不孕不育如何检测（共6篇）
不孕不育如何检测 篇1
大理不孕不育/男性不育自我检测更高效
核心提示：男性不育的全身检查与内科方法相同，要特别留意发育、营养及精神状况，才能及早发现问题，进行相关治疗。
凡夫妇婚后同居2年以上，未采用避孕措施而未受孕，其中有女方的原因也有属于男方的病证。不孕原因中，男方占40%，女方占60%。那么，男性不育还有哪些检测方法呢？大理天龙男科医院介绍男性不育的自我检测方法如下：
一、病史
正确采集病史很重要，医生要认真负责，并替患者保密；患者也要生动配合，如实反映以下情况：
1、既往病史
是否患过淋病、腮腺炎、结核、附睾炎、前列腺炎、肾盂肾炎、膀胱炎或脊髓损伤，有无排尿困难，有无糖尿病或甲状腺性能减退等，治疗情况及效果如何。
2、职业与工种
有无接触毒物（铅、汞、磷）、放射线，是否高温作业，接触时间以及有无防护措施；营养状况;有无不良嗜好(烟、酒)等。
3、既往检查与治疗情况
男方精液检查结果、采集时间与方法；曾否治疗，效果如何;女方检查的情况。
4、家族史
家族中有无不育症、两性畸形、遗传病、结核病等患者。
5、婚姻及性生活情况
包括对性生活的态度，情况与频度，有无遗精、阳痿、早泄等，婚前有无自慰习惯；夫妻感情如何，妻子的健康情况，性生活是否协调等；结婚年限、同居时间及是否采取过避孕措施。
二、体格检查
包括全身及生殖器官检查。全身检查与内科方法相同，特别要留意发育、营养及精神状况，但重点则是生殖器官的检查，检查内容包括：
1、阴茎
留意有无严重的包茎、硬结、炎症用肿瘤或发育异常。
2、尿道
有无瘘孔、下裂、硬结。
3、前列腺
经肛诊可检查其大小，有无硬结、肿物，还可推拿取前列腺液检查。
4、睾丸
丈量其大小、触诊硬度，有无硬结、压痛、肿物，是否为隐睾。
5、精索
触摸其中输精管的硬度，有无结节、压痛，有无精索静脉曲张。
编辑：猫娘、
不孕不育如何检测 篇2
关键词：不孕不育患者,生殖性,免疫抗体,检测分析
当前时期,导致不孕不育症的原因越发复杂,10%～15%的已婚夫妇患有该病症,而其中约有30%～40%患者患上此种疾病,与其免疫性抗体存在明显的联系,由免疫抗体造成的不孕症成为人们关注的焦点[1]。目前,免疫性抗体的检测作为临床治疗不孕不育症的主要方法,获得了较为显著的疗效,该检测结果普遍被用来作为诊断及鉴别不孕不育症发病机理及治疗方法的参考指标。本院对2010年10月～2012年10月来我院就诊的女性不孕不育症患者4680例的血清进行了检测,现将其结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2010年10月～2012年10月,我院诊治不孕不育女性患者4680例,年龄22～39岁,平均婚龄不少于2年,通过对患者的年龄、病史、流产史进行询问,排除其中原因不明的器质性病变患者。
1.2 检查方法
所有患者均被采集2ml的静脉血,用来实施血清分离试验。四种抗体检测方法为ELISA法,即抗精子抗体,Anti-sperm antibodies,抗卵巢抗体,Anti-ovarian antibodies,抗子宫内膜的抗体,Endometrial antibody,抗心磷脂的抗体,Anti-cardiolipin antibodies。试剂盒的选用(安群生物工程公司提供)、操作、结果判断均按照标准的要求进行。本次研究共检测4680例不孕不育病患,其中原发不孕组患者360例、继发不孕组1500例、反复流产不孕组2300例、孕早期停止胚胎发育不育组520例实施独立的检查记录分析。
