细胞污染

细胞污染（精选7篇）

细胞污染 篇1

细胞培养技术广泛用于科研、教学及临床研究实验, 这项技术看似简单但不太容易操作。污染是细胞培养技术中面临的主要问题, 预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。掌握一定的预防和避免污染措施, 可有效地防止细胞污染, 避免不必要的人力、物力浪费, 保证实验体系的稳定性和可靠性。

1 污染来源

1.1 细胞污染

细胞组织本身带有污染, 细胞在取材时已经污染。

1.2 血清污染

动物血清是细胞培养中常用的天然培养基, 但由于血清采集于多个动物, 而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同, 因此血清中许多成分的浓度有很大的变异, 并且灭菌的不彻底性, 导致血清存在潜在的病毒和支原体污染。

1.3 实验室内空气不洁净

空气中含有大量的微生物, 消毒杀菌不充分, 很容易造成细胞培养室污染。另外, 工作时工作人员不带口罩, 呼出气体中排出细菌和支原体污染空气, 也会导致污染。

1.4 器具清洗消毒不彻底

培养用物品、材料洗刷不净, 培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。

1.5 操作不当

(1) 实验人员的器具相互之间串着用, 造成交叉污染; (2) 一次未将所有的所需要试剂、工具放入工作台, 这样增加了污染的机会; (3) 器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过、是否已经消毒灭菌处理过, 或者虽经处理, 但时隔已久又末重新处理; (4) 操作者不认真, 动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品, 如手上皮肤和瓶子外壁等; (5) 操作者操作时大声说话、来回走动扬起灰尘等。

2 污染的预防

预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前, 才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手。

2.1 室内环境[1]

细胞培养室要有操作间、缓冲间和更衣室。房间装修密闭性较高, 且不宜开设外窗, 无菌间的房顶、墙壁和地面均应光滑、无死角, 室内应有紫外线杀菌装置。实验台和仪器布局应合理。一般来说, 二氧化碳培养箱和净化工作台不应对着门摆放, 离心机和显微镜不应离得太远。

2.2 物品的消毒灭菌

细胞培养所用物品的清洗、消毒要彻底, 各种溶液灭菌除菌要仔细, 操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。

2.3 实验人员

进无菌室前要用肥皂洗手或用5%苯扎溴铵浸泡5min, 按规定穿隔离衣;进入后关好门, 坐下来尽量少走动;工作开始要先用75%乙醇棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口[2]。事先要严格检查器材、溶液和培养物, 不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内, 更不能随便使用, 以免造成大批污染。做完试验后应将试验产生的废物和废液及时处理掉, 并清洁台面。

2.4 防止细胞交叉污染

在进行多种细胞培养操作时, 所用器具要严格区分, 最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作, 避免一起进行时发生混乱。在进行换液或传代操作时, 注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口, 以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

3 污染的清除

细胞培养中最常见的是细菌、真菌和支原体污染。培养细胞一经污染, 多数较难处理。如果污染细胞价值不大, 宜弃之。判断细胞是否污染的一种简单方法是, 如果是细菌污染, 培养基应该很快变浑浊;如果是真菌感染, 特别是初期感染, 在低倍镜下可以看到小黑点, 特别是成团的小黑点, 如果无法确定, 就换高倍镜, 如果是死细胞, 在高倍镜下就可以分辨, 而真菌在高倍镜下仍然是小黑点。有细胞株留存的或可购置的, 可在寻找原因后彻底消毒操作室, 然后复苏或重新购置细胞再培养。若污染细胞价值较大, 又难于重新得到, 可采取以下办法清除。

3.1 细菌污染

对于细菌污染, 通常是通过药敏试验, 选取广谱抗生素组合, 就能够达到抑制细菌生长的目的。笔者发现联合用药比单独用药效果好, 预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素 (青霉素100U/ml加链霉素100μg/ml) , 污染后清除用药需采用大于常用量5~10倍的冲洗法, 于加药后作用24~48h, 再换常规培养液。实验中抗生素的使用会使被救治细胞的生长状态受到很大影响, 如果处理不好也可能造成细胞株的死亡, 建议采用含20%血清的培养基对细胞进行培养, 直至细胞状态恢复[3]。

3.2 霉菌污染

霉菌污染早期, 应用PBS多次冲洗细胞, 尽量将孢子洗掉, 然后用两性霉素B 25μg/ml处理12~24h, 换液后两性霉素B换3~5μg/ml浓度, 每天换液, 连续处理2~3d。两性霉素对细胞生长影响也很大, 浓度过高可致细胞死亡, 浓度过低时则不能抑制霉菌生长。另有文献报道, 低速离心法去除细胞培养中的霉菌污染, 所需实验条件简单, 去除霉菌污染彻底、耗时短, 能将霉菌污染所造成的对细胞的不良影响降至最低程度[4]。

3.3 黑胶虫污染

黑胶虫是一种生物还是非生物, 学术界还存在争议。黑胶虫与细胞竞争性生长, 开始时对细胞并无影响, 但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候, 细胞生长就会受到影响直至死亡, 严重影响了科研活动的开展和进行。早期污染, 一般采用如下方法:用0.25%胰酶消化, 当有少量细胞变圆或脱壁时用血清终止消化, 轻轻用培养基或D-Hanks液清洗3遍 (缓慢流过细胞表面) , 不要吹打, 然后吹散细胞, 换用培养瓶培养, 隔天换液。2d后重复1次, 以后每24~36小时换1次液, 1周后, 黑色颗粒基本消失, 细胞生长正常。也可用麦诺霉素10μg/ml处理, 连续1周。但麦诺霉素对细胞有毒性。

3.4 支原体污染

关于支原体污染后的处理, 是一个公认的棘手难题, 结合文献和实际工作体会, 笔者认为以下措施可参考。

3.4.1 加温处理法:

将污染的细胞在41℃作用5~10h, 最长不超过18h, 以杀灭支原体, 是一种比较简单的方法, 对细胞损伤不大。

3.4.2 BM-Cyclin-1、2排除法[5]:

细胞传代同时加BM-Cyclin-110μg/ml, 37℃培养3d;胰蛋白酶消化、传代, 加入BM-Cyclin-25μg/ml, 37℃培养3d;继续传代追加BM-Cyclin-25μg/ml 1次, 培养2~4d弃药液, D-Hank′s液洗2次, 胰蛋白酶消化、传代, 进行常规培养。

3.4.3 M-Plasmocin:

InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体, 不影响细胞本身的代谢, 并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞, 不会重新污染支原体, 是目前对抗支原体最理想的方法。但是该种药物价格非常昂贵, 限制了其广泛应用。

除了上述去除污染的方法外, 还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等, 但均较麻烦, 且效果不确定, 所以一旦支原体污染, 除非有特别重要价值, 一般均弃之重新培养。

参考文献

[1]王秀卿, 勾凌燕, 王志玲, 等.细胞体外培养工作中存在的问题及预防[J].临床合理用药杂志, 2010, 3 (8) :80.

