细胞膜片

2024-12-08

细胞膜片（共5篇）

细胞膜片篇1

摘要：目的介绍一种膜片钳实验中简便、快速分离大鼠和豚鼠心肌细胞的方法, 探讨影响细胞分离产量和质量的原因。方法迅速取出动物心脏, 挂在Langendorff装置上, 分别用无钙台式液和酶液进行灌流一段时间, 然后剪取心室部分, 置于KB液中将其剪碎吹打分散, 筛网过滤将滤液放置在2℃～6℃冰箱中冷藏4h后可进行膜片钳实验。结果用此方法分离出的心肌细胞存活率高, 结构完整, 具有良好的耐钙性和较长的存活时间。结论控制好分离心肌细胞分离中的各种实验条件和熟练的实验操作, 是分离出适合于膜片钳实验的心肌细胞的重要因素。

关键词：膜片钳,心肌细胞,大鼠,豚鼠

心肌细胞的分离是膜片钳实验当中重要的步骤。能否得到质量好、数量多的细胞是膜片钳实验能否顺利进行的关键因素。自从1969年Kono[1]首次报道了酶解法被运用于细胞分离以来, 不少人在实验中对这种实验方法进行了改进[2,3], 但分离后的细胞存活率和钙耐受性总是不稳定, 因此直接导致膜片钳实验不能顺利进行。本文所采用的细胞分离方法参考了刘恭鑫等[4]的方法, 并总结自己在实验当中的经验对细胞分离的方法做了改进, 分离细胞过程简单, 时间短, 获得细胞存活率高, 结构完整, 纹理清晰, 具有良好的钙耐受性和较长的存活时间。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠、豚鼠, 体重200 g~250 g, 雌雄不限, 由山西医科大学实验动物中心提供。

1.2 药品及溶液配制

HEPES[4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine-ethanesulfonicacid]、牛磺酸 (taurine, TAU) 、L-谷氨酸 (L-Glutamic acid) 为美国Sigma公司产品, 胶原酶P (collagenase P) 为 Roche Diagnostic GmbH Mannheim 德国产品, 其余试剂均为国产分析纯试剂。

台氏液:KCl 5.4 mmol/L, NaH2PO4 0.33 mmol/L, HEPES 5 mmol/L, Glucose 10 mmol/L, MgCl2 1 mmol/L, NaCl 140 mmol/L, CaCl2 1.8 mmol/L, 用1.0 mmol/L的NaOH调pH值到7.35~7.40。无钙台氏液:去除钙离子的台式液。酶液:KCl 5.4 mmol/L, NaH2PO4 0.33 mmol/L, HEPES 5 mmol/L, Glucose 10 mmol/L, MgCl2 1 mmol/L, NaCl 125 mmol/L, Taurine 20 mmol/L, CaCl2 75 μmol/L, 胶原酶P 5 mg~7mg。KB液:L-谷氨酸 50 mmol/L, KCl 30 mmol/L, 牛磺酸 20 mmol/L, KH2PO4 30 mmol/L, HEPES 10 mmol/L, Glucose10 mmol/L, MgCl2 1 mmol/L, EGTA 0.5 mmol/L, 用1.0 mmol/L的KOH调pH值到7.35~7.40[5]。

1.3 实验方法

取大鼠或豚鼠, 腹腔注射肝素200 U/kg, 20 min后迅速剪断动物颈部放血, 开胸取出心肺, 立即置于0 ℃氧饱和的无钙台式液中修剪, 保留心脏并游离出长1.5 cm~2.0 cm长的主动脉, 插入Langendorff灌流装置的主动脉套管, 并用棉线固定;在7 kPa~8 kPa灌注压下, 用纯氧饱和的37 ℃~38 ℃无钙台式液灌流7 min~8 min;然后再用酶液循环灌流15 min~20 min, 这种条件下心脏灌流得充分, 为鲜红稍带黄色, 心肌组织松软;最后再用氧饱和37 ℃无钙台式液灌流1 min~2 min。剪下心室部分置于室温KB液中剪碎, 用粗口吸管轻轻吹打, 然后用150 μm的筛网过滤, 室温下稳定1 h后, 放入冰箱2 ℃~6 ℃下冷藏4 h备用。

2 结果

经上述方法分离大鼠和豚鼠的心肌可以得到单个心肌细胞, 存活率大约为70%~90%, 在KB液中放置72 h后仍有40%~50%存活。状态良好的心肌细胞光镜下观察:呈杆状或矩形, 具有清晰的横纹, 立体感强, 台盼蓝拒染, 心肌细胞长60 μm~160 μm, 宽10 μm~40 μm, 大鼠与豚鼠心肌细胞静息电位均为-70 mV~-80 mV, 复钙后大约有60%~70%的细胞存活。

3 讨论

膜片钳技术中的吉欧封接是技术改进的一次革命, 而理想的单个心肌细胞标本的制备是能够形成吉欧封接的先决条件, 因此心肌细胞标本的质量直接影响实验的成功率。本实验研究所采用的心肌细胞分离方法快速简便, 分离细胞的结果稳定, 细胞存活率高, 结构好, 耐钙且存活时间长, 因而大大提高了膜片钳实验当中的工作效率。细胞分离的质量以及存活率和以下一些因素有关。

