分子中药学

分子中药学（精选7篇）

分子中药学 篇1

分子印迹技术 (molecular imprinting technology, MIT) 是将功能单体, 在模板分子的存在下交联聚合, 然后洗脱除去模板分子, 制得的聚合物在立体空穴和功能基排布上与目标分子具有互补的结构。由于其具有高选择性和高强度的优点, 与天然抗体相比制备简单, 且模板分子可重复使用, 现已广泛用于手性固定相、仿生传感器、固相萃取、模拟酶催化及药物控释等领域中。

1 分子印迹聚合物 (molecule imprinting polymer, MIP) 的制备

1.1 本体聚合法

把印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶于惰性溶剂, 密封在真空环境中, 经聚合制得棒状印迹聚合物。此法制备工艺简单, 但处理过程费时费力, MIP利用率低, 所得粒子的不规则性降低了其分离能力。

1.2 原位聚合

在色谱柱内直接聚合制得连续型棒状MIP。此法较简单, 且制得的MIP具有连续性、均一性的特点, 从而得到较好的分离效果。

1.3 悬浮聚合

采用全氟化碳液体作为悬浮介质, 代替了传统的有机溶剂——水悬浮介质, 从而根除了非共价印迹中存在的不稳定的预组织合成物。

1.4 溶胀聚合

溶胀聚合又称为多步溶胀悬浮聚合或种子溶胀悬浮聚合。采用乳液聚合法合成粒径较小的微球作为种子, 再用一定的乳液进行多次溶胀种子, 通过还原剂的加入经光引发或热引发聚合物制得符合要求的MIPs微球。

1.5 表面聚合

表面聚合是把印迹分子和功能单体在溶剂中形成的复合物, 与表面活化过的硅胶/聚三羟甲基丙烷三丙烯酸酯粒子/玻璃等介质反应接枝聚合, 从而制得MIPs的一种方法。这一方法解决了本体聚合中印迹分子包埋过深或过紧而难洗脱的问题。

2 在中药提取分离中的应用

中药是我国具有国际比较优势的产业之一, 但其所含成分非常复杂, 为了提高中药的疗效, 减低毒副作用, 提高中药制剂的内在质量, 选用合理的提取分离技术是非常重要的。分子印迹技术与色谱分离技术相比, 具有分子识别性强、固定相制备简便快速、操作简单、性质稳定 (耐酸碱、耐高温、高压等) 、溶剂消耗量小、模板和MIPs可以回收再利用等优点, 在中药有效成分的提取分离中有很好的应用前景。

2.1 在固相萃取中的应用

分子印迹聚合物用于固相萃取的主要作用是分离、提纯和浓缩样品, 能够克服生物或环境样品体系复杂、预处理手续繁杂等不利因素, 对于痕量分析有重要作用和意义, 是一种样品预处理技术。陈移姣等[1]以咖啡因为模板, 采用水溶液悬浮聚合法制备了用于色谱分离 (作HPLC的固定相) 的微米级分子印迹填充膜, 通过改变HPLC的流动相缓冲溶液的pH值, 研究了咖啡因在MIPs柱上的容量因子 (k) 、分离因子 (α) 和印迹因子 (β) , 说明该MIM在水溶液中对茶叶中的咖啡因进行了分离富集。颜流水等[2]制备的槲皮素MIP, 将其作为吸附剂填充成固相萃取柱, 结合毛细管电泳仪, 对比槲皮素及其结构相似物芦丁的混合物电泳图, 结果表明, 芦丁分子由于羟基与葡萄糖和鼠李糖相连, 空间体积比槲皮素大, 较难进入由模板分子槲皮素形成的分子印迹孔穴, 而槲皮素是通过特异性识别作用吸附在印迹孔穴内。向海艳等[3]以反式白藜芦醇为模板分子, 采用溶液聚合方法, 合成白藜芦醇的MIP, 研究表明该印迹聚合物中形成了2类不同的结合位点。虎杖提取物经固相萃取, 得到主要含白藜芦醇及少量结构与其相似的白藜芦醇甙组分。张春静等[4]用奎宁作为模板分子, 以醋酸纤维膜为支撑体, 制备对奎宁及其类似物有特异择性的分子印迹复合膜, 膜结合性研究表明该膜对模板分子奎宁具有独特的结合能力, 结合量可达到20.6μmol/g, 分离因子为5.6。膜透过实验表明非模板分子辛可宁透过印迹膜速率较大, 这将有利于奎宁和辛可宁的分离。

2.2 在对手性化合物分离方面的应用

由于分子印迹聚合物具有分子水平上的专一性识别, 同时具有MIPs良好的操作稳定性及识别性质, 不受酸、碱、热、有机溶剂等各种环境因素影响的特点, 决定了分子印迹聚合物在手性分离方面的广泛应用。黄晓冬等[5]采用原位聚合法直接在毛细柱中管合成辛可宁印迹聚合物, 用压力辅助毛细管电色谱模式拆分非对映异构体辛可宁和辛可尼丁, 结果柱效远高于其在高效液相色谱分离中的柱效。Beach等[6]以 (-) -伪麻黄碱和 (-) -降麻黄碱为模板, 制得MIPs作为薄层色谱的手性固定相, 不仅实现了对相应模板分子的识别, 而且还能分离出结构类似的手性化合物麻黄碱和副肾碱。董襄朝等[7]以 (-) -ephedrine为模板分子, 采用本体法合成了 (-) -ephedrine分子印迹聚合物, 将其用于分子印迹固相萃取, 成功地测定了中药麻黄中的 (-) -ephedrine, 结合HPLC进行分析, 表明该聚合物对 (-) -ephedrine有良好的选择性和亲和力, 有较高的回收率和精密度。邹汉法等[8]以中药延胡索中的L-四氢巴马丁为模板分子, 用原位分子印迹技术, 合成了L-四氢巴马丁分子印迹聚合物整体柱, 通过与HPLC联用, 表明模板分子具有特异的识别能力, 在优化色谱条件下, 使D-和L-四氢巴马丁手性对映体得到较好的分离。

2.3 在有机酸类、黄酮类和生物碱类的应用

由于MIP具有从复杂样品中选择性地吸附模板分子或与其结构相近的某一族化合物的能力, 因此它非常适合用作活性成分的分离与提取。朱秀芳等[9]以氧化阿魏酸为假模板分子, 通过自组装技术在乙腈中制备了对阿魏酸具有良好识别能力的MIPs, 可对川芎水提液中阿魏酸进行提取分离。程绍玲等[10]以葛根素为模板分子, 丙烯酰胺为单体, 二甲基丙烯酸乙二醇酯 (EDMA) 为交联剂, 制备葛根素MIP用于分离葛根提取液中的葛根素, 并用静态吸附实验研究了葛根素MIP的吸附行为, 结果表明该MIP对模板分子葛根素印迹效果较强, 得葛根素回收率为83%, 远大于用大孔吸附树脂的提取效果。Kobayashi等[11,12,13]首次采用湿相转化技术制备了茶碱的MIP薄膜, 这个薄膜是丙烯腈-丙烯酸的共聚物。通过吸附实验发现, 该技术制备的分子印迹膜为不对称结构, 包含一致密表层与一多孔支撑亚层, 对茶碱的吸附量远大于咖啡因, 这表明在相转化的过程中, MIP记录下了茶碱分子的形状。通过对薄膜的表征, 发现了茶碱和共聚物间相互作用的证据。Lai JP等[14]以苦参碱为模板制作了分子印迹膜, 从槐属植物苦参中提取分离苦参碱, 结果分子印迹膜对苦参碱的回收率可达到71.4%, 并提示其可用于大规模分离提取中药有效成分。

2.4 在其他领域的应用

分子印迹聚合物用作传感器的敏感材料是分子印迹技术的一个重要方面。分子印迹聚合物敏感材料与近年来研究较热的生物敏感材料相比, 具有耐高温、高压、酸、碱和有机溶剂, 不易被生物降解破坏, 可多次重复使用, 易于保存等优点, 且较生物材料易得, 可用标准化学方法合成出来。因此, 其膜适合作为灵敏度较高的传感器, 目前已被用作传感器的敏感部件, 用于识别氨基酸、除草剂、有机溶剂、神经毒剂、金属离子等多种物质[15]。

