3.4 pET32a (+) -NS1和pcDNA3.1 (+) -NS1表达载体的构建、鉴定结果

将原核及真核重组质粒分别进行菌落PCR鉴定, 得到了与目的基因大小一致的片段, 在原核重组质粒中选择1, 7, 8号菌株扩增抽提质粒双酶切鉴定, 真核重组质粒选择2号菌株扩增抽提质粒双酶切鉴定, 初步证明表达质粒pET32a (+) -NS1和pcDNA3.1 (+) -NS1构建成功, 见图5～8。

M.DL-2 000 Marker;1～10.菌落PCR产物。

M.DL-2 000 Marker;1～10.菌落PCR产物。

M.DL-15 000 Marker;1, 3, 5.质粒双酶切产物; 2, 4, 6.对照。

M. DL-15 000 Marker;1.质粒双酶切产物; 2. 对照。

3.5 pET32a (+) -NS1和pcDNA3.1 (+) -NS1表达载体的测序结果

测序结果表明, pET32a (+) -NS1和 pcDNA3.1 (+) -NS1序列与预期相符, 说明JEV NS1基因的表达载体pET32a (+) -NS1和pcDNA3.1 (+) -NS1构建成功。

3.6 pcDNA3.1 (+) -IL-2-NS1融合表达载体的鉴定结果

将构建的pcDNA3.1 (+) -IL-2-NS1重组质粒进行菌落PCR鉴定, 均得到了与NS1大小一致的片段, 选择1#菌株扩大培养抽提质粒后用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ三酶切, HindⅢ、EcoRⅠ双酶切及HindⅢ单酶切鉴定, 结果初步证明pcDNA3.1 (+) -IL-2-NS1融合表达载体构建成功, 见图9、图10。

M.DL-2 000 Marker;1～5.菌落PCR产物。

M1.DL-2 000 Marker; 1, 2.质粒酶切产物;3.对照;M2.DL-15 000 Marker。

3.7 pcDNA3.1 (+) -IL-2-NS1融合表达载体的测序结果

测序结果 (见图11) 表明, JEV NS1基因与IL-2融合表达真核载体pcDNA3.1 (+) - IL-2-NS1构建成功。

4 讨论

根据P.Shirish等[2]对JEV基因的分型方法得出, 我国分离的乙型脑炎流行毒株至少有2个基因型, 分别为基因Ⅰ型和基因Ⅲ型。其中基因Ⅰ型毒株多数从蚊虫和猪体内分离[3,4,5], 此次分离的乙型脑炎病毒和国内大多数分离株同为基因Ⅲ型, 其NS1编码一种高度保守的分泌型糖蛋白, 富含甘露糖寡糖基团, 是第1个被翻译的非结构蛋白, 可在感染细胞的表面表达, 以溶解或与胞膜成分相连的形式分泌到胞外, 这种分泌形式只限于NS1的二聚体, 胞外的NS1又称为可溶性补体固定抗原 (SCF) , 与胞内的NS1具有相同的抗原性。NS1蛋白含有12个恒定不变的半胱氨酸残基和2个N-连接糖基化位点, 通过二硫键形成二聚体NS1蛋白, 可由NS1-NS2A前体经过蛋白酶切割产生, 并通过其上游的结构蛋白羧基端信号序列插入内质网腔[6], NS1被认为是病毒蛋白中最适合作为疫苗抗原的蛋白之一。

试验成功构建了JEV GZ株原核表达载体pET32a (+) -NS1、真核表达载体pcDNA3.1 (+) -NS1以及IL-2融合表达载体pcDNA3.1 (+) -IL-2-NS1。序列分析结果表明:NS1基因与GenBank上公布的JEV NS1序列 (SA14-14-2) 同源性为98.1%。该研究结果为JEV基因工程疫苗、生物免疫活性及细胞因子对真核表达的影响的研究奠定了一定基础。

参考文献

[1]殷震, 刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社, 1997.

[2]SHIRISH P, BANERJEE K.Phylogenetic analysis of the envelopegene of Japanese encephalitis virus[J].Virus Res, 1996, 42 (1/2) :107-117.

[3]王环宇, 付士红, 李晓宇, 等.我国首次分离到基因Ⅰ型乙型脑炎病毒[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2004 (24) :843-849.

[4]王俊文, 付士红, 王环宇, 等.辽宁省乙脑病毒的分离与鉴定[J].中华实验和临床病毒学杂志, 2006 (20) :61-65.

[5]王作虪, 安淑一, 王燕, 等.辽宁省乙型脑炎病毒分离及进化树分析[J].中国公共卫生, 2008, 24 (3) :341-343.

[6]CHEN L K, LIAO C L, LIN C G, et al.Persistence of Japanese en-cephalitis virus is associated with abnormal expression of the non-structural protein NS1 in host cells[J].Virology, 1996, 217 (1) :220-229.

日本乙型脑炎病毒 篇2

1 流行病学调查

2008年4月上旬, 贺州市信都镇某公司猪场从南宁某种猪场引进体重在80~100 kg大约克种公猪6头, 进栏后与其余14头2~3岁公猪一同饲养。进栏后15 d开始生产猪精液, 精子活力达0.8以上, 密度中等。6月份新引进的公猪开始出现发热症状, 畜主采用头孢类、安乃近、黄芪多糖、板蓝根等治疗, 2~3 d体温恢复正常, 食欲好转, 但精子活力显著下降, 部分公猪出现一侧性睾丸肿胀、睾丸缩小变硬和死精现象。

据调查, 畜主公猪引进后没有进行乙型脑炎免疫, 该场2007年6-9月份陆续有公猪睾丸肿胀、死精等现象, 天气转冷后部分公猪耐过后继续生产, 场地有病原微生物存在, 同时南方天气热, 蚊蝇横行, 极易造成疫病发生。