3.1 实验条件的控制

实验条件包括实验用水, 各种实验试剂, 溶液成分、温度、pH值和氧饱和度。实验中所用水质的好坏直接关系到分离细胞的成败[2], 在进行心肌细胞分离时应使用三蒸水或者去离子水, 要求水的电导在1 μs/cm以下。溶液当中的各种成分纯度至少要在化学纯以上, 酶的效价和用量是细胞分离当中的关键因素, 酶的量过多会使细胞结构遭到破坏, 存活的细胞未达到高阻封接便破膜死亡。酶的用量过少时, 不能很好地消化细胞间的连接, 分得的细胞很多呈捆状或链状连在一起, 即使有一些单个细胞, 由于细胞膜上残存的未被消化的物质, 直接影响细胞膜与玻璃电极之间的封接。酶的用量应在实践中不断摸索调整到最适用量。温度也是细胞分离当中的重要因素, 取出心脏后置于0 ℃氧饱和的无钙台式液中, 可在修剪时减低心肌组织的代谢从而保护心肌;细胞分离过程中要求室温保持在25 ℃~30 ℃, 灌流液体的温度保持在37 ℃~38 ℃, pH值调到7.35~7.40是模拟内环境, 以便使酶的活性保持最佳状态。本方法中动物在体的肝素化可以有效防止冠状动脉内血栓的形成, 保证液体灌流的畅通, 从而保证心肌组织的供氧供能, 提高细胞的存活率和保持良好的状态。

3.2 熟练的实验操作

在控制好实验条件后, 分离细胞过程中

1) 为山西省回国留学人员科研基金资助项目 (No.2007-42)

熟练的操作也是非常重要的。分离心肌细胞是一个程序化的连贯工作, 此过程中各个步骤紧密联系相互影响。处死大鼠要快, 这样不但可以减少动物的痛苦, 还可以保证心室腔不会形成血栓;开胸取出心脏、修剪心脏和悬挂心脏动作要准确而迅速, 这样可以减少心肌组织缺氧, 从而保证分得的心肌细胞数量和质量, 熟练的操作是在实验当中逐步培养成的。细胞分离的过程中每一步操作和每一个实验条件都是非常重要的, 任何小的疏漏都可能影响分得的细胞数量和质量, 所以要求实验者在工作中要细心和耐心。

参考文献

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[4]刘恭鑫, 顾全堡, 郭棋, 等.大鼠、豚鼠心肌细胞的简单快速分离[J].中国应用生理学杂志, 1997;13 (4) :

[5]武冬梅, 吕吉元, 边竹平, 等.抗心律失常药E-4031对豚鼠心室肌细胞Na+/Ca2+交换电流影响[J].中国药理学与毒理学杂志, 1999, 13 (3) :161-164.

细胞膜片篇2

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

3个月龄雄性新西兰大白兔, 体重2.5~3.5 kg, 由第四军医大学动物实验中心提供。将兔随机分为3组, 其中10只为实验组, 接受共培养细胞膜片复合HA移植治疗;10只为BM-MSC对照组, 接受单纯BM-MSC细胞膜片复合HA移植;5只为空白对照组, 不接受任何治疗。

1.1.2 实验试剂及仪器

α-MEM培养基, 青、链霉素 (Gibco, 美国) ;胎牛血清 (FBS, GE Healthcare, 美国) ;Percoll分离液, 抗坏血酸, 地塞米松, 戊巴比妥钠, 羟基磷灰石 (Sigma, 美国) ;谷氨酰胺 (Invitrogen, 美国) ;兔CD34抗体 (Bioss Inc., 美国) ;人重组粒细胞刺激因子 (齐鲁制药, 山东) 。流式细胞仪 (Beckman-Coulter, 美国) , 二氧化碳恒温孵箱 (Thermal, 美国) , 体视显微镜 (Leica MZ9.5, 法国) , 倒置相差显微镜及照相系统 (Olympas, 日本) 。

1.2 方法

1.2.1 兔PB-CD34+细胞的分离

采血前给予兔皮下注射人重组粒细胞刺激因子10μg/kg, 1次/d, 于第5天采血。采用心脏取血的方法, 每只兔取血约80ml。将取得的静脉血与等体积的PBS充分混匀, 采用Percoll分离液分离得到单个核细胞。依据说明书加入抗体标记细胞, 将细胞悬液置于4℃冰箱中孵育30min, 利用流式细胞仪分选PB-CD34+细胞。将分选好的细胞调整密度为1×106/ml, 接种于25 cm2的一次性培养瓶中, 放置二氧化碳孵箱 (5%CO2) 中孵育, 备用。

1.2.2 兔BM-MSC的分离

抽取兔股骨骨髓血, 采用密度梯度离心法分离骨髓血中的MSC[2]。调整细胞密度接种于25 cm2的一次性培养瓶中, 放置二氧化碳孵箱 (5%CO2) 中孵育。24 h后换液, 去除悬浮、未贴壁的细胞, 之后每3 d更换培养液。待细胞生长至80%~90%融合时, 以0.25%胰蛋白酶消化, 按1∶2比例传代培养。

