生物相容性评价

生物相容性评价（共8篇）

生物相容性评价 篇1

摘要：细胞生物相容性评价是生物材料临床应用前必须检测的项目, 目前的评价方法主要以细胞毒性试验法为主, 国内外标准就细胞毒性试验已有具体的试验原则和试验方法。随着现代细胞生物学和分子生物学技术的进步, 细胞毒性评价出现了一些国内外标准尚未收录的新的评价指标和评价方法, 本文主要综合常用的评价指标和评价方法及其发展现状作一综述。

关键词：细胞生物相容性,试验方法,毒性机制

0.引言

细胞生物相容性评价是生物材料生物相容性评价的一项重要内容, 细胞毒性试验作为检测生物材料毒性的手段, 具有简便、敏感性高、节省动物、节约经费、缩短生物材料研究周期等优点, 已被广泛应用于生物相容性评价。以往对生物材料的细胞生物相容性的评价往往只着眼于细胞的形态与数量的变化, 随后发展到对细胞生长、附着、增殖及代谢方面的影响, 并提出了以有活力的细胞数和细胞增殖能力作为评价生物材料细胞生物相容性的观点。20世纪90年代初, 有学者提出并确定了对生物材料进行分子水平生物相容性研究的设想, 借助分子生物学手段从分子水平研究生物材料对细胞行为的影响, 进而阐明生物材料对细胞作用的机制[1]。

细胞毒性试验是生物材料细胞生物相容性评价最常用的方法, 细胞毒性评价方法种类繁多, GB/T16886标准中按照材料与细胞的接触方式, 分为浸提液法 (主要是MTT试验法) 、直接接触法、分子滤过法和琼脂覆盖法。另有按照不同的生物学终点即不同评价指标进行分类的方法, 如细胞形态学、细胞膜效应、细胞代谢活性、细胞增殖率等评价方法。近几年也不断涌现出新的细胞毒性试验评价方法, 如细胞周期、细胞凋亡和细胞增殖相关蛋白检测等。不同生物材料的细胞毒性机制往往不同, 选择多生物学终点评价方法可以初步探讨材料细胞毒性的机制, 同时综合运用近几年发展迅速的分子生物学方法可以更进一步明确材料的毒性机理。本文主要就常用的评价指标和评价方法及应用进展作一综述, 可为研究者在细胞生物相容性的方法选择上提供参考。

2. 传统的多生物学终点细胞毒性评价方法

2.1 细胞形态学评价

一种发展最早的定性细胞损伤检测方法, 材料导致细胞损伤从而发生形态学的改变, 通过显微镜下观察到变圆或裂解细胞所占的百分比来估算细胞毒性级别。目测细胞毒性试验方无法定量细胞毒性大小, 但2008年Sujata[2]等对显微镜下观察细胞形态毒性的定性判定方法与MTT法等定量细胞毒性判定法进行了比较, 研究得出Pearson相关系数为0.9, 说明二者具有良好的相关性。此外, 由于该方法可直观地观察到材料细胞毒性的大小, 所以目前仍被广泛用于生物材料细胞毒性的评价。

2.2 细胞膜效应评价

(1) 中性红摄取试验 (neutral red uptake, NRU)

检测原理是未受损的细胞可摄取中性红染料并将其蓄积在溶酶体内, 用中性红染液洗脱剂 (乙醇或乙酸) 溶解中性红, 并通过酶标仪检测定量中性红, 活细胞摄入中性红的水平与活细胞的数量成正比。Borenfreund等[3]根据这一特性建立了中性摄取试验法, 并对几种金属材料的细胞毒性进行了评价, 认为中性红摄取试验是细胞毒评价的快速评价方法。国际标准ISO 10993-5:2009已收录该检测方法及具体的操作步骤。 (2) 乳酸脱氢酶释放法 (LDH释放法)

乳酸脱氢酶 (LDH) 是一种细胞胞浆内酶, 正常时仅存在于细胞内, 当细胞受到损伤裂解时即释放到细胞外, 所以培养液中该酶活性与被裂解的细胞数量成正比。LDH释放法只需测定培养后上清液的LDH活性, 操作简单, 客观性好并克服了形态学法的主要缺点。此外, 由于LDH是一种糖醇解酶, 广泛存在于各种细胞中, 这种酶仅在靶细胞变性时释放出胞外, 易检测, 无标记过程, 不存在防护问题, 自发释放率也小[5]。Issa等[6]采用MTT法和LDH释放法检测松香复合物 (resin composite monomers) 释放出的单体的毒性大小, 结果表明LDH释放法较MTT法敏感, 但二者均呈现了相似的细胞毒性等级。

2.3 细胞代谢活性评价

目前, 以线粒体琥珀酸脱氢酶作为生物学终点的评价方法应用最广泛。线粒体病变被认为是表示细胞受损伤最灵敏的指征之一, 所以可以十分灵敏地反映出材料对细胞造成的毒性损害程度。

(1) MTT试验

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 (Formazan) 并沉积在细胞中, 而死细胞无此功能。该试验过程简便, 自动化程度高, 无需复杂、昂贵的仪器, 已是目前应用最广泛的细胞毒性评价方法之一。但是在测定过程中产生不溶于水的结晶产物, 需要用DMSO溶解后才能测定光吸收值, 若结晶物溶解不完全, 会影响测定结果, 所以MTT试验法重复性略差。

(2) XTT试验

在MTT试验法的基础上发展了XTT试验法。XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物, 为线粒体脱氢酶的作用底物, 可被活细胞还原形成水溶性的棕黄色的甲臜产物, 与电子耦合剂如硫酸酚嗪甲酯 (PMS) 共同使用形成甲臜产物, 该甲臜属于水溶性产物, 其生成量与活细胞数量成正相关。Scudiero等[7]首次采用XTT体外细胞增殖和药敏检测, 所得出的细胞生长曲线与MTT法检测结果相似。Roehm等[8]的实验结果显示XTT法产生的甲臜多于MTT法, 且实验时间短、步骤简便, 认为XTT比色法优于MTT法。XTT已广泛用于生物材料的相容性评价[9,10]。此外, 与XTT类似的四唑氮衍生物还有MTS、WST-1, 它们经活细胞线粒体脱氢酶转化亦形成水溶性有色物质, 可直接进行比色, 从而减少了实验操作误差。由于该法较MTT法具有明显的优点, 已被纳入国际标准ISO 10993-5:2009中, 但实验成本较MTT法高。

2.4 细胞增殖率评价

观察材料或材料浸提液与细胞接触后细胞

2.5 DNA合成率检测

通过直接测定进行有丝分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力, 主要有5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (Brdu) 渗入法和胸腺嘧啶核苷 (3H-Td R) 渗入法, 3H-Td R渗入法因同位素3H具有放射性污染、操作复杂等缺点, 没有得到广泛的应用。5-溴脱氧核苷尿嘧啶为胸腺嘧啶的衍生物, 在DNA合成期 (S期) 可代替胸腺嘧啶而被摄入合成DNA, 测定结合了荧光燃料的抗Brd U单克隆抗体得出Brdu的摄入量, 通过流式细胞仪或细胞酶联反应测定带有标记DNA的细胞所占比率, 可以反映与材料接触后的细胞的增殖能力。Dekker[13]等对MTT法、蛋白质含量检测法及5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (Brdu) 渗入法三种定量检测方法进行比较, 结果发现虽然5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (Brdu) 渗入法是最敏感的方法, 但重复性略差。

3. 细胞毒性评价方法的补充

3.1 细胞周期的检测

生长速度和增殖率的改变, 主要有克隆形成试验。克隆形成试验是检测与生物材料作用后的细胞的克隆形成能力, 用克隆形成率 (实验组的克隆数/对照组克隆数) 评价材料的细胞毒性, 最早由Tuchiya[16]等研究者提出。Kotoura等[12]在1985年用克隆形成试验法对两种金属 (钛和镍) 、两种陶瓷 (氧化铝陶瓷和磷酸钙) 及两种聚合物 (高密度聚乙烯和聚氯乙烯) 进行了细胞毒评价, 结果发现克隆形成试验可以用于毒性材料的筛选。Tuchiya等[11]选用分子滤过法、琼脂覆盖法、中性红摄取法和克隆形成试验 (包括直接接触法和浸提液法) 对两参照样品 (ZDEC-PU和ZDBC-PU) 的毒性进行了检测, 结果发现克隆形成试验 (直接接触法) 较其他几种方法敏感, 并能检测出微弱的细胞毒性。由于该方法的敏感性高, 已收录在国际标准ISO 10993-5:2009中。

