蚕蛹/分析

蚕蛹/分析（共7篇）

蚕蛹/分析 篇1

笔者对丽江市医院2006~2008年共收治33例食用蚕蛹后引起中毒的诊治进行分析, 旨在提高对该组疾病的认识, 以采取及时有效的防治措施。

1 临床资料

1.1 一般资料

33例患者中, 男18例, 女15例;年龄22~57岁, 平均32岁。食用数量:3~10个者5例, 11~15个者8例, >15个者13例, 用量不详者7例。发病时间:食用后2 h内发病者9例, 2~8 h发病者18例, 9~16 h发病者6例。发病季节:每年8~10月份。发病形式:全部为散发病例。制作方式:全部为煎炸。所有病例发病前均无类似病史及其他服药病史、饮酒史。

1.2 临床表现

本组病例均有不同程度的眩晕、头痛、头昏、恶心、呕吐、四肢麻木、无力及颤抖, 双眼水平震颤8例, 复视6例, 意识障碍5例, 腹泻9例, 斜视性眼振挛7例, 走路不稳、不能站立9例, 构语困难3例。体检:血压、体温均正常, 浅昏迷4例, 深昏迷1例, 双眼水平震颤8例, 双侧指鼻试验9例, 双侧巴基征阳性5例, 脑膜刺激征均为阴性。

1.3 实验室及辅助资料

WBC (5.2~11.3) ×109/L、中性粒细胞0.41~0.78、淋巴细胞0.12~0.49。心电图、颅脑CT均正常, 4例脑电图轻度异常, 可见到弥漫性不规则高振幅波。尿常规、肝功能正常。

1.4 治疗

本组病例均给予如下治疗: (1) 地塞米松静脉注射10~20 mg/d, 肌内注射异丙嗪25 mg/次; (2) 纳洛酮0.8 mg静滴; (3) 大量补液及维生素B6、维生素C、胞二磷胆碱;在此基础上有意识障碍者, 用25%甘露醇减轻脑水肿, 全部病例给予静脉输液促排泄。

2 结果

本组病例经上述处理后, 28例1 d内得到治疗, 临床症状消失;5例在5 d内痊愈, 复查脑电图均正常, 随访无复发和后遗症。

3 讨论

本组病例均有不同程度的眩晕、头痛、头昏、恶心、呕吐、四肢麻木、无力及颤抖, 严重者尚有意识障碍, 临床表现以前庭、锥体外系、小脑症状为主。蚕蛹中毒的机制尚不清楚, 目前有两种观点: (1) 中毒。蚕蛹内含有特异性神经毒素, 比较耐热, 即使将蚕蛹油煎或者煮熟后进食, 仍可中毒, 食后迅速起病, 症状出现的快慢、轻重与食量无关。检查中毒患者进食的剩余蚕蛹, 半数有虫体变色、发黑、发红, 其味不鲜, 或有麻辣感, 故蚕蛹的处理或者放置不当, 导致蛹内蛋白变性、分解, 产生毒素, 作用于体弱或易感个体, 均可发生中毒症状。蚕蛹内所含的特异性神经毒素, 主要损害神经系统, 出现锥体外系和小脑损害综合征等[1]。本组大部分病例出现眩晕、头痛、头昏、四肢、麻木、无力、颤抖等神经系统症状, 支持中毒的观点。 (2) 变态反应, 属Ⅰ型变态反应。人食用蚕蛹后, 其蛹体内的蛋白质 (或变性蛋白) 作为一种抗原, 诱发了易感个体发生抗原抗体反应[2]。此观点可以解释同餐多人共食蚕蛹者, 偶尔只有一例发病, 而且有时仅食1~2个蚕蛹即可发病。在本组病例中有2例, 再次食用蚕蛹后, 迅速再发眩晕、头痛、头昏、恶心、呕吐、四肢麻木、无力及颤抖, 而且症状比第一次更为严重, 很快出现昏迷, 再则短期肾上腺皮质激素及H1-受体阻滞剂异丙嗪治疗取得良好疗效, 反过来也证实了这一观点。

本病诊断不难, 结合食用蚕蛹史及食后数小时内迅速出现以前庭、锥体外系、小脑为主的神经系统症状, 甚至昏迷, 排除散发性脑炎、帕金森病、舞蹈病等神经疾病。鉴于目前对蚕蛹中毒机制的认识, 在治疗上及早应用肾上腺皮质激素、H1-受体阻滞剂以抗过敏, 给予大量补液、维生素B6、维生素C、胞二磷胆碱, 这里需要特别说明的是, 纳洛酮的应用, 蚕蛹中毒患者临床表现与急性酒精中毒有很多相似之处, 如均有共济失调、震颤、呕吐等症状, 均呈一过性功能损害等, 由此推测蚕蛹中毒很可能是蚕蛹体内有某种毒性物质, 特异性地作用于敏感个体, 激活了其体内的内源性阿片系统, 使β-EP等内源性阿片样物质释放增多, 从而出现毒性反应。张志刚等[3]报道23例蚕蛹中毒脑病患者经用纳洛酮治疗取得良好疗效, 印证了这一推测, 笔者对本组病例全部静脉滴注纳洛酮0.8 mg, 也取得了良好疗效。建议蚕蛹中毒患者及早使用纳洛酮, 以减轻对脑部的损害。蚕蛹中毒患者预后一般良好, 经抗过敏及对症治疗, 无任何后遗症。

预防蚕蛹中毒必须注意: (1) 加强卫生宣传教育工作, 让群众了解蚕蛹中毒的危害, 不买、不食腐败变质的蚕蛹。 (2) 食用蚕蛹前必须充分加热, 应在沸水中煮沸10~15 min再烹饪食用, 未食完的蚕蛹放置后不应再食用, 如再食用仍须重新加热;对已变质的蚕蛹, 绝对不可食用。

参考文献

[1]朱子扬, 龚兆庆, 汪国良.中毒急救手册[M].上海:上海科技出版社, 1996.

[2]王永茂.札蚕蛹所致中毒性脑炎37例报告[J].山东医学杂志, 1988, 19 (1) :81.

[3]张志刚, 王新国, 邹原波.纳洛酮治疗柞蚕蛹中毒性脑病23例分析[J].中国医院药学杂志, 2003, 23 (11) :690.

蚕蛹/分析 篇2

1 材料与方法

1.1 试验材料

木薯蚕蛹虫草:木薯蚕活蛹由广西蚕业技术推广总站提供, 于2013 年7—8 月饲养, 蚕期全龄喂食木薯叶;虫草菌种由大连生物技术研究所提供。以常规方式栽培木薯蚕蛹虫草[10,11], 待子实体成熟后采收备用。

仪器设备:GZX-9070MBE型数显鼓风干燥箱, 由上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产;LC-20AT型高效液相色谱仪, 由日本岛津公司生产;TA新世纪型紫外分光光度计, 由北京普析通用仪器有限责任公司生产;SKD-2000 全自动蛋白质检测仪, 由上海沛欧分析仪器有限公司生产;L-8900 型全自动氨基酸自动分析仪, 由日立高新技术公司生产;AF-7500 型原子荧光光度计, 由上海精密仪器仪表有限公司生产;AA320N型原子吸收分光光度计, 由上海仪电分析仪器有限公司生产。

1.2 试验方法

本试验委托广西壮族自治区分析测试研究中心进行测试。

1.2.1 三大营养元素的含量测定木薯蚕蛹虫草蛋白质的含量测定用蛋白质分析仪, 脂肪的含量测定用索氏抽提法[12], 总糖的含量测定用苯酚———硫酸法[13], 以参考文献[2]测定的柞蚕蛹虫草及冬虫夏草的三大营养元素的含量分别为第1 对照 (CK1) 、第2 对照 (CK2) 。