2 临床症状

病猪体温突然升高达40~41℃, 呈稽留热, 精神不振, 食欲不佳, 结膜潮红, 粪便干燥, 如球状, 附有粘液, 尿深黄色, 有的病例后肢呈轻度麻痹, 关节肿大。公猪发生睾丸炎, 一侧或两侧睾丸明显肿大, 较正常睾丸大1/2至1倍, 多为单侧性, 少为双侧性的。初期睾丸肿胀, 阴囊皱褶消失, 增温有痛感, 数日后炎症消退恢复正常, 或者变小、变硬, 功能消失;公猪性欲减退, 精液品质下降, 失去配种能力而被淘汰。

3 剖检变化

剖检淘汰病猪2头, 主要可见公猪睾丸不同程度肿大, 睾丸实质充血、出血, 切面有大小不等的黄色坏死灶, 周围出血。阴囊皱褶消失, 发亮, 鞘膜腔内潴留大量黄褐色透明液体。慢性病例可见睾丸萎缩、硬化, 睾丸与阴囊粘连, 实质大部分结缔组织化。

4 实验室诊断

根据该病发生有明显的季节性及公猪睾丸一侧性肿大等特征, 可做出初步诊断。然后将病变组织送至广西有关单位科研单位实验室通过病毒分离、荧光抗体试验、补体结合试验、中和试验和血凝抑制试验等, 确诊为乙脑病毒感染。

5 防治措施

5.1 治疗措施

5.1.1 加强管理:

猪栏附近乃至整幢猪舍内点蚊香驱蚊, 猪体用1%敌百虫喷洒灭蚊等措施。

5.1.2 对猪场进行全面彻底消毒:

用1∶100倍稀释的百毒杀对猪圈及用具、被污染的场地彻底消毒;用1∶200倍稀释的百毒杀带猪消毒, 2次/d, 连用3 d, 后改用1∶300倍稀释液1次/d, 连用3 d。

5.1.3 对病猪12头隔离治疗:

(1) 西医:头孢塞呋钠5 g+安乃近10 m L+柴胡注射液10 mL, 肌肉注射, 1 d 1次, 连用3~5 d;清开灵注射液20 mL加入10%的葡萄糖盐水中, 静脉注射, 1 d 1次, 连用3~5 d。

(2) 中医:金银花150 g、连翘75 g、竹叶75 g、芦根200 g、大青叶150 g、生大黄50 g (后下) 、黄芩50 g, 栀子、牡丹皮、紫草各50 g, 鲜生地60 g, 石膏400 g (先煎) 、赤芍60 g、板蓝根120 g、滑石60 g。将上药放入3 000 m L水中煮至1 000 mL早晚拌料饲喂。连服3~5剂。

治愈标准:种公猪体温、食欲恢复正常;猪精液精子活力、密度恢复正常即为治愈。

效果观察:共治疗12头公猪, 用药2 d后, 有8头公猪体温、食欲恢复正常, 继续使用中药治疗1周后, 精液检查有6头公猪精子活力恢复正常, 即为治愈6头, 淘汰2头。其余4头公猪用药3~5 d后, 体温、食欲恢复正常, 继续使用中药治疗1周后, 其中2头公猪一侧睾丸肿大至1/2~1倍, 精液检查可见采精量明显下降, 精子活力下降, 精子畸形率达30%以上;其中2头公猪睾丸明显萎缩变硬, 液检查可见80%为死精而被淘汰。

5.2 预防措施

对新引进公猪进行分栋专人饲养, 严格免疫接种、杜绝传播媒介和加强饲养管理。

5.2.1 免疫接种:

将新引进的种猪分栋饲养, 在蚊虫开始活动前1个月, 即5-6月份对易感猪只进行猪乙型脑炎疫苗预防接种, 间隔2周进行第二次免疫。5.2.2杜绝传播媒介:是预防和控制乙型脑炎流行的根本措施, 以灭蚊防蚊为主, 尤其是三带喙库蚊, 该蚊是我国和东南亚国家重要的传播媒介和病毒储存宿主。应根据其生活规律和自然条件, 采取有效措施, 才能收到事半功倍的效果。

5.2.3 加强饲养管理:

种猪在乙型脑炎流行季节饲喂高能量、高蛋白饲料, 保持猪体清洁, 维持猪体良好体况, 提高其自身抵抗力;搞好畜舍卫生, 强化粪便污水无害化处理以及环境消毒工作;加强动物疫病监测, 对没有经过夏秋季节的幼龄动物和从非疫区引进的动物, 引进后立即进行猪乙型脑炎疫苗免疫接种。

6 小结

6.1 本病目前尚无有效疗法, 临床上

治疗西药以对症治疗和支持治疗为主, 可用抗生素或磺胺类药物;中药则以清热解毒为主;且本病的治愈仅根据繁殖能力恢复而言, 其精液是否带毒传染等指标还有待研究。

6.2 本病流行有明显的季节性, 消灭蚊虫是预防本病的重要措施。

常于夏末秋初, 一般流行高峰在7-9 3个月, 海南地区流行在5—6月, 华南地区在6—7月, 华北地区在8—9月, 东北则在7—8月, 均与气温和蚊虫的季节性分布相一致。