近些年通过检测细胞周期来评价生物材料细胞毒性的研究报道日趋增多。细胞周期检测需借助流式细胞仪技术 (FCM) , 其利用鞘流原理, 使被荧光标记的单个悬浮细胞排成单列, 按重力方向流动。细胞被激光照射后发射荧光, 检测器可逐个对细胞的荧光强度进行测定, FCM对细胞测定能力是30万~60万个细胞/分钟, 同时可对细胞的核酸、蛋白质、酶、细胞周期分布等多种参数进行测定。该技术在材料的生物相容性评价中已有着广泛的应用价值。1998年, MA[14]等用流式细胞仪技术评价羟基磷灰石 (HA) 复合材料的生物相容性, 发现细胞形态学观察法未观察到细胞毒性, 但FCM分析得出HA的组成成分会影响细胞周期。戴建国[25]等人用流式细胞仪检测羟基磷灰石浸提液对L929细胞生长周期及凋亡的影响, 进而评价其生物相容性, 并期望探讨将细胞周期检测作为生物材料细胞生物相容性的重要补充。Reza等[16]提出FCM可以作为牙科材料理想且实用的细胞毒性评价方法。Zhang等[17]采用了MTT法、FCM和RT-PCR三种方法对五种口腔修复材料进行了细胞毒评价, 结果显示FCM和RT-PCR两种方法更加敏感, 并建议作为传统细胞毒评价方法的重要补充。

3.2 细胞增殖相关蛋白检测

Ki-67是一种与细胞周期相关的增殖细胞核抗原, Ki-67表达于所有的增殖细胞的细胞核内, 是检测细胞增殖的标志性核抗原。Ki-67表达于细胞周期的G1、S1和G2期而在G0期无表达, 2000年klein等[18]对将Ki-67蛋白含量作为细胞增殖评价方法进行了研究, 并与传统的细胞毒评价方法进行了对比, 他认为ELISA法检测Ki-67蛋白含量的方法是一种快速可靠、无放射污染的细胞增殖率评价的新方法, 并建议作为国际标准ISO 10993-5细胞毒性评价的补充方法。

3.3热休克蛋白检测

热休克蛋白含量检测是含汞牙科材料细胞毒性研究的一种评价方法。热休克蛋白 (heat shock protein, HSP) 与细胞间反应密切相关, 是细胞反应的一个标志性分子, 也是公认的在多种生物过程中起作用的重要蛋白质[19]。细胞在受到外界刺激时, 热休克蛋白参与细胞自我保护和细胞损伤的修复。Oshima等1997年提出热休克蛋白的检测可以作为牙科材料细胞毒评价新方法的可能性[20], 随后他又采用热休克蛋白 (HSP70) m RNA含量检测法对含汞牙科材料进行了毒性评价, 提出热休克蛋白 (HSP70) 含量检测可以作为含汞牙科材料的细胞毒评价方法, 且较传统的中性红比色法敏感[21]。

4.细胞毒性机制研究及其研究方法

事实上如果生物材料对机体的影响已经在整体水平和细胞水平上表现出来, 那么在分子水平的基因表达方面势必已经造成影响, 并且会极灵敏地反映出来。所以借助分子生物学等研究方法可以从分子水平上了解材料与细胞相互作用的机制。目前常用的研究方法包括流式细胞仪技术、细胞原位杂交法、逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 和DNA微阵列技术等。如Gu等[22]对丝素纤维与外周神经组织的体外生物相容性进行了研究, MTT法评价丝素纤维对细胞活力的改变, 流式

细胞仪技术评估细胞的增殖能力, RT-PCR法检测丝素纤维对雪旺氏细胞神经生长因子 (NGF) 和脑源性神经营养因子 (BDNF) m RNA的含量, 综合评价出丝素纤维与外周神经组织的体外生物相容性良好。宁丽等[23]采用细胞原位杂交试验观察医用硅橡胶对体外原代培养的成骨细胞骨桥蛋白 (osteopontin) 的m RNA基因表达的影响, 结果显示无毒性的硅橡胶不影响成骨细胞骨桥蛋白m RNA基因表达, 有细胞毒性的硅橡胶则抑制骨桥蛋白m RNA在成骨细胞中的表达。吕晓迎等[24]采用MTT法和基因表达图谱分析法对镍离子细胞毒性及毒性机制进行了研究。章非敏等[25]着重研究口腔材料生物相容性评价的新方法, 利用流式细胞仪技术和RT-PCR法对5种牙体修复材

5.结语

综上所述, 评价生物材料的体外细胞生物相容性试验方法较多, 亦各有其特点。各试验方法之间虽然存在一定的相关性, 但是很难达到完全一致性。众多研究表明, 不同细胞毒性评价方法对不同生物材料的敏感程度不同, 原因可能在于不同的化学物质其毒理作用机制不同, 而立足于不同生物学终点的评价方法显示出了不同的敏感度。2005年Weyermann等[26]对MTT法、LDH法和NUR试验三种试验方法进行了比较, 并研究其毒性机制, 结果发现LDH试验对于细胞膜料的细胞毒性和毒性机理进行了初步的探讨。综合以上研究, 生物材料细胞毒性机制层面的研究, 为从分子水平上评价材料的生物相容性提供了实验依据, 也是常规细胞毒性评价的重要补充。

完整性的破坏较敏感, 而对于影响细胞内活动的一些毒性物质反应不敏感;MTT试验法主要对影响线粒体酶活性的毒性反应敏感, 对于溶酶体破坏相关的细胞毒性, NUR检测灵敏度较高。因此在选择试验方法时, 必须根据“最接近应用状况”的原则, 合理地选择样品与细胞的接触方式和检测生物学终点的评价指标或评价方法。综合运用分子水平评价方法, 阐明材料对细胞的作用机制, 全面地评价生物材料对细胞的毒性作用, 将是生物材料细胞生物相容性评价的发展方向。

生物相容性评价 篇2

1目的

本程序规定了实验室常规操作人员以常规检测相同的方式对实验室质量考评的样品检测和判定的基本要求，并全面分析考评结果和实验室差距，以改进和完善实验操作与管理，确保常规实验结果的准确性。

2适用范围

适用于规定检测项目的实验室质量考评。3职责

3.1检测岗位人员负责所检测项目的实验室质量考评操作。

3.2实验室负责人负责分析考评结果和实验室差距，制定和实施改进计划。4工作程序

4.1参加卫生部临检中心组织的输血相容性检测实验室质量考评活动。4.2制定实验室质量考评活动时间表，确保质量考评按期完成。4.3以常规检测相同的方法对质量考评的样品进行检测和判定。4.4根据标本接收时间随机指定检测岗位人员进行检测。

4.5接收实验室质量考评标本品时，要核对外包装是否完好，是否在规定时间内到达，标识是否清楚，标本量是否足够，与清单上列出的是否一致，有无漏渗及发货时间是否准时等异常情况，并按说明书要求保存。

4.6严格按说明书规定的时间和频次进行检测。

4.7实验操作岗位人员须将质控品与其它标本按标准操作规程常规操作、结果分析、判定、审核及报告。

4.8实验完成后对质控品的检测数据进行汇总，填写《输血相容性检测室间质量评价结果回报单》。

4.9结果报告给实验室负责人审核签发后，按规定时间发出。

4.10保留对质量考评样品检测的原始记录，以备与质量考评考核部门反馈结果进行核对和查找差距原因。

4.11接到质量考评结果反馈报告，应对结果进行比对、分析，查找差距产生的原因，制定改进计划和措施，并评价相应改进措施的成效。

4.12对于室间质评不合格的检测项目实验室负责人应组织实验室人员在1~3天内找出不合格的原因，常见原因如下：

4.12.1检测仪器未被校准及有效维护。4.12.2未做室内质控或室内质控失控。4.12.3试剂质量不稳定。

4.12.4操作人员的能力不能满足要求。4.12.5操作人员未按照SOP进行实验操作。4.12.6上报的检测结果计算或抄写错误。4.12.7 EQA样品处理不当。4.12.8 EQA样品存在质量问题。

4.13实验室负责人填写《输血相容性检测室间质评不合格分析报告单》，提出具体整改意见，得到科主任认可、批准后向全科通报，在下次室间质评中实施，并追踪评价改进效果。

4.14将室间质评回报结果、整改分析报告等相关资料归档，由科室统一保存。5 相关文件

《血站实验室质量管理规范》卫医发[2006]183 6相关记录

生物相容性评价 篇3

凋亡因其可以从形态、分子、蛋白、基因等不同深度层次进行检测,从实验的精确性和重复性角度,显示了其优越性。本实验采用体外试验,利用L929细胞与金属合金浸提液直接接触,检测凋亡相关基因Caspase-3活性,探讨细胞凋亡与口腔材料生物相容性的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

小鼠成纤维细胞 L929 中国医大中心实验室惠赠

1.1.2 金属合金:

基本资料见表1

1.1.3 试剂和仪器

RPMI1640培养基(Gibco公司,美国),胎牛血清(华美生物工程公司),胰蛋白酶TRYPSiN 1:250(华美生物工程公司),磷酸盐缓冲液/PBS(0.01M PH 7.2～7.4)(福州迈新生物技术开发有限公司),活细胞/凋亡细胞/坏死细胞鉴别试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司),Caspase-3分光光度法检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司),Bradford蛋白含量检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司),细胞培养箱HERA Cell 150(Heraeus公司,德国),超净台 air tech(苏净集团安泰公司),高速离心机Sorvall super T 21(Sorvall公司,美国),水浴箱Grant OLS 200(Grant 公司,美国),倒置相差显微镜(Olympus公司,日本),荧光显微镜(Olympus公司,日本),紫外-可见光分光光度计(PYE-UNICAM/SPECTRONIC,英国),酶标仪(TECAN,瑞士)。

1.2 方法

1.2.1 材料试样及浸提液制备

制作半径5mm、厚1mm的圆形蜡片,根据不同合金的要求铸造形成圆形金属片,打磨抛光后超声清洗15min;去离子水冲洗数遍后置于玻璃小瓶中,将金属片于121℃高压灭菌后待用。无菌下将各金属圆片置于24孔板中,每孔加2mL含10%胎牛血清RPMI 1640培养液(同时设立阴性对照),在37℃、5%CO2 条件下连续浸提72h后待用。

1.2.2 实验分组

根据金属浸提液的不同将L929细胞分为阴性对照组、银钯合金组、钴铬合金组、镍铬合金组、2号合金组。分光光度法检测caspase-3表达。

1.2.3 分光光度法检测caspase-3表达

分别以5组浸提液培养对数生长期的L929细胞48h,按Caspase-3分光光度法检测试剂盒说明书操作,Braford法测定caspase-3蛋白浓度,用酶标仪在λ=405nm测定其吸光值。通过计算OD诱导剂/OD阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组caspase-3活化程度。

1.2.4 统计学分析

采用方差分析进行统计学分析,所有计量资料以均数±标准差表示,使用SPSS 13.0软件对结果进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各实验组48hOD值的平均值及caspase-3活化度

见表2。各组OD值的平均值均高于阴性对照组;计算各时间点内各金属合金OD值与阴性对照组OD值的倍数来确定各实验组caspase-3活化程度。

2.2 在4种金属浸提液作用下caspase-3活化情况

运用SPSS软件处理数据所得各实验组caspase-3活化度,见表3。不同金属浸提液作用L929细胞后,各实验组caspase-3活性明显不同,各实验组比较有显著性差异(P<0.01)。由图1可明显看出caspase-3活化度大小,由高到低:钴铬合金组>2号合金组>银钯合金组>镍铬合金组。

3 讨论

在离体研究中,口腔金属材料的溶出产物如Ni, Gr, Mo等显示出不同程度的细胞毒性[2,3,4],而由此引发的细胞死亡机制还未阐明。一般而言,细胞死亡有两种不同的模式:凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)[5]。战德松等在磁性附着体中铁素体不锈钢引起小鼠成纤维细胞L929的死亡模式中得出结论:金属材料引起细胞的死亡方式主要是凋亡,并具有浓度依赖型及时间依赖型特性[6]。有学者检测了Nitinol合金对鼠骨肉瘤细胞Ros-17死亡率和凋亡率的影响,结果表明细胞的死亡类型可能与材料的生物相容性有关[7]。

本实验采用4种齿科合金浸提液培养L929细胞,观察细胞坏死和凋亡情况,检测凋亡相关蛋白caspase-3的表达,分析金属离子诱导细胞凋亡情况。进而探讨细胞凋亡与口腔材料生物相容性的关联。

在细胞凋亡过程中caspases-3处于核心位置。Caspase3的激活可以认为是细胞凋亡的标志[8]。从表2中可见,各实验组caspase-3活化度大小的顺序:钴铬合金组>2号合金组>银钯合金组>镍铬合金组。运用SPSS软件处理数据所得各实验组caspase-3活化度,见表3。不同金属浸提液作用L929细胞后,各实验组caspase-3活性明显不同,各实验组比较有显著性差异(P<0.01)。由图1可明显看出caspase-3活化度大小,由高到低:钴铬合金组>2号合金组>银钯合金组>镍铬合金组。

在前期实验中,对小鼠无致畸作用,对染色体无致突变作用[9],MTT法检测,细胞毒性与对照组间无差异[10],表现出良好的生物相容性。本实验中2号合金caspase-3表达强度介于各对照组之间,与前期2号合金生物相容性实验结果吻合。caspase-3作为细胞经凋亡表达的关键因子,对其进行表达量的检测有助于我们更快捷有效的将细胞凋亡这一方法应用于口腔材料生物相容性的研究。

参考文献

[1]陈治清.口腔材料学[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2004:25-27.

[2]David A,Lober D.In vitro cytotoxicity of orthodontic archwires incortical cell cultures[J].Eur J Orthod,2004,26:421-426.

[3]Al-Hiyasat AS,Bashabsheh OM,Darmani H.An investigation ofthe cytotoxic effects of dental casting alloys[J].Int J Prosthodont,2003,16(1):8-12.

[4]Al-Hiyasat AS,Darmani H,Bashabsheh OM.Cytotoxicity ofdental casting alloys after conditioning in distilled water[J].Int JProthodont,2003,16(6):597-601.

[5]Majno G,Joris I.Apoptosis,oncosis,and necrosis.An overviewof cell death[J].Am J Pathol,1995,146(1):3-15.

[6]战德松,吕娇,赵奇,等.磁性附着体中铁素体不锈钢引起小鼠成纤维细胞L929的死亡模式[J].金属学报,2006,42(8):892-896.

[7]Kapanen A,Ilvesaro J,Danilov A,et al.Behaviour of nitinol inosteoblast-like ROS-17 cell cultures[J].Biomaterials,2002,23(3):645-650.

[8]XUJ,WEC,XUC,et al.Rifampic in protects PC12 cells againstMPP+induced apoptosis and inhibits the expression of analpha SyNucleinmultimer[J].BrainRes,2007,30(1139):220-225.

[9]洪岩松,贾迎杰,战德松.自制烤瓷合金的生物相容性评价[J].口腔医学,2008,28(11):561-563.

生物相容性评价 篇4

生物材料对于宿主来说是一种外源性物质, 不管是外科手术植入的器械, 还是用于再生医学的构成物、药物或基因送递的载体、辅助诊断或成像的介质。无论想达到什么目的, 这些生物材料都不应该在宿主或患者体内产生明显的临床不良反应, 因此要对生物材料进行生物安全性评价。

1 医疗器械产品进行生物相容性检测的意义

随着生物医学工程的发展, 医疗器械行业也在飞速的进步。许多新型的生物材料不断涌现并不断被应用于医疗器械的研发与应用中。一方面各种三类医疗器械产品的结构及组成成分越来越复杂, 特别是人体直接接触的外部接入器械及植入器械结构复杂、材质多样, 另一方面目前越来越多的一次性无菌医疗器械应用于临床, 在应用前必须是无菌包装, 稍有不慎就容易造成细菌内毒素及其他形式的污染, 因而这类产品的医疗风险越来越高。为了保证产品的安全有效, 一种新的生物材料在进入临床之前必须进行生物相容性的评价, 这就对生物材料的生物相容性评价提出了更高的要求。

2 医用高分子材料生物相容性研究现状

2.1 生物材料的分类

生产制造人工器官的材料有多种, 但它和普通的材料最大的不同处, 在于材料的生物相容性。只有能满足生物相容性要求的材料, 才有可能成为制造人工器官的材料, 人们通常称这类材料为生物医学材料 (biomedical material) 或生物材料 (biomaterial) 。

由于种类繁多、应用目的不同, 目前生物材料还没有统一的分类标准。当今广泛应用的生物材料分类, 主要有下列四种。 (1) 医用高分子材料 ( 高聚物) 。如热塑型、热固性、合成橡胶弹性体、合成纤维、粘合剂等。 (2) 天然高分子材料。如天然橡胶、多肽类、白蛋白、绢丝类等。 (3) 金属材料。如金属 (钛、铜、金、银、铂等) 和合金材料 (钛合金、不锈钢、镍铬合金等) 。 (4) 无机材料。如陶瓷、碳素、玻璃、石膏等。

2.2 医用高分子材料生物相容性研究现状

2.2.1 医用高分子材料分类

医用高分子材料作为生物材料的重要组成部分在我国研究起步较早, 发展较快, 现有医用高分子材料60 多种, 制品达400 余种, 用于医疗的聚甲基丙烯酸甲酯每年近300吨。然而, 我国医用高分子材料的研究目前仍然处于经验和半经验阶段, 还没有能够建立在分子设计的基础上。

现代医学的进步已经越来越依赖于生物材料的发展, 医用高分子材料作为其重要组成部分应用更加广泛, 需求量也随之越来越大。按照医学用途, 主要可分为: (1) 一次性使用的医用高分子材料。如输注器械、血袋、各种导管及插管、采血管、高分子绷带等。 (2) 植入、介入类材料。如人工血管、人工心脏瓣膜、人工晶体、人工关节、人工肾、人工肺、中心静脉导管等。 (3) 用于人体组织修复材料。如人工皮肤、疝修补片等。 (4) 药物和药物控释用高分子材料。如载药支架等。 (5) 医药包装用高分子材料。如预灌封注射器、药用胶囊、大输液瓶等。