1.2.2 氨基酸含量的测定用氨基酸自动分析仪对木薯蚕蛹虫草中所含氨基酸及其含量进行测定, 以参考文献[9]测定的柞蚕蛹虫草及冬虫夏草中氨基酸的含量分别为第1 对照 (CK1) 、第2 对照 (CK2) 。

1.2.3 有效活性成分的测定木薯蚕蛹虫草虫草素的含量测定用HPLC法, 虫草酸、虫草多糖及超氧化物歧化酶 (SOD) 的含量测定用紫外分光光度法[9], 以参考文献[9]测定的柞蚕蛹虫草及冬虫夏草中氨基酸的含量分别为第1 对照 (CK1) 、第2 对照 (CK2) 。

1.2.4 部分无机盐及维生素的含量测定木薯蚕蛹虫草的铁 (Fe) 、镁 (Mg) 、锰 (Mn) 、钙 (Ca) 、锌 (Zn) 、铜 (Cu) 、汞 (Hg) 、镉 (Cd) 、铅 (Pb) 、钾 (K) 的含量测定用原子吸收分光光度法[3,14], 硒 (Se) 的含量测定用荧光法[3], 磷 (P) 的含量测定用分光光度法[14];维生素的含量测定用HPLC法[16]。

2 结果与分析

2.1 木薯蚕蛹虫草的三大营养元素含量

木薯蚕蛹虫草的干物质中含蛋白质71.00%, 脂肪0.94%, 总糖0.36% (表1) 。与文献[2]报道的柞蚕蛹虫草、冬虫夏草的营养成分相比, 蛋白质含量与柞蚕蛹虫草的相当, 比冬虫夏草高1 倍;木薯蚕蛹虫草的脂肪含量不足柞蚕蛹虫草的1/3, 仅为冬虫夏草的1/10;木薯蚕蛹虫草的总糖含量显著低于柞蚕蛹虫草和冬虫夏草的含量[17]。

注:柞蚕蛹虫草和冬虫夏草数据来源文献[2]。

2.2 木薯蚕蛹虫草的氨基酸含量

在木薯蚕蛹虫草中检测到18 种氨基酸, 占虫草总量的19.21%, 低于柞蚕蛹虫草 (26.78%) , 略高于冬虫夏草 (19.03%) 氨基酸的含量。与柞蚕蛹虫草和冬虫夏草的含量对比, 只有甘氨酸和组氨酸含量均高于这2 种虫草。木薯蚕蛹虫草的谷氨酸、胱氨酸含量约为柞蚕蛹虫草的1/3, 冬虫夏草的谷氨酸含量也比木薯蚕蛹虫草高出近1 倍。木薯蚕蛹虫草中甘氨酸、赖氨酸含量比冬虫夏草高1 倍多, 蛋氨酸、亮氨酸的含量只有柞蚕蛹虫草的1/2, 其它氨基酸含量与对照相比略低或相近 (见表2) 。蛹虫草的粗蛋白因环境、品种等因素不同, 各种氨基酸含量存在一定差异, 对其含量报道的差异较大[2,3,4,5,6,7,8,9]。

注:柞蚕蛹虫草和冬虫夏草数据来源于文献[9]。

2.3 木薯蚕蛹虫草的有效活性成分含量

蛹虫草用于医学发挥药理作用的主要有效成分是虫草素、虫草酸、虫草多糖。此次检测木薯蚕蛹虫草中虫草素的含量比冬虫夏草高1 倍, 而柞蚕蛹虫草中虫草素的含量则高出木薯蚕蛹虫草近10 倍;木薯蚕蛹虫草中虫草酸的含量不足柞蚕蛹虫草和冬虫夏草的1/2, 且未检测到虫草多糖, 而在柞蚕蛹虫草和冬虫夏草中均检测到一定含量的虫草多糖 (表3) 。木薯蚕蛹虫草的SOD值为1 409 U/g, 不同检测方法和不同培养基培育的蛹虫草SOD活性差异大, 目前检测到桑蚕蛹虫草SOD最高为1 882 000 U/g[18];廖春丽等[8]通过WST-1 试剂盒对SOD酶活进行测定, 测得蛹虫草子实体内SOD酶活为515.4 U/g。

注:柞蚕蛹虫草和冬虫夏草数据来源于文献[9]。

2.4 木薯蚕蛹虫草的部分无机盐及维生素含量

木薯蚕蛹虫草富含多种无机盐, 对人体有益的Ca、Fe、Zn、Se等元素含量较高 (见表4) 。木薯蚕蛹虫草还含有维生素A、E及B族维生素, 未检测到维生素D和维生素C (见表5) 。

单位:mg/kg

单位:μg/g

3 小结与讨论

不同产地蚕蛹的营养成分研究 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

蚕蛹:分别来源于广东、湖北宜昌、浙江海宁和浙江湖州四种不同产地。

1.1.2 主要仪器

1 0 1 A-3型数显电热风干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)、套式恒温器(海宁新华医疗器械厂)、DDY-5型总氮测定仪(北京兴化真空仪表厂)、LWY-型调温式远红外烧煮炉(吉林省四平市兴科仪表厂)、SZF-06A型脂肪测定仪(上海新佳电子有限公司)、万分之一电子天平(德国SARTORIUS公司)、Vrian Prostar高效液相色谱系统(230三元梯度泵、二级管阵列检测器、410自动进样器)、SUPELCOSLTMLC-DABS柱(4.6mm×150mm,3µm)、JBZ-14型恒温磁力搅拌器(上海志威电器有限公司)、PH201型PH计(意大利哈那公司)、真空干燥箱(上海申仪开关厂)。

1.1.3 主要试剂

甲醛(A R)、氢氧化钠(A R)、乙醚(A R)、硫酸铜(AR)、硫酸钾(AR)硫酸(AR)、盐酸(AR)、混合硼酸指示剂(现配)、Dabsyl-CL衍生剂(SUPELCO批号502219)、磷酸二氢钾(AR)、丙酮(AR)、乙醇(AR)、甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC)、Dabsyl-CL衍生试剂(SUPELCO公司)、氨基酸标准品(Waters公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 水分含量的测定

分别称取不同产地蚕蛹药材粉末4~5g,平铺于干燥至恒重的扁平形称量瓶中,精密称重,打开瓶盖在105℃下干燥5h,将瓶盖盖好,移置干燥器中,冷却30min,精密称重,再在上述温度干燥1h,冷却,称重,至两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量,计算供试品中含水量(%)。

1.2.2 脂肪含量的测定

分别称取不同产地蚕蛹药材粉末4~5g,加乙醚约60m L在脂肪测定仪上回流6h,回收乙醇后,将平底烧瓶在水浴上挥去有机溶剂,然后再105℃时烘至恒重,称其重量,再洗去脂肪,称取烘至恒重的平底烧瓶的重量,两个重量相减即得油脂重量,最后计算供试品中脂肪的含量(%)。

1.2.3 总氮含量的测定

分别称取不同产地的蚕蛹粉末20mg加入消煮管内,再分别加入5滴30%的硫酸铜溶液,0.3g硫酸钾及5mg浓硫酸,然后放入远红外消煮仪以290℃消煮3h后(消煮完全),冷却,用总氮测定仪测定总氮。

1.2.4 氨基酸含量测定

1.2.4. 1 蚕蛹水解液的制备

取不同产地蚕蛹个200mg分别加入6mol/L的HCL600m L置三口烧瓶中在110℃下加热24h[5]后,放置室温,抽滤,滤渣弃去,滤液用蒸馏水定容至1000m L。

