脂质过氧化物酶（共9篇）
脂质过氧化物酶 篇1
植物叶片中的叶绿素含量、可溶性蛋白含量、过氧化物酶 (POD) 和超氧化物岐化酶 (SOD) 活性常作为评价叶片衰老程度、抗性大 小和产量高低的指标[1]。目 前, 植物在逆境条件下的膜脂过氧化反应和保护酶系统超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化物酶 (POD) 、过氧化氢酶 (CAT) 活性的变化己广泛用于植物对逆境机理的研究[2], 但多是关于保护酶系统与植株抗病机理研究的报道。玉米 (Zea mays) 是我国的主要粮食作物, Duncan[3]已对玉米一生中光合作用作了大量研究。为了提高玉米 的产量和品质, 在农业栽培技术和作物育种上开展各种研究的同时, 掌握作物个体发育对外界环境条件营养物质需要极为重要。关于玉米一生各时期所需要的营养和缺素症状也己有大量的报道[4,5,6], 但多偏重于地上叶器官形态及某些生理特性的研究。而缺素情况下对玉米叶片脂质过氧化程度的研究鲜有报道, 为了深入全面掌握玉米生长发育对各元素需要, 本文拟以6种必需元素, 利用营养液培育方法, 在系统观察比较缺素形态特征基础上, 侧重对其脂质过氧化及酶活性进行研究, 以补充和完善对缺乏各类元素症状的认识, 为更有效地掌握玉米生产中营养管理提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
玉米品种:金玉1号 (材料由东北农业大学植物生理实验室提供) 。
1.2 方法
1.2.1 试验材料培育
种子消毒后, 进行1 d的浸泡处理, 再将其放入25℃温箱中处理3 d。待玉米苗长出两片真叶, 将水倾出换入1/4完全培养液培养, 直至幼苗长出3片叶时, 去掉胚乳, 再进行缺素培养。
1.2.2 缺素处理方法
参照郝再彬, 苍晶《生理实验》[7]所示, 配制出完全培养液和缺素营养液 (见表1) , 分别装入500 mL的培养缸内, 选择发育一致的玉米幼苗移入各缸内培养, 每7 d更换一次培养液, 观察完全液 (对照) 和缺素液玉米的生长和发育, 培养时经常调整pH和充气, 待缺素症状出现后 (17 d) 对其进行生理指标测定。
注:每100 mL培养液中贮备液的用量/mL;-N表示培养液中缺少该种元素, 其它相同。
1.2.3 测定方法
参照郝再彬, 苍晶《生理实验》[7]。叶绿素含量测定:722-分光光度计-丙酮法;水溶性蛋白含量测定——考马斯亮蓝G-250法;超氧化物歧化酶 (SOD) 测定——NBT (氮蓝四唑) 法;过氧化氢酶活性测定——紫外吸收法;过氧化物酶活性测定——愈创木酚法;丙二醛 (MDA) 含量测定——硫代巴比妥酸 (TBA) 显色反应。
2 结果与分析
2.1 培养液缺素培养时植株表现的症状
培养液缺氮时玉米植株矮小, 生长缓慢, 叶片由下而上从叶尖沿中脉向基部黄枯;缺磷时幼苗叶尖和叶缘呈紫红色, 老叶变黄, 茎秆细小, 生长缓慢;缺钾时老叶边缘枯焦、发褐, 幼叶变黄, 植株矮小;缺镁时下部叶片平行叶脉间呈现淡黄色条纹, 进一步扩展到整个叶片纵向变黄, 甚至发白, 最后其边缘呈紫红色;缺钾老叶从尖端沿着叶缘向叶鞘逐渐变褐而枯焦, 并逐渐由叶缘向叶的中心扩展;缺钙的玉米植株幼叶变黄枯萎, 植株矮小;缺铁时新生叶片出现失绿, 脉间失绿, 发展至整个叶片淡黄或发白, 植株瘦小, 生长缓慢。
2.2 培养液缺素培养时玉米叶片叶绿素、蛋白质含量的变化
由表2可知, 营养液中缺少某一种元素叶绿素含量都有不同程度的降低, 其中缺氮、缺镁、缺铁下降显著, 这可能与氮、镁是叶绿素的组成成分以及铁能促进叶绿素的生物合成有关。其它缺素造成叶绿素含量降低, 可能是由于这些元素都不同程度的参与叶绿素的合成所致。缺氮、缺铁培养的营养液较用完全培养液蛋白质的含量下降显著, 其它缺素培养均有不同程度降低, 因为氮、铁是蛋白质合成的组成成分, 其它元素不同程度地促进植物对氮的吸收, 当磷、钾、镁缺少时, 导致氮循环不畅, 进而引起蛋白质合成受阻[8]。相关性分析表明:在叶绿素含量测定方面, 缺氮处理与完全培养液培养表现为极显著相关;在蛋白质测定方面, 缺磷、缺钾处理分别与完全培养液培养呈极显著相关, 缺镁处理与完全培养液培养呈显著相关。