1.2.3 共培养体系的建立

取对数生长期P3 r BM-MSC接种于6孔培养板内, 每孔细胞数量为1×105, 过夜培养贴壁。培养基为含10%胎牛血清的低糖α-MEM培养液, 加入谷氨酰胺2 mmol/L, 青霉素钠和链霉素各100 U/ml。将PB-CD34+细胞加入培养板内, 每孔数量为5×105, 每孔细胞数目之比为PB-CD34+细胞∶BM-MSCs=5∶1。之后1周内培养液不更换, 第2周时培养液每3 d更换1次。共培养14 d后, 弃去未贴壁的细胞。

1.2.4 共培养细胞与单纯BM-MSC成膜诱导

取共培养满14 d的细胞 (于9 cm培养皿中, 2种细胞添加比例同前) 以成膜诱导液 (含10%FBS的α-MEM, 加入地塞米松10 mmol/L、抗坏血酸50μg/ml、谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素钠和链霉素各100 U/ml) 继续培养14 d, 每3 d换液1次。相同方法培养单纯BM-MSC。

1.2.5 细胞膜片复合羟基磷灰石移植物的制备

以眼科镊配合细胞刮刀轻轻地收获细胞膜片。将预先在基础培养液中湿润过夜的羟基磷灰石粉末100 mg轻撒于膜片中央, 小心地将其包裹于细胞膜片中, 再将其放入基础培养液, 置于二氧化碳孵箱中孵育4 h, 使其膜缩收紧团块。分别制备共培养细胞及单纯BM-MSC细胞膜片复合物备用。

1.2.6 兔颅骨极限缺损模型的建立和修复

实验动物均接受1%戊巴比妥钠1 ml/kg静脉注射麻醉。麻醉显效后头部剪毛备皮, 用碘酒、酒精交替消毒皮肤。于颅顶部设计舌形切口, 手术刀切开皮肤、皮下组织, 暴露颅骨, 将骨膜翻起, 以手机钻头比照直径15 mm圆形塑料圆片制备全层缺损, 此过程中持续以生理盐水降温, 并注意保护颅骨下的硬脑膜组织。之后共培养实验组及BM-MSC对照组移植事先制备好的移植物, 去除骨膜组织后小心缝合伤口。空白对照组直接缝合伤口。

1.2.7 观察指标

术后, 所有动物继续饲养8周。术后4、6、8周行CT扫描并三维重建。8周后以过量麻醉剂 (1%戊巴比妥钠2 ml/kg) 处死动物, 收集颅骨标本进行检测。

1.2.7. 1 大体观察

活体触诊动物颅骨修复情况。肉眼观察取出标本缺损区修复情况。

1.2.7. 2 影像学观察

所有实验动物术后4、6、8周给予头颅常规CT扫描, 并行三维重建, 比较各组动物颅骨缺损修复情况。

1.2.7. 3 组织学观察

将标本以4%多聚甲醛固定2d后, 17%EDTA (p H 7.0) 脱钙2周, 流水冲洗2 h, 石蜡包埋, 切片, 常规HE染色。

1.2.7. 4 新生骨定量分析

选择通过标本中心、切面完整、染色清晰的切片, 以图像分析软件 (Image-Pro Plus, Media Cybernetics, 美国) 定量检测染色切片, 计算缺损修复率, 公式为新生骨面积/缺损区面积, 结果以x珋±s标准差表示。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件分析数据, 2组数据之间比较采用双侧t检验, P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 共培养体系的建立及细胞膜片形成

成功分离出兔PB-CD34+细胞及BM-MSC。共培养14 d后, 倒置显微镜下观察共培养细胞呈复层贴壁生长状态, 细胞形态为成纤维样, 细胞之间的形态无明显差异。2种细胞成膜诱导培养7 d左右开始形成薄膜样物质, 并逐日增厚, 14 d后, 于培养皿底部可见一层白色薄膜即为细胞膜片。以细胞刮刀小心自薄膜边缘沿培养皿底部刮下膜片, 此过程中可以发现膜片具有一定弹性及机械性能。倒置显微镜下观察见膜片内细胞呈梭形, 密集、重叠生长 (图1) 。2种细胞膜片从形态学上无明显差别。

A:剥离的细胞膜片;B:培养14 d后膜片中的细胞

2.2 实验动物情况及大体观察

所有动物均对手术、麻醉耐受良好, 无并发症及术后感染。术后8周, 触诊实验组及BM-MSC对照组动物颅顶部缺损处可触及硬组织生成, 质地无明显区别。空白对照组动物颅顶部可触及明显缺损。肉眼观察标本发现, 实验组及BM-MSC对照组动物颅顶缺损区均有骨性组织生成, 空白对照组动物颅顶部仅见纤维性组织生长。

2.3 常规CT扫描并重建结果

所有实验动物术后4、6、8周给予头颅常规CT扫描并行三维重建。可以观察到:空白对照组仅缺损边缘有少量新骨生长;BM-MSC对照组生成的新骨量明显大于空白对照组, 但所生成新骨大部分位于缺损边缘, 而缺损中央部分并不明显;共培养细胞组缺损边缘及中央均有明显的新骨生成, 且术后8周影像显示, 缺损已基本修复 (图2) 。