参考文献

[1]杨小燕.现代猪病诊断与防治.北京:中国农业出版社出版, 2005, 193～196

日本乙型脑炎病毒 篇3

关键词：乙型肝炎病毒携带者,乳汁,检测,母乳喂养

乙型病毒性肝炎是我国主要的传染病之一, 是乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus, HBV) 感染机体后所引起的疾病。乙型肝炎病毒携带者是指乙型肝炎表面抗原 (HBsAg) 阳性持续6个月以上, 很少有肝病相关症状与体征, 肝功能基本正常的慢性HBV感染者。新生儿乙型肝炎病毒携带者的发生与母婴垂直传播有关[1], 母体血液中的e抗原 (HBeAg) 可通过胎盘进入胎儿体内, 同时与分娩时和产后密切接触有关。母乳是婴儿成长唯一最自然、最安全、最完整的天然食物, 营养丰富, 含有婴儿所需的所有营养和抗体, 保证婴儿的正常、健康发育。然而乙型肝炎病毒携带者孕妇这一群体产后能否进行母乳喂养, 是否会增加新生儿感染HBV的概率, 一直是备受关注的话题[2]。本研究通过观察分析乙型肝炎病毒携带者乳汁中乙型肝炎病毒检测的相关数据, 包括乙型肝炎病毒标志物 (HBV-M) 和HBV-DNA的检测。探讨乙型肝炎病毒携带者母乳喂养的安全性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2009年5月至2012年5月本院产科住院分娩者产前检查HBsAg阳性者90例, 年龄在22～37岁, 平均年龄 (26.4±3.2) 岁, 平均孕龄 (38.8±1.3) 周, 怀孕期间孕妇均无厌油腻、乏力、黄疸等肝炎症状和体征出现。

1.2 方法

1.2.1 标本采集方法

分娩前抽取外周静脉血3mL于采血管中, 37℃下放置10min后, 以3000r/min离心机离心10min后, 分离上层血清, -70℃保存待检。产后3～5d孕妇待初乳分泌后, 用肥皂水、清水洗净乳头, 轻柔按压乳房致乳腺管畅通, 轻压乳晕使乳汁自然流出, 用清洁干燥试管收集3～5mL, 以3000r/min离心机离心10min后, 分离取出中层清液即乳清, 保存在-70℃待检。

1.2.2 标本检测方法

主要进行HBV-M和HBV DNA的检测。采用FQ-PCR技术, 使用PCR检测试剂盒 (美国雅培公司) 及TC-48/T/H DNA自动扩增仪 (日本大和公司) 进行检测。检测静脉血中的HBV-M和HBV DNA, 乳汁中的HBV DNA, 将两者进行对比分析。

1.2.3 统计分析方法

将检测所得结果进行归纳总结, 分组资料采用卡方检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳汁中HBV-M与HBV-DNA检测情况

HBsAg阳性HBeAg阴性为单阳, HBsAg阳性HBeAg阳性为双阳。90例HBsAg阳性的孕妇中, 单阳者60例, 双阳者30例。单阳和双阳产妇乳汁中检出HBsAg (+) 、HBeAg (+) 、HBV-DNA (+) 的比例对比差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

2.2 乳汁HBV-DNA检出情况与血清HBV-DNA的关系

90例孕妇产前静脉血检测显示, 乙型肝炎表面抗原 (HBsAg) 、e抗原 (HBeAg) 、核心抗体 (抗-HBC) 阳性者即“大三阳”50例, 乙型肝炎表面抗原 (HBsAg) 、e抗体 (抗-HBE) 、核心抗体 (抗-HBC) 阳性者即“小三阳”40例。血清HBV-DNA载量<1×106者为35例, 乳汁HBV-DNA检出情况为0例;1×106者15例, 乳汁HBV-DNA检出情况为1例, 占6.6%;1×107者为10例, 乳汁HBV-DNA检出为4例, 占40%;1×108者为25例, 乳汁HBV-DNA检出9例, 占36%;1×109者为5例, 乳汁HBV-DNA检出1例, 占20%。见表2。

3 讨论

乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) 阳性, 说明感染了乙型肝炎病毒。感染了乙型肝炎病毒不等于得了肝炎。只有当乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) 阳性且肝功能受损并伴有肝炎体征和症状才算得了肝炎。乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg) 阳性且肝功能正常者被称为乙型肝炎病毒携带者, 乙型肝炎病毒携带者不需要药物治疗。核心抗原 (HBcAg) 在体内经过代谢后丢失了一部分氨基酸并改变了空间结构, 失去了原来的抗原性, 而转化成具有另一种抗原活性, 称为e抗原 (HBeAg) 。HBeAg是以隐蔽形式存在于HBV核心中的一种可溶性蛋白。HBeAg是HBV核壳蛋白的分泌型表现, 它在一个人的血液中出现, 提示HBV正在复制, 有很强的传染性。通常HBsAg/HBeAg阳性被认为是具有传染性的间接标志, 而HBV-DNA作为HBV的基因组成和复制模板, 是具有传染性的直接证据。不同的乙型肝炎模式患者有不同的乙型肝炎病毒DNA复制。乙型肝炎血清标志物只能反映人体对乙型肝炎病毒的免疫状态, 不能直接反映病毒在体内的复制情况, 更难以对乙型肝炎病毒复制程度及传染性做出判断。乙型肝炎病毒携带产妇有两种情况, 一种为单纯乙型肝炎病毒携带者, 这些产妇一般无传染性。另一种血清、乳汁中HBV-DNA呈阳性, 提示婴儿宫内感染风险高, 不应母乳喂养[3]。本研究从30例HBsAg阳性产妇的乳汁中分别检测了HBsAg、HBeAg、HBcAb和HBV-DNA。其中HBsAg/HBeAg总阳性率达40% (12/30) , HBV-DNA总感染率达12.5% (5/40) 。提示HBsAg阳性母亲的乳汁具有潜在的传染性。本研究证明, 本研究结果显示, 产妇血清中HBV-DNA者乳汁中均未检出HBV-DNA, 其中包括大三阳和小三阳产妇。说明只要产妇血清中HBV-DNA<1×106copies/mL时, 母乳喂养是相对安全的。血清中HBV-DNA≥1×106copies/mL时, 乳汁中可检出HBV-DNA, 母乳喂养存在一定风险, 应慎重考虑。