2.3 缺素对MDA含量的影响
MDA是膜质过氧化的产物, 其含量的多少可代表膜损伤程度的大小[9]。由表2看出, 各缺素处理下, 丙二醛 (MDA) 的含量均高于完全培养液培养的植株, 这可能是不同缺素培养使叶片内自由基产生速率增加, 细胞质膜相对透性增大所致, 导致膜脂过氧化产物丙二醛 (MDA) 含量增多。
2.4 缺素对3种保护酶活性的影响
SOD、POD、CAT是植物在逆境条件下的三大主要保护酶系统。这些活性氧在植物体内不断生成, 同时又被SOD、CAT和POD等保护酶系统清除, 由于缺素造成植物营养不良, 进而对植物造成伤害, 所以, 这3种酶活性的大小可作为衡量作物抗逆性强弱的指标[1]。而SOD、CAT和POD活性表现为 (见表2) , 缺素培养液培养植株的生理指标略低于用完全培养液培养的植株, 这可能是缺素培养后, 引起生物体膜脂过氧化程度增高, 导致生物体内自由基的产生与消除的平衡被迫坏, 加速植株早衰。相关性分析表明, 缺镁处理与完全培养液培养超氧化物歧化酶 (SOD) 活性表现极显著相关;在过氧化酶活性 (CAT) 方面, 缺氮、缺钾、缺镁处理分别与完全培养液培养呈极显著相关, 缺铁处理与完全培养液培养呈显著相关。
注:*代表0.05水平显著相关, **代表0.01水平相关。
3 讨论
植物除了从土壤中吸收水分外, 还要从中吸收矿质营养和氮素, 以维持正常的生命活动。作物缺乏某种必须元素时, 便会引起生理和形态上的变化。如:氮、磷是蛋白质、核酸、磷脂的主要成分, 缺氮、磷时, 蛋白质、核酸、磷脂等的物质合成受阻, 同时叶绿素合成受限。钾在碳水化合物代谢、呼吸作用及蛋白质代谢中起重要作用, 生物体缺钾还会间接地影响光合作用。钙离子可作为磷脂中的磷酸与蛋白质的羧基间联结的桥梁, 具有稳定膜结构的作用。镁在核酸和蛋白质代谢中起重要作用。铁是合成叶绿素所必需的, 它又是许多酶的辅基, 如细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等[10]。所以当培养液中缺少某种元素时均会使生物体蛋白质代谢降解加速, 含量降低;叶片绿色逐渐消失, 光合速率下降。又由于生物膜是由膜脂和蛋白质组成的连续的片层结构, 呈流动镶嵌模式。在膜上还存在有许多酶。缺素培养后, 膜失去适应力, 胞内物质发生泄漏, 膜功能受损, 使细胞中活性氧增多, 导致膜发生相变, 膜脂过氧化程度增高, 膜脂过氧化产物还会产生自由基, 如O2 -参与启动膜脂过氧化或膜脂肪脱脂作用[11]。通常, 细胞内产生的活性自由基会受到其植物体产生的保护酶调节与控制, 在逆境胁迫下和衰老过程中这些保护酶可清除过量的自由基 (如O2-由SOD清除, H2O2由CAT和POX等清除) , 维持代谢平衡, 保护细胞的正常结构, 因而植物能在一定程度上忍耐、减缓和抗御逆境胁迫, 延缓植物器官的衰老过程[12], 本研究在缺素培养过程中, SOD、POD、CAT活性降低, 说明植物体存在大量的自由基未来得及清除, 细胞膜受损, 导致植物体加速衰老[13]。所以合理施肥, 对延长玉米光周期、增加玉米产量具有重要的意义。
摘要：主要以玉米品种金玉1号为试材, 用水培法在苗期进行缺素 (N、P、K、Ca、Mg、Fe) 处理培养, 缺素症状出现后对其生理指标进行测量, 结果表明:在不同缺素培养下玉米叶片的丙二醛 (MDA) 含量显著增加, 产生的活性氧物质诱导超氧化物歧化酶 (SOD) 和过氧化物酶 (POD) 活性以及过氧化氢酶 (CAT) 活性下降, 植株的叶绿素含量、蛋白质含量降低。
关键词：玉米,缺素,细胞膜透性,保护酶
脂质过氧化物酶 篇2
过氧化物酶[peroxidase,POD,EC1.11.1.7(X)]是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的.一类氧化酶。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化瓜：RH2+H2O2 ・H2O+R。