2.4 组织学观察及定量分析

所取得的标本均行HE染色检查 (图3) , 结果显示:共培养细胞组的成骨效果明显高于2对照组。以图像分析软件定量检测HE染色切片, 各组新生骨修复率为:空白对照组6.3%±1.2%;BM-MSC对照组为14.7%±2.1%;共培养细胞组为29.5%±5.6%, 共培养细胞组与BM-MSC对照组及共培养细胞组与空白对照组之间的差别均有统计学意义 (P<0.05, 图4) 。

3 讨论

细胞共培养是上个世纪80年代发展起来的新技术, 它是将2种或2种以上的细胞混合置于同一环境中进行培养, 以最大限度地模拟体内环境、维持培养体系性状以及观察细胞之间的相互作用。共培养体系建立的目的在于, 利用一种辅助细胞的存在, 诱导另一种目的细胞的分化、增殖及细胞活性的维持等。由于共培养技术能够更好地模拟细胞在体内的生长环境, 因此取得了比单一细胞培养更好的实验效果。国内外的许多研究已经证实, 共培养的不同细胞之间通过“对话”, 能够起到诱导分化、维持和促进细胞活性等作用。Bhandari等[3]将大鼠肝细胞与成纤维细胞共培养发现, 相比单独培养的肝细胞, 18 d后只有共培养体系的肝细胞仍能保存细胞活性与功能。Sorrell等[4]将人皮肤纤维样细胞与血管内皮细胞共培养后发现, 前者通过释放成纤维细胞生长因子和VEGF-A维持了血管内皮细胞的完整性。

在本实验中, 我们采用了直接接触共培养的方法, 以PB-CD34+细胞为辅助细胞, 以BM-MSC为目的细胞。BM-MSC是目前骨组织工程中的应用最广泛的种子细胞, 其促进成骨的能力已得到众多实验的证实[5,6]。以往CD34+细胞均自骨髓血中获得, 但是近年来, 外周血CD34+细胞越来越受到研究者青睐。主要原因是外周血收集方便, 若应用于临床, 还可以使患者省去麻醉及骨髓穿刺之苦。虽然外周血CD34+细胞数量相对较少, 但应用粒细胞集落刺激因子等细胞因子和/或化疗药物刺激之后, 通常能将足够数量的细胞动员至外周血中。根据相关文献的报道, PB-CD34+细胞具有很强的诱导促进血管发生的作用[7,8], 同时其本身也可以分化为MSC而贴壁生长[9,10]。本文的结果证明, 经过PB-CD34+细胞的诱导, BM-MSC的成骨效应可以进一步增强。

细胞膜片技术最初是为了解决组织工程中种子细胞的流失而产生的, 它的原理是通过各种细胞因子、药物等的诱导, 使被培养的细胞分泌大量的细胞外基质而形成的薄膜状细胞聚合体。这一技术由Okano等[11]于1993年首次报道。由于细胞膜片技术保留了一些重要的细胞表面蛋白, 如细胞与细胞间离子通道、连接蛋白、生长因子受体等[12], 使其拥有很多优点, 包括良好的生物相容性;适宜的机械强度和可操作性;细胞接种成功率高、基质丰富;可量化控制, 能够根据实验的需要调整膜片大小和厚度;可以直接用于组织构建, 也可以联合有效的支架材料一起应用。我们采用将细胞膜片包裹培养液预培养的羟基磷灰石粉末修复颅骨缺损, 既能提高移植细胞的利用率, 又能有效地利用羟基磷灰石的骨诱导活性, 在实验中也取得了良好的修复效果。

另外, 我们的研究还存在一些缺点和不足。首先, 没有使用细胞示踪技术, 进一步证明移植的外源性细胞在成骨中发挥了重要作用。其次, 应用流式细胞仪分选外周血CD34+细胞的成本较高, 限制了其临床应用。

综上所述, 我们通过应用共培养细胞修复兔颅骨极限缺损模型, 验证了共培养细胞可以作为一种优秀的种子细胞应用于骨组织工程。通过运用细胞膜片技术复合HA支架材料, 我们有效地修复了兔颅骨极限缺损, 为临床治疗颅骨缺损提供了一种新的思路和方法。

参考文献

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细胞膜片篇3

离合器作为汽车的重要部件, 起着保证汽车平稳起步、变速器顺利换挡和防止传动系过载等作用。随着汽车发动机性能的不断提高及汽车电子技术的迅速发展, 人们对离合器的设计要求越来越高。膜片弹簧离合器的重要元件膜片弹簧, 其设计分析大多沿用Almen-Lazlo公式, 简化较多;或者仅对大端进行静载荷有限元分析, 很难真实地模拟膜片弹簧的结合与分离时的应力变化情况。

2 LS-DYNA的介绍

ANSYS/LS-DYNA是世界上著名的显式非线性动力分析软件, 其能够真实地模拟世界上各种复杂的非线性问题, 如几何非线性、材料非线性和接触非线性等问题。该软件特别适合求解各种非线性结构的高速碰撞、爆炸和金属成形等非线性动力冲击问题。由ANSYS/LS-DYNA进行分析的结构若受有预载荷, 如果不能确定预载荷是否影响系统的动态响应, 就需要进行隐式-显式序列求解。不像显式-隐式求解被局限于金属成形过程, 隐式-显式过程能广泛用于初应力影响动态响应的工程问题中。