2 结果
原发不孕组、继发不孕组、反复流产不孕组、孕早期停止胚胎发育不育组患者的AsAb、AoAb、EmAb、AcAb四种抗体阳性检出率分别为10.34%、10.53%、23.73%、11.93%;21.43%、64.19%、46.73%、15.41%;15.80%、47.20%、41.33%、25.65%;15.38%、8.91%、28.68%、22.92%。详见表1。
3 讨论
AsAb抗精子抗体作为临床上最早确定的抗生育类的抗体,并非任何情况下所有人都可以具备,就女性来讲,它是在某些特定的因素诱发而产生的,比如,生殖道感染或黏膜损伤[2],该抗体一旦发生,女性机体就会对精子形成免疫作用,进而造成免疫性的不育症状。从本院对1005例患者的AsAb进行检测,得出阳性病例175例,其阳性率达到17.41%的结果可以看出,AsAb对于女性不孕不育患者的影响极为显著。临床上,此类患者的治疗可以采用人工助孕手段,以及中西医结合免疫治疗法进行诊治,使呈现阳性的患者成功受孕生育。
AoAb作为一种抗体,其靶抗原被置于卵母细胞、卵巢颗粒细胞及间质细胞等场所,患者遭受创伤或出现感染症状,都会使AoAb在卵巢抗原大量释放的情况下迅速产生,并干扰胚胎细胞的分裂,使卵泡闭锁的速度加快,最终导致患者不孕[3]。本院共对1267例患者检测了AoAb,其中阳性例数为538,其阳性率达到了42.46%,在继发不孕方面更是达到了64.19%,明显地造成不孕,临床上可通过人工助孕来帮助患者解决此类问题。
EmAb抗体是将子宫内膜作为其靶细胞,并诱发诸多的免疫病理反应,而造成子宫内膜异位等病症。我院对1545例患者进行EmAb检测,分别得出了23.73%(原发不孕)、46.73%(继发不孕)、41.33%(反复流产不育)、28.68%(孕早期停止胚胎发育不育)的阳性率,可以说EmAb抗体应用于临床上对不孕不育症状进行诊断及观察十分有益。
AcAb作为免疫性抗体中极其重要的一类,通过本院347例反复流产患者的检测结果可知,在流产方面的阳性率达到25.65%,是造成流产不孕不育症的主要原因之一。在临床治疗不孕不育症患者时,应重点对具有流产史患者开展AcAb方面的检验,以便于进行针对性的治疗。同时,在借助AcAb诊断具有流产史患者发病的病因时,医疗卫生人员还要通过问询、检验及复查(约在检测后的2～3个月内实施),判断患者在近期内是否有感染史,或患者目前是否处于严重感染的状态,以避免感染问题所造成AcAb抗体含量的变动,确保其诊断结果的精准性。患有流产史且AcAb阳性系数较高的患者,非常容易出现流产现象,在进行治疗的过程中,人工助孕的技术一般不甚适用。
参考文献
[1]吴艳,钟路,赵英,等.海南地区不孕不育患者的生殖免疫性抗体检测分析[J].中国妇幼保健,2008,23(27):3853-3855.
[2]蔡智慧,冯丽,高新萍,等.生殖免疫性抗体产生及导致不孕机制相关研究进展[J].医学研究与教育,2012,29(06):65-69.