1.2.4. 2 标准曲线的制备

精密吸取混合氨基酸标准品100µL,用Na HCO3溶液(p H=9.0)稀释至2m L,则得到123nmol/m L的标准液。精密吸取此标准液100µL于试管中,加入500µL DABS-CL衍生剂,70℃水浴反应10min后,真空干燥,干燥固体用1m L 70%乙醇溶解,微孔滤膜过滤,备用,分别去3、9、15、24、30µL进样,测定峰面积并绘制标准曲线。

1.2.4. 3 色谱条件

(1)流动相。A:0.025mol/L的磷酸二氢钾缓冲液(p H调至7.0);B:70%乙腈与30%甲醇(体积比)混匀。(2)梯度条件:initial至9min,A有80%调至70%,保持到23min,23min至24min A由75%调至68%,保持到30min;30min至37min,A由68%调至60%;37min至46min,A由60%调至40%;46min至54min,A由40%调至25%,保持到59min;59min至60min,A由25%调至80%,保持到80min结束。(3)流速:1.5m L/min。(4)检测器:PDA(436nm)。(5)柱温:30℃。

1.2.4. 4 样品氨基酸含量测定

取100µL蚕蛹水解液,衍生化同标准品,经微孔滤膜过滤后,上样分析,样品液氨基酸的含量测定结果见表表盒2。

2 结果分析

(单位:g./100g)

(单位:g/100g)

由表1、2可见,四个产地蚕蛹的水分含量以湖州产蚕蛹最高,容易发生霉变,收购后应马上烘干。各地蚕蛹的脂肪和总氮含量相差无几,以浙江海宁和广东产蚕蛹含量较高。四个产地蚕蛹水解后氨基酸含量和必需氨基酸含量以广东和浙江海宁产的较高,湖北产蚕蛹各项指标均为最低。

3 讨论

蚕蛹自古就作为滋补强身,和脾胃,长肌肉的食物和药物。历代本草著作中都有蚕蛹作药用的记载。《本草纲目》记载蚕蛹“为末饮服,治小儿疳瘦,长肌,退热,除蛔虫;煎汁饮,止消渴”。现代的本草学著作如《中药大辞典》、《中药志》、《中华药海》、《中药辞海》等也都将蚕蛹作为补益类中药收录。

蚕蛹的蛋白质含量十分丰富,可达55%~60%。蚕蛹系全价蛋白,营养价值可与鸡蛋、牛奶媲美。试验证实,可促进幼龄大鼠生长发育、各项营养学指标与酪蛋白相一致甚至超过酪蛋白。20世纪60年代用脱脂蚕蛹为原料生产蚕蛹蛋白,用于治疗浮肿病和干瘦病。本课题组从蚕蛹中提取的复合氨基酸,含人体所需要的18种氨基酸,组分配比合理,符合FAO/WHO(联合国粮农/世界卫生组织)所规定的氨基酸模式。蚕蛹复合氨基酸可明显提高免疫低下小鼠T淋转和B淋转功能,并有抗疲劳,促进造血,护肝,降糖和一定的抗肿瘤作用。以蚕蛹复合氨基酸为原料已研制成食品营养强化剂“复合氨基酸”、“复方营养要素”;保健品“舒乐康胶囊”、“天龙宝口服液”、“生宝养生液”、“补骨神口服液”、“益尔康胶囊”等,氨基酸系列营养食品(面条、饼干、果酱、可乐等),丝菊美系列化妆品(防皱面霜、二合一洗发香波、洗面奶、沐浴乳、润肤露、香水等6种)。这些新产品投放市场后,深受群众欢迎。

蚕蛹油含有约75%不饱和脂肪酸和20%饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸主要由油酸、亚油酸和亚麻酸组成,饱和脂肪酸主要为棕榈酸和硬脂酸,还含有微量夹杂物,如蛋白,磷脂,糖类,色素等。由于蛹油中含有大量具有三个不饱和双键的α-亚麻酸,故蛹油的不饱和程度相当高。另外值得一提的是蛹油中还含有约4%的磷脂。蛹磷脂中含有溶血卵磷脂,神经磷脂,磷脂酰肌醇,卵磷脂等,是治疗高血脂症、动脉硬化、肝炎、肝硬化辅助医药医疗。

蚕蛹甲壳质主要集中在蛹皮中。脱脂蚕蛹中含蛹皮8%~9%,主要成分为甲壳质、蛋白、无机盐、以及色素等。蛹皮中可提取的甲壳质达50%以上,而蟹壳中可提取的甲壳质仅20%~25%,故蛹皮中有用甲壳质为蟹壳的两倍。蚕蛹皮中提取甲壳质制备人造皮肤、手术缝线在医学上用途广泛。

蚕蛹中还含有磷脂、多糖、胆甾醇、植物甾醇、麦角甾醇、肾上腺素、去甲肾上腺素、腺嘌呤、次黄嘌呤、胆碱和多种蛋白激素,如促前胸腺激素,滞育激素,以及大量维生素A、维生素B2、维生素D、叶酸和丰富的Mg、Ca、Zn、Fe、Cu、Se等微量元素。从蚕蛹中可提取出治疗艾滋病的有效药物成分A.Z.T.及提取脱氧核苷酸钠、维生素B2等原料,这些项目急待进一步深入开展。

本研究在课题组以前工作的基础上,将各个产地蚕蛹的营养成分进行系统的比较,为寻找新的优良动物氮源提供了有力依据。为蚕蛹提取复合氨基酸做前期的工作。

参考文献

[1]李政,马阿秀.蚕蛹蛋白质的营养价值及提取方法[J].氨基酸杂志,1983(1):11-13.

[2]施觉明,张文娟,胡阳.中药蚕蛹的营养药理研究[J].中药药理与临床,1988,4(1):60.

[3]浦锦宝,魏克明,陈锡林.蚕蛹的传统应用和现代研究概况[J].浙江中医学院学报,1999,26(10):36.

[4]林少文.蚕蛹的化学和生物学评价[J].食物农业科学杂志,1983,34(8):896.

单酶水解蚕蛹蛋白工艺条件研究 篇4

本文采用中性蛋白酶与碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白制备复合氨基酸, 以水解液中氨基氮总量与总氮的比值为指标, 通过单因子试验和正交试验考察酶解温度、时间、底物浓度及加酶量诸因素对酶解反应的影响, 确定了蚕蛹蛋白单酶水解的最适酶解条件。所制备的氨基酸可望直接应用于食品、医用工业, 为蚕蛹蛋白产业化开发, 解决丝厂副产品出路问题提供了一条崭新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂与仪器

1.1.1 原料

干桑蚕蛹, 购于湖州宝锌生物技术有限公司。

1.1.2 试剂

中性蛋白酶:由淀粉液化芽孢杆菌生产。食品级, 主要参数为:活力>100, 000WU/g, 外观为淡黄色粉末状固体 (精制中性蛋白酶的活力以WU来表示, 一个WU指在p H7.5、温度30℃的条件下, 每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量) ;碱性蛋白酶:由地衣芽孢杆菌生产。食品级, 主要参数为:酶活力58, 000DU/g, 在p H8.5、温度40℃的条件下, 1ml2%的酶溶液生成0.400消光度差时, 表示酶制剂有1000DU;两种酶均购买于中国无锡杰能科技生物工程有限公司。

本试验使用的其它化学试剂:浓硫酸、Cu SO4、K2SO4、硼沙 (Na2B4O7·10H2O) 等均为分析纯, Na OH溶液 (40%、0.1N) 、0.1N的HCl溶液、2%硼酸溶液、50%乙醇溶液、40%的中性甲醛溶液、混合指示剂 (0.2%溴甲酚绿-乙醇溶液与0.2%甲基红-乙醇溶液按5:1比例混合) 、0.1%百里酚酞乙醇溶液、0.1%中性红。