2.2.2 我国医用高分子材料技术水平

主要体现在以下几个方面。 (1) 用于人造器官, 如心脏瓣膜、人工肾、人造皮肤、疝气朴片等。我国在此领域起步较晚, 但在初级的组织工程支架材料方面投入较大, 浙江大学、清华大学、中科院成都有机所等均有课题小组进行相关研究, 他们通过多层复合、共聚等手段将聚乳酸、聚乙内酯、海藻酸钠等生物相容性材料制备成支架材料。 (2) 用于医疗器械, 如手术缝线、导尿管、检查器械、植入器械等。目前的手术缝线多数来自于丝素蛋白, 其纤维不但具有优良的生物相客性, 也具有很好的力学强度;而可吸收缝线则主要采用聚乳酸, 我国目前已经可以完全自主生产这几种缝线, 同时在国内拥有较大的市场份额。 (3) 用于药物助剂, 如药物控释载体、靶向材料等。我国在这方面的研发位于世界前列, 中科院长春应化所研究人员利用静电纺丝技术制备的聚乳酸超细纤维可以包埋油溶、水溶药物, 同时实现控制释放[1]。

2.2.3医用高分子材料的生物相容性评价研究

材料的生物相容性包含很多方面 (图1) 。

目前国际上通用的高分子材料安全评价项目有:细胞毒性试验, 皮肤刺激试验, 全身急性毒性试验, 亚急性毒性试验, 慢性毒性试验, 皮内试验, 热原试验, 长期植入试验, 黏膜刺激试验, 组织细胞的黏附性和增殖性试验等。其中细胞毒性试验以其简便、快捷、灵敏性高、节省动物等优点均被列为首选试验项目, 作为评价材料毒性的重要指标。评价生物材料的体外细胞生物相容性试验方法较多, 亦各有其特点。各试验方法之间虽然存在一定的相关性, 但是很难达到完全一致性。研究表明, 不同细胞毒性评价方法对不同生物材料的敏感程度不同, 原因可能在于不同的化学物质其毒理作用机制不同, 而立足于不同生物学终点的评价方法显示出了不同的敏感度。2005年Weyermann等对噻唑蓝比色法 (MTT法) 、乳酸脱氢酶释放法 (LDH法) 和中性红摄取试验 (NUR试验) 三种试验方法进行了比较, 并研究其毒性机制, 结果发现LDH试验对于细胞膜完整性的破坏较敏感, 而对于影响细胞内活动的一些毒性物质反应不敏感;MTT试验法主要对影响线粒体酶活性的毒性反应敏感, 对于溶酶体破坏相关的细胞毒性, NUR检测灵敏度较高。因此在选择试验方法时, 必须根据“最接近应用状况”的原则, 合理地选择样品与细胞的接触方式和检测生物学终点的评价指标或评价方法。综合运用分子水平评价方法, 阐明材料对细胞的作用机制, 全面地评价生物材料对细胞的毒性作用, 将是生物材料细胞生物相容性评价的发展方向[2]。

2.2.4 新型医用高分子材料在医疗器械方面的应用

常用的医用高分子材料包括用于植入人体的高分子材料包括人造器官如人工心脏、人工血管等和用于治疗的高分子材料包括牙科、眼科、美容材料以及外用治疗的高分子材料[3]。随着对生物材料的生物相容性的研究逐渐深入, 越来越多的新型生物材料进入了大家的视野。

在有机高分子材料方面, 水凝胶作为在水中既能溶胀而又不溶于水的一类亲水性高分子材料, 它含水量高, 柔软性好, 对小分子渗透能力强, 因此对周围组织的整合性好, 比其他类型的合成材料更宜用作生物医用材料使用。聚乙烯醇是自然界中唯一的水溶性高分子聚合物, 其亲水性好、来源丰富、价格低廉。通过物理、化学、辐照等方式可将聚乙烯醇交联制成具有优良吸水溶胀性、生物降解性和稳定性的水凝胶材料, 在软骨、角膜、髓核、皮肤等组织的移植替换和修复重建中具有广阔的应用前景[4]。另外, 生物材料的血液相容性是指生物材料表面抑制血管内血液形成血栓的能力和生物材料对血液的溶血现象、血小板功能降低、白细胞暂时性减少、功能下降以及补体激活等血液生理功能的影响。有文章研究显示聚酯类抗凝血生物材料和钛类抗凝血生物材料溶血率低, 血小板黏附少, 纤维蛋白原吸附少, 动态凝血时间和复钙时间均延长, 具有良好的血液相容性, 是目前较为理想的抗凝血生物材料[5]。

综上所述, 生物材料其未来发展可概括为四个方面:一是生物可降解高分子材料的应用前景更加广阔, 医用可生物降解高分子材料因其具有良好的生物降解性和生物相容性而受到高度重视, 无论是作为缓释药物还是作为促进组织生长的骨架材料, 都将得到巨大的发展;二是复制具有人体各部天然组织的物理力学性质和生物学性质的生物医用材料, 达到高分子的生物功能化和生物智能化, 是医用高分子材料发展的重要方向。三是人工代用器官在材料本体及表面结构的有序化、复合化方面将取得长足进步, 以达到与人体相似的结构和功能, 其生物相容性也将明显提高。四是药用高分子和医药包装用高分子材料的应用将会继续扩大。

3 无源医疗器械材料生物性研究的现状及展望

3.1 目前无源医疗器械的种类

医疗器械, 是指直接或者间接用于人体的仪器、设备、器具、体外诊断试剂及校准物、材料以及其他类似或者相关的物品, 包括所需要的计算机软件;其效用主要通过物理等方式获得, 不是通过药理学、免疫学或者代谢的方式获得, 或者虽然有这些方式参与但是只起辅助作用;其目的是: (1) 疾病的诊断、预防、监护、治疗或者缓解; (2) 损伤的诊断、监护、治疗、缓解或者功能补偿; (3) 生理结构或者生理过程的检验、替代、调节或者支持; (4) 生命的支持或者维持; (5) 妊娠控制; (6) 通过对来自人体的样本进行检查, 为医疗或者诊断目的提供信息[6]。

医疗器械相对于药品而言, 种类更为繁多, 成分更为复杂, 既包括人工合成的高分子材料、又包括天然高分子材料、无机材料、金属材料和动物源性组织工程材料等。医疗器械的根据其结构特征分为:有源医疗器械和无源医疗器械。其中, 无源器械的使用形式有:药液输送保存器械;改变血液、体液器械;医用敷料;外科器械;重复使用外科器械;一次性无菌器械;植入器械;避孕和计划生育器械;消毒清洁器械;护理器械、体外诊断试剂、其他无源接触或无源辅助器械等。

3.2 无源医疗器械生物相容性研究的依据、项目

通过评价什么项目, 才能反映出材料的生物相容性问题, 是一个比较复杂的系统工程。国内外都制定了许多方法和评价标准, 如ISO 10993 系列国际标准、我国GB/T16886 系列标准等。其主要精神是观察研究材料植入体内长期、短期与机体组织、细胞、血液相接触后所引起的各种不同的机体反应。

3.3 无源医疗器械生物相容性研究的现状

无源医疗器械由于种类多, 范围广, 其生物相容性的研究一直在飞速的进步中。

在高分子材料方面, 一次性注射器已广泛应用于医疗机构, 其质量的好坏与人民群众的生命安全息息相关。一次性使用注射器属于体外与体内相接触中, 间接与血液接触类器械, 作用时间为A类 (<24 h) (表1) 。研究结果表明, 一次性使用注射器具有一定的细胞毒性;急性全身毒性试验、皮内反应试验和迟发型超敏反应试验未见异常[7]。医用硅橡胶在生命科学、医疗器械、药物等领域中已得到广泛而重要的应用, 但还有巨大潜力可挖, 随着生命科学的发展及生物材料的研究, 它将为人类社会做出更大的贡献[8]。生物纸是一种新型的交联多糖类生物材料, 通过按国家标准GB/T 16886 医疗器械生物学评价系列标准进行了全面的生物学评价, 证明材料具有良好的生物相容性[9]。聚乳酸 (polylactide, PLA) 及其共聚物是一类可生物降解的高分子材料, 具有优良的力学性能、化学稳定性, 吸收度及强度高, 其在生物体内的降解产物乳酸可参与到新陈代谢中, 最终生成二氧化碳和水排出体外。参照我国医疗器械生物学评价标准 (GB/T 16886) 的要求, 从致热原、细胞毒性、溶血、急性全身毒性、皮内反应、致敏反应、皮下植入试验、遗传毒性和亚慢性全身毒性等方面对制备的可降解材料聚乳酸进行了生物安全性评价, 结果证明该聚乳酸材料具有良好的生物相容性和生物安全性, 可作为医用材料使用。近年来已被广泛应用于缓释药物载体、外科手术缝合线、骨科内固定板、骨钉、组织防粘连材料、组织工程细胞支架等, 在抗肿瘤、骨缺损修复及眼部疾病治疗等领域发挥着不可替代的作用[10]。生物可吸收性植入物的出现及其在微创外科方面的广泛应用, 在过去几十年中极大地改善了医疗卫生诊治水平。一种新型材料:生物可吸收性形状记忆聚合物 (BSMP) 生物相容性良好, 体内降解速率稳定, 是一种良好的聚合材料[11]。