3 膜片弹簧静力分析

3.1 膜片弹簧的基本结构及优点

膜片弹簧是具有弯曲形状的盘状弹簧, 其在结构形状上可分为两部分。第一部分是其内孔圆周表面上开有许多均布的长径向槽部分, 像一圈伸出的手指, 如图1所示, 在槽的根部制成较大的长方圆形孔, 这部分称之为分离指;另一部分是从窗孔底部至弹簧外圆周的部分, 它的形状像一个无底的碟子, 和一般机械上所用的碟形弹簧类似, 固称之为膜片弹簧的碟簧部分。

膜片弹簧具有压紧弹簧和分离杆的作用, 该作用减少了零件数目从而减轻离合器的重量;而且膜片弹簧具有良好的非线性特性, 如果设计合理, 可使摩擦片磨损到极限时, 压紧力改变较少, 并减轻离合器分离时的踏板力, 使得操纵轻便。

3.2 膜片弹簧的建模及网格划分

网格划分是有限元分析的重要技术, 网格的数量、形式及质量决定了计算的精度和速度。有限元单元主要包括实体单元、壳体单元和梁单元三种类型。其中实体单元用来构造三维实体结构;壳单元 (也称为板单元) 用来模拟厚度较小的二维物体;梁单元专用来模拟钢架、桁架、链杆及弹簧等一维的物体。膜片弹簧的单元不可用梁单元, 可用壳单元和实体单元。膜片弹簧离合器的支撑圈和压盘实际上分别作用于膜片弹簧的上、下表面, 而板壳模型采用中面建模, 与实际情况不相符。膜片弹簧壳单元计算速度较快, 但实体模型计算精度更高, 故采用实体模型并进行实体网格单元划分。

进行膜片弹簧实体建模前, 先对模型进行简化处理, 去除一些对结构强度影响不大的小半径圆角和工艺特性曲面。在三维软件中建立简化后的膜片弹簧实体模型, 再导入Hypermesh中进行网格划分。选用三维8节点实体单元, 共划分了15696个单元, 25956个节点。材料为50CrVA, 其材料属性如表1所示。

3.3 膜片弹簧大端加载分析

根据膜片弹簧离合器的工作情况, 设定膜片弹簧的边界条件及加载方式。在支撑圈限定的节点上施加零位移约束, 在与压盘接触的节点上施加指定的位移约束, 其约束及加载情况如图2所示。经过静力分析求解得出其应力云图如图3所示。由膜片弹簧的应力云图可以看出, 其在大端窗口底部应力最大, 此时最大值为1.11E9Pa, 而材料的许应应力为1.67E9Pa。在静态载荷下, 膜片弹簧没有塑性变形, 是安全的。

4膜片弹簧小端加载运动仿真

为进行显示求解, 将分析的隐式单元转换为显式单元, 并读入来自隐式分析的节点结果。膜片弹簧大端静载荷分析所用的几何构形及其变形的几何构形, 将用做显式分析的起始点, 然后施加所需的约束及载荷。在施加载荷前, 定义时间-位移载荷数组, 将载荷施加到膜片弹簧小端部分的节点组元上。时间-位移载荷表如表2所示。

定义求解时间, 输出文件类型及输出文件频率等并进行显式求解, 经过后处理后, 显示其应力云图。取其0s、0.0015s、0.051s、0.15s时刻的应力云图。其运动仿真的应力云图分别如图3~6所示。0s时的应力云图与图3的膜片弹簧大端加载应力云图是相同的。小端加载后其最终应力云图为图6, 其在大端窗口底部应力最大, 此时最大值为1.03E9Pa, 小于其许用应力, 小于预载荷的最大应力1.11E9Pa。可见预载荷可以有效减小膜片弹簧的内应力。

5 结语

本文建立了一款膜片弹簧的三维有限元模型, 并对膜片弹簧进行了隐式-显式求解, 进行了膜片弹簧施加预载荷后小端的动态仿真分析。分析结果表明膜片弹簧符合强度设计要求, 而且预载荷的施加使膜片弹簧的内应力有显著降低。

参考文献

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[3]胡静.捷达轿车离合器膜片弹簧的设计与研究[D].长春:长春理工大学, 2008.