乙型肝炎病毒携带者在怀孕前就应该接受在怀孕前就应该接受乙型肝炎病毒相关几个方面的检测并做出全面评估, 了解HBV-DNA是否阳性及病毒载量, 特别是HBV-DNA≥1×106copies/m L者, 应暂缓妊娠并进行抗病毒治疗。已经怀孕的高病毒载量的孕妇, 可运用拉夫米定降低HBV-DNA载量, 可以有效降低胎儿宫内感染几率。乙型肝炎病毒携带者能否母乳喂养, 病毒检测学方面是主要要求以外, 同样对母亲的乳头状况如是否有破损、出血现象及宝宝口腔黏膜是否破损或肠道是否有炎症如腹泻症状等方面也需密切关注。所以在乙型肝炎病毒携带孕妇住院期间, 需加强健康教育, 让孕妇及家庭了解乙型肝炎病毒相关的各个方面以及母婴传播的知识, 有利于母婴阻断工作的开展及防护[4]。

乙型肝炎病毒携带者能否母乳喂养一直是乙型肝炎病毒携带孕妇迫切想知道的问题, 也是医疗工作者较难回答的问题。本研究总结归纳为乙型肝炎病毒携带者需检测乙型肝炎病毒在乳汁中的HBV-DNA载量, 同时需考虑孕妇及胎儿的黏膜破损等情况。对于不可以母乳喂养的乙型肝炎病毒携带者, 需解释清楚并实施母婴阻断, 对于可以母乳喂养的乙型肝炎病毒携带者, 应定期随访复查病毒指标。

参考文献

[1]牛敏蓉, 张彬彬, 邵志英.母体乙肝病毒携带与新生儿黄疸发生相关性关系的研究[J].中国医药导报, 2012, 9 (5) :60-62.

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[3]朱敏蓉, 张彬彬, 邵志英.母体乙肝病毒携带与新生儿黄疸发生相关性关系的研究[J].中国医药导报, 2012, 9 (5) :60-62.

日本乙型脑炎病毒 篇4

关键词：乙型脑炎病毒,Pr M,原核表达,单克隆抗体

乙脑 (Japanese encephalitis, JE) 是由日本乙型脑炎病毒 (Japanese encephalitis virus, JEV) 经蚊虫传播引起人或动物中枢神经系统感染的急性传染病, 病死率在10%以上。我国发患者数占世界总发患者数的80%, 幸存者约15.3%, 有不同程度的脑膜炎后遗症[1]。近年来, 其流行范围有不断扩大的趋势[2,3]。

JEV为一单股正链RNA病毒, 基因组全长约11 kb, 整个基因组由5’非编码区、一个几乎跨整个基因组的单一开放阅读框 (open reading frame, ORF) 和3’端非编码区构成。ORF约10.3 kb编码1个多聚蛋白前体, 经切割后形成3个结构蛋白和7个非结构蛋白, 其中结构蛋白Pr M (膜蛋白前体) 约为18 500 Da。乙脑病毒的免疫原性和细胞嗜性等主要由其结构蛋白决定[4]。乙脑病毒Pr M基因的保守性很高, 可诱导机体产生中和抗体, 是诱发保护性免疫的重要成分[5,6]。对Pr M基因功能性与应用性研究已成为国内外学者当前研究的热点[7,8,9]。本研究通过工程菌表达Pr M重组蛋白, 以Ni2+NTA亲和层析柱纯化蛋白后免疫BALB/c小鼠, 制备相应单克隆抗体 (monoclonal antibody, mc Ab) , 为进一步探讨乙脑病毒分子的生物学功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂

PCR试剂盒、p MD19-T Simple vectors试剂盒、T4 DNA连接酶、蛋白Marker (均为Fermentas公司) ;PCR产物纯化试剂盒 (QIAGEN公司) ;限制性内切酶XholⅠ、Bam H I (NEB公司) ;PET-21a (+) vectors及大肠埃希菌BL21、Ni-NTA His-Bind Resin (Novagen公司) ;ECL发光底物和Protein A Sepharose购自GE Healthcare公司;感受态细菌E.coli JM109和E.coli 21由本实验室保存;健康8周龄BALB/c小鼠, 由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供;DMEM高糖培养基、8-氮鸟嘌呤 (8-A G) 、HAT、HT、双抗、胎牛血清 (FBS) 购于Gibco公司;福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、羊抗小鼠Ig G-HRP、PEG购于Sigma公司;链酶亲和素-HRP购于KPL公司。

1.2 Pr M基因的扩增

根据Gen Bank中注册的ABD84370序列, 选择Pr M为研究对象, 利用PAS法进行人工合成 (南京金思瑞生物技术有限公司) 。在引物的两端各设计了Bam H I和Xho I酶切位点和保护性碱基, PCR插入上游引物序列:GCCGTCTCGGATCC (下划线为Bam HⅠ酶切位点) , 插入下游引物序列:GCCGTCTCCTCG AG (下划线为XhoⅠ酶切位点) 。以合成基因片断为模板进行PCR, 循环参数:94℃预变性1 min, 94℃变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 完成32个循环。72℃10 min琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 Pr M基因表达载体的构建与鉴定

将p ET21 (Amp) 载体和上述目的基因的PCR回收纯化产物分别进行Bam H I、Xho I双酶切, 37℃过夜。酶切产物在 (10 g/L) 琼脂糖凝胶上进行电泳, 按照QIAGEN公司胶回收试剂盒步骤要求进行胶回收。将Bam H I和Xho I双酶切并回收纯化后的目的基因Pr M和载体质粒p ET21 (Amp) , 按5∶1的摩尔浓度比例, 用T4 DNA连接酶连接, 16℃, 过夜。转化感受态E.coli JM109菌, 挑取单个菌落37℃摇菌过夜。提取质粒进行PCR及酶切鉴定, 阳性质粒送南京金思瑞生物技术服务有限公司测序。