3.4 对无源医疗器械生物相容性研究的展望

当然随着社会的进步和科技的发展, 生物相容性的评价方法也在不断完善中。目前一种新的致热原检测方法正在被学者研究, 即细胞检测法, 该方法主要以人源细胞在体外进行致热原检测, 其原理为致热原物质能引起人源细胞释放一些与发热反应有关的细胞因子, 通过免疫化学方法定量检测这些因子的含量来反映其致热原的反应情况, 其优点是在不使用动物的情况下能够达到家兔法的检测效果。该方法操作简便、稳定可靠, 有望成为替代现行热原检测方法的一种可以进行定量半定量检测的方法[12]。因此, 用细胞来替代动物进行热原试验将成为今后的发展趋势。[13]

总之, 随着科学技术的发展, 特别是材料科学与生命科学的发展加快了医疗器械新产品研制, 随之对医疗器械生物学评价提出新的课题。关键是要科学地总结、提高, 正确地应用IS0 10993 系列标准, 把握医疗器械的风险, 保证器械使用的安全有效。

4 浸提条件对无源医疗器械生物相容性影响的研究现状

医疗器械生物学试验中样品制备是生物学试验的第一步, 是生物学试验成功开展的前提, 是确保生物学实验结果真实可靠的保证。

医疗器械生物学评价系列标准GB/T 16886.12 对样品制备条件进行了推荐, 在生物学试验中常需要使用样品浸提液进行试验, 即将试验样品浸入适宜的介质中, 在一定的条件下进行浸提, 然后使用浸提液进行一系列的生物学试验, 其目的在于检测医疗器械可溶出物可能导致的生物学反应, 以评价产品可能对病人或使用者的潜在危害。生物学评价系列标准GB/T 16886-12 对浸提法原理进行了说明, 并对浸提容器、浸提介质、浸提条件和方法等均进行了推荐。此方法主要参考药包材的浸提方法, 但由于医疗器械的材料、预期用途、使用方法等与药包材有很大区别, 加上医疗器械本身的多样性, 试验人员应该根据样品的物理化学特性等选择更加合理的浸提条件和方法。

在邹文等[14]中指出, 高分子聚合物经浸提后3 种材料为疑似反应, 经再次激发后确认2 种为无超敏反应, 1 种为弱致敏物。而其他生物医用材料如金属及合金、陶瓷、生物修复材料等均无超敏反应, 且在121 ℃, 1 h浸提条件下进行试验的生物医用材料占80.4%。我们是否可以认为高分子聚合物在同等的浸提条件下更易产生超敏反应。同时我们也会产生疑问, 这种浸提条件的选择是否为最佳的, 其他生物医用材料的浸提条件是否能够完全反应出该材料的生物相容性?

同时, 在一次性使用注射器的生物相容性研究中发现, 高温对这一类材料有一定影响。在制作浸提液的过程中, 所用浸提介质和浸提条件应与最终产品的特性和使用以及使用目的相适应, 在选择浸提条件时应考虑器械材料的物理化学特性、可溶出物或残留物。同时, 浸提是一个复杂的过程, 受时间, 温度、表面积与体积比、浸提介质以及材料的相平衡的影响, 要考虑高温对浸提动力学及浸提液恒定性的影响。

体外细胞毒性试验是目前国内外生物学评价标准中重要的一环, 是评价直接或间接接触人体组织和细胞的医疗器械的通用方法, 目前标准推荐的实验方法有:浸提液试验、直接接触试验、间接接触试验。浸提液试验是目前用于检测医疗器械的细胞毒性比较广泛的一种方法, 选择不同的浸提介质可能对试验结果有直接的影响。浸提介质的选择对评价产品体外细胞毒性结果的影响程度以及评价结果是否存在差异等问题目前尚无相关文献报道。

目前有关何种浸提条件最合适, 现有生物学评价是否足够等问题的研究国内外均开展得不多, 可能是由于医疗器械产品发展较快, 医疗器械生物学评价体系的建立相对较晚, 加上医疗器械的多样性, 医疗器械材料种类众多, 物理化学性能相差很大, 如果一一进行研究, 时间成本和经济成本均太高。随着医疗器械监督管理的发展, 这种矛盾日益显露。因此通过研究浸提条件的改变对无源医疗器械, 特别是以高分子材料为原料的无源医疗器械的部分生物相容性项目的影响, 可以有效的完善我国对无源医疗器械材料的生物相容性研究。

摘要：生物材料与人体各组织间的相互作用与影响是生物材料一直以来关注的焦点, 更是生物相容性研究的基础。医疗器械作为现代人们医疗的必须手段, 其安全有效性的评价是保障我国医疗事业健康发展的基础。现有的医疗器械安全有效性评价是基于GB/T 16886系列标准要求, 标准中有些方法主要参考药包材等检验方法, 但由于医疗器械的材料、预期用途、使用方法等与药包材有很大区别, 加上医疗器械本身的多样性, 现有生物相容性项目是否足够与完善就成为医疗器械生物相容性领域研究的焦点。生物学试验中样品的制备条件作为生物学试验的基础, 直接影响着试验数据的准确性和有效性, 更应受到足够的重视。

一次性注射器的生物相容性研究 篇5

1 试验材料

1.1 试验样品

选择17批一次性使用注射器,来源于国家抽验。

1.2 试验仪器和所需材料

采用超净工作台(苏州净化设备有限公司,型号:SW-CJ-1C),二氧化碳培养箱(Thermo公司,型号:3111),小鼠成纤维细胞L-929(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库),酶标仪(Tecan公司,型号:Sunrise RC梯度),MEM/EBSS培养基(赛默飞世尔生物化学制品有限公司),胎牛血清(赛默飞世尔生物化学制品有限公司),胰蛋白酶(Thermo),MTT溶液(Sigma公司),完全弗氏佐剂(Sigma公司),植物油(天津嘉里粮油工业有限公司),雄性豚鼠(河南康达实验动物有限公司,合格证号:0007273),日本大耳白(河南康达实验动物有限公司,合格证号:0002677),昆明种小鼠(郑州大学实验动物中心,合格证:0000909)。

2 试验样品的制备[4]

2.1 细胞毒性试验

同一批号取一次性注射器3支,浸提介质为含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液,无菌条件下,抽取细胞培养液至最大刻度线处,置于37℃的CO2培养箱中24h。阳性对照用5%二甲基亚砜(DMSO),阴性对照材料选用高密度聚乙烯,取高密度聚乙烯适量,按0.2g/mL加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基,置于37℃培养箱浸提24 h。

2.2 急性全身毒性试验

浸提介质为0.9%的氯化钠注射液,同一批号取注射器10支,分别加0.9%的氯化钠注射液至公称容量并把芯杆最大容量,两端封闭,置121℃恒温箱中保温1h后取出,把浸提液移入无菌的三角烧瓶内,供24h内使用。同法操作制备植物油浸提液和浸提介质对照液。

2.3 皮内反应试验

浸提介质为0.9%的氯化钠注射液,同一批号取注射器3支,分别加0.9%的氯化钠注射液至公称容量,两端封闭,振摇3次,置121℃恒温箱中保温1h后取出,供2h内使用。同法操作制备植物油浸提液。取对照液0.9%氯化钠和植物油各10mL放于无菌三角瓶中,同上方法放置。

2.4 迟发型超敏反应最大剂量试验

浸提方法同皮内反应试验,皮内诱导阶段试剂的配置,注射弗氏完全佐剂与生理盐水以50:50体积比混合的稳定乳化剂,试验样品液以50:50的体积与稳定乳化剂混合后进行皮内注射。

3 试验方法

3.1 细胞毒性试验[5]

选取17批国家抽验的注射器,取生长旺盛的小鼠成纤维细胞L929,胰蛋白酶消化成细胞悬液后,用RPMI1640培养液调整细胞密度至1×104/mL,以100μL/孔接种于96孔培养板,96孔板边缘孔全部加入无菌PBS200μL,然后置5%CO2培养箱中孵育37℃/24h。空白对照组用RPMI1640培养液交换。阴性对照组用高密度聚乙烯浸提液交换,阳性对照组用5%DMSO浸提液。样品试验组分别用体积分数100%、50%(即按1:1用含细胞培养液稀释)的样品浸提液每孔100μL交换,置于培养箱中继续培养。对试验样品组、阴性对照组、阳性对照组及空白对照组的细胞进行显微检查,48h后每孔加入20μL(5 mg/mL)MTT溶液,继续培养5h,小心吸去孔内液体,每孔加入200μL DMSO,振荡10 min,用酶标仪主波长570nm,参考波长630nm处检测吸光度OD值,取6孔平均值。按下列公式计算相对增殖率(relative growth rate,RGR,RGR=实验组OD值/空白对照组OD值×100%)。根据RGR值,按表1评分定出材料的毒性级别。