作 者：田国忠 李怀方 裘维蕃 作者单位：田国忠(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所,)
李怀方,裘维蕃(中国农业大学植物保护学院植物病理系,)
脂质过氧化物酶 篇3
过氧化氢酶是一种重要的功能性食品酶, 在酸、碱或酶的作用下易失活;体内广泛存在的蛋白酶可降解游离CAT, 缩短其体内半衰期。以大豆卵磷脂和甘三酯为载体的SLN具有运载和防止CAT蛋白酶解的潜力。本研究室最近以富含PC的大豆卵磷脂制备了CAT-SLN, 本研究旨在探讨这种包埋技术对PC结构的影响及防止CAT被蛋白酶酶解的性能。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
CAT购自上海楷洋生物技术有限公司, CAT测试盒购自南京建成生物工程研究所, 三棕榈酸甘三酯 (TG) 和大豆磷脂酰胆碱 (PC) 为本试验室自制, 考马斯亮蓝G-250、丙酮和购自国药集团化学试剂有限公司, Poloxmer 188购自沈阳药大集琦药业有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 两步乳化法W/O/W制备过氧化氢酶固体脂质纳米粒
按照图1所示流程, 利用双乳化和溶剂蒸发技术制备过氧化氢酶固体脂质纳米粒 (CAT-SLN) , 合成工艺条件为:将浓度为2% (w/v) 的酶溶液 (内水相) 加入至含TG和PC (最佳PC∶TG=15.24%) 的二氯甲烷/丙酮 (1/1) (油相) , 油相∶内水相=5, 超声作用20s乳化形成W/O乳状液, 加入1.5%Poloxmer188水溶液 (第二相) 中, W/O乳状液∶第二相=1∶4, 超声作用30s乳化形成W/O/W型乳状液。所得双乳液抽真空旋转蒸发、冷冻离心 (15 000 r/min, 60 min, 4℃) 得到纳米粒。
1.2.2 CAT酶活测定
加入钼酸铵而迅速终止过氧化氢酶 (CAT) 分解H2O2的反应, 剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物, 在405nm处测定其生成量。定义每毫克酶每秒钟分解1μmol H2O2的量为一个活力单位。
1.2.3 过氧化氢酶包载在SLN中位置的测定
据文献报道, 荧光可以用来检测蛋白质包载在SLN中的位置。将制备得到的样品置于1cm直径的比色杯固定激发波长280nm, 发射波长300~750nm范围扫描样品, 测定样品的荧光发射峰强度。
1.2.4 体外释放检测
将冷冻离心得到的纳米粒置于离心管中, 加入pH值6.8的PBS1.0mL作为释放介质, 于恒温摇床中, 在37℃、100r/min进行释放试验。定时取样0.2mL离心, 并补加等量的新鲜PBS液, 继续振荡。所取上清液用考马斯亮蓝法测定其蛋白含量, 以PBS液为空白对照, 根据标准曲线计算释药量和累积释放率。
1.2.5 远紫外-圆二色光谱
将制备得到的酶溶液置于1cm直径的比色杯, 放入远紫外-圆二色光谱中, 在190~250nm的波长下扫描, 以PBS缓冲液作为空白, 测定其二级结构。
1.2.6 蛋白酶敏感性测定
使过氧化氢酶或CAT-SLN与0.2% (w/v) 蛋白酶K (溶于PBS, pH值7.3) 在37℃共孵育, 在不同时间点测定CAT酶活。
1.2.7 数据处理
用SPSS 10.0进行单因素方差分析, 用Tukey法进行多种比较。结果用平均值±SD表示。
2 结果与讨论
2.1 固体脂质纳米粒的体外释放
如图2所示, 在过氧化氢酶从纳米粒释放的初期, 有突释现象产生, 这种突释与脂质基质中PC∶TG有关, PC∶TG为5时最弱, PC∶TG为1时最明显。CAT在12h以后呈现持续的缓慢释放。外层没有包被Poloxmer188的W/O乳粒CAT释放最快。因此, SLN适合于作为延迟释药的给药系统, 可以通过改变脂类骨架结构、表面活性剂浓度和生产工艺参数 (如温度) 来修正释药曲线, 释药曲线可被调整为延迟释放而完全无突释现象, 也可以有部分突释, 随后是延迟释药, 在这些情况下突释药物可作为首剂量给予。