1.1.3 主要仪器和设备

日立 (Hitachi) 835-50型氨基酸自动分析仪;电热恒温干燥箱, 上海跃进医疗器械厂;LD4-2A型离心机, 北京医用离心机厂;AB204型电子天平, 上海市实验仪器总厂;SHH-W-420恒温振荡水浴箱, 河北省黄骅市渤海电器厂;磁力搅拌器, 法国制造;p H-2型酸度计由上海第二分析仪器厂生产;LNK-801B型远红外消煮炉, 四平市电子仪器厂;改良式凯氏定氮仪, 中草药粉碎机, 电炉;滴定装置, 定量瓶、移液管、三角瓶、烧杯等。

1.2 方法

1.2.1 蚕蛹蛋白质含量的测定

1.2.1. 1 干蚕蛹粉的制备

用中草药粉碎机将干蚕蛹粉碎, 过80目筛, 装入干净的三角瓶备用。

1.2.1. 2 蚕蛹粗蛋白质含量的测定

采用凯氏定氮法[1], 按照GB5009.5-85测定, 将含氮量乘以6.25即为蛋白质的含量。

1.2.2 蚕蛹蛋白酶解的工艺流程

称量干蛹粉样品→按固液比加蒸馏水→搅拌调p H值→封口→巴氏灭菌→蛋白质熟化→冷却至恒温→加酶摇匀→水解→水解液加热灭酶→离心分离→测定上清液氨基氮含量、氨基酸组成。

游离氨基酸分析:采用LC-8800全自动氨基酸分析仪分析, 色谱条件:钠型阳离子交换树脂4.6×60, 流动相为柠檬酸三钠缓冲液;四元梯度洗脱, p H3.2~4.9;检测波长为:510nm, 流速为0.4ml/min, 柱温为50℃;柱的衍生条件为:反应液A:390g茚三酮/L丙二醇甲醚;反应液B:醋酸钠/醋酸:丙二醇甲醚为60:40;反应温度为135℃;流速为0.35 ml/min。

1.2.3 蚕蛹蛋白酶不同条件下的水解

试验

1.2.3. 1 水解温度

取自制干蚕蛹粉6份, 在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃6个水平下进行酶解。底物浓度10%, 即固液比1:9 (每份10g, 加入90ml蒸馏水) ;粗蛹蛋白经过85℃处理20min熟化变性;分别加入中性蛋白酶或碱性蛋白酶, 加酶量为2.0g/100g干基;中性蛋白酶、碱性蛋白酶水解时, p H值分别恒定为7.0、8.0, 以40%Na OH溶液或1:4盐酸调节, 每隔1小时调1次。酶解6h后, 煮沸5mim, 灭酶并除去未水解的蛋白质, 冷却后用3000r·min-1离心分离5min, 取上清液。沉淀用适量蒸馏水洗涤1次, 合并上清液, 并记录体积。采用甲醛滴定法测定氨基氮含量, 取两次平行实验结果的平均值, 确定最适温度。

1.2.3. 2 水解时间

取自制蛹蛋白粉4份, 每份10g, 分别在50℃进行酶解, 其它处理同上, 到达设定时间后, 取上清液用甲醛滴定法测定其氨基氮含量, 并计算氨基总量/总氮值, 取两次平行实验结果的平均值, 确定最适水解时间。

1.2.3. 3 底物浓度

取自制干蚕蛹粉4g、6g、8g、10g、12g, 分别按4%、6%、8%、10%、12%加入蒸馏水96ml、94ml、92ml、90ml、88ml, 在50℃酶解6h, 其它处理同上, 确定最适酶解底物浓度。

1.2.4 蛋白酶水解蚕蛹蛋白的正交试验设计

本试验采用L16 (45) 表[2]正交设计法, 对水解时间、酶解温度、底物浓度、加酶量 (中性蛋白酶或碱性蛋白酶) 等4个条件进行优化试验, 设计了4因素4水平正交试验, 见表1。

1.2.5 氨基氮含量的测定

采用甲醛法测定水解液中氨基氮的含量。

1.2.6 水解率的计算

水解率= (氨基氮总量/总氮量) ×100%。

氨基氮总量/总氮量= (水解液体积×氨基氮的含量) / (样品重量×总氮含量) 。

1.2.7 氨基酸组成的测定

采用氨基酸自动分析仪测定水解液中游离氨基酸的含量。

2 结果与分析

2.1 蚕蛹粗蛋白含量

采用凯氏定氮法测定实验室制备的干蚕蛹粉, 其粗蛋白含量为50.6%。

2.2 蚕蛹蛋白在不同条件下的酶解结果

2.2.1 温度对蚕蛹蛋白酶解结果的影响

从表2可见, 温度对酶水解蚕蛹蛋白的影响十分显著。随着温度不断升高, 氨基氮含量和氨基氮总量/总氮量的值逐渐增大, 中性蛋白酶在酶解温度为60℃、碱性蛋白酶酶解温度为50℃时达到最大值, 其后如温度继续升高反而下降。主要是因为温度升高使酶蛋白变性, 活力减弱, 氨基酸因为发生美拉德反应而损失。因此, 水解蚕蛹蛋白时, 采用中性蛋白酶的最佳酶解温度为60℃, 碱性蛋白酶酶解温度以50℃为宜。

从温度对中性、碱性蛋白酶水解结果的影响曲线走势图1可见, 碱性蛋白酶的水解高峰要早于中性蛋白酶, 在30℃~60℃条件下, 水解率明显高于中性蛋白酶, 而60℃以上酶基本失活, 水解率下降。

2.2.2 时间对蚕蛹蛋白酶解结果的影响

由表3可看出, 随着水解时间的延长, 蚕蛹蛋白水解液中的氨基氮含量和氨基氮总量/总氮量的值有所增加, 但8h后水解速度增幅下降, 10h与8h比较仅增加0.005、0.006 (中性蛋白酶水解) 及0.004、0.005 (碱性蛋白酶水解) 。说明随着时间延长, 氨基氮含量增加, 酶的活力受到抑制, 水解效率下降。因此, 两种蛋白酶水解时间8h较为适宜。

时间对中性、碱性蛋白酶水解结果的影响曲线走势图2表明, 碱性蛋白酶氨基氮总量/总氮量的值 (水解率) 增幅大于中性蛋白酶, 延长水解时间可适当提高碱性蛋白酶的水解率。

2.2.3 底物浓度对蚕蛹蛋白酶解结果的影响

由表4可见, 随着底物浓度的增加, 水解液中氨基氮含量不断升高, 氨基氮总量/总氮量的值逐渐下降。底物浓度较低时, 酶与底物形成一对一的络合物酶活力最强, 水解率最高;一旦底物浓度超过酶的“饱和”值, 酶的稳定性下降, 且随着水解产物的增加, 酶活力受到抑制, 故底物浓度不宜太高。而底物浓度太低时, 氨基酸得率少, 水解效率低;适当增加底物浓度可提高氨基氮得率。本试验底物浓度以4%时水解率最高, 12%时其氨基氮含量最大。

由底物浓度对中性、碱性蛋白酶水解结果的影响曲线走势图3可见, 碱性蛋白酶氨基氮总量/总氮量的值 (水解率) 随着底物浓度的增加降幅小于中性蛋白酶, 表明在同样底物浓度下水解效率要高于中性蛋白酶, 为增加氨基氮得率, 碱性蛋白酶水解时可适当提高底物浓度。