油缸安全膜片的应力计算篇4

石油开采的过程都是在井下数千米的地层进行的。井下设备的工作因结构空间的限制有时必须采用液压油缸进行驱动。井下环境恶劣,很多机械零件周围充满了油砂混合介质。如果砂子进入液压系统就会堵塞液压系统的安全阀孔造成油缸内的压力急剧升高,甚至会导致设备塑性变形,从而引起“卡钻”一类重大事故的发生。

为了避免此类事故的发生,并考虑设备结构的尺寸限制,笔者希望设计一套“安全膜片”。安全膜片的作用是在压力过大时自己发生破裂而使液压系统卸载,也就同时保护了其它设备不发生塑性变形,从而避免出现更大的经济损失。

在油缸缸盖上铣出一个直径为D的圆槽,并在油缸盖中心位置开一个直径为d的圆孔,将安全膜片嵌入到圆槽中,当压力过大时,安全膜片因受力变形进而发生破裂并卸去系统内过高的压力而起到保护设备的作用。油缸盖如图1所示。

选取一种圆形纯铝板作为安全膜片。采用纯铝的原因是注意到其塑性较好及材质一致性比较容易控制。安全膜片的结构如图2所示,其基本尺寸如下:

板的直径D=71mm,板受载荷部位为直径2R=15mm的圆面,板厚为h=1.5mm。

这种安全保护装置属于一种破坏性的安全阀。其体积小,结构及工作原理都很简单,不会额外增加设备的径向尺寸,也不会改变整个设备的外形,因此对钻探设备和航空设备这类尺寸要求严格的系统而言是比较适用的安全装置。

笔者为此做了一些实验。实验结果表明:在上述条件下施加P=40MPa的压力时纯铝材质的安全膜片就会破裂,故称P=40MPa为本膜片的破裂压力。

确定膜片的厚度和小孔的直径是这种安全装置的设计要素。笔者希望找到一种比较成熟的公式去确定膜片的以上参数。传统的计算方法较多,应该用理论计算得到的破裂压力与实验破裂压力的比较,并将其作为依据去衡量哪种公式比较适合这种安全膜片的设计。

2 传统计算方法

2.1 剪切理论计算

传统观念认为,安全膜片所受的载荷可以简化为沿周边的剪切载荷。根据剪切的实用计算公式[1],安全膜片受到的最大剪切应力为:

安全膜片受到的压力为:

式(2)中:d——安全膜片上承受载荷的小圆面的直径;

h——安全膜片的厚度。

查表可知,纯铝压力加工成型并退火后其板材的剪切强度极限为邀στ妖=60MPa。

将邀στ妖=60MPa,d=15mm,h=1.5mm代入(1)、(2)、(3)计算得P=24MPa。

即当压力达到24MPa时安全膜片应发生破裂。但是,实验测得破裂压力可以达到P=40MPa。此种计算方法所得结果与实验数据相差66.7%。按上述的剪切理论计算,1.5mm厚度的安全膜片抵抗不了40MPa的压力,必须增加膜片的厚度才能达到要求。前面的实验已表明,若真的根据计算结果去增加膜片的厚度,则不能保证膜片在需要破裂的时候产生破裂,也就不能起到应有的安全作用。

2.2 平板弯曲理论计算

还有人认为这种情况下膜片受压变形而出现弯曲,因弯曲应力过大而破裂。根据平板弯曲理论,将模型简化,如图3所示。

由实验可知,板的破坏是从周界开始的,因此,应将周边应力作为危险计算应力。

根据圆形平板的计算公式,得膜片周边应力:

式(4)中:q——板承受的载荷;

R——承受载荷的那部分圆面的半径;

E——安全膜片的弹性模量。

将邀σt妖=邀σb妖=100MPa,R=7.5mm,E=68GPa,h=1.5mm,代入(4)计算得q3=7.69MPa。

上述计算表明:当压力达到7.69MPa时安全膜片应发生破裂。但实验测得破裂压力已达到P=40MPa。此种计算方法所得结果与实验数据相差420.2%。由此看来,按这种设计方法设计出来的产品也不能保证设备的安全,应该放弃。

2.3 周端固定的安全膜片计算

根据资料认为,膜片在发生破裂的瞬间,原来的平面膜片急剧地挠曲,变成半径为R=b/sinφ的球形的一部分(如图4所示);膜片的厚度由h减小到h1,沿着膜片厚度上的应力分布差不多是常数,并且等于σp。

根据平衡条件可以得到

当安全膜片破裂前的瞬间邀σb妖=σF

式(6)中:{σb妖}——安全膜片的强度极限;

φ——挠曲角,sinφ=0.618(实验结果)。

将b=7.5mm,邀σb妖=100MPa,h1=1.2mm,sinφ=0.618代入(6)式得P=19.77MPa。

计算表明:当压力达到19.77MPa时安全膜片应发生破裂。但是,实验测得破裂压力可以达到P=40MPa。此种计算方法所得结果与实验数据相差102.3%。按该方法的计算结果进行安全膜片设计不能使本装置产生需要的安全保护作用。

综上所述,这些传统的计算方法造成的后果十分危险。出现这种结果的根本原因是以上的计算都将安全膜片看成是始终的弹性体。实际上本安全膜片的塑性很大,受载不大的时候就进入了塑性流动阶段且流动硬化性能不好。若将其看成是弹性体,不免造成计算应力过大的缺陷。

Ansys软件是美国Ansys公司的应力分析软件,其中有一款计算模型针对塑性材料,既考虑了材料的弹性阶段也考虑了塑性阶段,比较符合安全膜片的实际变形过程。

3 借助Ansys软件进行计算

安全膜片的破裂的过程是一个非线性变形的过程,对类似的塑性材料应该采用非线性方法来计算。

工业纯铝的应力-应变关系曲线(σ-ε曲线)如图5所示,图5中εs表示屈服时的应变值。由图5可明显看出,当ε>εs时,应力-应变曲线变化非常平稳,近乎一条直线,尤其是当εs<ε<50%时表现更为明显。将图5中的几个关键点的值输入到Ansys中定义材料的弹性模量。