表面活性剂既可加速脂质降解 (如胆酸钠盐) , 也可延缓脂质降解 (如poloxamer407) , 通过选择合适的表面活性剂可获得适宜释药速率。过氧化氢具有高渗透性, CAT-SLN具有低释放速率也可发挥良好作用。因此本研究中用poloxamer118做为表面活性剂是适宜的。如选用其他poloxamer系列表面活性剂可能进一步降低释放速率, 还待进一步研究。
2.2 过氧化氢酶包载在SLN中的位置
药物在SLN中的分布主要由药物性质 (熔点、极性等) 、脂质材料性质、表面活性剂浓度和工艺参数 (制备温度等) 决定其分布模式, 有固体溶液型 (药物以分子形式分散于脂质材料中, SLN的基材是固体溶液) 、内核-外层型 (药物浓集于外层) 和内核-外层型 (药物浓集于内核) (图3) 。
当荧光的激发波长在280nm时, 过氧化氢酶在其最大发射波长560nm处将会有一个强烈的荧光发射峰。因此, 利用重金属盐使CAT变性, 从而影响其荧光强度可以判断过氧化氢酶在SLN中的具体位置。在这部分试验中, 硫酸铜被选取作为过氧化氢酶的变性剂。我们首先按照包载药物的制备顺序利用双乳液法制备出包载过氧化氢酶的SLN, 然后平行地将相同数量的过氧化氢酶加入到空白SLN的外水相当中。最后, 我们将不同浓度的硫酸铜溶液作为淬灭剂加入到SLN的外水相当中, 进而测定溶液的荧光强度。最后通过荧光强度的变化, 推测其在SLN中的位置。
由图4可知:当硫酸铜加入后, 处于外水相的CAT将在重金属Cu2+的作用下发生变性从而导致荧光淬灭。当过氧化氢酶在制备过程中加入到SLN中时, 随着硫酸铜浓度的增加, 荧光强度并没有发生明显的降低, 由此可证明, 在外水相中并没有大量的过氧化氢酶分子, 且处于SLN内部的过氧化氢酶在脂质的保护下没有发生淬灭。在对照试验中, 当过氧化氢酶在SLN制备完成后加入到外水相中时, 随着硫酸铜浓度的逐渐增大, 过氧化氢酶的荧光强度发生明显降低, 可见在外水相当中, 确实存在大量的过氧化氢酶分子, 与本身过氧化氢酶加入在外水相当中的试验过程相吻合。这组试验数据说明, 当采用复配乳化剂时, 过氧化氢酶分子在制备过程中被包载进脂质核的内部当中, 并且在W/O型乳状液向外水相分散制备成SLN的过程中, 过氧化氢酶没有从中释放出来。由此推测, 添加到SLN内部当中的过氧化氢酶分子可能大部分存在于固体脂质和内水相之间, 一部分过氧化氢酶可能从中释放出来。
研究表明:如药物熔点高于脂质材料, 冷却时会先结晶凝固形成药物核心, 表现出缓释行为;若药物熔点低于脂质材料, 则脂质先重结晶, 药物分布于外层, 表现出突释行为。此外药物亲脂性越高, 包封率相应越高。本研究结果按时CAT的熔点应该高于PC∶TG为5的脂质材料。而从图2可以推测, 当PC∶TG大于或小于5时, CAT相对于脂质材料的熔点可能较高。
2.3 释放后过氧化氢酶与原过氧化氢酶的远紫外-圆二色光谱
由于纳米粒子会产生严重的光散射现象, 严重干扰测量结果, 所以在SLN相中的蛋白质的二级结构用圆二色的方法测定较为困难。故本节将释放后的过氧化氢酶与原样对比, 考察其在制备过程中二级结构的变化。
在图5中208nm和218nm处为α-螺旋的特征峰;215nm是β-折叠的特征峰。表1分别列出了过氧化氢酶原样和释放出来的过氧化氢酶的二级结构形式的百分比。通过对比发现, 过氧化氢酶中α-螺旋的含量基本不变;而β-折叠的含量有所差别, 释放出来的β-折叠含量明显比在原样含量低;而且释放出来的β-转角含量比原样含量高。由于β-折叠和β-转角都是由氢键构成, 这里可能存在着β-折叠向β-转角转变的过程, 因而导致β-折叠的含量降低。由此可见, 过氧化氢酶的二级结构仅仅是受到轻微的扰动, 并没有遭到破坏, 其二级结构仍然较好地保持着。
2.4 CAT-SLN的抗蛋白酶性质