2.3 蚕蛹蛋白酶解条件正交试验优化确定

为了进一步确定中性或碱性蛋白酶单酶水解蚕蛹蛋白的最佳条件, 根据单因素试验结果开展正交试验, 结果见表5。

2.3.1 中性蛋白酶最佳水解条件确定

见表6, 对中性蛋白酶水解蚕蛹蛋白的氨基氮总量/总氮量的值进行级差分析表明:水解时间 (A) 、酶解温度 (B) 、底物浓度 (C) 、加酶量 (D) 对水解结果的影响, 各因素的主次顺序为C>B>D>A, 即底物浓度>酶解温度>加酶量>水解时间, 底物浓度影响最大, 是重要影响因素, 水解时间影响最小。最佳条件组合为A3B3C1D2或A3B3C1D3, 为降低成本、减少用酶量, 宜选择前者, 即在16个处理中最优处理组合11号。在水解时间8h、酶解温度60℃、底物浓度4%、加酶量1.2g/100g干基时, 水解效果最佳, 在此条件下水解率为34%。考虑操作方便及经济实惠, 水解时间控制在6~8h范围便可。

单位:h, ℃, %, g/100ml。

2.3.2 碱性蛋白酶最佳水解条件确定

对碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白正交试验所得氨基氮总量/总氮量的值进行极差分析, 结果见表7, 最优水平组合为A3B3C1D2, 与中性蛋白酶水解条件一致, 在16个处理中最优处理组合为11号。即水解时间8h、酶解温度60℃、底物浓度4%、加酶量1.2g/100g干基, 水解率为43%。各因素的主次顺序为C>A>B>D, , 即底物浓度影响最大, 加酶量影响最小, 在生产中原料充裕情况下, 为降低成本, 可适当减少酶的使用量。

2.4 中性蛋白酶最佳水解结果

中性蛋白酶按优化试验条件水解蚕蛹蛋白, 水解液经离心和过滤后, 取上清液用氨基酸分析仪测定其游离氨基酸含量, 结果如表8所示, 水解液中17种氨基酸 (色氨酸未检测) 总含量为91.636mg/100ml, 其中7种人体必需氨基酸含量0.768~13.701mg/100ml之间, 占氨基酸总量的36.982%。其氨基酸组成均衡, 水解产品可作为食品营养添加剂, 分离提纯后可作为医疗保健用品, 有广阔的应用前景。

注:检测单位为中国农科院热带农业生态研究所重点实验室。

2.5 碱性蛋白酶最佳水解结果

碱性蛋白酶在优化条件组合下水解蚕蛹蛋白, 用氨基酸分析仪测定水解液中游离氨基酸含量, 结果如表9所示, 色氨酸未检测, 水解液中含有17种氨基酸, 总含量为120.583mg/100ml, 其中7种人体必需氨基酸含量在1.380~13.735mg/100ml之间, 占氨基酸总量的33.967%。必需氨基酸的比例接近于WHO/FAO制定的理想蛋白质组成标准, 该法是一种较为理想的蚕蛹蛋白水解方法。

注:检测单位为中国农科院热带农业生态研究所重点实验室。

3 小结

3.1

中性蛋白酶水解蚕蛹蛋白在p H=7时, 最佳酶解条件为:酶解温度60℃、水解时间8h、、底物浓度4%、加酶量1.2g/100g干基, 增加底物浓度可提高水解效率, 水解时间不宜太长。

3.2

碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白在p H=8时, 最佳酶解条件与中性蛋白酶相近, 延长水解时间, 酌情减少加酶量, 可降低水解成本。

3.3

利用蛋白酶单酶按正交试验优化条件组合水解蚕蛹蛋白, 用氨基酸分析仪测定水解液中游离氨基酸含量, 中性蛋白酶及碱性蛋白酶水解液中17种氨基酸 (色氨酸未检测) 总含量为91.636mg/100ml、120.583mg/100ml, 其中7种人体必需氨基酸含量分别在0.768～13.701mg/100ml、1.380～13.735mg/100ml之间, 分别占氨基酸总量的36.982%、33.967%。

3.4

蛋白酶水解蚕蛹蛋白是开发蚕蛹蛋白资源的有效途经, 且碱性蛋白酶优于中性蛋白酶。据报道, 蚕蛹蛋白质含有18种氨基酸, 组成合理, 比例均衡, 其中必需氨基酸含量之和超过40%, 非常符合FAO/WHO提出的氨基酸模式, 本试验酶解结果与其基本一致。表明酶解蚕蛹蛋白有利于保存其营养成分, 水解产物氨基酸组成合理, 可作为食品营养添加剂或分离提纯后可作为医疗保健用品, 如进一步制成氨基酸衍生物其应用领域将更为广阔。

3.5

本试验水解蚕蛹蛋白所得氨基酸含量偏低, 有待于进一步改进其工艺流程, 以提高蚕蛹蛋白的利用率。

参考文献

[1].徐秀兰主编.生物化学实验与指导[M].北京:中国医药科技出版社, 1994.17～21

[2].王钦德, 杨坚主编.食品试验设计与统计分析[M].北京:中国农业出版社, 2003.506

家蚕蛹虫草小规模生产技术 篇5

1 蛹的准备

1.1 蚕茧选择

选择无工业污染, 土壤重金属含量低的蚕区;桑树管理上, 少施磷肥、钾肥等肥料, 饲育中少添氯霉素, 最好是对蚕茧产地的桑叶进行重金属含量测定;茧色洁白、发育整齐、死笼、不结茧较少、蛹体较健康的群体。

1.2 规模选择

根据市场需求, 确定生产规模, 下面就每个生产期生产100kg成品进行介绍。

1.2.1 场地选择和改造。面积100㎡的房子, 房子较阴凉、能通水电;配置3匹空调2台、日光灯12只、多层蚕架几个。

1.2.2 原材料准备。生产前准备好菌种500支, 废报纸1 000张, 蚕匾250只, 微波炉塑料盒或透明玻璃瓶8 000只, 接种针、酒精、木框、小型喷雾器等小物品;蚕茧1 250kg。

劳动力配置, 以每个劳力每天削茧10kg、削茧2d、接种2d计, 大约需500人次。

1.2.3 生产日期确定。一般以茧站开始收茧第2d, 此时大部分化蛹1~2d, 分批买茧, 分批操作, 可减少人员数量, 增加工作天数, 便于管理。

2 接种

2.1 接种适期

化蛹后2~4d (复眼着色前) 较佳, 如蛹体偏嫩, 出现败血蛹多, 蛹体偏老, 化蛾较多;接种前将受伤蛹、败血蛹、僵蛹等不良蛹挑出。

2.2 接种技术

挑取蛹虫草菌分生孢子, 无菌水制成悬浊液。用接种针蘸取悬浊液, 穿刺接入蚕蛹体内, 接种部位是环节节间膜较薄处。

2.3 接种注意事项

穿刺接种7~8只蛹后, 针头可能有污染, 为减少污染机会, 应在酒精灯上烧红消毒, 再进行重新接种。

关键技术是蘸一下孢子悬浊液, 刺一只蚕蛹, 而不能蘸一下孢子悬浊液, 刺多只蚕蛹。

技术参数:环境条件, 无太阳照射;通风温度为22~25℃, 不能高温;湿度为较干燥;要求尽量减少蛹的翻动, 运输要求路程短, 平稳, 忌颠簸。

3 接种蛹虫草菌蚕蛹的保护技术

22℃恒温保护, 蛹体自第4d开始出现褐色斑点, 体色逐渐变褐色 (花色) , 蛹体逐渐变硬;将4d前变色、变硬的蛹一律剔除。此外可能有一定数量的败血蛹发生;11d左右, 蛹体完全变硬, 此时, 将未感染菌的蛹剔除, 以免化蛾污染群体。