不孕不育如何检测 篇3
[关键词]不孕不育；抗精子抗体；抗子宫内膜抗体；抗心磷脂抗体；抗卵巢抗体
女性不孕不育症为临床妇科常见病，严重影响患者家庭和睦以及社会的和谐。随着生育年龄的增加，女性不孕症有逐年上升的趋势，其中免疫因素在越来越受到临床工作者的重视。据文献报告，有近一半的不明原因不孕与免疫有关。因此本次研究2014年2月～2015年7月期间我院不孕不育门诊接诊的520例不孕不育患者的抗精子抗体（AsAb）、抗子宫内膜抗体（EmAb）、抗心磷脂抗体（ACAb）、抗卵巢抗体（AOAb）四项生殖免疫抗体进行检测，旨在探讨自身免疫抗体的检测在不孕不育患者中的应用价值，为不孕不育的临床诊断提供依据。现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2014年2月～2015年7月期间我院不孕不育门诊接诊的520例不孕不育患者作为研究对象，年龄20～42岁，平均（34.6±2.5）岁；病程2～11年，平均（3.2±1.4）年。根据患者的具体情况将其分为3组：原发不孕组（160例），占30.77%；继发不孕组（240例），占46.15%和自然流产组（120例），占23.08%。自然流产1～6次，平均为（2.3±0.7）次。所有患者均符合《妇产科学》第7版不孕不育的诊断标准。排除感染、内分泌异常、生殖道畸形、输卵管不通畅、排卵异常以及其他的病变，且排除男方不孕的因素。对三组患者采用化学发光的方法检测抗自身抗体，并比较分析。3组患者年龄、性别及体重指数等一般资料差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2方法
抽取所有患者3mL的静脉血，分离血清备用。血清抗精子抗体（AsAb）、抗子宫内膜抗体（EmAb）、抗心磷脂抗体（ACAb）、抗卵巢抗体（AOAb）4项采用化学发光的方法检测抗自身抗体，试剂盒购自源德生物工程有限责任公司，操作按说明书。
1.3观察指标
观察三组AsAb、EmAb、ACAb、AOAb检测结果。比较分析三组患者免疫抗体阳性检出率，免疫抗体阳性指四种抗体中至少有一项为阳性。
1.4统计学处理
采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用x2检验，以P<0.05为差异有统计学意义
2结果
2.1血清4种免疫抗体检测结果比较
原发性不孕组AsAb、EmAb、AcAb的阳性率均明显低于继发不孕和习惯性流产组，差异有统计学意义（P<0.05），而继发性不孕和习惯性流产组之间差异无统计学意义（P>0.05）。对比三组患者AOAb患者阳性，差异均具有统计学意义（x2=8.09，P<0.05）。见表1。
2.2三组免疫抗体阳性率比较
原发性不孕组免疫抗体阻性率明显低于继发性不孕组和习惯l生流产组，差异有统计学意义（P<0.05）；继发性不孕和习惯性流产组免疫抗体率差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
3讨论
不孕症是一种特殊的生理缺陷，对女性的身心健康及家庭带来较为严重的身体和精神伤害。近年来，随着女性性观念的变化，受晚婚晚育、人工流产、性传播性疾病等因素的影响，女性发病率正在逐年上升。治疗不孕不育的关键在于针对病因进行治疗，导致不孕症的病因复杂，且涉及多个领域，其中，部分患者病因与自身免疫抗体有密切的关系，是由于生殖系统抗原的自身免疫或同种免疫引起的不孕症，因此，近几年，免疫因素在越来越受到重视。生殖免疫抗体可以通过影响精子的活性、阻碍精卵的结合、干扰胚胎着床以及胚胎的发育等多个途径去干扰生殖的过程。大量研究证明，AsAb、EmAb、ACAb、AOAb四项免疫抗体是导致自身免疫性不孕不育的重要因素。