[2]黄培堂.细胞实验指南 (上册) [M].北京:科学出版社, 2001:63.

[3]王秀岩, 吴庆田, 侯霞, 等.复配抗生素在贴壁细胞污染救治过程中的应用[J].黑龙江医药科学, 2003, 26 (5) :78.

[4]杨卫兵, 刁庆春, 叶庆.低速离心法去除细胞培养中霉菌污染[J].第三军医大学学报, 1999, 21 (8) :549-553.

[5]刘岚, 陈绍坤, 余红.贴壁细胞培养过程中支原体污染的几种救治方案疗效比较研究[J].现代医药卫生, 2008, 24 (8) :1221-1222.

细胞培养中污染的预防与清除 篇2

1 污染的来源

细胞培养中污染的来源主要有以下几种途径: (1) 细胞组织本身带有污染。 (2) 实验室内空气不洁净。 (3) 实验操作者未能严格遵守操作规程。 (4) 生物安全柜不洁净或使用不正确。 (5) 实验中所用的器具和培养基消毒不彻底。

2 污染的预防

2.1 购买合格的细胞, 并留种冻存, 必要时可将细胞悬液加入肉汤培养基或琼脂培养基中, 观察是否有微生物滋生。

2.2 定期对实验室进行消毒。常规消毒可用紫外线照射30min、75%乙醇擦拭工作台面。彻底消毒可用0.1%新洁尔灭擦洗实验室墙壁及台面, 或封闭实验室, 用40%甲醛溶液10m L/m3进行熏蒸消毒30min。

2.3 工作人员进入实验室应更换隔离衣, 佩戴帽子、口罩;操作时应消毒双手或佩戴一次性无菌手套;工作中应尽量避免走动扬尘和大声说话。吸管等实验器材如碰触操作人员手、工作服、其它器具表面或生物安全柜内壁时应更换新的。

2.4 生物安全柜滤膜应定期更换。实验前应清洁生物安全柜台面及内壁, 用紫外线照射30min消毒, 将实验用器具和培养基用75%乙醇擦拭消毒后放入生物安全柜, 将循环过滤系统开启30min后方可开始实验操作。实验后应清洁台面及内壁, 关闭循环过滤系统, 用紫外线照射30min消毒后方可关闭生物安全柜电源。

2.5 实验器材如为玻璃制品应洗刷干净, 在浓酸溶液中浸泡过夜后反复清洗, 彻底去除酸液, 在电热恒温干燥箱中160℃持续2h消毒, 并在无菌实验阴性后方可使用。实验器材如为一次性塑料制品应购买合格产品, 每批次产品应抽样在无菌实验阴性后方可使用。

2.6 实验用培养基配制后应按照说明彻底消毒, 久置的已消毒培养基应重新消毒。培养基使用时应适量加入抗生素。血清制品使用前应先确定是否已经灭活处理。

2.7 不同细胞在传代或换液时所用器具应严格区分, 避免细胞间交叉污染。

3 污染的清除

细胞培养中最常见的是细菌污染和真菌污染。培养液混浊, p H值改变一般为细菌污染;真菌污染液体一般不混浊, 肉眼可见菌球或在倒置显微镜下可见菌丝。

3.1 如发生真菌污染, 为避免更大的损失应果断弃去, 并严格消毒实验室及实验器具。

3.2如发生细菌污染也很难去除干净, 如细胞价值不大, 宜弃去, 并在彻底清除污染源后重新培养;如细胞珍贵, 不易得, 可用以下方法清除污染:

3.2.1将污染细胞置于4℃冰箱以延长微生物的生长繁殖。

3.2.2将细胞用平时传代的培养液稀释在细胞培养板或细胞培养瓶中, 加入不同浓度的抗生素, 逐日观察, 找出细胞中毒剂量 (细胞中毒表现为脱落, 融合, 圆缩等) 。

3.2.3将低于中毒剂量1~2倍的抗生素加入培养液中将污染细胞传2~3代, 再用加入平时传代的抗生素剂量的培养液传代2次, 如未见污染, 可认为细菌污染已去除干净, 如仍有污染则需要重复使用以上方法, 直至细菌完全被去除。

3.3细胞的交叉污染, 可使细胞失去原有的特性。而此种污染无法逆转, 应弃去污染细胞, 重新培养。

参考文献

[1]田启超, 张涛, 田丽芳, 等。细胞体外培养过程中霉菌污染的预防[J]。动物医学进展, 2007, 28 (8) :115。

[2]李颖健, 刘志红。细胞培养污染的途径、危害及预防措施[J]。肾脏病与透析肾移植杂志, 1999, 8 (3) :245。

细胞污染 篇3

当前, 在医学、病毒学、细胞遗传学以及卫生检验等诸多领域, 细胞体外培养发挥重要作用。但是在细胞培养过程中, 污染问题始终受到人们的关注。对于自然界中的所有微生物而言, 都是细胞培养过程的污染来源和威胁, 如昆虫、霉菌、细菌、病毒等。当微生物进入到培养体系中, 就会频繁地增值和代谢, 尤其以生物性污染的危害最为严重。一般情况下, 如果发生了真菌污染问题, 需要进行灭菌处理并将培养物直接废弃。但是对于一些细胞具有难以复制性、实验过程复杂等现实问题, 就不得不采取有效的污染清除方法, 才能保留较为珍贵的细胞, 降低成本损失。如果一些培养的细胞非常重要, 或者受到的污染并不严重, 就可以消除污染或者想方设法控制污染。以常规采用的广谱抗真菌药 (如两性霉素B) 对细胞会产生额外的毒性作用, 在细胞培养中不适用;专门在细胞培养中采用的水溶性两性霉素B大多来自国外进口, 成本相对较高。本文根据实验室小鼠成肌细胞C2C12培养过程产生白色念珠菌污染的实际情况, 试图采用大扶康进行预防和控制, 取得了一定的效果。

2 实验过程与观察方法

在室温37℃的环境下, 满足5%的CO2以及一定的湿度条件, 在含有10%的胎牛血清DEME培养基中, 培养小鼠成肌细胞C2C12。具体检测项目和方法分析如下:

2.1 污染的检测方法

在培养小鼠成肌细胞C2C12过程中, 细胞培养液没有出现任何的颜色变化现象;经过显微镜进一步观察, 细胞的活力弱化, 生长速度逐渐缓慢, 甚至出现个别死亡现象。显微镜中可以看到单个或者成串、成团的贴壁白色椭圆形菌落, 对受到污染的细胞培养液进行收集, 采取离心处理措施, 对沉淀涂片实行革兰氏染色、检验结果为白色念珠菌。

2.2 白色念珠菌的防控

合理控制大扶康在细胞发生毒性中的剂量, 针对产生白色念珠菌污染并且污染程度相近的细胞, 采取三种防控方法:其一, 采用高浓度的大扶康和PBS进行洗涤、冲击, 起到控制作用;其二, 采用低浓度的大扶康和DEME培养基继续进行培养控制;其三, 大扶康和硫酸阿米卡星+头孢他啶配伍, 继续维持培养过程, 预防真菌污染问题。具体分析如下:

(1) 大扶康毒性水平的确定。在不含有抗生素的培养基中, 对细胞进行计数、消化及稀释作用, 一般稀释为常规细胞传代浓度即可, 将细胞悬液分散到12孔的培养板中。在不同浓度的梯度范围之内, 分别添加大扶康, 每孔中的培养基数量为1ml;根据细胞毒性指标, 每天观察细胞是否脱落, 出现空泡、汇合度下降和变圆。处理后用台盼蓝染色法检测细胞生存率, 确定大扶康的最佳使用浓度。

(2) 合理控制高浓度洗涤冲击。将2倍控制浓度的大扶康及1ml的PBS加入到白色念珠菌污染的细胞培养皿中, 静置约15min。通过显微镜观察这种方法的抑制效果, 并注意C2C12细胞生长的情况, 每日定期重复以上操作。

(3) 维持培养策略。向发生白色念珠菌污染的细胞培养皿中加入控制浓度的大扶康培养液培养细胞2~3代, 隔天换液。连续培养1周后, 显微镜下观察该方法的抑菌效果及对细胞生长情况的影响。改用低于治疗浓度一半的剂量进行维持培养, 连续培养1周。在无抗生素的培养基中培养4~6代, 确定污染是否已被消除。

(4) 预防真菌污染措施。染消除后的细胞, 采用30μg/ml大扶康与20μg/ml硫酸阿米卡星+50μg/ml头孢他啶配伍的方法继续培养, 连续观察2周。新复苏的细胞和同一培养箱中的其他细胞均可用此方法进行真菌污染的预防。

3 实验结果分析

3.1 大扶康的毒性水平

当细胞处理完毕24h左右, 一些孔中大扶康的浓度就会降低到250μg/ml以下, 而抗生素浓度的下降, 白色念珠菌的活动更加频繁;在大扶康浓度达到60020μg/ml的孔中, 基本已经控制细菌污染问题, 但是大多细胞发生脱壁、死亡现象;在大扶康浓度达到30020μg/ml的孔中, 效果良好。经过24h处理之后, 其中的污染基本控制, 剩余细菌的数量较少、游走缓慢, 仅有少量细胞发生脱壁或死亡问题, 更多的细胞处于增值状态;48h之后污染完全控制。

3.2 高浓度冲击的控制效果

白色念珠菌污染的细胞培养皿中加入600μg/ml的大扶康与1ml PBS, 培养箱中静置15min。显微镜下观察到细胞稍有变形, 即将脱壁。立即换完全培养基培养细胞。此方法每天重复1次, 共7d, 7d后污染完全被控制。细胞较处理前数目增多, 处于增殖状态。

3.3 维持培养的控制效果

在白色念珠菌污染的细胞培养皿中加入300μg/ml大扶康培养液培养细胞2~3代隔天换液。1周后, 显微镜下观察到细胞污染被完全控制, 少量细胞脱壁死亡。用150μg/ml大扶康进行维持培养1周后在显微镜下观察, 无白色菌落, 细胞污染被完全控制。

4 结论与思考

在细胞培养过程中, 白色念珠菌较为常见, 可通过空气、培养液或者器皿传播。如果发生白色念珠菌污染问题, 需要立即采用抗真菌药物并切断污染源。污染的细胞要及时灭菌销毁, 以免污染其他细胞。由于一些细胞很珍贵, 因此不得不设法清除。事实上, 经真菌污染的细胞, 在抗菌素作用下, 细胞原有的许多生物学特性 (如基因的表达, 抗原性和代谢特点) 也随之发生了相应的改变, 对研究结果造成严重影响。所以在采用每一种治疗方案时必须对其效果以及对细胞可能产生的毒性影响进行监测。

经本实验表明, 大扶康有广谱抗真菌作用, 主要用于治疗念珠菌、隐球菌等, 尤其适用于不能耐受两性霉素B毒性作用的细胞, 而且价格低廉, 容易获得。利用大扶康和硫酸阿米卡星+头孢他啶配伍的方法, 可有效防范真菌污染问题。其中, 硫酸阿米卡星抗菌谱与庆大霉素相似, 对需氧革兰氏阴性杆菌有较强的杀灭作用。头孢他啶抗菌活力较强, 抗菌谱较广, 对革兰氏阳性或阴性菌均具有较强的抗菌作用, 可用于治疗由两种以上敏感菌引起的混合感染。因此采用3种抗菌素配伍的方法可代替两性霉素B用于细胞污染白色念珠菌的防控。但是该方法的运用, 是否影响了C2C12细胞的转染效果和分化能力, 今后仍需进一步探讨。

摘要：基于细胞培养过程, 采用大扶康对白色念珠菌污染问题的形成加以控制, 对不同浓度的大扶康进行观察、培养, 了解其对小鼠成肌细胞C2C12的生长影响, 判断应用效果。

关键词：细胞培养,白色念珠菌,污染,防控

参考文献

[1]刘轶, 朱国强.动物细胞培养及微载体技术研究进展[J].吉林农业大学学报, 2007 (2) .

[2]李祥, 王成焘, 王林.可控多孔结构生物活性钛的制备及其体外细胞培养[J].稀有金属材料与工程, 2010 (10) .

[3]高航, 关春艳.兔主动脉内皮细胞培养及鉴定:内皮细胞分离方式及培养条件的改良[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010 (11) .

[4]赵俊, 王兴满, 胡勇, 等.动物细胞培养物中支原体污染的检测[J].安徽农业科学, 2010 (3) .

[5]邵建波, 金庆辉.一种细胞培养微芯片的制作及应用[J].生物工程学报, 2008 (7) .

细胞污染 篇4

关键词：产单核细胞李斯特菌,生猪屠宰,流通,流行病学

产单核细胞李斯特菌 (Listeria monocytogenes, Lm) 是一种重要的人兽共患食源性病原菌, 引起以脑膜炎、脑炎、败血症为症状的李斯特菌病[1]。该病虽然感染率较低, 但病死率高达30%～70%[2], 因此对于该病爆发的监测具有重要的公共卫生学意义。本研究采用周晓辉等[3]介绍的PCR快速检测产单核细胞李斯特菌的方法对生猪屠宰加工流通环节的产单核细胞李斯特菌进行分子流行病学监测, 取得了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 样品采集

根据生猪屠宰加工生产流程和HACCP系统原理[4], 选择待宰猪环境、宰前、屠宰过程、生鲜猪肉入库前、冷库肉、市场销售生鲜猪肉等六个关键环节采集样品共680份, 其中, 前5个环节各采集样品100份, 市场 (超市、专卖店和农贸市场) 销售生鲜猪肉180份样品。待宰猪环境采集棉拭样品, 宰前采集经冲洗后的猪体表猪毛样品, 屠宰过程中采集冲洗后的大肠样品, 其余环节均采集肉样, 进行产单核细胞李斯特菌监测。待宰猪环境棉拭样品用Cary-blair运送培养基运送, 其余样品置于4℃冰盒, 于16h内送达实验室, 并立即检测。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