技术参数:湿度70%以下;室内无光线保持黑暗;接种后1~4d内禁止蚕蛹滚动或翻动, 意思是接种后4d内不要动蚕蛹。

4 接种后的正常管理

每天巡查一遍, 注意塑料盒内的温度, 盒盖及盒壁均有水珠, 表明菌生活力旺盛, 无需补水 (冷开水) ;如果水珠较少, 则需用喷雾器补少量水, 同时需及时吸除积水, 以防蛹体浸水腐烂, 每天保证12h光照。

技术参数:温度为22℃恒温;湿度为80%;每天通风换气。

5 蚕蛹虫草的收获保存技术

培育期一般为40d, 子实体顶端开始出现乳头状突起, 这是蛹虫草成熟的标志。此时停止补水。收获时, 利用清水稍稍冲洗一下即可。然后直接用烘箱55~60℃烘48h (不变形能基本保持原状最佳) 。

蚕蛹/分析 篇6

关键词：蚕蛹,性别识别,MATLAB,图像处理,神经网络

0 引言

在蚕种生产过程中，蛹体雌雄鉴别的准确率直接关系到蚕种的质量和品种的纯度。我国蚕茧产量占世界总产量的3/4，每年需要切削种茧5 000t，在蚕茧制种时，需要将蚕蛹从蚕壳中分离出来进行雌雄鉴别。目前普通是用人工进行削茧和鉴蛹，劳动强度大、生产效率低，对操作的熟练程度有较高的要求，经常出现操作人员被割伤现象。而且种茧切削、雌雄鉴别须在5～7天之内完成，蚕种场不得不招聘大批短期劳动力，使蚕种生产成本大大提高，且忙乱中难免造成雌雄混淆，以致发蛾后同系自交成纯种，严重影响了蚕种质量[1]。

为区别蚕茧性别，日本曾根据蚕茧的质量来区分雌雄茧，并制造了蚕茧雌雄鉴别机;但由于错判率较高，未能得到推广应用。国内有人利用荧光法鉴别雌雄茧，但只适用于茧色判性品种及其特定的杂交组合[2]。潘沈元等曾用近红外反射光谱的模式识别方法对雌雄蚕茧的识别进行了初步探讨，但还有许多问题值得进一步研究，如样品的代表性和特征值选取的合理性问题[3]。

随着计算机技术和神经网络技术的发展，利用数字图像处理技术和神经网络进行模式识别在实际应用中取得了良好的效果。因此，本文通过MATLAB平台，利用计算机图像处理技术，对获取的雌雄蚕蛹图像进行预处理后，根据提取的形体特征和尾部纹理特征，用BP神经网络对蚕蛹雌雄进行分类识别。

1 图像获取

识别系统的总框图，如图1所示。

本文采用1 000万像素数码摄像头拍摄蚕蛹图片。为了与自动分选系统结合，将蚕蛹经传送带匀速送入一透明有机玻璃U型槽中。传送带速度可控，保证蚕蛹单粒送入U型槽中进行拍照，在垂直于U型槽的圆周方向相隔120°各设置一个摄像头，对U型槽中的蚕蛹进行全方位的图像采集，以获得蚕蛹的真彩图像，即RGB图像。图像获取装置如图2所示。

由于蛹的雌雄具有不同的特征，从外形来比较，雌蛹体较肥大，腹部末端较圆;雄蛹体较瘦小，腹部末端较尖。但更主要是从性征上来区别，雌蛹在第8环节(翅下第5环节)腹面的中央，从前缘到后缘有“x”状纵线;雄蛹在第9环节(翅下第6环节)腹面的中央有似凹陷小点[4]。所以，选择提取蚕蛹的几何即体型和尾部纹理特征来对蚕蛹雌雄进行识别。雌雄蚕蛹尾部性状特征如图3所示。

2 图像预处理

2.1 图像滤波

图像获取过程中由于受各种因素的影响会产生噪声污染，噪声会影响到图像处理全过程以至输出结果，因此滤除图像中的噪声是图像处理中极为重要的步骤[5]。脉冲噪声在图像噪声中最为常见，其概率密度函数为

其中，z表示图像中像素灰度值。如果b>a，灰度值b在图像中将显示为一个亮点;相反，a的值将显示为一个暗点。本文采用矢量中值滤波方法，矢量中值滤波器的输出值为滑动窗口中矢量集合的中值。对于具有N个矢量的集合V={v1,v2，…，vN}，求中值矢量的算法如下:

1)对于每个矢量计算它到其余矢量的距离之和Si，有

2)从S1～SN中求出最小值Smin，记录其下标。

3)该下标所对应的vVMF即为这组矢量的中值，也就是矢量中值滤波器的输出vVMFvVMF∈V，则

应用矢量中值滤波方法，对蚕蛹图像进行了增强。在矢量中值滤波器中，算法在滑动窗口中寻找一个距离其他像素最近的像素，并以此像素代替原中心像素，因此能够有效地滤除脉冲噪声，并具有相对好的边缘保持特性。

在MATLAB中，实现这个功能的函数是

其中，A为待处理图像，[m n]为设定区域大小。

2.2 图像分割

为了有效地进行图像分析，往往需要先进行图像分割，将图像中有意义的特征或者需要应用的特征提取出来，也就是把图像中的一些干扰景物去掉，最大限度把蚕蛹本身图像从背景环境中“抓取”出来，以提高量化特征值的准确性。本文采用的是边缘检测和匹配分割的方法;边缘的检测是利用物体和背景在某种图像特性上包括灰度、颜色或者纹理特征等的差异来实现的;匹配分割可以用于搜索特殊的模式，笔者用一幅图像抽取出物体或模式，指导在余下的图像中基于某种最优性准则搜索相同或相似的模式，在本文中就是对具有不同纹理特征的蚕蛹尾部进行搜索。分割后的雌蛹尾部纹理图，如图4所示。

2.3 图像灰度化

图像灰度化是进行图像识别的基础，灰度化处理就是把彩色图像转变为黑白图像，这样可以去除颜色的干扰，从而为获取与颜色无关的几何、形态等特征做好准备。本文获取蚕蛹RGB图像时，分别用红、绿、蓝3个色度值为一组，代表每个像素的颜色。处理图像的时候，要分别对RGB 3种分量进行处理。实际上RGB并不能反映图像的形态特征，只是从光学的原理上进行颜色的调配，所以经常要把图像弄成灰度值图像直接进行处理。

在MATLAB中，直接调用rgb2gray函数把真彩图像转换为灰度图像。有

转换后的灰度图像如图5所示。

2.4 图像二值化

将256个亮度等级的灰度图像通过适当的阈值选取可以获得反映图像整体和局部特征的二值化图像。所有灰度大于或等于阈值的像素被判定为属于特定物体，其灰度值以255表示，否则这些像素点被排除在物体区域以外，灰度值为0。

使用MATLAB自带的in2bw函数，通过设定亮度阈值将灰度图像转换成二值图像，如图6所示。此时，T=0.6。

3 特征提取

特征提取是对模式所包含的输入信息进行处理和分析，将不易受随机因素干扰的信息作为该模式的特征提取出来。

3.1 形体特征

形状特征描述目标区域的几何性质，与区域的颜色无关。面积和周长是描述块状图形大小的最基本特征。面积S是图像中前景区域大小的度量，粗略地讲，该面积为图像中非零像素的数目。在MATLAB中，使用函数bwarea来计算二进制图像的面积S。图形周长L为图像上相邻边缘间距离之和。本文采用8邻点距离求周长，则图像中任何两相邻边缘点间的距离都为1，而倾斜方向上相邻边缘像素间的距离为槡2。圆形度R0用来描述物体形状接近圆形的程度，其计算式为