分子印迹技术在中药新药开发中的研究主要是寻找已知药物的代替品。高活性的抑制剂因其自身的高毒副作用, 或在体内不能被很好地吸收而无法最终成药。以一种高效高毒性的分子作为模板分子制备MIP, 直接从天然组合化学库中筛选出其它有效且低毒的化合物作为代替品;或者利用那些高效无毒但是由于制备困难而非常昂贵的药物分子作为模板, 寻找其它成本低廉且容易得到的代替品[16]。目前该研究还处于探索阶段, 利用MIP对模板分子及其结构类似物的高选择性, 使其成为一种新的分离材料应用于中药新药开发的研究。

3 结语

综上所述, MIT已经广泛地用于中药研究的各个方面, 并以其广阔的应用前景受到众多研究者的重视。但作为一种新型的分离技术, 其本身在理论和应用等方面还存在五大有待解决的问题: (1) 大量的分子印迹聚合物局限在非极性环境中, 应寻求一些实用于水溶液的功能单体; (2) 目标分子与MIP结合位结合较慢, 易引起峰展宽、拖尾而降低分离效率; (3) 印迹聚合物具有非均一结合位和可接近性, 这导致了分离在非线性等温吸附线下进行; (4) 印迹聚合物的“印迹”容量低, 因为一些结合位常被埋葬在聚合物的三维结构中而不能被利用; (5) 目前大多数功能单体只适用于小分子物质, 对于生物大分子的印迹技术尚需要进一步改进。

随着化学、生物学、材料学和分析技术的不断进步, 以上困难可通过提高印迹分子回收率, 使用新的交联剂, 提高烙印技术等手段加以克服[17]。总之, MIP作为一种高选择性主体及其所独有的特异性分离特点, 预示着该技术在中药活性组分的分离中将具有良好的应用前景。

摘要：分子印迹技术 (MIT) 是一种使所得聚合物的作用点, 对目标分子具有预定识别、选择性的聚合物制备技术。就分子印迹技术的原理、制备及其在中药活性成分的分离、有效成分的固相萃取、对手性异构体及结构类似物的分离等方面进行综述, 并展望了分子印迹技术在中药学领域的发展趋势。

关键词：分子印迹技术,分子印迹聚合物,中药,提取分离

分子中药学 篇2

07 资源 姚晓

关键词: 环糊精类;β-环糊精；药用制剂;应用;进展

环糊精(cyclodextrin, CD)是6个以上葡萄糖分子单元通过α-1, 4糖苷键连接而成的环状聚合体,具有空腔结构,是良好的天然合成包合材料。已知环糊精有多种同系物，常见的是a一，β一和丫CD，其中以β一CD在药剂学上应用最为广泛。美、法、德、意等国已有数十个含CD及其衍生物的药品问世，剂型有片剂(包括舌下片)、胶囊、糖丸、注射液、栓剂、口服液、口腔洗剂(含漱液)、油膏等;所涉及的药物有毗罗昔康、前列腺素El、E:、节蔡酸酷、碘、地塞米松、硝酸甘油、头抱替安、氢化可的松、伊曲康哇、氯氮革、大蒜油等〔’〕。近年来，环糊精在中药研究中的应用也较为普及和深人。近年来包合技术在医药领域中的应用日益广泛,其中应用较多的是β-环糊精(β-CD)及其衍生物。小分子药物与β-环糊精制成环糊精包合物后,能显著地改善药物理化性质,解决有些中药制剂生产中遇到的诸多困难,为药物新制剂、新剂型的发展提供了有效手段。

1环糊精的结构

1.1基于非共价结合的包合作用

环糊精的结构呈中空圆筒状,这种独特的空间三维结构是其药学应用的基础。大量分布于圆筒外侧的羟基决定了其良好的水溶特性,而圆筒内侧的非极性基团则在环糊精内部形成了一个疏水环境。这种内外侧极性迥异的性质使它在水溶液中能将疏水性分子部分或全部包嵌于中间孔穴内从而形成包合物。一般认为,环糊精与药物分子主要通过疏水性能和范德华力进行包合。但也有研究表明,水相中的环糊精还能以自身聚合体等形式与药物发生作用。由于它们之间并无共价键产生或断裂,因此包合是物理过程而非化学反应,结合于包合物内及游离在外的药物分子之间处于一种可逆的动态状态。

早在1953年,Freudenberg等就申请了第一份有关环糊精药学用途的专利,涵盖了环糊精在改善药物性质方面诸多应用,如提高水溶性及稳定性等。随着研究的不断深入,人们已不满足于仅由淀粉水解得到的几种天然环糊精。通过在葡萄糖的2,3和6位羟基上引入不同的功能性基团而获得的环糊精衍生物目前已有数千种之多。由于环糊精及其衍生物本身呈水溶性,对人体安全低毒,且不会引起免疫反应,所以在药学领域的应用日趋广泛。

CKD-732是一种新型的血管生成抑制剂,具有很强的抑制肿瘤生长活性,但因水溶性差和室温下化学性质不稳定等缺点阻碍了它的临床使用。经过2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CyD)包合后,其水溶性和稳定性均得到了显著改善。核磁共振分析显示, CKD-732的环己烷环与HP-β-CyD产生包合作用,而前者稳定性增强也归因于分子中的不稳定基团受HP-β-CyD孔穴之保护而免受外界因素的影响。对免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus)的包合研究发现,在天然α-,β-和γ-环糊精中,β-环糊精与他克莫司的结合稳定常数最高,说明前者的孔径大小与他克莫司分子最为匹配;其衍生物二甲基-β-环糊精(DM-β-CyD)的稳定常数及增溶效果更优于母体的原因是甲基化使孔穴的疏水空间增大,进而强化了包合能力。相反,由于取代基2-羟丙基空间位阻的原因,HP-β-CyD的增溶能力不及其母体。药动学试验提示,DM-β-CyD包合物可稳定持续地释放他克莫司,在提高生物利用度同时也使血药浓度保持在较为平稳的水平。

DY-9760e是一种用于治疗急性局部缺血性休克的新型细胞保护剂,Nagase等发现,与中性HP-β-CyD相比,呈负电性的磺丁基醚-β-环糊精(SBE-β-CyD)能与之形成更为稳定的包合物,从而显著提高药物的水溶性和光稳定性。园二色谱及核磁共振分析显示,除了SBE-β-CyD通过苯环包合DY-9760e所具有的疏水效应外,药物的阳离子基团与SBE-β-CyD的阴性取代基之间也因静电引力产生协同作用。此外,因包合的屏蔽效应,聚氯乙烯(PVC)塑料容器管对药物的吸附程度显著降低,提示SBE-β-CyD在非肠道制剂中的潜在应用前景。

Piel等研究表明,与目前市售的胶束溶液制剂相比,经HP-β-CyD或SBE7-β-CyD包合后,虽然咪康唑(miconazole)的溶解度相当,但它们能避免原有制剂中表面活性剂聚乙二醇蓖麻油所导致的过敏反应,且静脉注射后在动物体内的释放性能也无变化。事实上,药物在口服或非肠道途径进入体内后能快速从环糊精包合物中释放,其药动学的基本特性不受影响。

进一步研究显示,环糊精或其衍生物的包合能有效抑制药物的细胞毒性。如DY-9760e与SBE7-β-CyD形成稳定的包合物后显著地抑制了前者对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和对兔耳缘静脉血管的毒性作。同样,非甾体抗炎药萘普生(naproxen)的光毒性经β-环糊精包合后明显降低。由于该毒性是因萘普生光分解产生的单线态氧及自由基所致,因此推测β-环糊精对光分解产物也有包合作用。神经肌接头阻滞剂罗库溴铵(rocuroniumbromide)是麻醉医师常用的肌肉松弛药,术后为防止药物残留通常给予相应的逆转剂(如新斯的明等乙酰胆碱酯酶抑制剂),后者伴有心动过缓和恶心呕吐等不良反应。Bom等发现了一个能有效包合罗库溴铵分子的γ-环糊精衍生物(Org25969),经X射线结晶学研究证实两者在Org25969空腔内发生极为稳定的结合,从而间接阻断罗库溴铵的药理活性。体外及动物实验均显示,Org25969能快速逆转罗库溴铵引起的神经肌接头阻断作用,效果优于新斯的明,且未观察到任何毒副作用。目前Org25969作为

