乙型肝炎DNA（精选7篇）
乙型肝炎DNA 篇1
乙型病毒性肝炎在临床中是较为流行的, 危害性较为严重的一种病毒性肝炎疾病[1]。目前临床中对乙型肝炎进行诊断、判定治疗效果与传染性的效果指标通常为多项血清学标志物检测, 当然HBV-DNA则为公认的显示病毒存在的一种特异性指标[2]。本文选取640例HBs Ag阳性患者标本, 分析乙型肝炎病毒DNA与血清标志物的关系, 现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料选取本院2012年8月~2014年8月640例HBs Ag阳性患者标本, 其中男420例, 女220例, 年龄16~78岁, 平均年龄 (37.2±10.5) 岁。
1.2 方法
对HBV-DNA载量检测, 应用实时荧光定量聚合酶链反应 (FQ-PER) , 试剂盒购于杭州博日科技有限公司, 仪器为Line-Gene荧光定量PCR检测仪, 所有操作均严格按照说明书执行。对检测结果予以分析, 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 法检测HBs Ag、乙型肝炎表面抗体 (抗HBs) 、HBe Ag、乙型肝炎e抗体 (抗-HBe) 、乙型肝炎核心抗体 (抗-HBc) 。
2 结果
经血清免疫标志物检测显示, 276例“大三阳”患者中HBV-DNA阳性270例 (97.8%) , 230例“小三阳”患者中HBV-DNA阳性60例 (26.1%) 。见表1。312例HBe Ag (+) 中HBV-DNA阳性306例, 阳性率98.1%, 328例HBe Ag (-) 中HBV-DNA阳性92例, 阳性率28.0%, 328例HBe Ag (-) 中HBV-DNA大部分出现在抗HBe (+) 血清中。见表2。
注:HBV-DNA (+) 为HBV-DNA拷贝量>103copies/ml
3 讨论
HBV感染极有可能导致血液中相关抗原、抗体及病毒DNA的形成, 目前在临床中对HBV感染的实验室诊断指标通常为血清学标志物、HBV-DNA。经研究可知, 应用ELISA法检测HBV的血清学标志物, 而且采取荧光定量PCR检测血清HBV-DNA水平, 且对HBV-DNA与血清学标志物关系予以准确分析[3]。
在本文选取的640例HBs Ag阳性乙型肝炎患者中, 其病毒标志物存在不同组合方式, 通过对其与HBV-DNA相关性分析, 显示HBV-DNA与HBe Ag存在较为显著的一致性, 312例HBe Ag (+) 血清中HBV-DNA阳性率98.1%, 由此可知HBV-DNA可以在发生HBV感染的早期得到检测。有资料显示, 血清HBV-DNA、HBe Ag基本会一起产生或消失, 所以HBV-DNA呈现阳性时对于乙型肝炎的临床诊断具有促进作用[4]。328例HBe Ag (-) 血清中, HBV-DNA阳性率28.0%, 但是通过其他检测方法依然可以显示在一些HBe Ag阴性检测到HBV-DNA, 出现此现象是因HBV为了能够避免宿主形成的免疫反应通常出现一定变异, 使得HBe Ag呈现阴性, 但此现象也并非说明HBV清除或复制能力有降低现象, HBV-DNA的确能够防止由于HBe Ag变异而出现阴性误导。276例“大三阳”患者中, HBV-DNA阳性270例, 阳性率达到97.8%, 230例“小三阳”患者中HBV-DNA阳性60例, 阳性率为26.1%。有研究资料显示[5], 大部分“大三阳”患者的血血液液中中会会检检测测到到HHBBVV--DDNNAA, , 其其阳阳性性率率达达到到9966%%, , 有的患者e抗原转变成e抗体后也就是“大三阳”转变成“小三阳”后, 血清HBV-DNA检出率下降到30%, 表明患者病毒依然没有完全消除和已经停止复制。此情况与后病毒遗传物质发生突变或与宿主基因发生整合现象﹑用药后未再复制、血清病毒炎症清除导致血清HBV-DNA消除或降低到极低浓度 (低于检测下限) 存在一定关系, 此类情况并非确切的表明患者已经恢复, 需进行随访且予以血清HBV-DNA的复查工作, 防止出现误诊现象。
参考文献
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乙型肝炎DNA 篇2
1 材料与方法
1.1 材料
pBR322-HBV质粒 (含3个HBV基因组) 、DH5a菌种, 由生命科学学院微生物实验室提供。
培养基有LB液体培养基、LB固体培养基和SOC培养基, 试剂包括pBS-T连接试剂盒、dNTP、TaqDNA聚合酶、IPTG、xGal、SDS、琼脂糖、二甲基甲酞胺购、RNase。以上及相关溶液均购自购自Biolabs公司。
1.2 方法
1.2.1 引物和探针的设计思路:
使用专业软件根据乙肝病毒DNA前C区、C区和X区的保守序列的特点, 针对性的设计出特征性引物和对应的TaqMan探针和TaqMGB探针。