AsAb是最早肯定的导致不孕的抗体，大约10%～30%原因不明的女性不孕症可能由于AsAb改变。据临床观察，AsAb阳性的女性患者，通常都存在生殖器官及经期异常出血时有性交史，或有生殖系统感染、炎症等。正常情况下，女性生殖道具有酶系统，能降解进入的精子抗原，不会对其配偶的精子抗原产生免疫反应。在生殖道感染、出血等情况下进行性生活，会刺激抗精子抗体产生，AsAb会直接影响受精卵着床、精卵结合以及精子正常活动等，导致女性对精子发生免疫反应，进而导致不孕。EmAb是子宫内膜异位症（EMTl的标记性抗体，子宫内膜异位症患者受到异位内膜刺激或经血逆流等因素有关，通过各种免疫性反应，EmAb对子宫内膜功能造成损害，影响胚胎着床，容易发生早期流产。ACAb多出现于组织的炎症、损害以及粘连后，主要引起血栓的形成，且引起蜕膜和胎盘的血流不通畅、血供不足等而导致流产。AOAb可引起卵巢的损伤，以导致不孕不育。
本研究结果中，原发性不孕组有25.63%与免疫因素有关，在继发性不孕和习惯性流产组比例更高，分别为37.92%和39.17%，与其他的报道一致。原发性不孕组AsAb、EmAb、AcAb的阳性率均明显低于继发不孕和习惯性流产组，差异具有统计学意义（P<0.05），而继发性不孕和习惯性流产组之间差异无统计学意义（P>0.05），这些可能与在流产过程中抗原暴露以及局部炎症为抗体产生提供诱因有关。三组患者AOAb患者阳性，差异有统计学意义（x2=8.09，P<0.05），由此说明AOAb能够导致患者卵巢受损，进而造成不孕的情况。
不孕不育如何检测 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年1月~2011年6月我院妇科不孕门诊患者210例。
1.2 方法
常规消毒后用无菌棉拭子采取宫颈黏液于无菌管内, 同时采取阴道分泌物置于0.5ml生理盐水中立即送检。 (1) 念珠菌检测:采用革兰染色油镜镜检, 查到卵圆形真菌孢子或假菌丝可做出报告。 (2) 阴道毛滴虫检测:采用湿片法, 用生理盐水做分泌物涂片, 显微镜下查到活动的滴虫可做出报告。 (3) 细菌性阴道病检测:采用郑州安图生物科技有限公司试剂盒, 严格按说明书步骤操作和判断结果。 (4) 支原体检测:采用珠海益民生物工程制品厂试剂盒, 严格按说明书步骤操作和判断结果。 (5) 衣原体检测:采用上海鸿泰生物工程有限公司试剂盒, 严格按说明书步骤操作和判断结果。 (6) 革兰氏阴性双球菌 (淋球菌) 检测:采用革兰染色油镜镜检, 查到革兰氏阴性双球菌, 形似肾或咖啡豆, 凹面相对, 散在白细胞之间或被吞噬于中性粒细胞质之中。
2 结果
2.1 阳性检出率
210例标本中, 阳性检出164例, 占78.1%, 阴性检出46例, 占21.9%。
2.2 阳性标本微生物检出率及感染率
164例阳性标本中各种病原微生物的检出率, 见表1。164例阳性标本中病原微生物感染情况显示, 单一微生物感染114例 (69.5%) , 两种微生物感染39例 (23.8%) , 三种微生物感染7例 (4.3%) , 三种以上微生物感染4例 (2.4%) 。
注:★包括解脲支原体、人型支原体
3 讨论
不孕症是生殖健康研究的热点问题之一, 其原因复杂, 而女性生殖道感染是引起不孕的主要原因之一。本次对不孕症妇女阴道分泌物检测结果显示, 210例标本中阳性164例, 占78.1%, 其中, 支原体检出率达53.0%, 居于首位, 其次是衣原体占50.0%, 细菌性阴道病、念珠菌、阴道毛滴虫、淋球菌分别为9.1%、7.9%、1.8%、0.6%。可见支原体性阴道炎在不孕妇女阴道炎中占主导地位。
支原体是一种介于细菌和病毒之间, 无细胞壁, 呈高度多形性, 可塑性, 易溶解性, 并能通过滤菌器的原核微生物。目前认为其引起不孕的机制主要是支原体有粘附精子的作用, 阻碍精子的运动;支原体能产生神经氨酸酶样物质干扰精子和卵子的结合;支原体与精子膜有共同抗原, 对精子可造成免疫损伤而导致不孕。由于支原体无细胞壁, 对青霉素、头孢菌素等作用于细胞壁的抗生素不敏感, 对作用于其核糖体、抑制或影响菌体蛋白合成的抗生素敏感, 故临床上治疗支原体常选用四环素、大环内酯类和喹诺酮类药物[2]。