3.2 急性全身毒性试验[6]

随机选取5批国家抽验的注射器,选用昆明种小鼠,体重17~20g,随机将小鼠分为样品组和对照组,每组10只,其中,各样品组5只小鼠由尾静脉恒速注射材料浸提液,对照组5只注射生理盐水对照液;另外各组5只由腹腔分别注入植物油浸提液和植物油对照液。注射量均为50mL/kg。于注射后4h、24h、48h和72h观察小白鼠运动是否减少,观察并记录试验组和对照组动物的一般状态、毒性表现和死亡动物数,在72h时称量动物体重量。

3.3 皮内反应试验[7]

随机选取5批国家抽验的注射器,日本大耳白兔15只,用75%酒精消毒皮肤暴露区域,在每只兔脊柱一侧选10个点,每点间隔2cm,前5个点皮内注射氯化钠样品浸提液,后5个点注射氯化钠对照液。在每只兔的脊柱另一侧注射植物油制备的样品浸提液和植物油对照液,操作步骤同上。每点注射量0.2mL,注射后24h、48h、72h观察注射部位的红斑和水肿的组织反应评分,并记录试验结果。72h评分后,分别将每一试验样品和溶剂对照的全部红斑与水肿记分相加,再除以18[3(动物数)×3(观察期)×2(记分类型)],计算出每一试验样品和每一对应溶剂对照的综合平均记分。

3.4 迟发型超敏反应试验[7]

随机选取5批国家抽验的注射器,每组10只豚鼠;另选5只豚鼠做对照。皮内诱导阶段:每只豚鼠在约2 cm×4 cm剪毛区内注射3排(每排2个注射点),第1排注射0.1mL注射弗氏完全佐剂(FCA)与生理盐水,以50:50体积比混合的稳定乳化剂,第2排注射0.1mL样品浸提液,对照组注射生理盐水,第3排注射0.1mL样品浸提液(对照生理盐水)与稳定乳化剂的等比混悬液。局部诱导阶段:注射1周后,试验区用10%的十二烷基硫酸钠进行预处理,按摩导入皮肤,然后用样品浸提液,将20mm×40mm滤纸片浸透后局部贴敷于每只动物的去毛背部试验区的诱导注射点部位。用封闭式包扎带固定敷贴片,并于(48±2)h后除去包扎带和敷贴片。对照组使用生理盐水同法操作。激发阶段:诱导14 d后,每只以样品浸提液或对照液局部贴敷于诱导阶段未试验部位,封闭式包扎带固定,并于24h除去包扎带和敷贴片。除去包扎带后24 h、48h观察试验组和对照组动物激发部位皮肤情况。按Magnusson和Kligman皮肤致敏的分级标准对每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应进行描述并分级。

3.5 统计学处理

实验组数据以±s表示,组间比较采用t检验。

4 结果

4.1 细胞毒性试验

倒置显微镜观察发现,空白对照组及阴性对照组细胞培养24h后,贴壁生长好,细胞呈梭形或不规则三角形;而阳性对照组细胞很少贴壁,大部分细胞成圆形,核固缩、死亡细胞明显增多。有4批细胞毒性较大,其余的细胞毒性都在正常范围之内,试验结果,见表2。

注:No.1~No.17为样品编号。

4.2 急性全身毒性试验

所有实验小鼠均无死亡,1组4只、2组3只、5组1只动物精神不好,体质量有所减轻,有轻微反应;4组动物整体体质量增长较少;其他动物精神状态良好,活动、进食及大小便均正常,无惊厥、瘫痪、呼吸抑制等毒性反应,体质量均有不同程度的增加,试验结果,见表3。

4.3 皮内反应试验

每一试验样品:氯化钠浸提液与氯化钠对照平均记分之差均为0;植物油浸提液与植物油对照平均记分之差也均<1.0(分别为0.3、0.4、0.2、0.3、0.2)。所以在本试验条件下,样品浸提液对皮肤无刺激作用。

4.4 迟发型超敏反应试验

阴性对照组动物记分均为0,试验组动物记分均为0,所以,在本试验条件下,样品浸提液对豚鼠无迟发型致敏作用。

5 讨论

在国家抽验的基础上,本研究采用体外细胞毒性试验和体内试验(急性毒性试验、皮内反应试验和致敏试验)相结合的方法,补充做了一些试验来探究一次性使用注射器的生物相容性。

不少检测机构在检验一次性使用注射器的细胞毒性时,经常会发现送检样品的细胞毒性呈中度或重度,不符合国家标准。据调查分析,注射器细胞毒性不合格的原因可能有以下3方面因素:

(1)目前,一次性使用注射器的原材料主要是聚丙烯(PP),为了降低生产成本,可能会添加质量较差的PP材料。

(2)注射器灭菌的过程中,PP和橡胶活塞经常吸附一定量的环氧乙烷(EO),如果解析时间不够的话,残留的EO就会产生较大的毒性。

(3)在注射器生产过程中,胶塞上使用的硅油不合格,使用工业硅油代替医用硅油,使细胞毒性增加。也有文献[8]研究表明,注射器细胞毒性较大的原因为活塞的洗液残留。建议企业在生产中使用合格的原料,增加EO解析时间,同时改进生产工艺,清除残留洗液。

由于在以往的试验中发现高温对这一类材料有一定影响,所以本次选取注射器在121℃下浸提1h进行试验,虽然致敏试验结果未发现异常,但个别产品的急性毒性试验、皮内反应试验有不同程度的反应,其原因,可能是不同材质高温浸提还是有影响的。建议在注射器的国家标准中增加体外细胞毒性试验和体内相关试验,以较全面地评价产品的质量。

参考文献

[1]奚廷斐.医疗器械生物学评价[J].中国医疗器械信息,1999,5(3):4-9.

[2]国家药品监督管理局.GB/T16886.1-2001《医疗器械生物学评价第1部分:评价与试验》[S].北京:中国标准出版出,2001.

[3]李彤,等.40株肠球菌应用两种仪器鉴定结果的比较研究[J].中国医疗设备,2009,24(3):55-57.

[4]国家药品监督管理局.GB/T16886.12-2005《医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品》[S].北京:中国标准出版社,2005.

[5]国家药品监督管理局.GB/T14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法》[S].北京:中国标准出版社,2005.

[6]国家药品监督管理局.GB/T16886.11-1997《医疗器械生物学评价第11部分:全身毒性试验》[S].北京:中国标准出版社,1997.

[7]国家药品监督管理局.GB/T16886.10-2005《医疗器械生物学评价第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验》[S].北京:中国标准出版社,2005.

相容性评价指标及改进分析 篇6

碰撞相容性是指汽车在碰撞中保护自己的乘员, 同时也保护对方车辆乘员的能力。在碰撞中, 当两辆车乘员的死亡率很低的时候, 才能够表明两辆车具有良好的相容性。这就明确指出汽车相容性不仅仅包括对自己的保护, 同时也包括对对方车辆的保护。在车辆碰撞法规日益严格的今天, 汽车的碰撞相容性也越来越多地引起了人们的注意。在满足了相关法规的同时, 也要考虑到汽车碰撞相容性的因素, 这样才能真正地为乘员提供一个安全的乘坐环境。

1 相容性研究方法及评价指标

相容性是一个前沿性的课题, 目前还没有统一的研究方法, 同时也没有出台相应的法规。国内与相容性相关的法规主要有GB 11567.1-2001和GB 11567.2-2001。这两个法规主要是针对侧面和后下部防护装置, 对于相容性并没有明确的指标规定。

目前国内外有关相容性的研究主要采用以下一些衡量指标:速度变化量、乘员承受的最大加速度、轿车前端变形区域长度、轿车车身变形率。由于乘员承受的最大加速度与轿车的乘员约束系统有很密切的关系, 并且约束系统各部件之间的关系错综复杂, 不易评判, 而轿车前端变形区域长度及车身变形率同样与轿车本身的结构相关, 因此本文创新性地采用轿车方向盘的侵入量和侵入速度作为衡量指标。因为该指标易于测量, 同时也是导致乘员受伤的关键部件, 文献[4]中指出汽车正面碰撞时转向盘是使驾驶员重伤的主要元件。