肉类样品取1g用消毒剪刀剪碎加入9ml李斯特增菌培养基LEB (美国DIFCO公司) , 培养24h后, 用铂耳取菌液划线, 接种于李斯特选择培养基OXFORD (美国DIFCO公司) 培养24h, 挑取可疑菌落于纯培养基BHI (美国DIFCO公司) 过夜培养, 提取基因组DNA作为PCR模板。

1.2.2 模板制备

参考周晓辉等[3]介绍的溶菌酶-蛋白酶K法提取基因组DNA:取250μl BHI培养基中过夜培养的菌液加入Eppendorf管, 13000rpm离心10min;弃上清液, 用95μl1×Buffer混匀;加4μl溶菌酶 (50mg/ml) , 颠倒混匀;室温孵育15min;加1μl蛋白酶K (20mg/ml) , 震荡数秒钟;58℃孵育, 直至菌液变请;95℃加热8min, 使酶失活;离心取上清液备用。

1.2.3 PCR扩增

参考Michel Doumith等[5]的报道, 选取李斯特属特异性基因prs合成一对引物;参考周哓辉等[3]方法, 针对产单核细胞李斯特菌溶血素基因hly合成一对引物。

PCR体系中各成分的量: (1) prs体系:10×buffer2.5μl, Mg Cl22μl, d NTPs (2.5μmol/l) 1μl, prs P1和prs P2 (10μm) 各为1μl, 模板溶液2μl, Taq酶0.3μl, 去离子水15.2μl。 (2) hly体系:10×buffer2.5μl, Mg Cl21.5μl, d NTPs (2.5μmol/l) 2μl, hly P1和hly P2 (20μm) 各为0.5μl, 模板溶液3μl, Taq酶0.2μl, 去离子水14.8μl。

PCR反应程序为: (1) prs基因:94℃2min, 95℃10s, 60℃30s, 72℃30s, 40个循环, 72℃10min。 (2) hly基因:94℃2min, 95℃10s, 60℃30s, 72℃30s, 35个循环, 72℃10min。

PCR产物电泳鉴定:配置1.0%琼脂糖溶液, 按0.3mg/L加溴化乙锭 (EB) 制胶, 取8μl PCR产物点样, 以DNA Marker做对照, 60V电泳1.5h。取出凝胶, 在凝胶成像仪上观察结果。

2 结果

整个流程共检测了680份样品, 其中有13份样品污染Lm, PCR结果见图1-1, Lm阳性率1.9%。整个屠宰-加工-销售环节销售过程的市场生鲜肉样品Lm污染率最高, 达5%, 明显高于其它各环节, 而宰前猪毛样品、屠宰过程大肠样品以及宰后入冷库前猪肉样品中均未检测到Lm, 污染率为0%。

M.DNA Marker DL2000;1.PCR product of standard strain;2-13.PCRproduct of the positive samples;15.PCR product of the negative control strain

(%)

3 讨论

本研究对生猪屠宰-加工-销售各环节Lm监测结果显示, 屠宰加工厂环境卫生条件的改善是避免发生交叉污染的关键环节。生产流程从宰前到猪肉入库均未检测出Lm, 说明此生猪加工厂对生产流程的控制和把关做得较好, 屠宰前对猪体表的淋浴有利于减少和清除病原微生物对猪胴体和生产线的污染, 此外, 生产流程中胴体产品在主生产线进行加工处理, 而肠道产品在副产品车间进行处理, 对二者采取两种不同的处理途径, 较好的控制了内脏冲洗加工对胴体生产加工流程的污染和其它加工环境的污染, 这是生猪屠宰加工流程中值得借鉴的地方[5]。另一方面, 待宰猪圈环境检测到Lm应该引起重视, 它是猪肉生产流通的首要关键环节, 这就提示了加强对猪圈环境定期消毒处理的重要性。一般而言, 冷库肉由于温度较低, 微生物污染问题不易受到重视, 受到的关注程度也相对较低。本研究的监测情况显示, 猪肉从入冷库前到入冷库后, Lm的污染率从0到3%大幅度提高, 这符合Lm能在低温繁殖的特性[6], 表明了冷库肉同样有受到Lm污染的可能性, 这就提示冷库环境卫生条件的改善同样应该受到相关部门和单位的重视。市场是此次屠宰-加工-销售各环节中Lm污染最严重的环节, 污染率高达5%, 这可能是由于猪肉在从生猪加工基地运往各市场进入流通环节的过程中受到自然环境和接触器皿上Lm的污染或加重污染所致, 也可能是由于市场内人员流动等原因造成污水、各种切割器具或其它各类生熟食品的交叉污染所致, 这就提示在生猪肉进入流通领域后应该尽可能减少各种外部因素造成的交叉污染。

综上所述, 本研究对生猪屠宰-加工-销售环节Lm的监测结果表明宰前环境、宰后销售前以及销售过程中均存在不同程度的产单核细胞李斯特菌污染, 为食品安全措施的制定提供了有用的流行病学数据。

参考文献

[1]Cristina M, Goncalo A, Luisa C, et al.Incidence of Listeria monocytogenes in different food products commercialized in Portugal.Food Microbiology.2004, 21:213-216.

[2]Schlech WF, Lavigne PM, Bortulussi RA.Epidemic Listeriosis:evidence or transmission by food.N J Med.1983, 308:203-206.

[3]Zhou X, Jiao X..Polymerase chain reaction of Listeria monocytogenes using oligonucleotide primers targeting actA gene.Food Contral.2005, 16:125-130.

[4]朱冬冬, 黄金林, 焦新安等.生猪屠宰加工流通环节沙门氏菌的监测研究[J].畜禽业, 2006, 3:44-45.

[5]Michel D, Carmen B, Philipper G, et al.Differentiation of the major Listeria monocytogenes serovars by multiplex PCR.Journal of Clinical Microbiology.2004, 42:3819-3822.

细胞污染 篇5

1 材料和方法

1.1 样品来源和种类

2005—2009年分别对集贸市场、超市、酒店等进行采样。其中生肉类126份、熟肉类30份、水产品81份、蔬菜91份, 沙拉酱9份、速冻米面食品21份、非发酵豆制品10份、奶制品9份, 共计377份样品。

1.2 检测项目

单核细胞增生李斯特菌。

1.3 培养基和试剂

增菌液、三糖铁 (TSI) 琼脂、SIM动力培养基、羊血琼脂培养基、显色培养基 (由北京路桥技术有限责任公司和青岛海博生物技术有限公司提供) , API LISTERIA生化试纸条 (由法国生物梅里埃股份有限公司提供) 。

1.4 检验方法

增菌试验:按照GB 4789.30-2003检测方法, 无菌取样品25g放灭菌的均质袋中, 加入225 ml LB1增菌液, 充分均质后30 ℃培养24 h。吸取0.1ml LB1增菌液加入10 ml LB2增菌液中增菌24 h, 2次增菌后, 再将LB2增菌培养物接种在改良的MC Bride 琼脂 (MMA) 和海博LM显色培养基进行分离, 30 ℃培养24～48 h。