衣原体为专性细胞内寄生、有独特发育周期、能通过滤菌器的原核细胞微生物, 主要是通过侵犯宫颈、输卵管上皮引起宫颈炎、输卵管炎、输卵管积水、输卵管瘢痕、阻塞导致不孕症及输卵管妊娠。对于衣原体泌尿生殖道感染的治疗仍以抗菌药物为主, 以四环素类抗菌药物为首选, 某些喹诺酮类药物也具有抗沙眼衣原体的作用。
本组资料显示, 不孕妇女阴道分泌物由单一病原体感染为主, 但合并两种或两种以上病原体造成的混合感染病例正逐渐增高, 应引起临床的高度重视。有些阴道炎患者 (尤其支原体、衣原体性阴道炎) 临床过程隐匿、症状轻微或无症状, 不易引起患者的重视, 临床实验室应将阴道分泌物的检测列为常规项目, 针对病原体选择合适的抗生素进行正确治疗, 可有效减少妇女不孕的发生, 从而提高生殖健康水平。
摘要：目的 通过对210例不孕妇女阴道分泌物检测结果分析, 了解不孕妇女阴道感染的主要类型和病原微生物种类。方法 对阴道分泌物进行常规湿片查阴道毛滴虫, 革兰染色查革兰氏阴性双球菌 (淋球菌) 、真菌、支原体、衣原体、细菌性阴道病使用相应的诊断试剂盒。结果 阴道分泌物阳性检出率为78.1%;支原体87例, 占53.0%;衣原体82例, 占50.0%;细菌性阴道病15例, 占9.1%;念珠菌13例, 占7.9%;阴道毛滴虫3例, 占1.8%;革兰氏阴性双球菌 (淋球菌) 1例, 占0.6%。结论 在不孕妇女阴道炎患者中, 支原体感染最常见, 其次是衣原体。
关键词：不孕妇女,阴道分泌物,病原学检测
参考文献
[1]王维鹏, 金正江.不孕不育患者解脲脲支原体培养及耐药性研究[J].中华医院感染学杂志, 2007, 17 (1) :110-111.
高龄女性如何战胜不孕? 篇5
保护好你的种子
女性原始的生殖细胞在胎儿期就形成了，年龄越大，卵子受到的环境和污染的影响就越多，而且随着年龄的增长，卵巢功能也在逐渐退化，很容易导致卵子的染色体发生异常，这是女性正常的新陈代谢，没办法回避。根据相关资料统计，由染色体异常导致胎儿出现畸形或智力低下的比率随着准妈妈的年龄增长而成倍地增加。除了年龄之外，还有很多因素，同样影响着卵子的质量。
好的生活习惯可以延缓卵子的老化
不抽烟、不喝酒。妇科专家指出，香烟中的毒素不仅会危害卵子，而且还会造成卵巢老化。研究结果显示，就卵巢功能而言，一位35岁女性烟民与不吸烟的42岁女性相差无几，是吸烟导致了女性生育能力的下降。长期酗酒也同样会导致卵巢的老化。为了保护好的种子，记得远离烟酒。不熬夜、有规律地作息。经常熬夜、生活规律被打乱，身体的生物钟也会被打乱，直接影响的就是内分泌环境的平衡。而激素的分泌失调会使卵巢的功能发生紊乱，影响卵子的发育成熟及排卵。
避免多次流产的伤害
子宫就如同孕育生命的土壤，而无论是药物流产还是手术流产，都无异于人为地破坏这块土地。如果反复进行，有可能会造成土壤贫瘠，无法受孕。而且，手术流产还有可能造成输卵管粘连、子宫内膜异位等导致不孕症的问题出现。所以，如果不想马上受孕，一定要做好避孕工作，保护好自己的生育能力。
避孕药及各项避孕措施的注意事项
如果是采用屏蔽工具避孕，如避孕套或阴道隔膜，马上停止使用就可以立刻进入准备怀孕。但如果是服用避孕药或使用宫内节育器，应提前一段时间停止使用，给身体留出充足的时间恢复正常的月经周期后，再受孕。一般来说，停服避孕药后第二个月经周期就可以准备怀孕了。而取出宫内节育器最好等上一两个月，到第三或者是第四个正常的月经周期再考虑受孕。
保持苗条的身材
过了30岁，很多女性都容易发胖，这时有意识地保持正常的体重不仅有益于健康，对于做个健康的准妈妈也是非常重要的。
超重可以增加很多孕期并发症的发生率
大龄本身就是妊娠高血压综合征和妊娠期糖尿病等妊娠合并症发生几率提高的原因，如果同时体重超标，就更会使患病的危险性增加。因此，为了健康的孕期要注意控制和保持正常体重。
保持正常体重保证顺利分娩
大龄准妈妈产道弹性降低，很容易发生产程延迟、手术助产等问题。如果体重超重，更会导致以上问题的发生几率的提高，增加分娩的风险以及产后恢复的难度。