1.2.2 PCR扩增pBR22-HBv质粒前e区、e区和X区保守序列:
为目的基因的扩增做好准备, 包括流程及所需原料, 在BioRadpTC-200PCR仪上94℃10min、94℃10s、59℃30s, 重复40次。
1.2.3 AT亚克隆:
挑取在LB培养基上生长的DH5a单菌落接种于5ml LB培养基中并在适宜条件培养3h, 取出、离心、弃上清再冰浴30min后制成感受态细胞;电泳待检测的PCR产物:直接使用pBs-T连接试剂盒16h, 然后去5μl连接液至100μl感受态细胞中并混匀, 再冰浴、热激、快速冰浴后加入400ml SOC培养基中, 温浴40min, 然后均匀涂布于90mn LB平板上, 于36℃的恒温条件下培养15h。
1.2.4 HBV-DNA荧光定量PCR定量DNA标准的制备:
最开始的工序是进行目标质粒的提取与纯化, 从扩大培养的阳性亚克隆菌液取lml离心、干燥后置于100μl冰预冷的碱裂解液中, 剧烈振荡后, 再离心、重复多次, 收集沉淀核酸, 以紫外分光光度计为主要工具, 检测含有乙肝病毒DNA的前C区、X区及C区保守序列的pBS-T质粒的浓度大小。根据公式可以得出所提取的每种质粒的拷贝数。然后用TE溶液进行10倍的倍比稀释得到标准品。以上述质粒亚克隆后的载体为模板, 在PCR仪上做温度梯度PCR, 从中找出亚克隆载体的最适退火温度。选择好PCR反应条件和反应体系后, 循环45次, 72℃5min。然后分步电泳, 并分别在各区的最佳退火温度条件下, 用10~1010copies/μl的10种浓度的质粒为模板进行PCR扩增操作。PCR扩增后以琼脂糖凝胶电泳的方法确定灵敏度, 并找出最高灵敏度的区段。
1.2.5 HBV-DNA荧光定量PCR定量检测标准曲线的制备:
在上部操作中确定的最高灵敏度的保守区段为基础, 以荧光定量PCR仪为主要工具, 选用10~1010copies/μl浓度不同的10个质粒标准品, 设置荧光定量PCR, 荧光定量PCR反应采用通用反应条件和反应体系。
1.2.6 HBV-DNA荧光定量PCR检测线性范围、精度和重复性确定:
对质粒标准品测定批内变异系数和批间变异系数, 分别为一个样品同时做出10个循环阈值然后求变异系数或者10个待检测物重复做4次循环阈值然后求变异系数。
2 结果
2.1 前C区、C区和X区目的片段
扩增后得到的保守序列分别为113bp、101bp和57bp。
2.2 HBV-DNA标准品制备
用紫外分光光度计测出的数据统计见表1, 然后将溶液倍比稀释, 每组稀释10个浓度梯度, 直到1010copies/2μl。
2.3 常规PCR检测灵敏度
以带有前C区的pBS-T质粒载体为模板的PCR扩增产物中, 第3~6泳道分别以58.3℃、58.6℃、59.1℃、59.7℃为最佳退火温度, 58.9℃下扩增效果最佳。在此温度下, 分别以上述10种梯度浓度的质粒为模板进行常规PCR扩增。4~10泳道均能扩增出产物, 且随质粒浓度的降低而减少。表明带有前C区质粒最高稀释度为104copies/2μl。其中, 以1010copies/μl浓度质粒为模板的扩增反应中表现出非特异扩增的现象。
同样的, 带有C区的为第4~7泳道, 平均58℃, 最高稀释度为106copies/2μl;带有X区的为第2~4泳道, 平均51℃, 最高稀释度为105copies/2μl。
2.4 HBV-DNA荧光定量PCR检测标准曲线
通过比较前C区、C区和X区保守序列的pBS-T质粒标准品灵敏度, 前C区保守序列最高。选取103~1010ceopies/2μl等不同浓度的质粒标准品在荧光定量PCR上扩增, 其曲线如下所示, 低于5×103copies/μl的质粒浓度未见扩增曲线, 可见5×103copies/μl为其能达到的灵敏度。见图1。
注:1~7分别为5×109、5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103copies/μl的扩增曲线
注:横坐标为循环阈值, 纵坐标是起始拷贝数的对数值
由图2可知, 模板浓度越高, 循环阈值 (Ct) 越小, 荧光信号随着循环数的增加逐渐增强, 经过计算浓度降低10倍时, 起始循环数增加4次, 两者呈负相关的趋势。其中相关系数为99.5%, 说明可信度较高。
2.5 HBV-DNA荧光定量PCR精度
将5×106copies/μl的质粒标准品10个同时在同等条件下进行荧光定量PCR, 得出循环阈值分别为:24.069、25.513、23.887、25.233、24.511、24.856、25.489、26.211、25.023、24.711, 均值为24.955, 标准差为0.688, 变异系数为2.800%, 说明荧光定量PCR检测的精确度较高。
2.6 HBV-DNA荧光定量PCR重复性