LM的鉴定:挑取MMA琼脂和显色培养基上5～6个蓝色可疑菌落接种于三糖铁 (TSI) 琼脂、SIM动力培养基及羊血琼脂平板上, 动力实验成伞状并在TSI斜面和下层产酸不产硫化氢的菌株、溶血试验阳性的菌株做革兰染色和过氧化氢酶实验, 对革兰染色阳性的短小杆菌和过氧化氢酶阳性的菌株用API LISTERIA生化试条鉴定, 凡革兰染色阳性、溶血试验阳性、SIM半固体上呈伞状, API生化试验附和者确定为LM。

2 结果与分析

2.1 食品中LM检出情况

2005—2009年共从377份食品中分离到LM 16株, 总检出率为4.24%。熟肉类、生肉类、水产品及蔬菜的检出率分别为10.0%、8.73%、1.23%、1.10%;21份速冻米面食品、10分非发酵豆制品、9份奶制品均未分离到LM。8类食品中, 检出率最高的是熟肉类, 检出率为10.0% (3/30) , 明显高于其他7类食品, 经统计学分析, 总的差异有统计学意义 (χ2=16.473, P<0.05) ;熟肉LM检出率与与生肉类经统计学分析差异无统计学意义。熟肉与其他6类检品比较, 经统计学分析, 差异有统计学意义 (χ2=14.749, P<0.05) ;见表1。

2.2 生肉类LM检出情况

4种生肉中检出率最高的是生鸡肉, 检出率为16.67% (11/126) , 经统计学分析, 总的差异无统计学意义 (χ2=5.881, P>0.05) , 见表2。

2.3 各年度LM检出情况

2005年食品中LM检出率为12.68%, 明显高于其他4年, 经统计学分析, 总的差异有统计学意义 (χ2=17.553, P<0.05) , 各年度检出率不同;2007年食品中未检出LM。5年来的检测, 我市食品污染状况呈逐年好转情况, 这与我市疾控中心和卫生监督所加大对超市、餐饮业等的主动监测和监督力度, 对检测不合格的产品进行封存、禁止销售并据具体情况对照有关标准和规范进行修改, 使食品卫生质量有较大的改善, 从而避免和减少了我市食源性疾病的暴发。见表3。

3 讨论

LM是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏菌病, 感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中, 食品中存在的LM对人类的安全具有危险, 该菌在4 ℃的环境中仍可生长繁殖, 是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。我国已经把该菌列为食品污染菌, 并作为必检项目。

本次调查主要在生肉和熟肉中检出, 与有关报道相一致[2], 显示邯郸市生肉和熟肉制品存在LM的污染, 是食物中毒潜在的危险;本次检测的8类食品377份样品, 共检出16株LM, 检出率达4.24%。在各种熟肉、生肉制品、蔬菜、尤其是水产品中都分离出LM, 其中生肉制品LM检出率高达8.73%, 与有关报道相一致[3];熟肉制品LM检出率最高为10.0%, 提示熟肉制品很易受该菌污染, 应引起高度重视。

肉制品不合格原因是生产经营者卫生意识淡薄, 食品敞开销售、器具、餐具消毒不严, 生熟不分, 防蝇防尘设施不全, 个人不良的卫生习惯等导致食品污染。卫生监管人员应增加监督频率, 对卫生设施不完善、生熟不分, 特别是冷藏、消毒设施不全要加强控制措施, 加强运输工具及运输过程的管理, 运输工具要定时清洗消毒, 离地存放, 以防污染;加强从业人员的卫生知识培训, 使其自觉遵守法律法规, 才能从根本上提高产品质量。1999年底, 美国发生了历史上因食用带有LM的食品而引起的最严重的食物中毒事件, 据美国疾病控制和防治中心资料显示, 在美国密歇根州有14人因食用被该菌污染的“热狗”和熟肉而死亡, 另外22个州中有97人患此病, 6名妇女流产;虽然在我国尚未见LM在这些食物中引起中毒的报道, 但仍不可忽视该菌的污染问题, 应引起我国食品卫生管理方的高度重视。

在水产品、蔬菜中首次检出LM, 检出率分别为1.23%、1.10%, 虽然没有生肉和熟肉中检出率高, 但表明蔬菜和水产品很易受到LM污染, 在运输、储存和销售等各个 环节要严把卫生质量关, 避免LM的污染, 从而有效的防止食物中毒的发生。

通过检测, 基本掌握了LM在我市各种食品中污染状况及其污染趋势, 确定了本市的高危食品;传统的食品安全控制方法不能有效防止食品污染, 餐饮业应积极推广HACCP (危害分析和控制关键点) 系统理论并使其普及和应用, 通过对食品全过程的各个环节进行危害分析, 找出能控制产品卫生质量的关键控制点 (CCP) , 并采取有效措施防止食品被污染, 保证上市食品的安全, 从而保障广大消费者的身体健康。

参考文献

[1]龚运伟, 郭红.食品中单增李氏菌污染的调查.现代预防医学, 2007, 34 (10) :1903.

[2]王春东, 陆俊荣, 李顺利, 等.沧州市2006—2007年食源性致病菌污染状况调查.职业与健康, 2008, 24 (20) :2160.

细胞污染 篇6

1 单增李斯特菌对食品的污染现状

单增李斯特菌广泛分布于自然界, 如土壤、污水、屠宰场、青饲料, 动物和人体也可带该菌, 该菌通过口腔-粪便的途径进行传播, 对食品的污染范围比较广、污染率也较高。据WHO报道, 4%~8%的水产品、5%~10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均可被该菌污染。我国自1994年制定《单增李斯特菌的检测标准》以来, 已有部分省市进行了食品中单增李斯特菌的污染监测工作。

不同省市单增李斯特菌的污染状况不同, 同一省市不同年份此菌污染状况也不同。选取我国方位不同、发展程度不同的10个省, 比较2000年前后这些省食品中单增李斯特菌的污染状况, 进而掌握单增李斯特菌对我国食品污染的发展趋势, 具体见表1。

通过比较可以看出, 与2000年前相比我国单增李斯特菌的污染率呈上升趋势, 由原来的0.89%增长到3.17%, 涨幅达2.28%。除江苏省和辽宁省污染率略有降低外, 其余8个省污染率均有不同程度的升高, 其中黑龙江省的增长幅度最高, 达5.66%, 且2000年后污染率最高的也是黑龙江省, 而污染率最低的是辽宁省, 仅为1.00%。尽管到目前为止, 我国尚未发现大面积爆发的由单增李斯特菌引发的食物中毒报道, 但从这10个省单增李斯特菌平均污染率不断增长的趋势看, 我国存在着单增李斯特菌引发食物中毒的潜在危险, 提示有关监督部门必须提高警惕, 加大对食品安全的监管力度。通过该比较还可以看出, 地域的经济发达程度与单增李斯特菌的污染率高低无明显关系。