如图6所示, 与蛋白酶K孵育后, 游离过氧化氢酶在1h内活性下降了近70%, 5h后活性检测不到, CAT-SLN在5h时还保留48%活性, 近24h时抑制保持30%左右活性, 蛋白酶处理后CAT-SLN活性的降低可能主要归因于表面结合及释放的CAT。由于CAT的作用对象H2O2具有强扩散性, CAT-SLN脂质核心中的CAT可以高效将其降解。
3 结论
脂质载体中PC和TG比例对CAT-SLN缓释效果有显著影响, 使用Poloxmer 188作为外相乳化剂可显著提高缓释效果, 当脂质载体PC∶TG为5时CAT累计释放率最低。CAT主要存在于SLN脂质核心。包埋对CAT的结构没有显著影响。CAT-SLN具有显著的抗蛋白酶酶解作用。
参考文献
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脂质过氧化物酶 篇4
本指导原则是对抗甲状腺过氧化物酶抗体测定试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、适用范围 从方法学考虑，在本文中抗甲状腺过氧化物酶抗体测定试剂盒是指采用化学发光免疫分析技术，利用全自动、半自动化学发光免疫分析仪，对人血清或血浆等样本中抗甲状腺过氧化物酶抗体的含量进行体外定量分析的试剂。化学发光免疫分析法主要有直接化学发光、电化学发光、酶促间接化学发光等。
根据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管〔2013〕242号），抗甲状腺过氧化物酶抗体测定试剂盒的管理类别为二类，分类代码为6840。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。
本指导原则不适用于：
（一）单独申请注册的抗甲状腺过氧化物酶抗体校准品和质控品。
（二）化学发光免疫分析法原理之外的其他抗甲状腺过氧化物酶抗体测定试剂盒。
二、注册申报资料要求 （一）综述资料 甲状腺过氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO），是催化甲状腺激素的重要酶，由甲状腺滤泡细胞合成。其主要成分是由933个氨基酸残基组成的分子量103kD的10%糖化的血色素样蛋白质，表达在细胞表面，在滤泡腔面的微绒毛处分布最为丰富。该酶可与甲状腺球蛋白（Thyroglobulin，Tg）协同作用将L-酪氨酸碘化，并将一碘酪氨酸和二碘酪氨酸联结成为甲状腺激素T4、T3和rT3。TPO也是自身免疫性甲状腺疾病一种重要的自身抗原，可以刺激机体免疫系统产生抗TPO抗体（Antibodies to thyroid peroxidase，Anti-TPO）。Anti-TPO作为自身免疫性甲状腺疾病一种主要的自身抗体，可通过激活补体、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用和致敏的T杀伤细胞直接杀伤等作用机制，引起甲状腺滤胞损伤，间接的抑制甲状腺素的合成，导致甲状腺功能减退。检测该类抗体的主要适用症为自身免疫性甲状腺疾病（包括突眼性甲状腺肿和桥本甲状腺炎等）。
Anti-TPO抗体主要以IgG类为主，该抗体主要见于自身免疫性甲状腺病，如桥本甲状腺炎（阳性率85%~100%）、Graves病（阳性率65%）、原发性黏液性水肿患者；
也见于其他器官特异性自身免疫病，如1型糖尿病（阳性率14%）、Addison病（阳性率31%）、恶性贫血（阳性率55%）及产后甲状腺炎（阳性率15%）等。目前认为，Anti-TPO抗体为人类自身免疫性甲状腺炎较理想的标志抗体，阳性结果可用于自身免疫性甲状腺疾病的辅助诊断。
综述资料应主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性方面的说明、研究结果的总结评价以及同类产品在国内外上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学、临床应用情况、申报注册产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的异同方面进行介绍。应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。