将5×104copies/μl~5×108copies/μl 5个不同浓度的质粒标准同时在荧光定量PCR仪上重复做4次扩增, 得到不同循环阈值和变异系数, 其变异系数分别为2.079%、2.214%、3.702%、3.442%和2.823%, 结果均<5%, 表明重复性好。
3 讨论
3.1 常规PCR分析
FQ-PCR一般经过设计扩增目的DNA序列所需的引物和探针、选择高效率扩增流程、制备已知浓度的包含目的DNA的相关载体并倍比稀释后制作标准曲线及根据标准曲线确定样品DNA初始量4个步骤[2]。引物是决定PCR特异性的寡核昔酸片段, 本实验选择HBV前C区、C区和X区的保守序列设计引物, 以此为基础, 来达到实验目的。
从原始质粒pBR-322-HBv中扩增前C区、C区、X区保守序列时, 均采用一个扩增条件, 设定好预变性时间使其双链充分解开而结合引物, 同时, 变性后温度快速冷却至40℃~60℃加快其结合, 退火温度与时间、引物长度、碱基组成及其浓度有关[3]。在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大提高PCR反应的特异性, 时间一般为30~60s, 本试验中, 退火温度以60℃为宜。
经目的序列亚克隆至载体后, 应针对性地改善扩增条件。通过对位于HBV 3个保守区段常规PCR灵敏度的检测得出前C区灵敏度最高, 以此作为目的序列用于实时荧光定量PCR检测结果较好。
3.2 HBV-DNAFQ-PCR检测效果评价
毫无疑问, PCR技术己成为病毒等病原性疾病灵敏的检测手段[4]。新世纪以来, 将PCR技术用于血液HIV-1、HCV、HBV的检测越来越广泛, 以荧光定量PCR为代表的检测方法可更加有效的待检测序列进行定量分析。各管内实验中完全封闭而无交叉污染, 在具有常规PCR优势的同时, 兼具计算机完成、DNA扩增的高效性、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性[5]。还可避免非特异性扩增及扩增产物污染而导致的假阳性的可能, 也解决了常规PCR对工作人员的危害和污染环境等问题, 提高了工作效率, 其在常规PCR基础上添加了荧光双标记探针, 和传统ELISA、常规PCR等方法相比具有一定的优势, 可根据荧光信号的循环阈值变化对比阳性参照标准品即可由电脑得出具体的定量结果, 可以准确地反映出乙肝病毒DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。
FQ-PCR是通过实时检测扩增过程中荧光物质强度变化, 对待测DNA进行定量分析的一种方法[6]。由上图可见, 在一定浓度范围内, 模板浓度与循环闭值之间具有较好的相关性, 在检测1010copies/2μl浓度的模板时, 常规PCR可出现非特异扩增, 而FQ-PCR则没有。当然, 在低于104copies/2μl浓度的待检测液中则没有荧光曲线的生成。同时, 理论上, 10倍稀释后扩增的循环阈值应该相差3.3倍, 本试验结果中可能是由于样本倍比稀释过程中的误差造成。当然, FQ-PCR技术作为近几年发展起来的新技术, 费用较高, 一定程度上限制了其应用, 故需要该项技术的不断成熟和成本的降低。
摘要：目的 用荧光定量PCR对HBV-DNA载量进行实验性研究。方法 扩增含有3个乙肝病毒基因组pBR322质粒中的乙肝病毒目的序列, 并通过AT亚克隆至pBS-T载体中。经过筛选、鉴定及测序验证保证相对更高的拷贝数。对3个保守序列进行了常规PCR退火温度的优化和灵敏度的检测, 建立荧光定量PCR反应体系从而制备标准曲线。结果 曲线相关系数为99.5%, 具有较高的可信度。负相关范围在5×1035×109copies/μl。不论是批内还是批间其变异系数值均小于5%。结论 荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA可以灵敏度好, 准确度高, 应加大研究降低成本应用于检验应用。
关键词：HBV,DNA,荧光定量PCR法,扩增曲线,标准曲线
参考文献
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乙型肝炎DNA 篇3
1 对象和方法undefined
1.1 对象
99例HBV感染者血清采自江苏省淮安市第四人民医院门诊(61例)和新入院患者(38例)。其中慢性乙肝患者84例,肝硬化患者15例;男性69例,女性30例;年龄21～69岁,平均年龄40.5岁。诊断标准符合2000年第10次全国传染病及寄生虫病学会和肝病学会分会联合修订的病毒性肝炎防治方案[3]。同时选10例健康检查者作为对照。
1.2 主要仪器
7300 Real Time PCR System为美国PE公司产品,全自动时间分辨荧光免疫仪由上海新波生物有限公司提供。
1.3 主要试剂
HBV-DNA实时荧光定量PCR试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司,检测灵敏度为1.00×102 U/ml。两对半试剂盒由苏州新波生物有限公司提供。