2 模型建立

考虑到相容性对模型的要求以及计算效率等问题, 在本例对相容性的分析中, 对重型车模型进行了适当的简化。因为驾驶室、鞍座、油箱、排气系统、电瓶箱等总成不参与和轿车的碰撞, 因此把其简化为质点, 这样既不影响整车惯性又提高了计算效率, 简化后的重型车基础模型见图1, 轿车基础模型见图2。鉴于篇幅关系, 对详细的建模过程不再阐述。

3 仿真分析

3.1 参考模型分析

根据已经建立的模型, 进行了仿真分析, 图3、图4分别为计算的仿真结果图、能量变化曲线图, 图5、图6分别为仿真中仪表盘和方向盘的侵入量及侵入速度曲线。

从图4中可以看出:总能量守恒, 沙漏能比较小, 验证了参考模型的有效性。从图5和图6可以看出:侵入量和侵入速度的值都比较大, 同时, 轿车速度的改变量也达到了5.7 m/s。对比轿车正碰变形及侵入量、侵入速度曲线, 可以发现:从相容性的角度来讲, 还有很大的改进空间。因为主要考察点在方向盘, 因此以后的碰撞结果只对方向盘进行测量分析。

3.2 改进结构设计及分析

针对基础模型的变形结果及曲线进行分析可以看出:轿车前端已经完全钻入重型车下面, 造成轿车侵入量和侵入速度过大。从图5、图6也可以看到:轿车的在与重型车的初始碰撞后, 侵入量增加比较迟缓, 这个过程正是轿车下钻的过程, 当轿车下钻完成后, 侵入量的增加又比较迅速, 轿车的下钻时间从图中看, 应该是45 ms～60 ms之间, 与侵入速度的变化趋势一致。

从上述分析可以得到以下结论:轿车的侵入过大主要是由于其下钻造成的。因此, 改进结构主要从防止轿车下钻入手。

图7为改进结构部件, 图8为其截面图。图7中A部件为改进结构, 原保险杠结构向下复制延伸, 同时增加吸能部件, 吸能部件为如图9所示的薄壁帽形结构, 共分为上、下两排, 厚度只有0.6 mm, 材料为屈服强度为129 MPa的低强度钢。

结构改进前后的侵入量和侵入速度对比曲线分别见图10、图11。

改进之后的保险杠有效地防止了轿车的下钻, 这个作用也在关键点的测量曲线有所体现, 改进结构使得轿车方向盘的侵入量和侵入速度有了大幅度的降低, 侵入量降低了30.2%, 侵入速度降低了26.4%。

3.3 改进结构验证

由于发生的车辆事故边界条件比较复杂, 因此考虑其中影响比较大的两个因素做参数分析以验证改进结构的有效性, 所选取的参数为速度和偏置量。

3.3.1 速度验证

该结构对于原模型的改进效果已经进行了仿真验证。为了进一步验证改进结构的有效性, 还计算了不同速度的碰撞模型。图12～图13是将碰撞速度提高的结果曲线图。

速度提高之后, 轿车前端受到的冲击更大, 驾驶室几乎已经完全变形。从侵入量和侵入速度曲线中也可以看到, 该改进结构使得侵入量降低了17.1%, 侵入速度降低了25.8%, 可见对不同的速度都有一定的改进效果。

3.3.2 偏置量验证

为了验证改进结构的有效性, 还计算了不同偏置量的碰撞方案 (初始偏置量为50%) 。图14～图15是降低偏置量 (偏置量为10%) 的碰撞结果曲线图。

偏置量降低之后, 轿车整体的变形变小, 这主要是因为轿车和重型车的吸能区域增加了, 因此有更多的能量转化为内能。从变形曲线中也可以看到, 侵入量和侵入速度明显降低, 验证了改进结构对不同偏置量的改进效果。

4 结论

根据对相容性概念的阐述以及研究方法的探究, 最终确定研究方案以及衡量指标。通过对不同方案的对比优化, 确定了最终改进结构, 改进结构对方向盘的侵入量降低了30.2%, 侵入速度降低了26.4%;同时还针对不同的速度和偏置量进行了比较分析, 结果显示, 改进结构同样有效。

摘要：对大量文献进行了查找总结, 确定了新的相容性衡量指标, 并且建立了相容性模型。通过对碰撞结果及影响相容性的关键因素进行分析, 提出了改进方案, 最后对改进方案进行了速度及偏置量的验证, 证明了改进方案的有效性。

关键词：衡量指标,相容性模型,改进方案

参考文献

[1]朱西产, 程勇.载货汽车防护装置最佳离地高度和刚度的分析[J].汽车工程, 2002, 24 (5) :420-421.

[2]袁泉, 李一兵.基于碰撞相容性因素的车辆追尾事故深入数据分析[J].汽车技术, 2006 (增刊) :73.

[3]程勇, 朱西产.大型载货汽车被动安全性的特点及改进措施[J].汽车技术, 2002 (5) :3-4.

生物相容性评价 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料(中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室制备),M TT(华美生物公司),胎牛血清(美国Sigm a公司),纤维原细胞由中南大学湘雅医学院细胞培养中心提供,实验动物由中南大学动物实验学部提供。高速离心机ZK 401(美国Beckm an公司),37℃、二氧化碳细胞培养箱(美国H eraeus公司),72-1型分光光度(上海悦丰)。

1.2 方法

1.2.1 细胞相容性检测

用2.5 g/L的胰蛋白酶消化单层培养的纤维原细胞,以含10%胎牛血清的D M EM培基配成单细胞悬液。以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中,每孔体积200μL。将培养板移入二氧化碳培养箱中,在37℃和5%二氧化碳的条件下培养24 h。在细胞孔内加入100μg聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料,继续培养5、10、15和20d后,每孔加入MTT溶液(5 m g/mL)20μL,37℃继续孵育4 h,终止培养。吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μL DMSO,振荡10 min,使结晶物充分溶解。选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值。设3个复孔。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔调零。

1.2.2 溶血实验

抽取兔血8 mL,肝素抗凝,加入10 mL生理盐水稀释。取5 g聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料于试管内,加入10 mL生理盐水,37℃保温60 min。阳性对照以10 mL 1%碳酸氢钠溶液中加入0.2 mL稀释兔全血;阴性对照则在10 mL生理盐水中加入0.2 mL稀释兔全血,对照组也在37℃保温60 min。所有试管经离心(750 r/min,5 min)后,取上清液移入72-1型分光光度计测量杯中于545 nm处测定其光密度(OD)。试验以不同的聚乳酸/羟基磷灰石配比重复3次。按下式计算溶血百分率:

将聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料高温高压(121℃,2 h)消毒后,按重量比用生理盐水配成4%、10%及20%的混悬液,24只小白鼠,雌雄各半,随机分为4组,分别一次性灌胃3种浓度的混悬液0.5m L(相当于1 000 m g/kg、2 500 m g/kg和5 000 m g/kg)。对照组以同样途径给予同样剂量的生理盐水。分别于给药前1周、给药后2周、给药后2周测量动物体重变化和观察各种反应。

2 结果

2.1 细胞相容性

随着培养时间的延长,各组细胞数量明显增加,聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料组与对照组比较差异无显著性(P>0.05),见表1。

2.2 溶血试验

一般认为,溶血百分率大于5%,可认为其发生溶血。实验结果由表2可以看出,聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料的溶血百分率均<5%。本实验材料体外检测引起的溶血程度属于正常范围,可认为本材料具有较好的血液相容性。

2.3 急性毒性实验

实验动物2周内一般情况良好,活动和食欲正常,呼吸平稳,无惊厥、瘫痪、呼吸抑制、腹泻、运动减少、体重下降(表3)和死亡现象。高、低剂量组动物无一死亡,测不出LD50,且各组动物体重增加的差异无显著性(P>0.05)。本实验中受试材料用量达5 000m g/kg,达到卫生部规定的实际无毒标准,故可认为本实验所用的聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料材料无急性毒性作用。

注:各组动物体重增加差异无显著性,P>0.05

3 讨论

生物相容性是生物材料研究贯穿的主题,因此,为了确保材料在临床研究时的安全性,在完成物理和化学性能、加工性能及外形等有效性设计后必须进行生物相容性评价试验,以便提供进一步有关安全性的数据和资料。

对生物材料进行细胞毒性研究是检测其生物相容性的一项基本内容。体外细胞培养法具有简捷、快速、灵活和重复性好的优点[3,4]。笔者对聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料细胞毒性的研究表明,随着培养时间的延长,各组细胞数量明显增加,聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料处理组与对照组的差异无显著性,反映了该复合材料对细胞无毒性。

溶血实验是通过对材料与血红细胞在体外接触所导致的红细胞溶解和血红蛋白游离程度的测定来评价材料的血液相容性。该实验能敏感地反映实验材料对血红细胞的毒性,是一种特别的材料筛选方式。聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料溶血率小于5%,符合医用材料的溶血率要求。

急性毒性实验结果显示,受试材料用量高达5 000m g/kg时,体重增加与对照无差异,说明其无急性毒性作用。

本研究证明,聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料有良好的生物相容性。

摘要：目的 对聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料的生物相容性进行研究,为其在骨的缺损修复领域中的临床运用提供依据。方法 检测聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料的细胞相容性、溶血百分率和急性毒性。结果 聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料组的细胞数量增加与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。纳米复合材料的溶血百分率<5%,溶血程度属于正常范围。实验动物2周内一般情况良好,高、低剂量组动物无一死亡。各组动物体重增加差异无显著性(P>0.05)。结论 本实验证明,聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料有良好的生物相容性。

关键词：聚乳酸/羟基磷灰石纳米复合材料,生物相容性,细胞相容性,溶血百分率,急性毒性

参考文献

[1]GARLOTTA D.A literature review of polylactic acid[J].J Polym Envim n,2002,9:61-84.