其中，S为面积，L为周长;R0范围为0

3.2 纹理特征

纹理特征反映了图像自身的属性，纹理特征提取是进行图像纹理描述、分类的关键环节，直接影响后续处理的质量。灰度共生矩阵(GLCM)是基于统计的分析方法中被广泛应用的纹理特征提取方法，GLCM函数通过计算图像中特定的像素在某一空间位置关系中出现的次数来刻画纹理特征。在MATLAB图像处理工具箱中，graycomatrix函数用来创建灰度共生矩阵，使用graycoprops函数来计算统计信息，这些信息提供了关于图像纹理的信息。本文中选用角二阶矩(能量)、对比度(惯性矩)、相关、熵和逆差矩等5个特征[6,7,8,9]。

4 神经网络分类器设计

目标图像预处理完成以后，就要用神经网络对样本进行训练以及识别，本文用的是前馈反向传播网络—BP(Back Propagation)神经网络。BP网络是一种按误差逆传播算法训练的多层前馈网络，是目前应用最广泛的神经网络模型之一。BP网络能学习和存贮大量的输入—输出模式映射关系，而无需事前揭示描述这种映射关系的数学方程。它的学习规则是使用最速下降法，通过反向传播来不断调整网络的权值和阈值，使网络的误差平方和最小。BP神经网络模型拓扑结构包括输入层(input)、隐层(hide layer)和输出层(output layer)。BP神经网络结构示意图如图7所示。

本文中，采用MATLAB神经网络工具箱中BP网络作为分类器模型。由于任何在闭区间内的一个连续函数都可以用单隐层的BP网络逼近，因而一个3层BP网络就可以完成任意的n维到m维的映射，所以本文使用3层神经元网络，输入层神经元用面积、周长、圆形度和5个纹理特征共8个特征构成特征向量，隐层节点数为11个，输出层节点数2个，输出为0,1两种值的组合，用10和01分别表示雌蛹和雄蛹。选择中间层神经元的传递函数为S型正切函数，输出层神经元的传递函数为0-1函数即S型对数函数，训练次数50，误差小于0.1。命令代码如下:

其中，P为输入矩阵，T为输出矩阵[10]。

5 结论

应用上述方案对871A和7532两个品种的蚕蛹图像进行了识别试验，每一品种取50个样本进行训练，50个样本进行测试，BP网络训练收敛，再用训练好的BP神经网络进行分类，识别率分别达到了98%和96%，符合识别准确率95%以上的育种要求。试验表明，利用计算机数字图像处理技术和神经网络技术对蚕蛹的雌雄性别自动识别方法是可行的，为蚕蛹的性别识别提供了一种新的方法，省去了人工识别的繁琐劳动，提高了劳动效率和识别的准确率。但是由于本次试验样品仅为两个品种而且标本数量较少，模型的可信度和稳定性需要在多品种、大样本下才能得到验证，模型的预测精度和稳定性需要进一步提高，而且蚕蛹图像特征的选择和特征量的提取及BP神经网络参数的选择也要进一步的研究。

参考文献

[1]胡祚忠,吴建梅,张剑飞,等.我国蚕桑生产机械设备的研究概况[J].蚕业科学,2010,36(6):998-1003.

[2]刘敬全,于振诚,崔玉梅,等.家蚕荧光茧色判性蚕品种荧光、春玉的育成及其一代杂交种的选配[J].蚕业科学,1996,22(3):155-159.

[3]潘沈元,陶鸣,孙爱群.雌雄蚕蛹近红外发射光谱的差异及其模式识别[J].昆虫学报,1996,39(4):362-365.

[4]冯家新.蚕种学[M].北京:中国农业出版社,1993.

[5]范立南,韩晓微,张广渊.图像处理与模式识别[M].北京:科学出版社,2007.

[6]王爱玲,叶明生,邓秋香.MATLAB R2007图像处理技术与应用[M].北京:电子工业出版社,2008.

[7]张强,王正林.精通MATLAB图像处理[M].北京:电子工业出版社,2012.

[8]余成波.数字图像处理及MATLAB实现[M].重庆:重庆大学出版社,2003.

[9]Svoboda T,Kybic J,Hlavac V.Image Processing,Analysis,and Machine Vision:A MATLAB Companion[C]//Thomson Engineering,2008.

蚕蛹/分析 篇7

灵芝 (Ganoderma lucidum) 是一种名贵的药用真菌, 具有灵芝多糖、多萜类等功效成分, 对癌症、心脏病、脑血栓等疾病具有显著的疗效[3]。随着人们对灵芝需求的不断提高, 野外采集或人工栽培子实体的获取方式数量稀少、周期较长, 已不能满足市场的需求, 故此能够在短周期内大量生产灵芝菌丝体的深层液体发酵方法得到了普遍应用[4,5,6]。而通过灵芝液体发酵能在短时间内获得大量发酵产物灵芝多糖, 对开发灵芝保健食品和药品有着重要意义[7]。

本研究尝试利用蚕蛹浸出液, 作为灵芝菌丝体液体深层发酵培养基基液, 为蚕蛹的进一步合理开发利用或蚕蛹开发过程中产生的废水处理作一个新的尝试。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

灵芝菌GIM5.251菌株购自广东省科学院微生物研究所菌种保藏中心

1.1.2 供试材料

蚕蛹由华南农业大学动物科学院蚕丝科学系提供

1.2 培养基

1.2.1 蚕蛹浸出液培养基

取干蚕蛹30 g, 加蒸馏水1 000 ml, 煮沸30min, 最后定容到1 000 ml, 作为培养基基料, 然后分别添加以下物质进行相关试验:

(1) 碳源试验:A液:蚕蛹浸出液30 g/l, 葡萄糖20g/l;B液:蚕蛹浸出液30g/l, 蔗糖糖20g/l;C液:蚕蛹浸出液30 g/l。

(2) 氮源试验:A液:蚕蛹浸出液30 g/l, 葡萄糖20 g/l, KH2PO41 g/l, Mg SO4·7H2O 2 g/l;蛋白胨2 g/l;B液:蚕蛹浸出液30 g/l, 葡萄糖20 g/l, KH2PO41 g/l, Mg SO4·7H2O 2 g/l, 酵母提取物2 g/l;C液:蚕蛹浸出液30 g/l, 葡萄糖20 g/l, KH2PO41g/l, Mg SO 4·7H2O 2 g/l;。

(3) 无机盐和VitB1试验:A液:蚕蛹浸出液30 g/l, 葡萄糖20 g/l, KH2PO41 g/l, Mg SO4·7H2O2 g/l, VitB1 0.45 mg/l;B液:蚕蛹浸出液30 g/l, 葡萄糖20 g/l, KH2PO41 g/l, MgSO4·7H2O 2 g/l;C液:蚕蛹浸出液30 g/l, 葡萄糖20 g/l。

1.2.2 对照灵芝培养基

(1) PDA培养基:马铃薯200g/l、葡萄糖20 g/l、蛋白胨2 g/l、KH2PO42 g/l、Mg SO4·7H2O 1 g/l、琼脂20 g/l。

(2) 种子培养基:葡萄糖20 g/l、蛋白胨2 g/l、KH2PO42 g/l、Mg SO4·7H2O 1 g/l、玉米浆15 g/l。

(3) 发酵培养基:葡萄糖47.4 g/l、蛋白胨4.39 g/l、KH2PO43.76 g/l、Mg SO4·7H2O 1 g/l和玉米浆15 g/l[8]。

以上培养基分别分装于250 mL三角瓶中, 每瓶100 ml, 115℃灭菌20 min, 待冷却后备用。

1.3 方法

1.3.1 发酵培养

(1) 从斜面培养基接种至装有100 ml上述1.22种子培养基的250 ml三角瓶中, 置于28℃恒温摇床上, 以100 r/min振荡培养4 d, 所得菌液为种子发酵液。