1.2 方法
①采用全自动时间分辨荧光免疫分析法检测免疫学指标,筛选出99例乙肝三阳的病例,具体操作参照说明书。其中小三阳(HBsAg、HBeAb 、HBcAb阳性)19例,大三阳(HBsAg、 HBeAg、HBcAb阳性)80例。②99例血清、唾液HBV-DNA定量检测,采用实时荧光定量PCR法。血清HBV-DNA检测取患者清晨空腹全血2 ml,离心取上清200 μl于1.5 ml灭菌离心管中,-20 ℃保存,唾液HBV-DNA定量检测取患者清晨漱口前唾液400 μl于1.5 ml灭菌离心管中,-20 ℃保存,检测当天取出血清和唾液,室温溶解,各取100 μl加入等体积核酸提取液,12 000 r/min离心10 min(离心半径15 cm),弃上清,于沉淀中加入20 μl提取液B混匀,100 ℃煮10 min,12 000 r/min离心5 min备用。取PCR反应管,分别加入处理后的样品(包括血清、唾液、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品)、阳性定量参考品各2 μl于PCR反应管中,8 000 rpm离心数秒,反应管置于7300实时荧光定量PCR仪样品槽,设置反应条件进行扩增,反应条件为93 ℃×2 min;93 ℃×45 S→55 ℃×60 s,10个循环,再按93 ℃×30 S→55 ℃×45 s,30个循环,荧光采集点选在55 ℃45秒,保存条件,运行仪器。
1.3 统计学处理
为了便于统计学处理,鉴于HBV-DNA试剂盒检测的敏感性,将HBV-DNA<1.00×103 U/ml的定为100 U/ml。计数资料组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果undefined
2.1 99例乙肝患者血清和唾液中HBV-DNA含量
99例乙肝患者血清中HBV-DNA>103 U/ml者90例,阳性率为90.9%,唾液中HBV-DNA>103U/ml者65例,阳性率达65.7%。其中血清HBV-DNA含量在103～104 U/ml之间10 例,104～106 U/ml之间33例, 106～107 I/ml之间的42 例,含量﹥107 U/ml的5例。相对应唾液HBV-DNA含量在103～104 U/ml之间的19例,104～106 U/ml之间的39例,106～107 U/ml之间的7例。10例健康检查者血清和唾液中均未检出HBV-DNA,见图1 。由图1可以看出乙肝患者血清和唾液中HBV DNA水平呈显著正相关(r=0.82)。
2.2 99例乙肝患者血清和唾液中HBV-DNA阳性率比较
乙肝患者血清和唾液中HBV-DNA阳性率分别为90.9%和65.7%,差异有统计学意义(χ2=18.57,P<0.01)。见表1。
3 讨论undefined
HBV进入人体后主要是在肝脏进行复制,亦可在肾脏、唾液腺进行增殖,并通过血液、尿液、唾液、汗液、精液、乳液等体液排出体外。曾有报道当HBeAg阳性患者每毫升血液中HBV-DNA达到161 013病毒颗粒时,也能在其他体液(如唾液)中发现病毒颗粒。HBV-DNA是HBV复制与传染的最直接和可靠的依据[4]。国内HBV的感染具有典型的家族聚集性,除血液直接传播外,其他体液传播也不能忽视,唾液是日常生活亲密接触最易接触到的一种体液,因此研究唾液中是否含有HBV-DNA及病毒含量的高低具有重要意义。
唾液HBV-DNA的检出,进一步提示乙型肝炎患者唾液中存在着活跃的病毒复制。国内未见对唾液HBV-DNA进行规范定量检测方法的文献报道。我们采用实时荧光定量PCR的方法,检测99例乙肝患者血清和唾液HBV-DNA的病毒载量,用以探讨唾液传播在乙型肝炎传播中的临床意义。结果显示, 乙肝患者的唾液中存在大量的乙肝病毒,唾液HBV-DNA检出率,随血清HBV-DNA效价的增高而上升。这与Van der Eijk等文献报道相似[5]。
本研究结果还显示,血清和唾液HBV-DNA阳性率差异具有统计学意义(χ2=18.57,P﹤0.01),且唾液与血清中HBV-DNA病毒载量呈显著正相关(r=0.82),这与胡大春等[6]和潘红英等[7]的报道相一致。张文军等[8]研究了唾液、尿液、胃液,同样证实唾液中含有大量HBV,也提出了唾液传染肝炎的可能,至于唾液中HBV的确切来源,目前尚未完全清楚,有报道认为唾液中HBV可能来源于外周血白细胞[9]。本文的研究无疑为乙肝通过体液传播的理论提供了临床依据,提示人们在感染者密切接触的人群中,尤其是家庭成员中有口腔黏膜破损者更应采取措施切断这种可能的传播途径,口腔医务人员应提高对就诊患者通过唾液交叉感染的警惕,加强对口腔器械的消毒工作。同时也进一步论证了乙肝患者的唾液极有可能是乙肝病毒传播的另一种重要途径,精确检测唾液中HBV-DNA含量可评价病毒在体内复制程度,进而判断患者的传