不要过度减肥
只有维持体内一定的脂肪量才能保证正常的月经周期，使女性具备生育的能力。如果采用少吃或不吃的方式减肥，长此以往，会导致女性体内的脂肪过度减少，造成排卵停止，导致不孕。
提前做好营养准备
补充叶酸
如果你计划在要投入准备怀孕的工作中，那么一件很重要的事情就是补充相关的营养素，例如叶酸。叶酸应该从孕前3个月就开始补充，每天应该补充400微克。
改掉不良的饮食习惯
一些平时的饮食习惯有可能会对孕期产生不良的影响，也应该在准备怀孕的过程中调整过来，如孕期容易出现缺铁和缺钙，所以如果平时你有饮用咖啡的习惯，那就慢慢戒掉吧。
少吃辣的、多吃新鲜的水果蔬菜、多喝水。
很多准妈妈在孕期最容易出现的不适症状之一就是便秘。而便秘和活动量少及饮食有直接的关系。所以从准备怀孕开始就要注意预防。
消除心理压力
很多大龄未准妈妈都会心存顾虑，一方面是担心自己能否健康地度过孕期，另一方面则是担心孩子，大龄会不会影响孩子的健康?
孕前检查可以让把危险扼制在萌芽期
一些疾病如果没有临床症状，很难被发现，例如糖尿病。孕前做个全面的身体检查，包括妇科检查乙肝两对半、血压等等，保证在良好的状态下怀孕，心理压力自然会减少。
计划受孕，提前测量体温
不孕不育如何检测 篇6
目前临床上诊断不育症除体格检查和常规的精液检查之外,会选择睾丸穿刺做组织学检查,以评估患者精子发生发育是否正常。本实验旨在寻找一种无创、安全、经济、可靠的诊断不育症的方法,通过比较男性不育患者和有生育能力的男性精浆中Caspase 3和Caspase 8浓度,分析精子活动力、密度与精子、精浆中Caspase 3和Caspase 8的关系,以全面了解少弱精子症的产生机制。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 生育组
20例生育男性均为妻子正在怀孕的28~37岁男性,精液质量正常(精子密度≥60×106/m L,活力A+B%≥50%)。
1.1.2 不育组
56例不育症患者为婚后性生活正常,同居2年以上,未采取任何避孕措施,配偶无妊娠史,经本院妇产科检查排除女方不孕因素而不育者。其中不育症Ⅰ组20位按WHO标准诊断为弱精子症(精子密度≥20×106/m L;A级<25%或A+B级<50%);不育症Ⅱ组19例为少弱精子症(精子密度<20×106/m L;A级<25%或A+B级<50%);不育症Ⅲ组17例为无精子症。均无外伤及遗传病家族史。所有患者都没有生殖道感染症状;3个月前无抗菌治疗史。所有患者都是自愿参加本研究的。
1.1.3 试剂
半胱天冬酶3和半胱天冬酶8(Caspase 3和Caspase 8)定量检测试剂(由美国R&D Sytems公司提供)。
1.2 仪器与设备
CASA:KONKYO CASAS-QH-111计算机辅助精子分析仪(包括专用高清显微镜、精子计数池、高分辨率成像及图像传输器);SANYO BIOMEDICAL FREEZER电冰箱;2~20、20~200和200~1 000μL高精度加液器及吸头(Holland);HHW21 600电热恒温水浴箱(上海实验仪器厂);XK96-3型微量振荡器(姜堰市新康医疗器械有限公司);MSB100.CE1.4型离心机(MSE Inc UK);Wellwash 4 MK 2型自动洗板机(Labsystems Dragon Inc Finland);Thermo MULTISKAN MK3 560254酶标仪。
1.3 试验方法
1.3.1 标本采集
受检者禁欲3~5 d,手淫法采集一次射出的全部精液于洁净的有盖容器中,置37℃恒温水浴箱内,精液液化后立即行计算机辅助精子分析(CASA)。
1.3.2 标本处理
以3 000 r/min离心15 min,分离出精浆用于测定,剩下的精子沉淀用普通生理盐水清洗并离心,离心速度为3 000 r/min,离心5 min,如此重复3次以去除残留的精浆,以分离精子(注:无精症组以其沉淀物为分析对象),将精子、精浆标本分别编号。