1.4 Pr M蛋白的诱导表达、纯化和鉴定

将鉴定正确的p ET21-Pr M重组质粒转化至工程菌E.coli BL21, 挑单个菌落至3 m L LB培养基 (含50 mg/L Amp) 中, 37℃摇菌至A600=0.6~0.8。以1∶100的比例将菌液接种于5 m L LB培养基中, 37℃摇菌至A600=0.6~0.8时加入终浓度为0.5、0.75及1 mmol/L的IPTG, 于25、30和37℃在0、2、4、6及8 h分别进行诱导表达。离心收集菌体后以冷PBS重悬, 直接进行SDS PAGE分析, 考马斯亮蓝R250染色显示蛋白条带。取最高蛋白表达量的菌液1 m L离心, 10 000 g, 2 min, 弃上清液, 以无菌PBS50μL重悬沉淀细菌, 超声裂解细菌, 再次离心。分别取上清、沉淀10μL行SDS-PAGE检测, 以明确目的蛋白在宿主菌中的表达形式。将已检测证实有Pr M蛋白表达的菌液300 m L, 8 000 g, 4℃离心10min, 弃上清后, 按 (菌重g/缓冲液体积m L) 1∶10比例向沉淀中加入溶菌缓冲液, 重悬细菌, 加入溶菌酶1 g/L, 混匀后冰浴30 min, 冰浴过程中超声裂解细菌 (加入蛋白酶抑制剂1 mmol/L PMSF) , 4℃, 10 000 g离心20 min, 弃沉淀, 取上清过Ni-NTAHis-Bind亲和层析柱纯化蛋白。用SDS-PAGE检测纯化后蛋白纯度, Bradford法测定纯化蛋白的浓度。将分离胶中的蛋白经电转印至PVDF膜上 (恒压100 V, 4℃, 1.5h) , 用50 g/L脱脂奶粉封闭电转后PVDF膜, 室温过夜, 按1∶2 000的比例, 用50 g/L的脱脂牛奶稀释抗组氨酸6×His的m Ab, 4℃孵育过夜, 洗涤, 按1∶10 000的比例, 用50 g/L的脱脂牛奶稀释HRP标记的羊抗小鼠Ig G抗体, 室温孵育1 h后, 再次TBS/T洗涤, 最后加ECL发光底物, 室温孵育5 min后, 曝光洗片观察结果。

1.5 杂交瘤细胞株的建立

将弗氏完全佐剂与纯化后Pr M (600 mg/L) 蛋白按1∶1的体积比例充分研磨, 制备成油包水乳化剂, 皮下多点注射于5只BALB/c小鼠, 于第14和21天将弗氏不完全佐剂与纯化后Pr M按1∶1的体积比例充分研磨加强免疫, 剂量均为0.2 m L, 第3次加强免疫后1周取尾血测效价。取其中免疫效果最好的小鼠融合前3天经尾静脉注射含50μg纯化Pr M蛋白的PBS溶液再加强免疫1次。小鼠骨髓瘤细胞N S1于融合前2周复苏培养于含有8-氮鸟嘌呤处理。细胞融合时, 分别收集免疫小鼠脾细胞和N S-1细胞, 不完全培养基洗涤3次后, 调整脾细胞数与N S-1细胞数之比约为1∶5, W=50%PEG1500作用1~2 min后, 加入含有HAT完全培养基稀释, 接种于96孔培养板, 37℃、5%二氧化碳培养。约2周后, 用间接ELISA法筛选阳性生长的细胞克隆孔, 并更换为含有HT的完全培养基, 1周后更换为完全培养基, 有限稀释法进行克隆及亚克隆, 扩增培养。

1.6 单克隆抗体的制备、纯化及鉴定

注射0.5 m L液体石蜡至BALB/c小鼠腹腔, 2周后注射1 m L 1×106的杂交瘤细胞。5~7 d后, 收集腹水。室温3 000 r/min离心5 min吸取上清。参照Protein A Sepharose亲和层析说明书进行腹水的抗体纯化。用纯化后Pr M融合蛋白包被ELISA反应孔, 通过间接ELISA法检测抗体效价;以免疫前小鼠血清作为阴性对照, 纯化后抗Pr M抗体倍比稀释, 纯化后的Pr M融合蛋白进行SDS-PAGE, 以腹水Ab (1∶10 000稀释) 作为一抗, 以HRP标记山羊抗小鼠Ig G作为二抗进行Western blot检测。

2 结果

2.1 DNA序列分析和预测的蛋白质特征

DNA序列分析和预测的蛋白质特征见图1。

Pr M基因测序结果见图2。测出Pr M编码基因核苷酸序列与Gen Bank中注册的ABD84370序列核苷酸序列同源性为100。

2.2 Pr M融合蛋白的诱导表达及Western blot鉴定

p ET21-Pr M阳性菌株经IPTG诱导后收集细菌, SDS-PAGE电泳显示:在30℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h条件下, 融合蛋白表达达到高峰, 蛋白条带位于约21 k D处 (与预期相符) , 用抗6×His m Ab进行Western blot鉴定, 确认具有His标签的融合蛋白Pr M表达。该重组蛋白主要以包涵体形式存在, 用Ni-NTAHis-Bind柱进行纯化及复性后, 蛋白浓度为600 mg/L, 纯度扫描证实蛋白纯度在90%以上 (图3) 。

2.3 杂交瘤细胞株的建立、单克隆抗体的制备、鉴定Pr M融合蛋白的诱导表达及Western blot鉴定

细胞融合率为85.5% (412/480) , 选择其中较高读数的10株进行克隆和亚克隆, 最终获得4株分泌抗蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 分别命名为:1、2、3、4号;制备纯化腹水经一系列梯度稀释, 间接ELISA法测定单抗效价, 4株抗体效价均超过1×106, Western blot鉴定与Pr M融合蛋白反应特异 (图4) 。