染力度,为慢性乙型肝炎的流行病学研究提供了新的思路和理念,但对唾液传播乙肝病毒的许多机制还需要进一步的研究与探讨,尤其是唾液中HBV-DNA临界传染量的确定是值得我们进一步研究的目标。
摘要：目的 探讨乙型肝炎(乙肝)患者唾液中HBV-DNA水平,为乙型肝炎病毒(HBV)经唾液传播提供临床依据。方法 采用实时荧光定量PCR法检测乙肝患者血清和唾液中HBV-DNA含量。结果 99例乙肝患者血清和唾液中HBV-DNA的阳性率分别为90例(90.9%)、65例(65.7%)。结论 乙肝患者唾液中HBV-DNA的阳性率与血清HBV-DNA的阳性率之间差异有统计学意义(P<0.01),乙肝患者唾液中HBV-DNA含量与血清HBV-DNA含量呈显著正相关(r=0.82)。
关键词：HBV-DNA,血清,唾液,相关性
参考文献
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乙型肝炎DNA 篇4
1 材料与方法
1.1 研究对象
本院门诊及住院确诊或怀疑乙型肝炎患者505例, 男331例, 女174例;年龄16~62岁。晨起空腹采血后立即分离血清, 一部分当天进行HBV血清学检测, 另一部分置高压锅灭菌的Eppendof管, -20℃待检。505例血清中检出主要特殊血清学模式4种共42例 (A模式:HBSAg、HBe Ag、抗HBC阳性;B模式:HBs Ag、抗HBs、抗HBe Ag、抗HBc阳性;C模式:HBs Ag、抗HBs、抗HBe、抗HBc阳性;D抗HBc阳性) , 以HBs Ag (+) 、HBe Ag (+) 、抗HBc (+) 作对照组 (n=225) 。另外的238例, 包括有HBs Ag (+) 、抗HBe (+) 、抗HBc (+) 150例, HBV DNA为 (4.51±1.57) 拷贝/ml, 阳性率66.0% (99/150) ;抗HBs (+) 、抗HBe (+) 、抗HBc (+) 74例, HBV DNA含量为 (4.19±1.32) 拷贝/ml, 阳性率为28.4% (21/74) ;抗HBs (+) 14例, HBV DNA全部阴性。
1.2 实验方法
HBV DNA含量的检测利用Taq Man技术的荧光定量聚合酶链反应, 使用美国Roche公司生产的Light Cycle实时荧光监测DNA分析仪及深圳匹及公司提供的配套试剂。HBV血清学检测采用美国Abbott公司生产的AXSYM全自动面疫分析仪及配套进口实剂, 检测HBs Ag、抗HBs、HBs Ag、抗HBe、抗HBc 5个项目, 均采用微粒子酶免疫分析法 (MEIA) 检测, 操作及指控均按公司操作规范进行。
1.3 统计学方法
HBV DNA含量以表示, 不同模式间比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
16例A模式处于HBs Ag (+) 向抗HBe (+) 转换过程中, HBV DNA含量明显低于转换前对照组模式, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 说明此时病毒的传染性已有所下降, 但比转换后模式 (C) 略高, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。B、C模式的HBV DNA含量分布明显不同, B模式HBV DNA含量与对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05) ;C模式HBV DNA含量与对照组比较明显偏低, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。见表1。同时观察到这2种模式的抗HBs滴度均<50mu/ml, 故对于B模式同样可能处于HBe Ag (+) 向抗HBe (+) 转换过程中, C模式可能处于HBs Ag (+) 向抗HBs (+) 转换过程中。D模式可能为HBV感染后从抗HBs (+) 、抗HBe (+) 、抗HBc (+) 血清学模式向抗HBs (+) 转换, 或者如Brechot等[1]报道的HBs Ag (-) 而抗HBc (+) 的血清学模式中存在着HBV DNA的低水平复制。对此也说明了HBs Ag (-) 或HBe Ag (-) 的血清学模式中同样应该从HBV DNA含量的角度来分析HBV的复制及传染性。
注:与对照组比较, *P<0.01
3 讨论
从本组资料来看, 对于常见的血清学模式, HBV DNA含量分布情况与文献报告[2,3]基本相符。
参考文献
[1]Brechot C, Kremsdorf D, Paterlin P, et al.Hepatitis B virus DNA in HB-sAg negative patients[J].J Hepatol, 1991, 13 (4) :49-55.