1.3.3 标本保存
置于-40℃冰箱内保存(勿反复冻融)。
1.3.4 试验过程
Caspase 3和Caspase 8定量检测试剂盒采用双抗体一步夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人Caspase 3和Caspase 8捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,温育并彻底洗涤,底物TMB显色,TMB在过氧化物酶催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中的人Caspase 3和Caspase 8呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。严格按说明书操作。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.0软件包进行统计学处理及绘图,实验数据用均数±标准差表示,组内精子与精浆中的酶含量比较采用两样本均数t检验;组间酶含量比较采用完全随机多样本均数的DUN-NET-t检验;酶含量与精子常规参数间的关系采用Pearson直线相关分析,与动力学参数的相关性用Spearman’s rho分析,检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 生育组与不育组CASA结果
生育组的精子参数都符合WHO标准指南的正常标准,不育症Ⅰ组(弱精症)的平均A级低于15%,与生育组比较差异有统计学意义(P<0.001);不育症Ⅱ组(少弱精症)的平均A级低于15%,平均密度低于20×106/m L,与生育组比较差异有统计学意义(均P<0.001);不育症Ⅲ组(无精症)密度、活动性和A级均为0,与生育组比较差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。
2.2 生育组与不育组Caspase 3和Caspase 8检测结果
各组的精子和精浆中都能检测到Caspase 3和Caspase 8,不育症Ⅲ组的Caspase 3和Caspase 8及其他不育组的Caspase 3和Caspase 8都表现为精浆中的Caspase平均含量高于精子中的Caspase含量。与生育组的精子/精浆相比,不育症Ⅰ组的Caspase 8和其他不育组精子/精浆中的Caspase 3和Caspase8的平均含量均较高。其中不育症Ⅰ组精浆中的平均Caspase 8含量高于精子,且有统计学意义(16.88±12.13 vs 10.70±2.24,P<0.05);不育症Ⅱ组精子的平均Caspase 8含量高于生育组,且有统计学意义(16.04±10.63 vs 9.85±5.57,P<0.05),其他无统计学意义。见表2。
2.3 Caspase含量与精子参数的相关性分析
用Pearson Correlation分析密度与精子、精浆中Caspase的关系,结果显示,精子的Caspase 8平均含量分别与精子密度呈负相关(r=-0.324,P<0.05)。用Spearman's rho分析精子运动参数与精子、精浆中Caspase的关系,结果显示,精子中的Caspase 8平均含量分别与精子活动性呈负相关(r=-0.343,P<0.05);
注:NC表示没有相关性存在;1)表示Spearman's rho相关检测存在相关性的结果,P<0.05;2)表示Pearson Correlation相关检测存在相关性的结果,P<0.05
精浆中的Caspase 8的平均含量与A级精子呈负相关(r=-0.326,P<0.05);精子的Caspase 8平均含量与A级精子呈负相关(r=-0.673,P<0.001)。其他精子参数与精子、精浆的Caspase不存在相关性,见表3。
3 讨论