不同食品的单增李斯特菌污染率不同, 而污染率的高低决定该食品对公共卫生的影响程度。为进一步了解单增李斯特菌对我国不同种类食品的污染状况, 还比较了以上10个省的5类食品, 即生肉、熟肉、乳、水产品、蔬菜在2000年前后的污染差异, 具体见表2。

由表2可见, 无论是在2000年前还是2000年后, 5类食品中污染率最高的均为生肉类, 且在2000年后除乳类食品污染率有所降低外, 其他4类食品污染率均有增高趋势, 其中涨幅最高的是生肉类, 达3.78%, 其次为熟肉类。以上结果表明, 单增李斯特菌对我国乳制品的危险性较小, 即使在乳制品类食品中存在少量单增李斯特菌的污染, 在公共卫生上也构不成明显危害。而作为肉类食品则不然, 由于生肉中的单增李斯特菌主要来自环境, 其在单增李斯特菌的传播链中起着重要作用。同时畜类屠宰和销售过程中的交叉污染更会加剧这种传播, 导致该菌在食品中的污染范围进一步扩大。而熟肉的即食性则决定了此类食品最易成为单增李斯特菌进入人体的载体。因此, 肉类食品可能会成为引发食物中毒和食源性疾病的重大安全隐患。故需要食品卫生监管部门加大对肉类食品的监督、监测力度, 控制住单增李斯特菌对此类食品的污染, 就可大大降低该菌引发的公共卫生安全问题的可能性。

不仅国内单增李斯特菌污染状况有愈发严重的趋势, 该菌在世界范围内的污染程度更令人担忧。以2000年后10个国家的污染状况为例说明目前该菌在世界范围内的污染状况:2000年, 日本肉类食品的污染率为牛肉12.2%、猪肉20.6%、鸡肉37.0%;2004年, 匈牙利奶制品 (包括生牛奶、奶酪和冰激淋等) 单增李斯特菌污染率达57.65%;2005年, 对土耳其发酵肠、生肉、熟肉进行单增李斯特菌的污染状况调查发现, 发酵肠的污染率达35%, 较2002年报道的瑞士发酵肠15%的污染率高出20%;2006年, 希腊对该菌的调查结果表明, 27.5%的生肉、8%的奶酪受到污染;2008年, 伊朗、意大利分别对不同种类食品进行单增李斯特菌的污染调查, 结果发现伊朗冻牛肉污染率最高, 为14.2%, 意大利的即食食品的污染率为9.5%。通过以上总结不难看出, 该菌污染范围较广、污染程度较大, 已经对世界公共卫生健康构成严重威胁。因此, 应加大、加强世界范围内单增李斯特菌的监控、监管力度, 避免爆发大规模的食物中毒事件和食源性疾病。

2 单增李斯特菌的耐药现状

作为食品中4大致病菌之一的单增李斯特菌对公共卫生的威胁不仅仅在于其能引发高死亡率的李斯特菌病和大规模的食物中毒事件, 还在于该菌愈发严重的耐药性及其耐药性的转移所带来的危害。一直以来, 单增李斯特菌被认为是一种对抗革兰阳性菌的抗生素都敏感的食源性致病菌, 但自1988年首次报道单增李斯特菌的四环素耐受株以来, 国内外学者相继从食品中分离出对一种或多种抗生素耐受的单增李斯特菌株。

国外诸多报道表明, 单增李斯特菌的耐药性也呈现愈发严重的趋势, 并且正以非常快的速度由单一耐药向多重耐药发展。20世纪80年代, 国外报道该菌多以单一耐药为主, 且耐药率最高的是四环素, 但自进入21世纪以来, 人们越来越多地从食品中分离到单增李斯特菌的多重耐药株。2002年, AureliP等从禽肉和鱼肉中分离到2株多重耐药株, 该菌株的耐药谱为四环素、氟甲喹、林可霉素和磷霉素。2006年, RodasS等对从牡蛎、鱼肉等食物中分离到的68株单增李斯特菌进行了13种常用抗菌药物的敏感性分析, 发现其中有6%的菌株对氨苄西林、红霉素、四环素、双氯西林、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异唑等药物耐药。同年, ShenY等对即食食品中分离出的91株菌进行了药敏分析, 发现有78%的菌株出现多重耐药, 耐药谱为四环素、萘啶酸、环丙沙星和复方磺胺甲基异唑。

我国对单增李斯特菌耐药性研究的报道并不多见, 但从仅有的几篇报道也能看出, 近年来我国单增李斯特菌具有较高的耐药率和较广的耐药谱。2003—2008年, 我国泉州市、佛山市、扬州市、温州市、江门市及浙江省等省市对单增李斯特菌的常见抗菌药物进行了耐药性分析, 结果发现该菌的耐药性已由单一耐药向多重耐药发展, 耐药谱由单一的呋喃妥因逐渐发展至呋喃妥因、伊诺沙星、头孢噻肟、痢特灵、诺氟沙星、氯霉素、复方新诺明、环丙沙星、多黏菌素B、卡那霉素、氯洁霉素等多种抗菌药物, 每种药物的耐药率不同, 范围为2.1%100%, 其中头孢噻肟、诺氟沙星、多黏菌素B、呋喃妥因的耐药率居高。

该菌耐药性的不断发展已经作为一个亟待解决的问题摆在人们面前。一方面, 单增李斯特菌耐药株的不断出现增加了李斯特菌病的治疗难度和治疗费用;而另一方面, 国内外耐药谱的差异性和单增李斯特菌耐药基因的转移性结合在一起, 进一步导致该菌耐药谱的复杂化, 这就意味着对李斯特菌病的预防和治疗将会出现难上加难的情况。

单增李斯特菌及其产生的耐药性对食品安全及人类健康的影响已经引起许多国家的警惕。建立和完善该菌及其耐药性监测系统和预警系统势在必行, 这不仅可以预防食品污染及增强对突发事件的反应能力, 同时还可以为制订行之有效的公共卫生政策提供科学依据。

摘要：单核细胞增生性李斯特菌作为一种重要的食源性致病菌已引起世界各国的广泛关注。文章主要综述了近些年来该菌对食品的污染状况和该菌耐药性的发展趋势, 以便人们更好地了解和掌握该菌对人类健康存在的潜在威胁, 进而为制订行之有效的公共卫生政策奠定基础。

细胞污染 篇7

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试品种:2年生的平阳特早茶苗。

重金属处理试剂:分别为分析纯的Cr(NO3)3·9H2O、As2O3、Cd(NO3)2·4H2O、Pb(CH3COO)2·3H2O。

盆栽土样:黄壤,土壤肥力中等,含有机质19.27 g/kg,p H 4.7,全氮0.61 g/kg,全钾9.39 g/kg,全磷0.32 g/kg,全铬64.88 mg/kg,全砷9.6 mg/kg,全镉0.083 mg/kg,全铅9.31 mg/kg。