安全膜片是对称结构,根据轴对称性,取圆盘横截面的1/2建立几何模型,厚度方向取15个单元,半径方向取30个单元,划分的网格如图6所示。

安全膜片所受约束简化为外圈受全约束,载荷简化为中间小圆部分受面载荷。

Ansys软件中,都是预先施加载荷并由载荷计算出膜片的应力,这一过程难以逆转,即难以像2.3中计算方法那样实现由破裂应力推出载荷的大小,用于和实验结果作出对比。因此,笔者采用试凑法,选取与40MPa相邻的一组载荷数据分别计算,将计算应力与安全膜片的强度极限进行对比,推算出安全膜片破裂时施加在安全膜片上的载荷。计算结果如表1所示。

由表1可知,当载荷变化较小时,载荷与应力之间满足线性关系。采用插值法,可以得到安全膜片破裂时施加的载荷应为40.3MPa。即当压力达到40.3MPa时膜片应发生破裂。实验测得破裂压力可以达到P=40MPa。此种计算方法所得结果与实验数据仅仅相差0.74%,而且这种误差使膜片的安全性能得到加强,故可以认定这种计算方法所获结果更加符合实际。

Ansys的网格划分还可以进一步细化,笔者已证明进一步细化不会引起计算结果的明显变化。

4 结论

通过以上几种计算方法的比较,前面三种计算方法理论上都是可行的,但计算结果都与实验的数据相差较大。相比之下,Ansys计算结果与实验结果更加吻合。出现这种结果的根本原因是前三种理论计算都将安全膜片看成始终的弹性体,实际上安全膜片的破裂变形过程是包含弹性变形和塑性变形两个阶段。为了精确地预测出安全膜片的破裂压力,在计算时也应该分为两个阶段来进行。Ansys可以计算塑性变形,但是,网格过多计算量会增大,网格过少计算结果不准确。安全膜片的选择计算目前还没有比较成熟的计算方法可供参考,这将是笔者今后的努力方向。总之,涉及到安全膜片的选择计算,可以将基于Ansys的分析计算作为一种推荐算法。

参考文献

[1]刘鸿文.材料力学[M].北京:高等教育出版社,2004.

[2]《机械设计手册》联合编写组.机械设计手册(上册)第二版[M].北京:化学工业出版社,1987.

[3]姚兆生(译),马骥(校).机械零件强度计算手册[M].北京:机械工业出版社,1979.

[4]张朝晖.ANSYS11.0结构分析工程应用实例解析[M].北京:机械工业出版社,2008.

膜片联轴器安装技术分析篇5

联轴器是用来将原动机所产生的转矩传递给从动机的装置, 分为刚性联轴器和挠性联轴器两大类。膜片联轴器是靠膜片材料的变形来吸收转动轴间存在的各种偏移的一种金属弹性元件挠性联轴器。其主要特点如下:结构简单, 不需润滑;平衡容易, 重量轻, 噪声低, 具有吸振能力;承受偏移能力强, 承载大, 效率高, 寿命长;环境适应性强, 应用广泛;可在不干扰主从动装置条件下装拆, 安装、使用、维护方便。

膜片联轴器在国内的应用已很普遍, 广泛用于各种机械装置的轴系传动, 如水泵 (尤其是锅炉给水泵) 、风机、压缩机、水泥机械、汽轮机等机械传动系统。

2 工作原理与结构

膜片联轴器由几组膜片 (不锈钢薄板) 用螺栓交错地与两半联轴器联接, 从而将主、从动轴连接起来, 形成轴系传动系统;同时, 靠膜片的弹性变形来补偿机轴由于制造误差、安装误差、温度变化等的影响所引起的角向、径向、轴向偏移。膜片联轴器主要是用于电动机、减速机及工作机的轴连接, 它至少由一个膜片和两个轴套组成, 适用于轴向间距比较小的设备上。有一些膜片联轴器有两个或三个膜片, 中间有一个或两个刚性元件, 两边再连在轴套上, 适用于轴向间距比较大的设备上。按照膜片联轴器的特点及应用范围又分为多种型号, 详见国家标准JB/T 9147—1999膜片联轴器。

如图1所示为膜片联轴器的典型结构, 应用最广, 适用于轴间距较大的设备上, 能对轴向、径向和角向偏移给予较大的补偿, 是膜片联轴器的首选形式。

现对这种带中间节的膜片联轴器的安装进行阐述。

3 安装技术及注意事项

3.1 安装前的准备

测量轴端间距、轴径、轴伸等尺寸并与联轴器相应尺寸对照, 在确认无误的情况下, 方可进行安装。

3.2 半联轴器的安装

1) 将安装轴表面的灰尘污浊擦拭干净, 同时抹一层薄薄的机油或者润滑剂。

2) 半联轴器内孔与轴的配合一般设计为过盈配合或过渡配合, 安装前应仔细检查半联轴器内孔和轴的外径, 保证表面清洁无毛刺。

3) 对于平直轴, 将键放入轴上的键槽中, 键端不应凸出或凹入轴端, 以齐平为好。将半联轴器放入油槽中加热, 温度为120℃~150℃, 加热保温后, 根据联轴器安装图迅速装到轴上要求的位置, 半联轴器与轴端一般应平齐, 禁止局部加热或锤击装配, 以免变形影响使用。对于锥形轴, 按平直轴装键同样要求将键装在轴上, 然后将半联轴器装于轴上, 并用手推紧, 再用螺母紧固, 使半联轴器轴向移动至固定位置。