新药已进入临床试验阶段。

此外,通过包合作用,环糊精及其衍生物还可用于减少药物挥发、矫味矫臭以及将油性药物粉末化等方面,在此不一一列举。

1．2 基于共价结合的共轭化合物

药物与环糊精之间除了通过非共价键形成包合物外,还可以通过共价键连接形成性能稳定的共轭化合物(Conjugated compound)。

抗肿瘤药物喜树碱(camptothecin,CPT)与β-环糊精聚合物(β-cyclodextrin polymer, CDP)形成CDP-CPT共轭化合物后,不仅提高了CPT的水溶性和稳定性,抗肿瘤活性也优于未包合的CPT;裸鼠实验显示,短期给予CDP-CPT后,其抑制肿瘤生长的活性可以维持较长时间,这可能与大相对分子质量的共轭化合物不易被肾清除以及CPT在肿瘤组织中以较慢速度释放有关。

Kamada等发现,抗炎药物酮洛芬(ketoprofen, KP)通过与α-环糊精上的一个羟基共价连接后,药物在大鼠体内的释放性能发生显著改变:酮洛芬仅在结肠与盲肠定点释放,并呈典型的缓释特性;联合使用KP-α-CyD共轭化合物及其他缓释载体,可以人为控制药物释放行为,满足临床上对不同性能释药制剂的需要。

2环糊精及其衍生物在药物制剂中的应用 2.1增加药物的溶解度和溶出度

水难溶性药物与CD形成包合物，药物的脂溶性基团插入CD筒内，筒状外围多个亲水性的醇经基，使得水难溶性药物在水中的溶解度上升，而亲水性衍生物的产生为水难溶性药物的广泛应用开辟了新的途径。岩白菜素的水溶性较低，其镇咳去痰作用也受到一定影响。岩白菜素经p一环糊精包结后，溶解度增加两倍，有望提高其疗效川。

2.2提商药物稳定性

不少药物受热、湿、光、空气和化学环境的影响，容易挥发或升华而药效降低。CD将客分子包人其空腔内而起到保护性作用，外部的水分子很难与客分子的活性基团作用。即便外部条件(温度、pH、溶剂)改变仍能保持药物的稳定，李。前列腺素PgE:在40℃紫外光下照射3h，活性损失50%，6h损失大于75%，而包合物24h无损失，10d仅损失5%〔’〕。

2.3使潮解性、挥发性或液体药物粉末化

环糊精可使中药挥发油粉末化，以适应片剂、散剂、胶囊剂、颗粒剂等的制备。脑立清片中冰片、薄荷脑相互共熔而成勃稠液体，使颗粒流动性变差，压片时易产生松片、麻面及重量差异不合格，糖衣片在贮存期内糖衣层变色，制成包合物加人即可得到显著改善书〕。

2.4降低药物的刺激性，减少药物不良反应

用卜CD包合后可减少毗罗昔康对胃猫膜的直接的急性损伤。雷公藤是有毒植物，但具有显著的抗炎免疫抑制作用，临床应用广泛。为了克服它的毒性，利用β一CD包合，能降低其毒性，提高疗效。

2.5掩盖药物的不良气味，利于患者服用

有些药物的嗅味不佳，特别是中草药特有的异味和苦味，直接影响到患者的用药依从性。如:大蒜精油川具有特异恶臭，与卜CD制成包合物后，能明显掩盖臭味。

2.6提商药物的生物利用度

β一CD及其衍生物可提高包合物制剂的生物利用度，但要求包合常数大小适当。含有DM一日一CD(2，6一二甲基一β一环糊精)、HP一日一CD(羚丙基一β一环糊精)和β一CD的胰岛素栓剂，生物利用度分别比普通栓剂提高8，5和3倍，原因可能是因为它们改变了直肠戮膜的脂质屏障而使AUC增大。但是不适当的比例还常常会降低药物的生物利用度。动物实验表明叫噪美辛与β一环糊精形成包合物，口服血药浓度较单体高，尿排量也明显高于单体，因此可以认为包合物的生物利用度高于单体。颜耀东侧等人应用β一cD对强疏水性的齐墩果酸进行包合实验研究，比较了包合前后的溶解度和溶出速率，实验结果表明，齐墩果酸一β一CD的溶解度和溶出速率明显高于齐墩果酸，有利于提高其生物利用度。

2.7调节给药速率

目前已有大量β一CD衍生物，如HP一β一CD等，这些β一CD衍生物具有高亲水性，有利于药物在胃肠道快速溶解，常用于改善难溶性药物的生物利用度。而疏水性β一CD衍生物可用于缓释水溶性药物，这对于多肤和蛋白类药物尤为重要。wang等「’‚〕采用HP一β一CD和其它辅料开发了硝苯地平双层片。研究中，药物与HP一β一CD及非离子表面活性剂聚氧乙烯氢化蓖麻油经喷雾干燥制得一种无定型的粉末作为速释部分，既获得了初始的快速溶解又能防止放臵过程中药物的结晶增长;同时再采用不同猫度等级的经丙基纤维素作为缓释部分，控制药物从骨架材料中的释放，通过调整速释部分和缓释部分的比例获得预期目的的药物释放速率。

2.8定位给药 2.81脑靶向给药系统

设计高亲脂性药物，可以使药物定向地到达脑及类脂丰富的器官中，增加药物在靶器官中的浓度。但药物的脂溶性过大，在配臵水性注射液中必然困难重重，应用HP一β一CD作为亲脂性靶向药物的载体，是一条可行的途径。据报道，手术前静脉注射氟桂利嗦的HP一β一CD包合物，结果在切除的脑瘤组织中，药物的浓度是血浆药物浓度的10倍。

2.82特殊细胞靶向

由于细胞表面β一内酞胺酶干扰β一内酞胺类抗生素穿过细胞膜的扩散率的测定，有报道「‘，〕选择β一cD与药物形成共扼化合物，一方面能增大药物的空间体积，同时也增加药物的表面亲水性以阻止药物透过细菌外膜通道，制备了不同间隔的β一CD/抗生素共扼化合物(间隔4.7一23.7)，结果间隔在16以上者对外膜上p一内酸胺酶抑制最佳。

2.83结肠定位给药系统

依据结肠生理条件设计的口服结肠靶向释药系统(OC-DDS)近年来颇受国内外研究者关注。β一CD与药物形成的包合物易受体内物质如类脂、胆固醇的影响，在胃肠中不稳定，达不到理想的结肠靶向释药效果。对此，研究者将β一CD和药物通过共价键结合制成前药，使其在胃和小肠中不降解，而在盲结肠中被特异性的酶降解，释出药物。降解产生的小分子糖如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等也可作为载体选择性地将药物转运至肝、结肠等特定细胞表面的糖受体。正丁酸对结肠炎、结盲肠癌等有抑制效果，但通常其吸收代谢在肠道上端，不利于结肠病变的治疗，制成oCDDS是其治疗结肠局部疾病的理想方式。Hirayam。等考察了单取代β一CD一正丁酸在大鼠肠内容物和体液中的释放。大鼠口服后，胃、小肠内容物及小肠、大肠匀浆中均未见明显的正丁酸;6h后在盲结肠内容物中产生大量正丁酸。结果表明β一CD一正丁酸前药可在大鼠盲结肠中定位释放正丁酸。

2.9促进药物吸收 黔cD衍生物(β一CDD)对药一物的稳定化和促渗透作用，改善了药物从鼻腔、直肠和眼猫膜的吸收。甲基化β一CD通过细胞旁路途径促进肤和蛋白从猫膜吸收，并靠物理屏蔽和代谢屏蔽，使药物免于破坏。DM一β一CD可促进肤和蛋白、舍瑞林、胰岛素和ACTH类似物的鼻腔吸收;促进直肠对胰岛素的吸收。β一CD用于透皮制剂，可提高药物的溶解度、稳定性和渗透性而加快吸收。如不定位甲基化β一环糊精(RM-βp一CD)将阿维酸A的溶解度由0.01mg’耐一’提高到3.35mg〃ml一’，可使其透皮吸收度提高3一4倍。

2.10在注射剂中的应用

HP一β一cD是美国FDA批准的第一个可供静脉注射的β-cD衍生物。HP一β一cD无毒，刺激性小，溶血作用很小，能增加难溶性药物溶解度，从而避免使用有机溶媒、表面活性剂和醋类。美国强生公司4O%HP一β一CD增溶的伊曲康哇口服液和静脉注射剂已上市。在注射剂中应用HP一β一CD作增溶剂和稳定剂进行研究的药物有尼莫地平、地塞米松、雌二醇、TMp和sMz、生长激素(GH)、KNI一272(治疗艾滋病药物，正进行临床前研究)及前列腺素等。磺丁基醚一汗环糊精(SBE一β一CD)是20世纪90年代由美国cydex公司开发的离子化β一CD，作为性能更为优良的药用辅料。最常见的sBE一β一cD是取代度分别为4和7的SBE4一β一CD与SBE7一β一CD。与HP一β一CD相比，它具有更好的安全性，更强的增溶与包合能力及更优的稳定性，特别是作为注射用辅料有着广阔的应用前景。目前辉瑞公司已成功开发以SBE一β一CD作为包合材料的抗精神病药Ziprasidone的注射剂并在美国、瑞典上市。