[2]黄佩捃, 潘世扬, 马晓兰, 等.乙肝患者血清中HBV DNA含量的测定及其意义[J].临床检验杂志, 2000, 18 (5) :297.
乙型肝炎DNA 篇5
1 材料和方法
1.1 标本来源
本组为乐昌市人民医院从2007年7月至2009年12月门诊及体检中心进行血清学标志物检测(HBV-M)为阳性的乙型肝炎患者336例,其中男171例,女165例,16~83岁,平均为56岁。对乙型肝炎的诊断均符合2000年中华传染病与寄生虫病分会、肝病学分会修订的病毒性肝炎防治方案的诊断标准,慢性乙型肝炎的诊断符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》标准。
1.2 分组
根据入组患者的血清学检测结果进行分组。分组如下:1组:HBs Ag(+)、HBe Ag(+)、HBc Ab(+)(大三阳);2组:HBs Ag(+)、HBe Ab(+)、HBc Ab(+)(小三阳);3组:HBs Ag(+)、HBc Ab(+);4组:HBs Ab(+);5组:HBe Ab(+)、HBc Ab(+);6组:HBs Ag(-)、HBs Ab(-)、HBe Ag(-)、HBe Ab(-)、HBc Ab(-)。
1.2 仪器和试剂
1.2.1 仪器
PCR仪为中山大学达安基因股份有限公司核酸扩增实时荧光检测系统DA7600型。
1.2.2 试剂
乙型肝炎两对半检测试剂由雅培公司提供同一批号试剂;HBV-DNA试剂购于中山大学达安基因股份有限公司。
1.3 检测方法
1.3.1 DNA提取
标本处理:(1)标本的收集:通过静脉采血法采集患者的静脉血液,离心取上层血清;(2)标本的前处理(DNA的提取):取100μL血清加入等量DNA浓缩液,振荡器振荡混匀5s;12000rpm离心10min;去上清,沉淀中加入DNA提取液30μL,振荡器剧烈振荡混匀5~10s,瞬时离心数秒,100℃恒温处理10min;12000rpm离心5min,上清液备用。
1.3.2 PCR扩增定量检测
采用核酸扩增实时荧光检测,完全按试剂盒说明书操作。取PCR反应管,按顺序放入PCR扩增仪中,按下面的程序进行设定反应条件:50℃,1min→94℃,2min→(93℃,5s→60℃,30s)循环40次。直接作HBV-DNA定量分析和数据读取,结果<1.00×103copy/m L为阴性。
2 结果
实时荧光PCR检测HBV-DNA结果见表1。
3 讨论
据估计目前全世界有乙型肝炎患者及无症状HBV携带者达3.5亿人[1]。而从我国来看,人群感染率为10%~15%,约有1.2亿人口为HBV携带者,其中约10%发展为慢性肝炎[2]。HBV可通过母婴传播,引起先天性感染及婴儿成为无症状HBV携带者,形成严重的社会卫生问题。因而如何更为快速、准确地诊断对于乙型肝炎而言至关重要。目前诊断乙型肝炎最常用的指标是HBV血清标志物(HBV-M)检测,即俗称的“两对半”检测,主要反映人体对HBV的免疫反应状态。其主要反映病毒入侵人体信息,既不能直接反映HBV在患者体内的复制情况,也不能判断患者是否具有传染性。而HBV-DNA检测能直接反映病毒携带水平和携带者传染性高低,是直接反应HBV存在、活动性复制及具有传染性的可靠指标[3]。而荧光定量PCR检测法在进行HBV-DNA检测的同时可对HBV-DNA进行量化,从而可对乙型肝炎患者体内的HBV复制以及传染性有更直接的了解,有利于临床对HBV感染、选择治疗方案及判断预后提供更为客观的依据。实时荧光PCR技术不仅融合了PCR和DNA探针杂交技术的优点,直接探测PCR过程中荧光信号的变化,而且整个实验过程均在完全封闭的状态下进行,不需要PCR的后处理和电泳检测,解决了PCR定量和防污染等问题,具有快速、准确、特异等优点,是判定HBV感染及其传染性高低的一项重要诊断技术。
HBV抗原主要有4种重要抗原,临床血清学标志物检测涉及的主为HBsAg、HBcAb、HBeAg/HBeAb。其中HBsAg能刺激机体产生保护性抗体,是HBV感染的主要标志;HBcAb(+)常提示HBV处于复制状态。本研究将不同HBV血清标志物分成不同组别,采用实时荧光PCR检测技术进行检测,并与血清学检测诊断进行比较。从结果可以看出,66份HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBcAb(+)标本中有64份HBV-DNA为阳性,阳性率达到97.0%,其PCR定量拷贝数为(3.34±1.54)×107/m L;84份HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)标本有120份HBV-DNA阳性,阳性率为70.0%,PCR定量拷贝数为(4.67±2.16)×105/m L,这说明大三阳、小三阳组患者具有很高或较高的病毒复制性,传染性强。这与相关文献报道通常乙型肝炎HBV-DNA含量变化与HBV血清标志物的变化基本相一致[4]相一致;23份HBsAg(+)、HBcAb(+)标本中有8份HBV-DNA为阳性,阳性率为34.8%,PCR定量拷贝数为(1.95±1.57)×104/m L;41份HBs Ab(+)的标本HBV-DNA阳性2例,阳性率为4.9%,PCR定量拷贝数为(5.67±1.18)×103/m L;46份全阴性的标本HBV-DNA阳性2例,阳性率为2.2%,PCR定量拷贝数为(2.38±1.16)×104/m L。总体来说,从本次研究结果可以看出,大三阳、小三阳患者血清中PCR结果拷贝数均较高,而HBs Ab(+)或HBs Ag(-)的标本PCR有个别阳性结果,但其拷贝数很低。这主要是由于实时荧光PCR检测灵敏度高,能将微量的HBV-DNA也检测出来,因而本研究中有些HBsAb(+)的血清标本也检出了HBV-DNA,这可能是体内HBV存在免疫逃逸所致。