1.2 实验设计

实验采用Cr、As、Cd、Pb四因素三水平正交实验设计L9(34),共9个处理,每处理3次重复。其处理水平和浓度见表1。其中,Cr、As、Pb的最高浓度是土壤环境质量标准(GB 15618-1995)中的土壤临界值。采用土培法,土壤经自然风干、去杂质、压碎后过2 mm孔径筛,充分混匀备用。按实验设计(表1)将各处理需添加的外源重金属完全溶解后借助喷雾器均匀施于土壤中,再次充分混匀,置于规格为高25 cm、宽38 cm的黑色营养钵中,每盆土重8 kg(以干土计),加蒸馏水使土壤含水量为田间持水量的70%左右,平衡1周以作为模拟不同浓度的复合重金属污染土壤。挑选生长一致的平阳特早茶苗,每盆栽种6株,成活后每盆定植4株。每处理重复3次(共6盆)。培养于四川农业大学教学实习茶场内,管理水平一致,于2007年4月布置、栽种,2008年11月取相同部位的叶片(秋梢芽下第1、2片成熟叶)用蒸馏水洗净、擦干,进行SOD、POD、CAT活性以及细胞膜透性的测试。

1.3 测试指标及方法

1.3.1 酶活性的测定

1.3.1.1 酶液的制备

在2008年11月15日采摘各处理茶树蓬面秋梢第1片成熟叶,洗净擦干后剪碎,准确称取0.5 g,加入0.3 g PVP和1.5 g石英砂以及5 m L 0.05 mo L p H 7.8的磷酸缓冲液研磨,将匀浆定容至10 m L,然后置于4℃冰箱中浸提2 h,3层纱布过滤后于12000 r/min冷冻离心15 min,收集上清液于-20℃冰箱中保存备用。

1.3.1.2 SOD活性的测定

采用氮蓝四唑比色法[2]测定,以抑制NBT光化还原反应的50%为1个酶活力单位。

1.3.1.3 POD活性的测定

采用愈创木酚氧化法[2]测定,以每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活力单位。

1.3.1.4 CAT活性的测定

采用分光光度法[3]测定,以每分钟OD值减少0.1定义为1个酶活力单位。

1.3.2 细胞膜透性的测定

参照邹琦[4]的方法。在2008年11月20日采摘各处理茶树蓬面秋梢第2片成熟叶,洗净擦干后避开主脉用0.8cm打孔器将每处理叶片打成45片(分成3份),置于3个干净的三角瓶中,准确加入20 m L蒸馏水,保鲜膜密封后放置室温4 h,采用DDS-11A电导仪测定初电导值,再次密封后于沸水浴中煮沸30 min,冷却至室温后摇匀,测定终电导值,计算相对电导率(%)。

1.4 数据分析

利用Excel 2003整理数据和作图,DPS 3.01数据处理软件统计分析。

2 结果与分析

2.1 Cr、As、Pb、Cd复合污染对茶树叶片酶活性的影响

逆境情况下,植物体内活性氧代谢会受到影响,超氧歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)分别清除自由基(O2-、H2O2),从而维持细胞膜结构的稳定。植物体内O2-含量一定程度的增加能诱导SOD酶活性的升高,但当O2-的增加远远超过正常的歧化能力时,细胞内多种功能受到破坏,生理代谢紊乱,SOD酶活性反而受到抑制而下降[5]。另外POD活性升高可以催化H2O2形成H2O,从而有效地阻止O2-和H2O2在植物体内的积累,排除这些自由基对植物细胞膜结构潜在氧伤害的可能性[6]。CAT也是植物抗氧化酶系统的重要组成部分,它能够清除细胞内过多的H2O2,以维持细胞内H2O2在一个正常的水平,从而保护膜结构[7]。

注:表中数据均为3次重复测定的平均值,同一列不同小写字母表示差异达5%显著水平。

茶树叶片SOD、CAT和POD活性的测定值见表2,从表2可看出当茶树受到Cr、As、Pb、Cd复合污染时,SOD、POD、CAT活性均呈增加趋势,且各处理保护酶活性均显著高于对照。说明Cr、As、Pb、Cd复合污染下,茶树体内O2-、H2O2等活性氧自由基大量增加,对正常生理代谢造成了伤害,此时SOD、POD和CAT保护酶活性随之被激活,清除了过多的氧自由基。这是茶树的一种应急解毒措施,使细胞免受毒害的调节反应,在一定程度上可减轻自由基对茶树细胞膜结构的伤害[8]。由此可见,茶树在一定浓度范围内对Cr、As、Pb、Cd复合污染具有耐受性。

图1为Cr、As、Cd、Pb分别与酶活性、相对电导率关系的正交实验直观分析图,可较直观地看出Cr、As、Pb、Cd对茶树叶片酶活性和细胞膜透性的影响。从图1也可看出,当土壤添加不同浓度的外源重金属Cr、As、Pb、Cd时,均能刺激茶树叶片的保护酶活性不同程度地升高。其中,Cr对SOD、POD和CAT活性的最高值和最低值影响最大,且Cr浓度不同导致其活性的变化幅度最大,说明茶树对Cr敏感;As对3种保护酶的活性均有显著的刺激作用,随As浓度的增加酶活性增加,且SOD和POD活性的增幅大于CAT活性的增幅;Cd对酶活性的影响相对较弱,变化幅度较小,其中,SOD和POD活性变化趋势基本一致,且二者活性的增幅均大于CAT;Pb对酶活性的影响最小,SOD活性缓慢增加,POD和CAT活性略有增加,总体来说,变化幅度最小。这些结果表明,在本实验处理浓度下,茶树叶片保护酶对4种重金属复合污染都具有一定的适应性,但3种保护酶对4种重金属复合污染的敏感程度有一定差异,其中SOD对重金属污染最敏感,其次为POD,CAT最次。由李合生[9]的研究可知,SOD催化生物体内的第一个氧活化产物O2-生成O2和H2O2,而POD、CAT催化H2O2生成O2和H2O,因此SOD是对应激反应最敏感的保护酶。张玉秀等[10]认为CAT是生物氧化过程一系列抗氧化酶的终端,对重金属所产生的生理效应表现相对较弱。

注:F0.05=3.63,F0.01=6.23。※表示在5%水平上显著,※※表示在1%水平上极显著。

从极差分析结果(表3)可以看出,4种重金属离子对酶活性的影响强弱顺序:SOD为Cr>As>Pb>Cd POD和CAT均为Cr>As>Cd>Pb。由此表明,Cr对酶活性影响最为明显,其中SOD活性Cr处理组的R值分别是As处理组的1.49倍,Pb处理组的5.86倍,Cd处理组的6.77倍;POD活性Cr处理组的R值分别是As处理组的1.31倍,Pb处理组的6.58倍,Cd处理组的15.71倍CAT活性Cr处理组的R值分别是As处理组的2.52倍,Cd处理组的6.92倍,Pb处理组的15.90倍,进一步表明茶树对Cr污染最敏感。Pb对POD、CAT活性的影响最小,而Pb的浓度在供试的4种重金属元素中最高,这可能是铅进入植物细胞后,与细胞中过剩的非蛋白巯基结合,形成不溶性络合物,或者以铅晶体缓慢地积累在细胞壁上,呈密布的微粒沉积下来,而微粒中的铅在生理上的作用是惰性的,因而在实验条件下显示的影响最小[11]。曹会聪[12]在对油菜的研究中得到了相同的结论,认为可能是由于Pb的移动性较差,进入植物根部后较快淀积而失去活性。