3．β-环糊精及其衍生物在中药领域中的应用 3.1增加药物的溶解度和溶出度

水难溶性药物与环糊精形成包合物,药物的脂溶性基团插入环糊精筒内,筒状外围多个亲水性的醇羟基,使得水难溶性药物在水中的溶解度上升,而亲水性衍生物的产生为水难溶性药物的广泛应用开辟了新的途径。丹皮酚具有易挥发性、水溶性差及见光易分解的特点,丹皮酚与2-羟丙基-β-环糊精形成的包合物,可增加药物的溶解度和稳定性,丹皮酚的溶解度可达到10 mg/mL,已达到注射剂的要求。以金银花挥发油为主要成分的制剂有金银花注射液、金银花露和清咽糖浆等。但挥发油成分普遍存在稳定性差、水溶性小、配制水溶液浓度低等缺点。金银花挥发油与2-羟丙基-β-环糊精形成的包合物,可增加药物的溶解度和稳定性,溶解度增加约为21倍。陈氏等实验制备得到的黄芪甲苷-羟丙基-β-环糊精包合物,达到了较为理想的增溶效果,并显著提高了其胶囊剂的溶出度。罗氏等研究表明,包合物能显著提高隐丹参酮的溶出度,包合物包结作用的热力学键力是隐丹参酮分子的羰基与羟丙基-β-环糊精分子的羟基形成氢键。

3.2提高中药制剂的稳定性

目前,环糊精在中药制剂中应用最多的是包封挥发性成分。当挥发性成分被环糊精包封后,可防止其逸散,提高制剂的稳定性。环糊精将客分子包入其空腔内而起到保护性作用,外部的水分子很难与客分子的活性基团作用。即使外部条件(温度、pH、溶剂改变)发生改变,仍能保持药物的稳定。纪氏等经稳定性实验表明,益智挥发油被β-环糊精包合后增加了其对光、热、湿的稳定性,降低了其挥发性,包合物的稳定性明显高于混合物,可见,β-环糊精可有效地防止益智挥发油的挥发、氧化变质,提高其稳定性。孟氏等稳定性试验表明,咳喘宁胶囊中挥发油β-环糊精包合物的抗光解性、热稳定性和湿稳定性明显高于物理混合物。挥发油β-环糊精包合物的挥发性明显低于混合物。可见,β-环糊精包合物可有效地防止挥发油的挥发,提高其稳定性。张氏等采用经典恒温法考察了羟丙基-β-环糊精对穿琥宁溶液稳定性的影响。结果表明,加入羟丙基-β-环糊精后,穿琥宁溶液的有效期延长。许氏通过稳定性实验表明,包合物的抗光解性、热稳定性和湿稳定性明显高于混合物。可见连翘油环糊精包合物可有效地防止连翘油的挥发,提高其稳定性。

3.3用于有效成分含量测定

利用β-环糊精与药物成分形成单分子胶束的增敏作用,用于药物含量测定。龙胆苦苷遇光、热极易分解,利用β-环糊精与龙胆苦苷包含物达到一个动态平衡,使荧光值稳定,能进行有效的含量测定。以β-环糊精为键合固定相的色谱柱能够较好地分离银杏叶提取物和银杏黄酮,优于葡聚糖凝胶。

3.4提高药物的生物利用度

β-环糊精及其衍生物可提高包合物制剂的生物利用度。肖氏等通过反相高效液相色谱法测定大鼠体内水飞蓟宾的血药浓度,进一步证明了水飞蓟素羟丙基-β-环糊精包合物可显著提高生物利用度。高氏等采用逆向混合搅拌法制备蛇床子素的β-环糊精包合物,用紫外分光光度法测定包合物中蛇床子素的含量、溶解度、溶出度,高效液相色谱法测定兔体内的血药浓度。结果表明,包合物能提高其兔体内生物利用度。

3.5减少刺激性,减轻不良反应

宋氏等采用β-环糊精将蟾酥进行包合制备成了蟾酥β-环糊精包合物,掩盖药物的不良气味,减少刺激性、降低毒性。何氏等通过将桉油进行β-环糊精包合后,不但达到了改变桉油剂型、减轻其不良反应、掩盖其刺激性的目的,且扩大了其应用范围。

3.6调节给药速率

孙氏等通过对大蒜油进行β-环糊精包合,再制成凝胶骨架缓释片,可以延长作用时间、减少用药次数、降低不良反应、提高制剂的生物利用度以及降低大蒜油对胃肠道黏膜的刺激性,比纯大蒜油具有更好的应用价值。讨 论

综上所述,随着医药现代化和工业化的进展,分子包合物的应用研究有很多报道,特别是在药剂领域的应用更令人瞩目。环糊精是改进药剂处方的有效辅料,尤其是越来越多新型环糊精衍生物的问世,其在药剂学上的应用,特别是在缓控释、透皮和黏膜给药系统及在中药制剂领域中的应用也在不断扩大和深入。环糊精及其衍生物在新型给药系统中的应用对于开发研制药物新剂型、新品种有着良好的前景,因此进一步开发研究环糊精及其衍生物在药剂学上的应用技术,具有十分重 要的意义。

参考文献 [1]刘赞，冯青然，张保献.环糊精及其分子包合技术在中药研究中的应用〔J〕.中国实脸方剂学杂志，2001，7(5):印

分子中药学 篇3

关键词： 川贝母；DNA；PCR 【中图分类号】R284 【文献标识码】B 【文章编号】1672-8602(2014)03-0196-01

川贝母系百合科植物川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母Fritillaria przewalskii Maxim.、梭砂贝母Fritillaria delavayi Franch.、太白贝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li或瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis（S.Y.Tang et S.C.Yue）Z.D.Liu.S.Wang et S.C.Chen的干燥鳞茎。按性状不同分别习称"松贝"、"青贝"、"炉贝"和"栽培品"。川贝母性微寒而味甘苦，入心肺经，能润肺、止咳、化痰，是一味珍贵的中药材。"中国药典"规定药用川贝母为以上6个品种，但我国贝母属植物已超过50种，造成贝母基源极为复杂，并且随着需求量的增加，基源混乱的现象呈现不断增加的趋势，直接影响川贝母临床用药的安全、疗效。运用分子标记技术鉴定川贝母的真伪，以克服目前仅依据形态、显微特征及理化进行鉴别的不足。使中药鉴定的手段从传统的形态表征扩展到了遗传物质DNA。特别是近年来微量DNA的PCR技术的应用发展，使分子生物学技术与方法以特异性强，稳定性好，微量、准确等特点，被广泛应用于近缘种、珍稀种、破碎药材等的鉴定。本实验应用分子生物学技术对川贝母进行了研究，建立了川贝母DNA分子标记鉴定方法，为川贝母与其伪品的鉴定提供了科学依据。

1 材料与仪器

1.1 药材:(1)伊贝母对照药材、平贝母对照药材、湖北贝母对照药材、浙贝母对照药材、川贝母对照药材（中国药品生物制品检定所）。(2)青贝、炉贝、浓蜜贝母（广西锦莹药业有限公司）。

1.2 试药: 新型植物基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）；10×PCR緩冲液、二氯化镁（25mmol/L）、dNTP（10mmol/L）、鉴别引物：5ˊCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3ˊ和5ˊGCTACGTTCTTCATCGAT 3ˊ、无菌超纯水、琼脂糖、50×TAE电泳缓冲液、DNA分子量标记物GM331（上海生工）；GelRed核酸凝胶染色剂（BIOTIUM）；高保真Taq DAN聚合酶（5U/μl）、10×酶切缓冲液、Sma I（10U/μl）（Fermentas）。