[2]BANDYOPADH YAY S,CH EN R,GIANNELIS EP.Biodegrad-able organic-inorganic hybrids based on poly(L-lactide)[J].Polym M ater Sci Eng,1999,81:159-160.

[3]张玉梅,付涛,徐可为,等.含镧羟基磷灰石的细胞毒性研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2000,10(3):152.[3]ZH ANG YM,FU T,XU KW,et al.Cytocom patibllity of im plan-tal m aterial of La—H A coating on titanium[J].J Pratt Stom ato,2000,10(3):152.Chinese

生物相容性评价 篇8

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

聚乙二醇甲基丙烯酸酯 (PEGMA, Mn=950) 和甲基丙烯酸十八酯购自阿拉丁试剂公司。罗丹明B购自国药集团化学试剂有限公司。偶氮二异丁腈 (AIBN) 经无水乙醇重结晶后使用。以上试剂均为分析纯。

药物浓度测定采用722型可见分光光度计, 上海精科。

1.2 PEGMA-SMA聚合物的制备与表征

惰性聚合物PEG-SMA合成以AIBN为引发剂, 通过自由基溶液聚合完成[10]。共聚物的结构如示意图1所示。利用核磁共振谱仪 (1H-NMR, 400MHz, AVANCE DMX400, Bruker) 对不同单体比例的PEG基聚合物进行了组成和结构的表征。

1.3 载药聚合物涂层的构建

1.3.1 基底材料的处理

所用基底材料为医用聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 膜片, 将PET膜片依次用丙酮、甲醇和三蒸水超声处理10min, 最后用三蒸水洗净。烘干, 保存备用。

1.3.2 带模型药物聚合物涂层的构建与表征

分别配制一定浓度的聚合物-四氢呋喃 (THF) 和罗丹明B-THF溶液, 并将二者混合, 得到带模型药物的聚合物涂层溶液。将已经处理过PET薄膜浸入所配制的溶液中, 然后匀速提起, 在空气中静置一段时间, 待THF挥发后, 重复以上操作6次, 真空烘箱中于50℃下干燥24h, 去除残余溶剂, 这样便获得了带模型药物的聚合物涂层, 结构如图2所示。将所得带模型药物的聚合物涂层避光保存备用。

1.4 载药聚合物涂层的体外药物释放行为研究

1.4.1 标准曲线的绘制

精确称量罗丹明B50mg, 置于100mL棕色容量瓶中, 用PBS缓冲溶液 (pH=7.4) 溶解并稀释至刻度, 摇匀, 配制浓度为500.00μg/mL的罗丹明B水溶液, 然后做倍比稀释, 得到浓度为250.00、125.00、62.50、32.25、16.13、8.07、4.04μg/mL的标准样品溶液, 分别测定其在554nm处的吸光度值, 绘制罗丹明B浓度C和吸光度A值的标准曲线。

1.4.2 模型药物的释放研究

将载药涂层1cm2左右置于称量瓶中, 加入2mL PBS缓冲溶液, 37℃恒温振荡水浴避光释放;间隔一定时间, 取出释放液, 加入新的PBS缓冲液继续进行释放, 取出的液体利用可见分光光度计测定其吸光度, 同时测定空白PBS的吸光度作为背景扣除, 对照罗丹明B的标准曲线计算缓释溶液中模型药物的浓度和总量。

2 结果与讨论

2.1 PEGMA-SMA聚合物的表征

利用核磁氢谱对PEGMA-SMA聚合物的结构进行了表征。结果如图3所示, 0.90和1.3附近的特征峰来自SMA中的-CH3和-CH2-CH2-, 3.3和3.5位置的特征峰则来自PEG-MA中与乙氧基-CH2-CH2-O-相连的甲基和乙氧基中的-CH2。同时利用核磁氢谱不同特征峰的积分面积比值可以计算出共聚物中各个单体所占的摩尔组成。分别对合成不同单体比例的聚合物进行组成计算, 结果如表1所示。对比理论含量可以看出, 聚合物单体组成与理论摩尔含量保持了很好的一致性。

2.2 载药聚合物涂层的体外药物释放行为研究

选用罗丹明B为药物模型, 对聚合物涂层的药物释放行为进行初步探索, 观察不同投料比的聚合物对药物释放的不同影响。通过测定溶液在554nm的吸光度, 并与标准曲线比较, 可以计算出特定时间下模型药物从涂层表面的释放量, 结果见图4。可以看出, 随着时间的增加, 药物的释放速率逐渐减小;且在相同时间下, 药物的释放量与涂层中聚合物的单体组成有关, 聚合物中疏水单元数量越多, 药物释放速率越快, 药物释放量也越多。

将不同时间的释放量依次累加, 得到如图5所示的载药聚合物涂层中模型药物释放累积总量变化曲线。药物释放结果显示, 罗丹明B的释放基本上是匀速的, 释放接近零级动力学。不同比例的载药聚合物涂层累积释放量呈现明显差异。样品编号为1# (PEGMA∶SMA=1∶2) 的聚合物48h后累积释放量接近100%, 释放速率较快;而3#聚合物 (PEGMA∶SMA=2∶1) 48h后累积释放量为80%左右, 这可能是由于涂层中药物主要通过扩散释放, 而对扩散机制控制的药物释放而言, 聚合物中的PEGMA具有水化作用, 可以在溶液中形成水化膜, 对药物释放起到了扩散屏障的作用[11,12]。PEGMA单体比例越大, 屏障效果越明显, 则药物释放量也越少。

3 结论

利用自由基聚合成功制备了不同单体比例的聚乙二醇甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸十八酯共共聚物, 并通过核磁对聚合物结构进行了定性和定量分析, 不同单体比例的聚合物均具有预期结构组成。以疏水性荧光染料罗丹明B为药物模型, 对不同组成的聚合物涂层药物释放行为进行研究发现:模型药物呈匀速释放, 且聚合物中疏水单元数越多, 药物释放速率越快;PEG单元由于其良好的生物相容性以及水化作用, 可以对药物扩散释放起到屏障作用。因此, PEG与SMA在聚合物中的相对比例越大, 屏障效果越明显, 则药物释放越缓慢, 释放量也越少。这一结果为后续研究PEG基聚合物涂层的药物可控缓释性能提供了理论依据和数据基础。

参考文献

[1]Roy A, Singh S K, Bajpai J, et al.Controlled pesticide release from biodegradable polymers[J].Central European Journal of Chemistry, 2014, 12 (4) :453-469.

[2]Pillay V, Tsai T S, Choonara Y E, et al.A review of integrating electroactive polymers as responsive systems for specialized drug delivery applications[J].Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2013, 102 (6) :2039-2054.

[3]解朝朋.聚乙二醇/聚酸酐共聚物的制备及药物控释性能研究[D].天津:天津大学化工学院, 2008.

[4]Jo S, Park K.Surface modification using silanated poly (ethylene glycols) [J].Biomaterials, 2000, 21 (6) :605-616.

[6]王勤, 王传栋, 刘阳, 等.聚乙二醇改性聚乳酸嵌段共聚物的合成与亲水性研究[J].化工新型材料, 2012, 40 (7) :81-84.

[7]Wu H, Zhu L, Torchilin V P.pH-sensitive poly (histidine) -PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery[J].Biomaterials, 2013, 34 (4) :1213-1222.

[8]Guo Q, Knight PT, Mather PT.Tailored drug release from biodegradable stent coatings based on hybrid polyurethanes[J].Journal of Controlled Release, 2009, 137 (3) :224-233.

[9]Gu X, Kuang Y, Guo X, et al.Synthesis and drug release properties of poly (ethylene oxide) segmented polysulfone copolymers.Journal of Controlled Release, 2008, 127 (3) :267-272.

[10]Wei Y, Ji Y, Xiao L L, et al.Different complex surfaces of polyethyleneglycol (PEG) and REDV ligand to enhance the endothelial cells selectivity over smooth muscle cells[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces, 2011, 84 (2) :369-378.

[11]Zhang L F, Sun R, Xu L, et al.Hydrophilic poly (ethylene glycol) coating on PDLLA/BCP bone scaffold for drug delivery and cell culture[J].Materials Science and Engineering:C, 2008, 28 (1) :141-149.