M:蛋白标准分子量 (14、18、25、35、45、66、116 k D upward) ;Lane 1:纯化蛋白;Lane 2:阴性对照;Lane 3、4:6×His抗体Western blot检测纯化Pr M蛋白

3 讨论

随着生物信息学及分子生物学的发展, 相关技术如病毒分离、病毒中和试验、RT-PCR、分子克隆、基因序列测定以及蛋白表达等相继被应用到病毒的检测与研究中来。国内外相继开发了相关乙脑病毒检测试剂, 但各种方法均有一定的缺陷, 特异性与敏感性也存在一定的差异, 难以满足临床的精确检测[10]。KONISHI等[11]研究表明Pr M蛋白具有免疫原性, 能诱导机体产生持久的抗体和T记忆性细胞, 引起保护性免疫反应, 是重组病毒接种后引起保护免疫反应的关键成分。本研究的关键在于通过生物信息学分析乙型脑炎病毒3种不同基因, 选择最保守最稳定的Pr M基因, 通过基因克隆, 构建高效的原核表达体系, 通过蛋白表达获得高活性的乙型脑炎病毒包膜前体蛋白, 用包膜前体蛋白去免疫BABL/c小鼠, 继而获得针对单一抗原决定簇的单克隆抗体, 避免了杂蛋白的干扰。同时, 采用高效的原核表达体系。表达出具有活性的真核细胞蛋白也是本研究的亮点之一。Pr M蛋白存在于感染细胞内未成熟毒粒中, 被切割后形成M蛋白, 参与病毒囊膜的构成, 抗M蛋白抗体对JEV具有轻度的中和作用。BRAY等[12]研究认为Pr M是病毒诱发保护性免疫的重要成分, 用表达Pr M蛋白的重组痘苗病毒免疫动物能诱导特异性抗体反应, 并能抗致死攻击[13,14]。MASON等[15]用表达Pr M蛋白的重组痘苗病毒免疫猪能诱导特异性抗率反应, 一些学者用构建含JEV不同基因的重组痘苗病毒免疫小鼠, 结果发现不含Pr M基因的重组病毒免疫动物无血凝抑制抗体, 抗同种病毒的攻击能力差。

M:蛋白标准分子量 (10、17、28、36、55、72、130 k D upward) ;Lane1:阴性对照;Lane 2、3、4、5:1~4号腹水Western blot检测纯化Pr M蛋白

日本乙型脑炎病毒 篇5

1 资料与方法

1.1 研究对象的选择

857例乙型肝炎选自白城市结核病防治研究所（白城市传染病医院）门诊和肝病疗区住院患者，其中男性患者488例，女性369例，年龄16～70岁，平均38岁。

1.2 实验试剂和仪器

采用英科新创HBV-M快显试剂盒测定乙型肝炎血清标志物HBV-M (HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc），采用深圳匹基PCR荧光定量检测试剂盒测定HBV-DNA。

F Q D-3 3 A荧光扩增仪：B L O E R荧光定量P C R检测系统B L O-RADMODE 550酶标仪。

1.3 检验方法和结果报告

将抽取的同一乙型肝炎患者血样同时行乙型肝炎血清学标志物HBV-M定性和血清HBV-DNA病毒载量定量和定性检测，HBV-DNA的计量单位为拷贝/mL。检测样本中，如HBV-DNA定量范围在5×102拷贝/mL～5×107拷贝数/mL时，判定为测定结果有效，可直接报告相应定量值；如HBV-DNA定量值>5×107拷贝/mL，则结果直接报告为>5×107拷贝/mL；如HBV-DNA定量值<5×102拷贝/mL，定量数值仅供参考，结果直接报告为<5×102拷贝/mL。HBV-M测定采用酶联免疫吸附法测定，采用PCR技术定量测定乙型肝炎患者HBV-DNA含量并进行定性判断。

1.4 统计方法

将检测结果计算阳性率（%），进行卡方检验和t检验，检验水准为0.05。

2 结果

乙型肝炎血清标志物HBV-M定性检测结果采用5种模式： (1) H B s A g阳性； (2) 抗H B c阳性； (3) H B s A g+抗-H B c阳性； (4) HBsAg+HBeAg+抗-HBc阳性（俗称大三阳）； (5) HBsAg+HBeAb+抗-HBc阳性（俗称小三阳）。857例血清HBV-DNA定量测量结果及HBV-M结果见表1。

统计学分析表明，大三阳模式与 (4) (5) 模式的HBV-DNA阳性百分率和HBV-DNA含量比较，差异均具有高度统计学意义（P<0.01）。HBV-DNA与HBe Ag的存在明显正相关关系；小三阳模式与大三阳模式相比，虽然HBV-DNA阳性百分率和HBV-DNA含量低于大三阳模式，但仍然高于其他模式，且差异也具有高度统计学意义（P<0.01）。

3 讨论

中国乙型肝炎病毒（HBV）的感染率较高（约为10%），并有逐年增高的趋势。如果不采取积极有效的防治措施，对人类的危害极大，大部分乙型肝炎患者存在肝内不同程度的炎症性病理改变，有的甚至发展为肝硬化甚至肝癌[1]，是中国的一个重要公共卫生问题。目前认为，血清HBV-DNA检测是HBV复制最直接、最可靠的标志，因此，对乙型肝炎患者进行HBV-DNA的定量检测，对于准确判断患者的传染性、正确判断抗病毒治疗的效果和预后具有重要的临床意义。由表1可知，大三阳模式与其他模式HBV-DNA阳性率和HBV-DNA病毒载量进行比较，差异均具有高度统计学意义（P<0.01），表明HBV-DNA与HBeAg的存在明显的正相关关系，提示病毒自我复制较为活跃，传染性较强，这说明HBeAg是HBV病毒复制活跃的标志之一[2]。虽然小三阳模式HBV-DNA阳性率和HBV-DNA病毒载量均低于大三阳模式，但仍然高于其他模式，且差异也均具有高度统计学意义（P<0.01），说明HBeAg虽然为阴性，但HBV并没有停止自我复制，只是自我复制能力减慢或部分患者出现HBV基因突变。临床研究表明，这样的感染更易伤害乙型肝炎患者，严重者可发展为肝硬化和肝癌[3]。