方差分析结果(表4)表明,土壤添加Cr对茶树叶片SOD、POD、CAT活性的影响极显著,As对SOD、POD和CAT的活性影响也达到显著或极显著水平;Cd对POD活性影响极显著,而对SOD、CAT活性影响均不显著,Pb对POD活性影响显著,对SOD、CAT活性影响均不显著。本实验中,Cr、As、Pb、Cd添加的浓度顺序为Pb>Cr>As>Cd,其中,Cr、As、Pb的最高浓度是土壤环境质量标准(GB 15618-1995)中二级标准的土壤临界值,Cd的最低浓度是土壤二级标准临界值的10倍,但对茶树酶活性和细胞膜透性的影响相对较小,这可能是由于拮抗作用,其他元素的存在降低了Cd的毒性,其机理有待深入研究。

为了检验这种影响,在SOD、CAT和POD活性(y)和诸因素(添加量,mg/kg)之间求出多元回归方程:

方程(1)、(2)、(3)表明,添加4种重金属元素均使酶活性增加,即它们协同使酶活性增加。而对方程(1)、(2)、(3)逐步回归分析也表明,Cr、As对酶活性的影响均最显著,这与极差分析和方差分析得出的结果一致。

以上结果都表明,Cr、As、Pb、Cd对茶树叶片酶活性的影响除了受到添加该元素的影响外,还受到共存元素的影响,其影响较为复杂。植物受重金属元素的胁迫取决于元素的浓度组合,在某一点上共存元素的拮抗或协同作用最强。因此,复合污染对茶树的影响是一种综合效应[13]。

2.2 Cr、As、Pb、Cd复合污染对茶树叶片细胞膜透性的影响

细胞膜是细胞与环境之间物质交换的界面,各种逆境对细胞的影响首先作用于细胞膜,细胞膜又是选择透过性膜,它能调节和控制细胞内外物质的运输和交换[14]。细胞膜透性是评定植物对污染物反应的生理指标之一[15],而相对电导率是反映植物细胞膜透性的指标。

相对电导率测定结果见表2,从表2可看出,在复合污染条件下,各处理的相对电导率均迅速增加,且极显著高于对照。Cr、As、Pb、Cd添加量与细胞膜透性的关系见图1,由图1可知,不同添加量的Cr、As、Pb、Cd组合,对茶树叶片细胞膜透性的影响有所不同。相对电导率的最高值和最低值均受Cr的影响最大,且由Cr浓度不同所导致电导率的变化幅度最大,这与Cr对酶活性的影响结果一致;相对电导率受Cd的影响最小,变化幅度也最小。在Cr、As和Pb处理下,相对电导率呈现相同的变化趋势,即随着重金属浓度的增加而增加;而Cd处理下,相对电导率呈现出先降低再升高的趋势。

通过正交实验的极差分析,可以区分出不同添加量的重金属元素对茶树的影响。从极差分析结果(表3)可看出,这4种重金属离子对细胞膜透性的影响强弱顺序为Cr>As>Pb>Cd。正交实验的方差分析结果(表4)表明:土壤添加Cr、As、Pb、Cd对叶片的细胞膜透性的影响均达到极显著。为了检验这种影响,在相对电导率(y,%)和诸因素(添加量,mg/kg)之间求出多元回归方程:

y(相对电导率)=7.9954+0.0743(Cr)+0.1776(As)+0.1461(Cd)+0.0128(Pb)(4)R2=0.9459(P<0.01)

方程(4)表明,添加的4种重金属元素均使相对电导率增加,即Cr、As、Pb、Cd协同使茶树叶片细胞膜透性增加。由唐咏等[16]的研究可知,重金属污染条件下,植物产生的过量自由基能损伤细胞膜中的不饱和脂肪酸和蛋白质,使细胞膜结构松散,细胞内的一些物质外流,从而导致细胞功能减弱。而在本实验的处理浓度下,茶树叶片细胞膜透性增加,意味着4种重金属的复合污染已使茶树叶片的细胞膜结构受到一定程度的破坏,并产生了毒害效应。而逐步回归分析表明,Cr、As的影响最显著。这与极差分析和方差分析得出的结果一致,也与本实验中酶活性的变化一致。说明茶树对Cr、As污染更敏感,耐受能力较差。

3 结论

在本实验条件下,Cr、As、Pb、Cd的复合污染使茶树叶片的SOD、POD、CAT三种保护酶活性和细胞膜透性均显著增加。三种保护酶活性的激活,在一定程度上可减轻自由基对细胞膜结构的伤害,表明茶树对本实验浓度范围内的Cr、As、Pb、Cd复合污染具有一定的耐受性。而细胞膜透性的增加,表明4种重金属的复合污染已对茶树叶片产生了毒害效应。

Cr、As、Pb、Cd复合污染对茶树SOD活性和细胞膜透性的影响均表现为Cr>As>Pb>Cd,对POD和CAT活性影响均为Cr>As>Cd>Pb。Cr对茶树SOD、POD、CAT活性和细胞膜透性的影响极显著;As对SOD、POD和细胞膜透性影响极显著,对CAT活性影响显著;Cd和Pb对POD活性和细胞膜透性的影响显著,而对SOD和CAT活性的影响相对较小。表明茶树对Cr、As污染更敏感,耐受能力较差。Cr、As、Pb、Cd对茶树叶片酶活性的影响除了受到添加该元素的影响外,还受到共存元素的影响,其影响较为复杂。

Cr、As、Pb、Cd添加的浓度顺序为Pb>Cr>As>Cd,Pb的用量最大,但对茶树的酶活性和细胞膜透性的影响相对最小,As的用量较小,却是影响酶活性和细胞膜透性的关键性因子,Cd的浓度远高于土壤环境质量标准中的土壤临界值,但对茶树酶活性和细胞膜透性的影响相对较小。

摘要：通过盆栽实验,研究了土壤中Cr、As、Pb、Cd复合污染对茶树叶片酶活性和细胞膜透性的影响。结果表明,茶树叶片酶活性和细胞膜透性的变化趋势基本一致,均随浓度的增加而增加,说明茶树在本实验浓度范围内对4种重金属的复合污染具有耐受性;极差分析表明,对SOD活性和细胞膜透性影响顺序为Cr>As>Pb>Cd,对POD和CAT活性影响顺序为Cr>As>Cd>Pb;方差分析表明,Cr对茶树SOD、POD、CAT活性和细胞膜透性的影响极显著;As对SOD、POD和细胞膜透性影响极显著,对CAT活性影响显著;Cd、Pb对POD活性和细胞膜透性的影响显著,而对SOD和CAT活性的影响相对较小,说明茶树对Cr、As污染更敏感,耐受能力较Cd、Pb弱。