1.3 仪器:H1850型台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；K960型热循环仪（杭州晶格仪器有限公司）；DYCP-31DN型电泳仪（北京六一仪器厂）；GSG-2000核酸/蛋白质凝胶成像仪（珠海黑马医学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 模板DNA提取:取本品0.1g，依次用75%乙醇1ml、灭菌超纯水1ml清洗，吸干表面水分，置乳钵中研磨成极细粉。取20mg ，置1.5ml离心管中，用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA[加入缓冲液AP1 400μl和RNA酶溶液（10mg/ml）4μl，涡漩振荡，65℃水浴加热10分钟，加入缓冲液AP2 130μl，充分混匀，冰浴冷却5分钟，离心（转速为每分钟14000转）10分钟；吸取上清液转移入另一离心管中，加入1.5倍体积的缓冲液AP3/E，混匀，加到吸附柱上，离心（转速为每分钟13000转）1分钟，弃去过滤液，加入漂洗液700μl，离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤液；再加入漂洗液500μl，离心（转速为每分钟12000转）30秒，弃去过滤液；再离心（转速为每分钟13000转）2分钟，取出吸附柱，放入另一离心管中，加入50μl洗脱缓冲液，室温放置3～5分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟,将洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2分钟，离心（转速为每分钟12000转）1分钟]，取洗脱液，作为供试品溶液，置4℃冰箱中备用。另取川贝母对照药材0.1g，同法制成对照药材模板DNA溶液。

2.2 PCR-RFLP反应:鉴别引物：5ˊCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA 3ˊ和5ˊGCTACGTTCTTCATCGAT 3ˊ。PCR反应体系：在200μl离心管中进行，反应总体积为30μl，反应体系包括10×PCR缓冲液3μl，二氯化镁（25mmol/L）2.4μl，dNTP（10mmol/L）0.6μl，鉴别引物（30μmol/L）各0.5μl，高保真Taq DAN聚合酶（5U/μl）0.2μl，模板1μl，无菌超纯水21.8μl。将离心管置PCR仪，PCR反应参数：95℃预变性4分钟，循环反应30次（95℃ 30秒，55～58℃ 30秒，72℃ 30秒），72℃延伸5分钟。取PCR反应液，置500μl离心管中，进行酶切反应，反应总体积为20μl，反应体系包括10×酶切缓冲液2μl，PCR反应液6μl，Sma I（10U/μl）0.5μl，无菌超纯水11.5μl，酶切反应在30℃水浴反应2小时。另取无菌超纯水，同法上述PCR-RFLP反应操作，作为空白对照。

2.3 电泳检测: 胶浓度为1.5%，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供试品与对照药材酶切反应溶液的上样量分别为8μl，DNA分子量标记上样量为1μl（0.5μg/μl）。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上检视。

3 结果

注：1伊贝母对照药材、2平贝母对照药材、3湖北贝母对照药材、4浙贝母对照药材、5川贝母对照药材、6青贝、7炉贝、8浓蜜贝母、9空白、M分子量标记物（100～600bp）。经PCR扩增反应后，青贝、炉贝与川贝母对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250bp有两条DNA条带。伊贝母对照药材、平贝母对照药材、湖北贝母对照药材、浙贝母对照药材、浓蜜贝母与川贝母对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在100～250bp无DNA条带。

4 讨论

由于本实验采用DNA吸附柱和新型独特的溶液系统，适合于从含酚类、多糖类和酶抑制物的制物样品中快速简单地提取基因组DNA。在此基础上采用聚合酶链式反应（PCR）技术对伊贝母、平贝母、湖北贝母、浙贝母、川贝母、青贝、炉贝、浓蜜贝母8种贝母进行扩增检测，结果表明，只有青贝、炉贝与引物有特异性的结合位点，不同产地的平贝母、、浙贝母、湖北贝母、伊贝母、浓蜜贝母与引物无特异性的结合位点。因此通过对8种贝母进行PCR分析，川贝母与其他贝母的DNA分子差异，实验结果重现性较好，为进一步发掘和充分利用贝母资源提供理论依据。

分子中药学 篇4

1 药学分子生物学虚拟实验在实验教学中所起到的作用

传统药学专业教学模式是仅仅注重传统化学领域的知识,重视中药提取,化学成分合成,药剂和药物分析,轻视生化,细胞生物学,分子生物学等知识的系统学习,这既与老一辈药学专业人的学识有关,又与我国以仿制药为主的研发思路有关。但实际是,走到今天,不论什么药物的研发,必然涉及到大分子和生物系统结构,因此,熟练掌握分子生物学的相关知识及实验技术是必不可少的。药学分子生物学实验是通过对微观分子世界的深入研究来不断的揭示生命中存在的各种奥秘。如果学生想要了解生命本质其必须能够真正的进入到微观世界。传统的课堂讲授,真人示范性的实验教学手段对微观世界动态变化的展示比较模糊,形象化较差,显得力不从心。而现代的信息数字化技术及多媒体技术却为对微观世界的形象化的展示提供了这种可能。运用计算机编程、网络信息的资源共享等现代的数字化信息技术开发一种新的实验教学途径———虚拟实验教学,成为解决药学分子生物学实验教学的一个重要途径[3]。虚拟实验教学是信息时代的产物,它在教育科研领域中具有广阔的应用前景,不仅仅是药学分子生物学实验教学的一个新的发展方向,而它也必将促进各类实验教育教学理念与教学模式的升级。

近年来学校数字化校园建设在不断的完善中,多媒体教室的扩大升级建设,网络资源共享,等各种信息化教学条件也在不断的优化中。这些硬件软件的完善都为开展药学分子生物学虚拟实验,建立虚拟实验室提供了可能,而学生在学习药学分子生物学实验技术时,可以通过在一种模拟实验室的环境下,运用鼠标点击进行相关的实验操作,通过这种更加客观直接的方式,使得学生对相关实验过程的理解加深。通过构建虚拟实验,一种开放式的实验环境提供给学生,在此基础上,让学生根据实验要求,自行设计实验方案,灵活地增加各种探索性实验内容。因此引入虚拟实验,不仅可以激发学生学习的兴趣,还可以锻炼学生的独立科研能力,这样为培养具有创新型的人才打下了坚实的基础。

2 构建药学分子生物学虚拟实验的优势

在传统实验教学中,有些药学分子生物学实验的实验设计往往会难以被有效的开展,而利用虚拟实验系统,就可以弥补传统实验中出现的一系列问题:诸如实验设备昂贵、实验场地狭小、实验教学经费不足、有些实验存在危险,或对于人体健康有危害,难以开展、实验周期较长。但构建虚拟实验室,进行虚拟实验,就可以避免这些顾虑。学生通过电脑就可以做实验,并获得与现实实验一样身临其境的体会。对于一些昂贵的精密仪器,学生也可以在虚拟的环境中得到亲自操作的乐趣,并且在虚拟实验环境中学生可以放心地去做各种容易发生意外状况的实验。例如,虚拟的核酸琼脂糖凝胶电泳实验,可以避免EB直接接触皮肤所带来的致癌危险;虚拟的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验,可避免由于学生操作失误,而造成灌胶液泄漏的意外发生;虚拟的动物组织RNA的提取实验中,可以避免由于操作不当,细胞裂解液的溅出对学生身体的伤害。实验室经常用到的各种精密仪器,高分辨质谱仪,可分选的流式细胞仪,荧光定量PCR,倒置荧光显微镜,酶标仪等等,甚至大到肉眼可见的各种细胞,细菌菌落,小到核酸、蛋白质大分子,学生都可以在虚拟实验室中直观地观察到,这就打破了传统实验中由于实验的抽象和微观性,造成学生对实验理解上的困难局面。

虚拟技术还可以突破时间的限制,一些需要几个小时甚至几天才能完成的分子生物学实验过程,通过虚拟实验技术,可以在很短的时间内呈现给学生。此外,在传统的实验教学模式下,在现实的实验室中,由于药学分子生物学实验要求的成本较高,花费的时间及需要的教学资源较多,很难让学生重复多次进行。而在虚拟实验中,学生就可以根据自己的兴趣可以进行多次重复实验,加深对实验的理解,提高学生的自我创新能力。学生以一种轻松的心态,类似于玩游戏的心态,通过所构建的虚拟实验程序进行练习,变被动学习为主动学习,有效提高了学生的学习效率。

3 药学分子生物学虚拟实验的应用前景展望

构建药学分子生物学虚拟实验,为学生提供了一个学习药学分子生物学的虚拟实验环境,不仅仅可以为药学专业服务,对于生物技术,研究生以及学习生物化学分子生物学的临床医学专业的学生都可以提供帮助。虚拟实验相对于单一的课堂授课,实验教师示范,多人围在实验台前动手操作的传统教学模式,虚拟实验更能激发出学生的学习热情。学生还可以在分子生物学实验技能学习平台上,利用虚拟程序中设定的实验仪器设备和实验技术搭建实验内容,自己构建虚拟实验,而教师在整个过程中作为指导者给予一定引导,鼓励学生自主创新,进行创新性实验的开发。

同时,随着虚拟实验系统的进一步开发,可以设定药学分子生物学虚拟实验的教学平台论坛,在论坛中,学生可以将自己的实验进度,实验中遇到的问题在论坛上随时发布并寻求帮助。此外,在虚拟实验进行的过程中,实验指导教师如果发现学生自己所构建的虚拟实验立意新颖,即可鼓励学生,进入科研实验室进行实物实验,可以让学生所设想的虚拟实验转化为实验技术成果,参与大学生创新竞赛[4,5]。通过虚拟实验的构建,可以使得医药学的教育更为直观,并丰富了教学形式,显著提高了实验教学的效果。因此,我们要在高校大力进行信息化建设的同时,借助这股东风,加速高水平的虚拟实验信息平台建设的步伐。

参考文献

[1]刘向华,德伟,刘志军,等.虚拟实验在分子生物学实验教学中的作用[J].基础医学教育,2014,16(11):973-975.