(2) 按5%的接种量, 将种子发酵液接种至各培养基中, 置于28℃恒温摇床上, 以100 r/min振荡培养6d, 测定菌丝体湿重和胞外多糖含量。

1.3.2 单因子比较

比较碳源和微量元素和培养体系初始pH值对灵芝菌的生物量和胞外多糖含量的影响, 各个组别设3个重复。

1.3.3 优选培养基配方

利用正交设计助手IIV3.1软件, 采用3因素两水平正交试验优选培养基配方, 各个组别设3个重复。

1.3.4 优选配方的比较

比较优选出来的培养基配方和文献的经验配方对灵芝菌的生物量和胞外多糖含量的影响, 各个组别设3个重复。

1.3.5 生物量测定

采用湿重法, 取发酵液100ml, 在4℃以10000r/min高速离心10min, 收集沉淀物, 称重。各测定指标测定两次, 取其均值[8]。

1.3.6 胞外多糖含量的测定

发酵液离心后所得滤液, 加入3倍体积无水乙醇, 剧烈搅拌, 4℃过夜沉淀, 高速离心醇沉液, 收集沉淀, 称重, 所得即为胞外多糖含量。各测定指标测定两次, 取其均值[8]。

2 结果与分析

2.1 不同的碳源、微量物质和初始pH值对灵芝菌的生物量和胞外多糖含量

蚕蛹浸出液添加不同碳源对灵芝菌的生物量和胞外多糖含量的影响结果如图1所示, 添加了葡萄糖的培养基的菌丝湿重和胞外多糖含量分别为27.5 g/l和2.5 g/l。而添加了蔗糖的培养基的菌丝湿重和胞外多糖含量分别为24.1 g/l和2.3 g/l。灵芝菌在未添加碳源的蚕蛹浸出液中亦能生长, 但是菌丝体湿重和胞外多糖含量较低, 分别只为12.4 g/l和1.1 g/l。

真菌菌丝体多利用果糖、葡萄糖等单糖作为碳源, 而灵芝菌丝体在糖浓度过高的发酵体系中, 溶液渗透压过高时, 细胞会脱水死亡, 适宜低糖发酵, 总糖不能超过3.5%, 特别是还原糖 (葡萄糖) 的用量不能超过3.0%[9]。试验结果说明, 在蚕蛹浸出液中添加适量的碳源, 能将灵芝菌的菌丝湿重和胞外多糖含量提高一倍以上;而葡萄糖作为碳源的效果稍好于蔗糖, 这也符合了李平作等[10]的研究结论:灵芝菌丝体在液体培养基中的生长速度以在葡萄糖培养基中最快, 蔗糖次之。

蚕蛹浸出液添加不同氮源对灵芝菌的生物量和胞外多糖含量的影响结果如图2所示, 添加了蛋白胨的培养基的菌丝湿重和胞外多糖含量分别为37.5 g/l和3.4 g/l。添加了酵母提取物的培养基的菌丝湿重和胞外多糖含量分别为38.2 g/l和3.4g/l。而在添加了氮源和无机盐, 没有添加氮源的培养基中, 菌丝湿重和胞外多糖含量分别也达36.7 g/l和3.3 g/l。

氮源是灵芝菌丝体生长的重要物质, 氮源供给量过低, 会导致菌丝体生长发育缓慢, 出现菌丝体未到达衰老期就提前自溶的情况;氮源不足或过量都会对菌丝体生长产生不利影响, 而利用低浓度供应氮源的手段可提高低分子量多糖的含量[9]。本试验结果表明, 蚕蛹浸出液培养基不添加蛋白质和牛肉膏等外加氮源时, 发酵体系的产菌丝和胞外多糖的能力未见显著降低;而添加氮源, 亦未见对菌丝体和胞外多糖的含量产生不良影响, 提示着蚕蛹浸出液可提供适合灵芝菌生长的氮源。

蚕蛹浸出液添加无机盐和VitB1对灵芝菌的生物量和胞外多糖含量的影响结果如图3所示, 添加了无机盐和VitB1的培养基的菌丝湿重和胞外多糖含量分别为35.2 g/l和3.2 g/l。而添加了无机盐但不添加VitB1的培养基的菌丝湿重和胞外多糖含量分别为34.6 g/l和3.1 g/l。灵芝菌在未添加无机盐和VitB1的蚕蛹浸出液中亦能生长, 菌丝体湿重和胞外多糖含量比添加组别低, 分别为23.4 g/l和2.1 g/l。

对于大型真菌而言, 钾离子可促进糖酵解, 而磷酸盐不足可能会抑制糖代谢, 此外, 镁离子含量的高低会影响碳源氧化的强弱[11]。同时, 灵芝菌丝体生长过程中需要某些维生素类物质参与代谢, 特别是VitB1, 它不能由菌体自身合成, 必须外加[9]。本试验在蚕蛹浸出液中添加了KH2PO4、Mg SO4以及VitB1, 以满足菌体的生长发育需要。试验结果表明, 不外加无机盐和生物素的组别, 其菌丝湿重和胞外多糖含量, 显著低于添加了的组别;而添加VitB1, 并未显示出明显的优势。

2.2 正交优选培养基配方

从2.1结果可知, 蚕蛹浸出液可不外加氮源的组别和添加氮源的组别发酵效果基本相当;因而设置了蚕蛹浸出液、葡萄糖、无机盐三因素两水平的正交试验来优选三者最优组合的培养基配方。结果显示, 三者中, 蚕蛹浸出液的含量是最主要的因素, 无机盐组合次之, 葡萄糖的含量变化, 对该发酵体系的影响最小。当蚕蛹浸出液含量为25 g/l、葡萄糖含量为20 g/l、无机盐组合为KH2PO41 g/l, Mg SO4·7H2O 1 g/l时, 所得的菌丝体生长状况为最优。

2.3 优选培养基配方培养灵芝菌的生物量和胞外多糖含量

采用方法2.2优选出了的培养基配方, 优选的蚕蛹培养基发酵培养后所得到的灵芝菌丝湿重和胞外多糖含量分别为38.9 g/l和3.5 g/l;稍低于经验培养基配方[8]的39.5 g/l和3.6 g/l, 但两者未见显著差异。文献[8]优选的经验培养基组成为:葡萄糖47.4 g/l、蛋白胨4.39 g/l、KH2PO43.76 g/l、Mg SO4·7H2O 1 g/l和玉米浆15 g/l。比较这两个配方可知, 本试验的优选配方, 所用葡萄糖的量仅为文献8所记载配方的二分之一, 无机盐的量约为其三分之一, 且不添加蛋白胨和玉米浆, 具有较大的成本优势。

3 结语

蚕蛹含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪、糖类及多种其他生物活性物质如:微量元素、维生素 (B1、B2、B3) 等成分[12]。王金喜等研究表明, 蚕蛹培养基能够满足金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌对营养物质的需求, 使之良好的生长繁殖;还可以替代吕氏血清培养基[13,14]。但鲜见将蚕蛹应用于真菌菌丝体培养的报道。本试验结果表明, 蚕蛹的营养成分丰富, 在外加适量的碳源和无机盐后, 可作为灵芝菌液体发酵的适宜培养基。蚕蛹浸出液可替代灵芝菌发酵液中的氮源和部分碳源、无机盐, 大大节约了原料成本。这一试验结果, 为蚕蛹的深加工开发, 提供了一个新的思路。

摘要：试验利用蚕蛹浸出液, 添加适量碳源和无机盐后, 作为液体发酵灵芝菌的培养基, 测定了灵芝菌生物量和胞外多糖含量的变化。结果表明, 蚕蛹浸出液作为灵芝菌发酵培养的基料, 可起到提供氮源、替代部分碳源和生物素的作用, 所得的菌丝体生物量、胞外多糖含量和添加蛋白胨、酵母提取物的组别相当。