综上所述，在临床工作过程中，不仅要应用乙型肝炎血清标志物HBV-M尤其是HBeAg来判断HBV是否在体内自我复制，更要结合PCR检测技术来测定HBV-DNA病毒载量，以准确判断HBV在体内的复制情况，准确判断抗病毒治疗的效果。

实践也已证明，采用PCR技术检测乙型肝炎患者血中的HBV-DNA敏感性高，特异性强，能直接反映HBV-DNA的复制情况，值得临床推广应用[4]。

参考文献

[1]王添章, 张宜俊, 刘树人等.慢性HBV感染者血清中HBV-DNA与HBeAg量的关系及其临床意义[J].检验医学, 2004, 19 (1) :71-72.

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[3]梅小平, 李健, 曾跃等.乙型肝炎病毒HBV-DNA与临床分析[J].中华肝病杂志, 2004, 22 (5) :313.

日本乙型脑炎病毒 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月—2013年1月我院收治的150例乙肝感染者, 其中男88例, 女62例;年龄25~67岁, 平均 (41.5±13.3) 岁;所有患者均符合中华医学会肝病学分会及感染病学分会《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准[3], 肝功能正常, 知情同意。排除合并严重心、肾、脑疾病, 排除合并腹水、肝肾综合征者, 排除其他类型病毒性肝炎、药物性肝炎、酒精性肝炎, 排除既往使用核苷酸类药物治疗者, 排除严重心、肾、胆道疾病及肝癌患者。根据随机数字表法, 将150例患者随机均分为阿德福韦酯组、拉米夫定组和实验组 (阿德福韦酯+拉米夫定) 。三组患者性别、年龄、病程、BMI、肝功等基线资料对比差异无统计学意义, 具有可比性 (P>0.05) 。

1.2 方法

所有患者入院后给予保肝药物及支持治疗, 阿德福韦酯组患者给予阿德福韦酯 (北京双鹭药业有限公司, 国药准字H20080497) 口服, 10mg/d;拉米夫定组给予拉米夫定 (湖南千金湘江药业有限公司, 国药准字H20103481) 口服, 100mg/d;实验组联合使用两种药物, 剂量与单独使用一样。

1.3 观察指标

采用荧光定量聚合酶链反应 (定量PCR) 检测患者HBV DNA水平, 采用日本OlympusAu2700全自动生化仪检测肝功能。随访1年, 观察治疗前后三组患者肝功能、HBV DNA水平。

1.4 统计学处理

由具有两年以上工作经验的临床医师收集数据, 采用SPSS16.0软件进行统计学分析, 计量资料采用 (±s) 表示, 组间比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝功能对比

治疗后实验组总胆红素 (TBIL) 水平显著低于单独用药组, 谷丙转氨酶 (ALT) 、白蛋白 (ALB) 水平显著高于单独用药组, 对比差异均有统计学意义 (P<0.05) 。

(±s)

注:*与单独用药组对比, *P<0.05。

2.2 HBV-DNA水平对比

实验组治疗后HBV-DNA水平显著低于单独用药组, 对比差异有统计学意义 (P<0.05) 。

(±s)

注:与单独用药组比较, *P<0.05。

2.3 不良反应

本研究中, 三组患者均未出现严重不良反应, 偶有轻度呕吐、头晕, 均给予对症处理, 无因药物不良反应引起的脱落患者。

3 讨论

乙型肝炎是由HBV引起的以肝脏损害为主的传染病, 在我国已成为危害大众健康的一类疾病。目前尚无治疗乙肝确切有效的方法, 以抗病毒、调节免疫、抗纤维化治疗为主。HBV的复制是乙肝不断发展的基础, 因此抗病毒治疗是乙肝治疗的关键, 通过抑制HBV复制达到减轻肝脏炎症、缓解肝纤维化、减少并发症的目的。目前常用的抗病毒药物有干扰素、核苷类药物、中药等, 核苷类药物是最直接的抗HBV药物, 通过组织病毒DNA复制从而起到抗病毒作用[4]。阿德福韦酯是一种单磷酸腺苷的无环核苷类药物, 在细胞内转化为阿德福韦二磷酸盐, 通过抑制病毒逆转录酶和DNA多聚酶起到对抗病毒的作用[5]。拉米夫定的作用原理与阿德福韦酯类似, 但是作用位点不同, 这为联合用药提供基础。HBV-DNA能直接反应病毒复制水平, 通过研究我们发现联合用药组的HBV-DNA水平显著低于单独用药组, 说明阿德福韦酯和拉米夫定协同抑制病毒的复制。有研究表明, 联合阿德福韦酯和拉米夫定可以提高HBV-DNA转阴率, 从另一方面支持了本研究的结果。ALT主要存在于肝细胞浆中, 细胞内浓度远高于血清浓度, 而肝细胞活性的改变可迅速引起ALT水平改变, 世界卫生组织推荐其为最敏感的肝脏指标[6]。白蛋白由肝实质细胞合成, 肝脏受损后白蛋白合成减少, 是反应肝脏功能的两个主要指标。总胆红素主要用于诊断肝脏疾病和胆道疾病, 本研究用于除外胆道疾病的肝病患者, 结果显示实验组总胆红素 (TBIL) 水平显著低于单独用药组, 谷丙转氨酶 (ALT) 、白蛋白 (ALB) 水平显著高于单独用药组, 对比差异均有统计学意义 (P<0.05) , 说明两药合用, 保存了患者的肝功能, 减少了HBV对肝细胞的损害, 而在不良反应方面, 三组患者均未出现因药物引起的脱落, 表明两种药物联合使用的安全性较高。