3.3 调整轴向尺寸 (FF)

轴向尺寸FF为两半轴节法兰面之间的距离。首先将主从动机器转子置于运转位置, 然后测取两半联轴器法兰面之间的距离达到生产厂家技术要求。电机要保证磁力中心位置, 从动装置要考虑推力轴承, 如锅炉给水泵应将泵转子向泵进口端推靠, 以平衡盘靠齐为准。

3.4 半联轴器初步找正

尽管联轴器具有较强的补偿能力, 但安装时要严格找正, 使得机组工作平稳, 以提高联轴器以及主机轴承的使用寿命。半联轴器分别安装完毕后, 进行初步径向、角向的找正。

对于无底座的大型设备就位后地脚螺栓无法紧固者, 应在初找后浇灌基础的螺栓孔。

3.5 机组的调中 (二次找正)

调中是安装中最重要的环节, 一般来说主、从动端设备初始对中越好, 那么传动系统的运行就越平稳。

对于无底座的大型设备就位后地脚螺栓无法紧固者, 应待其浇灌的基础螺栓孔混凝强度达到设计强度要求的70%后, 才能紧固地脚螺栓, 方可进行联轴器的二次找正工作;二次找正固定完毕后将垫铁接缝处点焊牢固并隐蔽完成。

联轴器对中, 常用的方法是利用百分表分别对联轴器半轴节的端面和外圆测取跳动值;由于存在轴向窜动, 常采用两块表同时测量轴向跳动值以抵消轴向窜动时造成的测量误差, 以及采用一块表测量径向跳动值 (通常称为三表法) 。详细测量步骤如下:

1) 将两个半联轴器暂时互相连接, 在圆周上画出对准线, 测量工具采用百分表和相应的工具 (如表架等) ;

2) 将两个半联轴器一起转动, 转动一周返回到初始位置, 应每转90°测量一次, 并记录5个位置的径向位移测量值和位于同一直径两端测点的轴向测量值;

3) 验证测量是否正确, 确定测量值是否有效;

4) 根据测量数值, 计算联轴器两轴心的径向位移、两轴线的倾斜度的实际值;

5) 角向、径向、轴向偏移符合制造厂家要求, 或如厂家无明确时, 应符合GB 50231—2009机械设备安装工程施工及验收通用规范的要求;

6) 具体记录形式及计算方法详见GB 50231—2009机械设备安装工程施工及验收通用规范附录。

3.6 装入联轴器中间节

将膜片组件、中间节放在两半联轴器之间, 然后分别将两端的螺栓、垫块、自锁螺母装入。各零件安装位置如图2所示。注意螺栓的安装方式, 请勿装反。先紧固一端自锁螺母 (自锁螺母装配时, 应涂少量中性润滑油) , 紧固时要尽量注意使螺栓不要转动, 严格按拧紧力矩要求, 用扭力扳手按对角顺序至少分三次均匀拧紧, 然后按拧紧力要求再拧紧另一端螺母。自锁螺母允许多次使用, 但若用手能自由地将自锁螺母锁紧部位拧入螺栓或自锁螺母收口部位有裂纹等缺陷时应报废, 严禁再使用。

3.7 安装注意事项

1) 联轴器的动平衡有严格的要求, 安装时注意联轴器外圆处对正标记 (动平衡配合标记) 、安装方向指示, 以保证良好的动平衡。

2) 膜片联轴器上的螺栓, 一般都是生产厂家特制, 不得用标准件替换。

3) 将联轴器插入安装轴;如孔径偏紧, 注意避免用铁锤或硬金属击打安装。

4) 带膜片的产品有棱边, 有致伤可能, 建议安装时佩戴厚手套等。

5) 膜片联轴器的容许偏差包括径向, 角向, 轴向偏差, 安装时偏差超出容许值时, 膜片联轴器可能会发生变形从而导致损坏或使用寿命缩短。

6) 膜片表面应光滑、平整, 并应无裂纹等缺陷, 半联轴器及中间轴应无裂纹、缩孔、气泡、夹渣等缺陷。

4 使用、维护

1) 对机组运行联轴器定期进行如下检查 (至少半年一次) , 若发现问题应及时调整和更换零部件。

a.螺母是否有松动, 传动螺栓配合段表面是否有明显揉伤;b.观察膜片组件的外层表面是否有碰伤、裂纹、过度的永久变形缺陷;c.检查机组轴对中是否已变化, 若不对中数值已超过规定, 应重新进行对中调整。

2) 在联轴器周边安装保护罩等装置以确保安全。

3) 拆卸时, 请在装置完全停止的状态下进行;依次松开锁紧螺丝。