综上可知,血清学标志物检测与实时荧光PCR检测HBV-DNA二者之间既有联系又有所区别。血清学标志物检测可以间接反映HBV的表达和复制,但因为HBV的表达和机体免疫反应的强弱受多种因素的影响,所以血清学标志物检测在反映患者体内病毒复制情况时有一定的局限性。可以看出,大部分乙型肝炎患者定量PCR检测HBV-DNA的结果与HBV血清学标志物检测结果一致。但当HBV低水平复制时,血清学标志物检测方法不一定能检测出来,而实时荧光PCR检测则具有较高的灵敏性。故实时荧光PCR检测HBV-DNA在判断体内HBV是否在复制、复制程度以及HBV血清学标志阴性肝炎患者的诊断方面,较优于血清学标志物检测,值得临床推广。值得注意的是,PCR仅对复制的病毒具有检测功能,对于非复制状态的病毒感染不能进行检测,因而也不能完全代替血清标志物检测[5]。
参考文献
[1]周正任.病原生物学[M].2版.北京:科学出版社,2004.
[2]叶任高,陆再英.内科学[M].6版.北京:人民卫生出版社,2005.
[3]马兰花,任君,刘利,等.探讨实时荧光PCR法检测乙肝病毒DNA在临床中的应用[J].西南国防医药,2009,19(8):815-817.
[4]何印蕾.实时荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义[J].实用医技杂志,2006,13(22):3954-3955.
乙型肝炎DNA 篇6
1 材料与方法
1.1 标本
选择2008年2—5月间来我院住院的乙肝患者250例,均符合1995年北京第5次全国传染病与寄生虫病会议修订的诊断标准,并经临床及实验室检查排除甲丙丁戊等型肝炎。其中男性149例,女性91例。血清检测取患者清晨空腹全血2ml离心取血清150μl,-20℃保存;同时取患者清晨漱口前唾液300μl,-20℃保存。
1.2 仪器
ABI 5700型荧光定量PCR检测仪。测定值判断标准为<103U/m 1阴性,>103U/ml为阳性。
1.3 试剂
HBV-DNA试剂为中山大学达安基因股份有限公司生产。批号为2008002。
1.4 方法
血清、唾液HBV-DNA定量检测,采用实时荧光定量PCR法,检测当天取患者的冻融血清、唾液各50μl,加入等体积DNA提取液,100℃煮沸10min,室温静置2h,10 000/min转离心5min(6850g),取上清液2μl进行PCR检测。
1.5 统计学分析
应用SPSS统计软件完成数据统计分析,采用χ2检验,设定P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 250例患者血清、唾液HBV-DNA检测结果比较
250例患者中血清HBV-DNA检测为阴性者25例,占10.0%;唾液HBV-DNA为阴性者68例,占27.2%。血清HBV-DNA>103U/ml者225例,阳性率达90%;唾液中HBV-DNA>103U/ml者182例,阳性率达72.8%。血清、唾液HBV-DNA阳性率之间差异有统计学意义(χ2=24.42,P<0.01)。见表1。
2.2 血清与唾液HBV-DNA水平相关性检验
通过相关分析(r=0.79,P<0.01),证实两者间存在相关性。
注:M为测定值(U/ml)。
3 讨论
乙型肝炎的传染源是多种急性、慢性乙型肝炎病人以及HBsAg携带者,由于HBsAg携带者尚无症状,不易被发现,要控制乙型肝炎的传播首先要切断HBV的传播途径。
近年来,很多的研究发现,除血清外其他体液中也能检测到HBV-DNA[4]。我们对250例乙型肝炎患者的血清和唾液的HBV-DNA检测结果进行了比较,发现唾液与血清中同样具有较高的HBV-DNA含量,它们之间有很好的相关性。在血清中HBV-DNA含量大于103 U/ml时,在其唾液中能测出HBV-DNA。来自中国疾病预防控制中心的报告认为,当血清中HBV-DNA含量大于105U/ml时,也能导致HBV的水平传播。因此,可以认为唾液中HBV-DNA含量大于105U/ml时也能导致HBV的水平传播。高病毒含量的唾液是HBV传染源之一,可以直接感染易感人群致乙型肝炎。HBV-DNA是直接反应HBV复制状态及传染性的最佳指标,可用于判断HBV感染的严重程度和传染性。可见通过血液和唾液中HBV-DNA含量的测定均能为乙型肝炎患者在诊断治疗以及治疗过程中病毒变化提供数据,而唾液检测取材方便,从而为阻止乙型肝炎发生发展及其演变,降低发病率与病死率具有重大的社会和经济价值。
参考文献
[1]World Health Organization Hepatitis B fact sheet,2002,wwwwhoint/vaccines/hepatitisbshtmlAccessed May,2004.