[2]陈小红.虚拟实验室的研究现状及其发展趋势[J].中国现代教育装备,2010(17):107-109.

[3]周枫,丁之旺,敖梅英,等.基于Flash技术的《药学分子生物学》虚拟实验室的构建及运用探讨[J].湖北函授大学学报,2014,27(2):75-77.

[4]王甜,王茂林,林宏辉.分子生物学虚拟实验室的构建[J].实验科学与技术,2015,13(3):43-46.

分子中药学 篇5

1 抑制兴奋性氨基酸毒性作用

兴奋性氨基酸 (excitatory amino acid, EAA) 主要是指谷氨酸 ( glutamate, Glu) 和天冬氨酸 ( asparate, Asp) 。当脑缺血缺氧时, 三磷腺苷 (ATP) 合成不足, 引起中枢神经系统EAA, 特别是谷氨酸大量释放, EAA重摄取发生障碍, 加上细胞内的EAA因钙内流而释放加速, 造成病灶局部脑组织间隙过量积聚, 引起对突触后膜受体的过度刺激而介导急性细胞渗透性肿胀和相关损伤。此外, EAA毒性可激活胞内信号传导通路, 触发缺血后致炎基因表达而引起神经细胞损伤。故拮抗EAA 兴奋毒性, 包括抑制其过度释放、促进其再摄取以及抑制其受体活性, 对脑缺血损伤具有防治作用。张焰等[1]在沙土鼠脑缺血再灌注损伤模型实验中, 发现灯盏花素可通过降低EAA释放而减轻脑缺血再灌注损伤。张翠兰等[2]研究表明, 竹节人参总皂苷可防止大鼠脑缺血及其再灌注后脑组织中EAA升高, 对大鼠脑损伤具有明显的保护作用。刘泰等[3]通过动物实验研究认为醒脑通脉胶囊 (田七、胆南星、地龙、石菖蒲、冰片) 能明显降低脑组织Glu和Asp含量, 表明该药可对抗缺血性脑损伤。

2 抗自由基的毒性损伤

人体内的自由基主要包括超氧阴离子、羟自由基、单线态氧、一氧化氮、烷自由基、烷氧基、烷过氧基和脂质过氧化物等。缺血性卒中时, 自由基主要通过AA代谢途径、黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统和一氧化氮合酶 (NOS) 途径产生。自由基对脑组织的损伤主要发生在缺血再灌注期。脑组织缺血后自由基生成增加, 再灌注后激化。神经细胞膜和细胞器的膜结构是自由基的主要攻击目标。介导神经元不可逆损伤的同时, 过度消耗超氧化物歧化酶 (SOD) , 并生成大量的脂质过氧化物代谢终产物丙二醛 (MDA) , 使缺血脑组织中SOD活性下降, MDA含量升高。自由基还能导致EAA释放增加, 促使脑缺血后再灌注损伤发生。研究表明[4,5,6,7,8,9], 葛根黄酮、人参皂苷Rg1、银杏内酯B、绞股蓝总甙、丹参酮ⅡA、灯盏花素等多种中药均可提高脑缺血大鼠SOD活性, 降低MDA含量, 减轻自由基反应对脑组织的损害, 对缺血脑组织具有明显的保护作用。龚秀云等[10]研究益肾降浊汤对大鼠脑缺血再灌注损伤模型的影响, 提示该汤剂可提高脑组织内SOD活性, 降低缺血再灌注后脑组织MDA含量, 保护神经元。

3 抑制炎症因子的表达

近年有关缺血性卒中发病的免疫机制研究有了新的进展, 证实一些炎性细胞因子如肿瘤坏死因子 (TNF-α) 、白细胞介素-1 (IL-1) 、白细胞介素-6 (IL-6) 、白细胞介素-8 ( IL-8) 、转化生长因子等在缺血性卒中病理生理学机制中发挥重要作用。炎性细胞因子以其强大的致炎作用参与脑缺血后的炎症过程, 刺激其他细胞因子和炎症介质的产生, 诱导损伤区白细胞浸润, 影响神经胶质细胞基因表达。这些细胞因子可作为内皮细胞活化的信号, 刺激细胞黏附分子的产生及白细胞-内皮细胞黏附, 导致缺血细胞的进一步损伤。因此, 抑制大量炎症因子的表达, 阻止炎性反应, 降低脑组织的损伤和破坏程度是缺血性脑损伤的脑保护治疗措施之一。韩绍娟等[11]发现, 补阳还五汤能明显降低沙土鼠脑缺血再灌注损伤后血清炎性细胞因子IL-1、IL-6、TNF-α的表达, 从而对脑缺血再灌注具有保护作用。杨柳等[12]研究发现, 活血通脉汤能显著抑制再灌注后脑组织病理结构的损伤, 以及缺血脑皮质中TNF-α和细胞间黏附分子1 (ICAM-1) 蛋白表达, 从而抑制再灌注引起的炎症反应所导致的继发损伤。张勇等[13]发现涤痰汤可抑制TNF-α表达, 减轻脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织受损程度。中药单方研究显示[14,15,16,17], 黄芪提取物能减少TNF-α的表达, 降低IL -1β水平;水蛭注射液可降低TNF-α、IL-1β和ICAM-1的表达;丹皮酚明显降低缺血区脑组织ICAM-1、血管细胞黏附分子1 (VCAM-1) 的蛋白及mRNA的表达;灯盏花素可抑制脑缺血后脑组织的ICAM-1表达。以上中药通过抑制炎性因子的表达阻止炎症反应, 对脑缺血再灌注损伤有保护作用。

4 干预细胞内钙超载

脑缺血缺氧后引起的胞浆静息游离钙离子浓度的增加来自于细胞外Ca2+内流、细胞内储存Ca2+释放以及胞浆Ca2+的外排能力下降。当钙内流过多或胞内储存钙释放过多, 超出神经元对Ca2+的调节能力时, 引起钙超载。钙超载是凋亡过程中的关键因素, 也是各种有害因素致神经元死亡的最后共同通路。钙超载可通过蛋白激酶C、蛋白酶SⅠ和Ⅱ、磷脂酶A2、磷脂酶C、Ca2+钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ、核酸内切酶、中性蛋白酶等作用而导致神经元坏死或凋亡。王继生等[18]通过实验观察发现茅莓总皂苷能不同程度地降低大鼠海马神经元细胞内Ca2+浓度。周乐全等[19] 的研究显示, 灯盏花素可显著降低全脑缺血再灌后大鼠海马CA1区神经元内游离Ca2+浓度。认为两药均可通过减轻细胞内的钙超载来对缺血神经元进行保护。另外, 参麻益智胶囊、血塞通等也可以降低神经细胞内游离钙离子的含量, 拮抗钙超载, 从而起到神经细胞的保护作用[20,21]。