凋亡,即程序性细胞死亡,是机体维持组织器官正常发育、清除异常细胞所必需的;同样在哺乳动物的睾丸组织中,凋亡对精子分化和睾丸成熟发挥着重要作用。Caspase作为凋亡机制的主要成员之一,全称为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶或半胱天冬酶。
现已知的人Caspase有14种,其介导的凋亡过程主要通过两条途径进行级联反应。第一条途径是膜死亡受体途径;第二条是线粒体途径,在两条主要的凋亡途径中,最重要的两个启动子是Caspase8[2]和Caspase 9,共同途径执行因子是Caspase 3[3]。本次实验通过检测这3种Caspase,以全面了解Caspase与精子活力和密度有关的凋亡机制。
就男性生殖方面,与Caspase有关的研究前人已进行多方面的报道,之前是研究睾丸和附睾中是否有存在于体细胞中的凋亡标记物,之后是研究睾丸在不同病理条件下与Caspase的关系[4,5,6,7],随后又开始研究体外精液中是否也有存在于体细胞中的凋亡标记物[8,9],这两年主要聚焦于特定的病理生理状态下的精子,研究其与Caspase有关的发病机制[10,11],也有研究体外环境下各种外加因素对精子凋亡标记物的影响[12,13],并研究它们的作用机制。这对于临床更好地理解各种不育的病因和机制,以及理解IVF/ICSI等辅助生殖结果都有很大的帮助,也为笔者治疗男性不育提供了好的科学依据。
由于精液体外处理方法都可能在一定程度上对精子或者生殖细胞的Caspase活性造成影响,比如机械的离心力[14]、MACS分离时的磁场力[14]、深低温冷藏[13]、梯度密度离心法和上游法等[15,16],以致于临床很难分清Caspase的活化到底是发生于射精前还是射精后[17,18],或者是射精前和射精后活化Caspase的总和。如果假设精浆中存在Caspase,那么精浆中的Caspase就能排除体外处理带来的影响,直接反映射精前精子的凋亡状况;而分离出的精子中的Caspase则主要反映射精后精子的凋亡状况,当然也可能是少量开始于睾丸或者附睾的精子的发育不全性的凋亡反映,也可能一部分因为体外处理而引起的Caspase的活化。因为健康的精子在射精后不能自发地凋亡[18,19],它们的死亡是由于坏死而不是由于凋亡[18]。另外,有人在睾丸和附睾中发现了凋亡标记物Caspase的存在[4,5,6,7],那就不难猜测凋亡细胞的残留物会或多或少地存在于精液中并随之排出体外,也就是精浆中可能存在Caspase的缘故。也有文献报道精液离心后的上浮物中检测不到活化的Caspase[8],但本研究的预实验在无精症精液标本中检测到了Caspase。
本次实验在所有被检测标本的精子中都检测到Caspase 3和Caspase 8的存在,这与之前大部分关于Caspase的报道一致:有人用免疫印迹法在患者和健康捐献者精子中检测到了酶原Caspase 3和Caspase9及低水平活化的Caspase 3和Caspase 9[20];也有人用免疫印迹法在健康捐献者和不育患者精子中发现了酶原形式和活化形式的Caspase 3和Caspase 8[13];另有报道Caspase 3和Caspase 8存在于人精子并且可以活化[12]。通过比较,笔者发现,与生育组精子相比,弱精组精子的Caspase 8平均含量,少弱精组和无精组精子的Caspase平均含量均较高。
值得注意的是,在生育组、弱精组、少弱精组和无精组所有标本的精浆中也检测到了Caspase 3和Caspase 8,为本研究精浆中存在Caspase的假设提供了直接而有力的证据。为此也可以推断,体外精浆中存在睾丸和附睾组织凋亡细胞的残留物,在一定程度上反映了睾丸和附睾组织的凋亡现状;另外,精浆中的Caspase也可能反映Caspase的其他功能,因为有人认为Caspase的酶原形式可能是其他与凋亡无关的功能,尤其在精子成熟和精子发生过程中[21,22,23]。此外,精浆中的这些Caspase是否可以继续对精液中存活的或者正在承受凋亡的精子起作用还有待于进一步的解释。