[2]中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙肝防治指南.医药导报,2006,25(5):116-120.
[3]王露楠,李金明,邓巍,等.乙型肝炎病毒DNA定值冻干血清用于荧光定量聚合酶链反应测定的研究.中华检验医学杂志,2004,27(8):523.
乙型肝炎DNA 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
2008年1月至2009年6月笔者所在医院体检乙型肝炎表面抗原阴性人群544例,男274例,女270例;年龄18～81岁,平均(52.4±13.8)岁。无肝炎症状及体征,肝功能各项指标正常。清晨采空腹血,分离血清于-20℃环境保存。
1.2 试剂和方法
用酶联免疫检测法检测HBVM(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc),操作严格按试剂盒说明书进行,并采用卫生部临检中心质控血清进行质量控制,结果判定:s/co≥1为有反应性,s/co<1为无反应性。PCR检测血清HBV-DNA,操作按试剂盒说明书进行。HBV-DNA拷贝数>10×103 copy/ml为阳性。
2 结果
544例乙型肝炎表面抗原阴性体检人群中,血清标本HBV-DNA阳性率5.9%(32/544);乙型肝炎五项标志物有6种模式,以HBeAb、HBcAb阳性模式的血清HBV-DNA阳性率最高,达27.7%,HBsAb阳性模式的血清HBV-DNA阳性率最低,为2.1%,而HBV全阴性的体检人群血清中仍检出HBV-DNA,阳性率为2.8%,见表1。
3 讨论
我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高发区,人群HBV感染率达60%左右,其中HBV携带率约占10%[2],通常认为血清HBsAg阳性是判断HBV感染的主要依据,HBsAg阴转及抗-HBs的出现被认为是HBV感染趋向于恢复或HBV清除的标志,已无传染性,预后良好。然而,越来越多的证据表明,部分血清HBsAg阴性患者并不能排除已感染HBV,其具有传染性,并且部分患者仍可发生肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。因此,重新评估HBsAg阴性血液安全性及正确诊断和治疗HBsAg阴性HBV感染,是临床重要问题。乙型肝炎表面抗原阴性而HBV表现阳性,其原因为:(1) HBV基因变异。HBV-DNA序列的变异,尤其是S区和前S区的变异,可影响HBV蛋白表达而导致血清HBsAg表达阴性。(2) HBV-DNA整合到宿主染色体中,HBV-DNA的整合可导致DNA序列重排,进而影响HBsAg表达。(3) HBV免疫复合物的形成。免疫复合物中的抗体封闭复合物内抗原,试剂中抗体不能与复合体内抗原结合,从而致HBsAg假阴性结果。(4)血清内HBV病毒低水平复制。这种情况可致抗原表达降低,临床常规方法不能检测[3]。
本研究发现,血液HBsAg阴性者体内存在HBV的总阳性率为6.6%,而且不同的HBsAg阴性的肝炎标志物模式也有较大的差异(2.1%～27.7%)。目前随着抗病毒药物的广泛应用,病毒耐药及基因变异随之增加,乙型肝炎表面抗原阴性HBV感染者比例亦会逐步提高[4]。因此,对HBsAg阴性做HBV的确证实验,是非常必要的,实验表明PCR方法能够灵敏、特异、快速地检测HBV-DNA,可能是目前临床最实用的HBV确证试验方法。
参考文献
[1]王蕾,刘华,王雯静,等.低水平乙型肝炎表面抗原的检测及其临床价值评估.微生物与感染,2009,4(1)9-14.
[2]叶维洪,钟振义.肝炎学大典.天津:天津科学技术出版社,1996: 463-515.
[3]杨飞飞,卢洪洲,尹有宽,等.HBsAg阴性慢性肝炎患者肝穿刺的临床意义.肝脏,2005,10(1):30-31.