5 抑制凋亡调控基因的激活

细胞凋亡程序的启动到凋亡的发生是通过多种细胞凋亡信号转导实现, 并由凋亡相关基因包括Bcl-2家族基因、胱冬酶家族基因 (caspase) 、P53基因、Fas基因、热休克蛋白 (HSP) 基因、即早基因 (IEG) 、Akt/蛋白激酶B (PKB) 基因等调节控制。其中Bc1-2及Bax蛋白的表达与细胞凋亡关系尤为密切。曲友直等[22,23]观察发现, 黄芪注射液、四逆汤可上调Bc1-2蛋白表达, 同时下调Bax蛋白的表达, 对脑缺血大鼠具有显著的保护作用。银建军等[24]观察到胡黄连可明显促进Bcl-2表达, 说明该药可抑制大鼠脑缺血再灌注后半暗带神经细胞凋亡的发生。另外, Caspase-3也是重要的参与细胞凋亡的分子, 一旦被激活, 细胞凋亡的发生将不可逆转。动物实验结果证明[25,26,27,28,29], 牛蒡子复方制剂、三七总皂苷、灯盏花素以及复方白花前胡液等均能下调Caspase-3蛋白的表达;银杏叶提取物可增加脑缺血损伤急性期Bcl-2蛋白的表达而减少Caspase-3的表达, 从而抑制缺血损伤及细胞凋亡, 起到神经保护作用。有研究认为[30,31]参芎注射液、脑络欣通 (黄芪、三七、川芎、蜈蚣等) 等可通过抑制脑缺血再灌注损伤大鼠Fas、FasL蛋白的表达而对脑细胞有保护作用。此外, 刺五加注射液还通过提高Bcl-2的表达并延长其表达的时间, 有效降低P53的表达并降低其峰值[32];葛根素通过上调HSP的表达等[33]对急性脑缺血损伤具有保护作用。

6 保护线粒体功能

目前认为, 凋亡的发生、发展与线粒体功能障碍密切相关。在缺血缺氧时, 脑细胞内ATP逐渐耗竭, 依靠ATP运转的离子泵 (ATPase) 活性因能量障碍而受抑制, 同时因钠泵 (Na+-K+-ATPase) 和钙泵 (Ca2+-Mg2+-ATPase) 活性降低, 导致胞内Na+和Ca2+超载, 引起迟发性细胞损伤。另外细胞外Ca2+内流入细胞, 主要集聚在线粒体内, 破坏线粒体结构和功能。缺氧缺血情况下, 线粒体DNA受损, 使呼吸链复合物电子传递完整性受到破坏, 主要是呼吸链复合物活性受损, 使黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性复合物途径被过度利用, 自由基生成增加, 超过了细胞本身的清除能力, 导致细胞凋亡, 因此线粒体DNA的表达紊乱可引起能量产生进行性衰竭, 导致细胞死亡。闵小芬等[34]的实验研究显示, 黄芪提取物能改善脑组织神经元在脑缺血再灌注后的结构破坏情况, 认为该药对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的保护作用的机制可能与其抗脂质过氧化和保护线粒体的作用有关。田京伟等[35]通过实验研究发现, 20 (S) -人参皂苷Rg3对缺血脑细胞线粒体的损伤有明显的保护作用, 可能是该药发挥其抗缺血性脑损伤的作用机制之一。

7 结语与展望

分子中药学 篇6

近年来分子生物学的发展突飞猛进,特别是聚合酶链式反应(PCR)技术的问世,推动分子生物学的各个领域向纵深发展[1]。基于PCR技术的现代分子生物学操作在中药鉴定中得到应用,以其独具的准确性和可靠性,弥补了传统中药鉴定中的许多不足,展现出其他方法难以比拟的优势。

本文以PCR技术为切入点,着重介绍目前在中药鉴定中运用较多的几种分子生物学操作技术,希望能够抛砖引玉,合众人之力增加中药鉴定中的现代元素,推动中药鉴定方法的改进与革新。

1 PCR技术概述

PCR技术由美国Karray等学者于1985年首创,并由美国Cetus公司开发研制。PCR技术原理是根据已知DNA片段序列,人工合成与该DNA两条链末端互补的寡核苷酸引物,在酶促作用下将待检DNA序列进行体外扩增。

PCR反应体系基本成分包括模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的体内复制过程,PCR反应的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:(1)变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,双链DNA解离为单链;(2)退火:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;(3)延伸:DNA模板与引物的结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对原则,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复上述反应步骤,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。如此循环往复,在短短的几个小时的时间里,模版DNA链便可被扩增几百万倍。

PCR技术使人们能够在体外进行DNA的复制,它的意义在于DNA是遗传密码的载体,具有相对的遗传稳定性,每种生物都有其固定的遗传密码。只要得到某种物质的微量细胞并将其细胞内的遗传物质提取出来,再通过PCR技术将其扩增,就会准确无误地判断该物质,进而判断该物种。PCR技术以其独具的可靠性和准确性,在中药材基原鉴定和真伪鉴别方面拥有广阔的应用空间。

2 基于PCR技术的现代分子生物学技术

PCR技术是现代分子生物学的基石,该项技术的问世具有划时代的意义。以PCR技术为基础,分子生物学领域衍生出多种新的实验操作技术,在生命科学的各个领域均得到广泛的应用。本文仅对应用于中药鉴定过程的几种操作技术进行介绍。

2.1 RAPD技术

RAPD即随机扩增多态性DNA,该技术建立在PCR技术基础之上,可对整个未知序列的基因进行多态性分析操作。RAPD技术以基因组DNA为模板,以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物,在热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)作用下,进行PCR扩增。扩增产物经电泳、染色后,在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。

目前,RAPD技术已应用于中药材的种质鉴定及伪品鉴别等方面。徐鹏等[2]运用RAPD技术对广西钩藤属药用植物进行遗传多态性分析,获得多态性条带231条,多态率达到88.9%。结果表明,3种广西钩藤属药用植物的聚类结果与其地理分布一致,所得RAPD标记可用于钩藤属药用植物的多态性研究;李雄英等[3]运用RAPD技术对绞股蓝及其伪品进行DNA指纹图谱的鉴别研究,实验结果证实该技术可有效地鉴别绞股蓝及其伪品乌蔹莓。

2.2 ISSR-PCR技术

简单序列重复区间(inter-simple sequence repeats,IS-SR)是近年来发展起来的一类新型的分子标记技术,具有多态性高和重复性好等优点,已广泛用于药用植物的鉴定和遗传多样性研究[4]。柴素芬等[5]以象头山芸香科植物为研究对象,从DNA提取、退火温度、循环次数、引物筛选等方面研究ISSR反应及优化条件,建立和优化芸香科药用植物的ISSR反应体系。结果表明,ISSR技术适合于芸香科药用植物的品种鉴定,同时可为芸香科药用植物的资源评价提供依据。

2.3 PCR扩增的特定片段的限制性位点分析

限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)利用放射性标记的探针,通过杂交显示特定的基因组DNA酶切片段,从而构建多态性的DNA图谱。它代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。

PCR-RFLP技术综合RFLP技术与PCR技术二者的优势,用特异性的引物先对模板DNA进行扩增,获得特异性的扩增产物,之后利用多种不同的限制性内切酶对扩增产物进行酶解,构建物理图谱,分析限制性位点在分类群中的差异。该方法准确可靠,重复性好,在中药鉴定研究中有一定的应用报道。吴平等[6]从5种海马干标本中提取DNA,利用PCR技术扩增12SrRNA和细胞色素b基因片段,对扩增产物进行RFLP分析。实验结果证实,采用PCR-RFLP技术可鉴别出其中的两种海马。

2.4 mRNA差异显示技术

mRNA差异显示技术通过将总RNA反转录成单链cDNA,然后进行PCR扩增,由此分离出不同分子大小的DNA,选择有差异表达的基因进行序列分析。该技术具有快速、多功能、所需RNA量少和重复性高等优点而被广泛用于分离克隆真核生物差异表达的基因[7]。目前,该技术在药学领域中的应用仅处于起步状态,借助该技术可以将栽培品种与野生种、道地药材与普通药材之间的差异鉴别出来。因此,mRNA差异显示技术在中药材的质量鉴定方面将拥有广阔的应用空间。

2.5 基因测序

基因测序是对药材特定的基因片段进行精确的DNA序列分析,并加以比较,从而达到鉴别药材的目的。常用的基因片段包括线粒体细胞色素基因和rRNA基因等。用于基因测序的基因在种内高度保守,而在种间序列的差异较大,适用于中药材种间的鉴定。

徐丽等[8]从冬虫夏草与其他品系虫草及其混淆品虫草中提取DNA,对核糖体基因(rDNA)进行测序,设计18S基因特异性引物进行扩增,扩增产物经纯化后,直接测序。结果表明,冬虫夏草与西藏白草、西藏黑草、无头草、默勒草的18 S序列相似度为100%;与亚香棒、北虫草的18S序列相似度分别为91.37%和91.74%。由此可见,18S序列可有效地鉴别冬虫夏草及其混淆品北虫草和亚香棒虫草。此外,基因测序技术也被报道应用于三七[9]及其伪品的遗传背景差异分析、巴戟天[10]道地性研究及半夏[11]的基原鉴别。