综上所述, 阿德福韦酯联合拉米夫定治疗乙肝效果确切可靠, 可有效抑制病毒复制, 无不良反应, 值得临床推广应用。

参考文献

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日本乙型脑炎病毒 篇7

1病例报告

患者女, 60岁。入院前7 d 无诱因反复出现突然全身抽搐、意识丧失, 伴发热, 每次持续4 min左右, 苏醒后记忆力明显下降, 且呈进行性加重, 不能理解家人说话, 答非所问, 多动, 寻衣摸床, 体温波动于37.2℃～38℃。曾到当地医院行头颅CT检查, 未见异常, 一般对症治疗, 效果欠佳, 于2007年7月3日收入我院。发病前无精神异常病史及癫痛病史。入院时查体:体温 37.2℃, 脉搏 72次/min, 呼吸20次/min, 血压90/60 mm Hg, 患者情绪抑郁、不能理解他人问话、答非所问, 即有明显的记忆力障碍, 时间、人物定向障碍, 颈部抵抗感, 四肢肌力五级, 伴无目的动作增多, 双下肢深、浅感觉、触觉、本体感觉不配合, 双腱反射等叩对称, 病理反射未引出, 双侧kerning征 (+) 。脑脊液检查:压力正常, 白细胞28个/高倍视野, 蛋白0.29 g/L, 糖3.93 mmol/l, 氯化物 103 mmol/l。头颅MRI示正常。初步诊断:单纯疱疹病毒性脑炎 (paraneoplasticlimbic encephalopathy, PLE) 。入院后患者再次出现癫痫发作1次, 持续约5 min, 清醒后记忆力进一步下降, 即给予患者抗病毒 (阿昔洛伟 0.5 g, 4次/d) 、脱水降颅压、脑保护、控制癫痫发作 (卡马西平 0.1, 3次/d) 等治疗3 d, 患者体温达38℃, 仍反复发作肢体抽搐, 认知功能障碍逐渐加重, 加大抗病毒药物剂量 (阿昔洛伟 0.75 g, 3次/d) 。2007年7月10日复查脑脊液检查:压力正常, 白细胞8个/高倍视野, 蛋白0.28 g/L, 糖3.12 mmol/l, 氯化物 105 mmol/l。乙脑抗体 (-) , 红细胞沉降率 76 mm/h, 风湿系列阴性, TC-12未见异常。加用抗痨治疗 (利福平 异烟肼 吡嗪酰胺) 5 d, 症状无改善, 2007年7月17日复查红细胞沉降率 123 mm/h, 肺及腹部CT示右肺下叶结节并纵隔淋巴结肿大, 转移不能除外, 双侧胸腔积液、胸膜肥厚, 肝右叶病灶考虑转移瘤。请化疗科会诊, 考虑患者一般情况较差, 不能耐受化疗, 应家属要求转回当地医院继续治疗。

2讨论

副肿瘤性边缘叶脑炎是由恶性肿瘤导致的一种神经系统副肿瘤综合征, 男性多于女性, 发病年龄26～80岁, 原发肿瘤多见于小细胞肺癌或霍奇金病, 少数由乳腺、卵巢、子宫、肾上腺、睾丸等恶性肿瘤引起, 恶性胸腺瘤有时也可导致本病[1]。本病并非是一局灶性病损, 而是在中枢神经系统各层次中均有病理发现, 边缘叶的深部灰质及周围的白质结构大量的神经元缺失伴反应性小胶质细胞增生及血管周围袖套状淋巴细胞浸润是其主要病理特点, 半球和边缘叶表现最为突出, 主要表现为健忘症候群, 以记忆力、定向力障碍为主, 伴有顺行性遗忘 (对发病后的事情忘记) 和虚构, 多数患者伴有颞叶癫痫和其他类型的癫痫发作;精神症状表现为明显的情感障碍伴有严重的焦虑和抑郁;临床特征除了健忘症候群、精神症状外, 可伴有小脑变性、脑脊髓炎、脑干脑炎及亚急性感觉神经经病等, 可出现肌阵挛、言语障碍、小脑体征等, 由于缺乏特异性体征, 其临床表现多样化, 诊断较为困难。目前临床诊断主要依据症状、体征及脑脊液特异性抗体检查, 且排除了脑实质和脑膜转移、代谢性脑病、药物、放射等损伤之后才能确诊, 疾病的早期容易误诊, 特别是本病神经系统表现在肿瘤诊断前数个月已发生。治疗以积极治疗原发肿瘤及对症处理为主, 据文献报道原发肿瘤化疗后或切除后病情得到控制时, 边缘叶脑炎可以缓解, 也有报道血浆置换对本病有效, 其他尚无有效治疗[2]。故及早认识这些症状作为恶性肿瘤的一种临床表现, 对进行早期诊断及治疗极为重要。

本例为60岁女性, 小细胞肺癌, 反复癫痫发作及进展性痴呆, 头颅MRI无阳性发现, 脑脊液检查淋巴细胞反应, 临床表现与PLE极为相似, 且临床上对肿瘤浸润、转移引起的病变比较重视, 而对癌肿引起的非转移性脑病重视不足, 导致临床误诊的主要原因, 失去最佳治疗时机。文献报道[3]部分神经症状是可逆转的, 故及早认识这些症状作为恶性肿瘤的表现, 可使患者获得早期诊治应引起临床医生的足够重视。

参考文献

[1]陈齐鸣, 钱伟东, 宋文英, 等.副肿瘤性神经系统综合征的临床分型、相关肿瘤及免疫学研究.蚌埠医学院学报, 2004, 29 (5) :354.

[2]许景芝, 黄宇明.肺癌致副肿瘤边缘叶脑炎一例.罕少疾病杂志, 2006, (1) :56.