2.6 基因芯片

基因芯片又称DNA芯片,是专门用于核酸检测的生物芯片。基因芯片的主要技术流程为:芯片的制备→样品的制备→杂交反应→芯片信号的检测与分析→芯片数据的统计分析和生物学分析。即在固相载体上按照特定的排列方式固定大量序列已知的DNA片段,将样品基因组DNA或RNA经过PCR或RT-PCR扩增等技术掺入标记分子后,与已知序列杂交,通过荧光检测系统对芯片进行扫描,检测杂交信号强度,利用计算机软件进行数据分析后,即可获得样品中大量的基因序列特征或基因表达特征信息。基因芯片技术可为植物种属的验证与质量控制提供一种快速、高质量的检测工具。杨忠等[12]利用基因芯片技术对多种贝母根茎的基因组DNA进行操作,结果显示不同贝母种属可在芯片不同位置检测到荧光信号,从而提供了一种快速高效的集基因分型与中药鉴别于一体的方法。

3 展望

与传统的中药鉴别方法相比,基于PCR技术的分子生物学鉴定技术具有准确性高、重现性好、稳定、可靠的优点。利用现代化分析技术可准确鉴别中药的真伪,从而完善中药质量评价体系,保证中药安全、有效、可控。目前,最重要的是要充分了解各项技术的优势,以便取长补短、综合利用,满足市场对药材准确鉴定的需求。

摘要：全文着重介绍了以聚合酶链式反应(PCR)技术为支撑的现代分子生物学技术,包括随机扩增多态性DNA(RAPD)技术、ISSR-PCR技术、PCR-RFLP技术、mRNA差异显示技术、基因测序技术及基因芯片技术在中药鉴定中的应用,指出现代分子生物学技术的蓬勃兴起将极大地推动中药鉴定的发展。

分子中药学 篇7

关键词：结合杆菌,分子表达,中药筛选

结核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病, 据世界卫生组织的调查, 我国结核病患者的人数位居世界第二位, 结核病已经成为了我国重点控制的重大疾病之一。由于结核菌在进入到人体以后会被细胞吞噬, 长期的存在就引发了人体免疫力低下的症状, 如果得不到及时的治疗会严重的影响病人未来生活的质量。为了对结核杆菌有一个良好的治疗措施, 医学界在抗结核杆菌的有效中药中进行了大量的研究实验, 筛选了部分重要的中药材应用在抗结核杆菌的治疗中。

1 抗结核杆菌有效中药的筛选

1.1 相关资料

在抗结核杆菌有效中药的筛选中, 本文选择了5种对结核杆菌有治疗作用的药用植物, 其采集地区、学名、药用功能如表1所示[1]。筛选过程中, 标准菌株H37Rv (人型结核分枝杆菌) 来自于中国药物生物制品研究所, 采用的试剂为Middlebrook7H9肉汤、葡萄糖、牛血清白蛋白;药品INH在去离子水中准备、RMP在DMSO中准备, 10%的OADA配置药品的成分如下所示:H2O为375mL、NaCl为4.25g、GS为10g、BSA为25g、Oleic acid为0.3m L。

药品试剂在搅拌至完全溶解的情况下, 将其体积调至到500mL, 然后采用0.22um的无菌过滤器过滤, 放置在40C保存。同时, 植物提取的初始浓度为20mg/mL的水提贮存液在蒸馏水中准备, 初始浓度为20mg/mL的植物乙醇提取贮存液在二甲亚砜中准备, 所有的贮存液在零下700C中保存至今使用。一般情况下, 在对植物提取物贮存液在Middlebrook7H9肉汤中稀释的最大期望值, 是最终检测浓度的4倍[2]。见表1。

1.2 筛选方法

1.2.1 筛选前的准备

在筛选前, 实验菌株TM07和H37Rv在Middlebrook7H9肉汤附加10%OADC和0.2%glycerol在370C的温度下培养, 一直到对数生长期, 而每种培养物和足够体积灭菌所添加的Middlebrook7H9肉汤混合, 为了得到检测所需要使用的菌液, 在使用前应该及时的将这种菌悬液, 同时用同样的Middlebrook7H9肉汤进一步的1∶20稀释[3]。

1.2.2 提取操作过程

筛选的过程需要在96孔平底细胞培养板中实施, 而不同的提取物在每个板中所检测的次数不可以低于3次。在操作的过程中加200mL的蒸馏水到微板的外围空中, 所有孔都增补100mL的Middlebrook7H9肉汤, 然后在讲提取物注入到每排的第一个孔中, 对其进行二次稀释, 在每孔的最终浓度为1%v/V时, 准备1:100和10:100的菌悬液稀释对照。平板在处于370C的温度下会再次的孵育24h, 在这种情况下如果燃料的颜色变成粉红色, 就说明菌体是处于生长的状态, 然后再将燃料加入到平板的所有剩余孔中, 与第二天对结果进行读取, 最低抑菌浓度的定义为阻止颜色变为粉红色的最低提取浓度[4]。

结果显示, 五种植物在乙醇提取物和水提取物对结核分枝杆菌的抗菌性都<200g/mL。

2 蛇床子对结核杆菌分子表达的影响

2.1 相关资料

在蛇床子对结核杆菌分子表达影响实验操作中, 其选择的菌株为人型结核分枝杆菌标准株H37Rv, 蛇床子来自于Sigma公司, 选择的试剂主要有乙醇、NaCl、三氯甲烷等化学试剂。试剂的配制有3种方法:0.1%DEPC水的配制;10*甲醛变性胶缓冲液的配置;5*上样缓冲液的配制。在通过这3种方法配置完毕后, 分别装置在1.5mL的离心管中, 保存的温度为4℃, 剩余零下20℃保存[5]。

2.2 操作方法

在蛇床子对结核杆菌分子表达影响实验操作中, 主要有基因芯片的制备、利用Agilent表达谱芯片研究蛇床子对H37Rv的分子作用机制和菌液样品制备以及总RNA的提取和纯化。

已经复苏的菌种接种到600mL7H9培养基中, 在此基础上与37℃的温度下培养1周, 代细菌增殖到对数生长期时, 以7H9培养基稀释, 同时将菌液的温度调整到OD值为0.2～0.3的范围内, 分别加入蛇床子, 然后在加药后放置在370C的温度条件下震荡培养4h, 离线收集各种菌体。

2.2.3 总RNA的提取和纯化

对于总RNA的提取使用TRIzol Max Bacterial RNAIsolationKit, 用RNasey MiniKit进行RNA的纯化和质检, m RNA样品的线性扩增及标记过程, 在这一系列的过程中发现, 总RNA的浓度和总量如表2所示。

3 总结

从本文实验研究中可以看出, 这五种植物在治疗结核杆菌中有着良好的效果, 但是乙醇提取物所表现出的抗结核性是高于水提取物抗结核性的。但是从这些实验中也可以看出, 传统中草药对于治疗普通感染的重要来源之一, 在此实验中这五种植物对于治疗结核杆菌有着良好的效果, 但是从实验中也看出, 被提取的植物在抗分枝杆菌活性上的表现不是十分的明显, 这可能和重要在治疗除肺结核外的感冒和咳嗽有关[6]。

从上述实验中也发现, 蛇床子可以有效的抑制蛋白质的修饰和修复相关的功能基因的表达, 其主要是通过干扰细菌蛋白质合成来实现杀菌的作用, 临床实验中表明蛇床子是不易产生耐药性的, 这为抗结核药的开发和基因的确定提供了一定的研究基础。总的来说, 在抗结核杆菌的治疗中中药和蛇床子的配合质量对结核杆菌的治疗作用还是非常明显的, 在临床中可以大力的推广和应用。

参考文献

[1]唐神结, 肖和平.利奈唑胺抗结核作用的研究及其最新进展[J].中华临床医师杂志 (电子版) , 2010, 4 (1) :243-246.

[2]严懿嘉, 朱建国, 华修国.基因分型技术在牛结核病的分子流行病学研究中的应用[J].中国人兽共患病学报, 2009, 22 (4) :187-189.

[3]韩晖, 叶临湘.结核分枝杆菌流行病学研究中基因分型的方法[J].中国社会医学杂志, 2010, 27 (4) :167.

[4]向敏, 刘娟.耐药性结核分枝杆菌的分子生物学检测方法研究进展[J].抗感染药学, 2009, 4 (1) :142-144.

[5]宋文刚, 孙玉芹, 刘立峰等.中药抗结核分支杆菌研究[J].北华大学学报 (自然科学版) , 2011, 8 (2) :89-91.