（二）主要原材料研究资料（如需提供）1.所用抗原/抗体的制备、筛选、纯化以及鉴定等详细试验资料。如抗原/抗体为申请人自制，则应详述抗原/抗体的名称及生物学来源，申请人对该抗原/抗体技术指标的要求（如外观、纯度、蛋白浓度、效价等），且其生产工艺必须相对稳定，并对其工艺有相关的验证。同时确定该抗原/抗体作为主要原材料的依据和质量标准；
如为申请人外购，则应详述其名称及生物学来源，外购方名称，提交外购方出具的抗原/抗体性能指标及检验证书，详述申请人对该抗原/抗体技术指标的要求以及申请人确定该抗体作为主要原材料的依据。
2.质控品（如有）的原料选择、制备、定值过程及试验资料。
3.申请人应根据GB/T 21415—2008/ISO 17511：2003《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》提供所用校准品的来源、赋值过程和相应指标、以及不确定度等内容。明确校准品的质量标准并提供校准品的溯源性文件，校准品应溯源至现行的国家标准品或国际标准品。
（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料（如需提供）生产工艺主要包括：各组分制备工艺的研究，包括试剂的配方及工艺关键参数的确定依据等。反应体系主要包括：反应条件、样本用量、试剂用量等确定的依据。
1.主要生产工艺介绍，可以流程图方式表示，并简要说明主要生产工艺的确定依据。
2.产品反应原理介绍。
3.抗原/抗体包被工艺研究：申请人应考虑如包被缓冲液及添加量、浓度、时间、温度等指标对产品性能的影响，通过试验确定上述指标的最佳组合。
4.体系反应条件确定：申请人应考虑反应模式、反应时间、反应温度、洗涤次数等条件对产品性能的影响，通过试验确定上述条件的最佳组合。
5.体系中样本及试剂的加样方式及添加量确定：申请人应考虑样本加样方式、加样量以及试剂添加顺序、添加量对产品检测结果的影响，通过实验确定最佳的样本及试剂的添加方式和添加量。如样本需采取稀释或其他必要的方法进行处理后方可用于最终检测，申请人还应对可用于样本稀释的基质或处理方法进行研究，通过试验确定样本稀释基质或处理方法。确定反应所需其他试剂用量（校准品、标记物、底物等）的研究资料。
（四）分析性能评估资料 企业应提交产品研制阶段的所有性能验证的研究资料，包括具体研究方法、质控标准、实验数据、统计分析等详细资料。建议选择不少于3批产品对以下分析性能进行研究，包括检出限、线性、准确度、重复性、批间差、特异性等指标。
对于适用多个机型的产品，应提供产品说明书【适用仪器】项中所列的所有型号仪器的性能评估资料。如产品涉及不同包装规格，则需要提供每个包装规格在不同型号仪器上的评估资料；
如不同包装规格之间不存在性能上的差异，需要提交包装规格间不存在性能差异的说明。
1.准确度 按以下优先顺序选择准确度性能评估方法，其结果应满足相关国际/国家及行业标准的要求：
1.1相对偏差 根据企业提供的试剂盒线性区间，将有证参考物质或其他公认的参考物质，或由参考方法定值的人源性样品（可适当添加被测物，以获得高浓度的样品）作为样本，合理设置2~3个浓度，将其作为样本按照待测试剂盒说明书的步骤进行检测，每个样品重复测定3次，测试结果记为（Xi），按式（1）分别计算相对偏差（Bi）。如果3次结果都符合要求，即判为合格。如果大于等于2次的结果不合格，即判为不合格。如果有1次结果不符合要求，则应重新连续测试20次，并分别按照公式（1）计算相对偏差，如果大于等于19次测试的结果符合要求。
……………（1）式中：
Bi——相对偏差；
Xi——测量浓度；
T——标定浓度。
注：优先考虑使用国家标准品或国际标准品、参考品。
1.2比对试验 参考体外诊断试剂分析性能评估相关技术审查指导原则的要求完成准确度（方法学比对）评估。
取不少于40个合理分布在线性区间内不同浓度的人血清或/和血浆样本，待测Anti-TPO试剂与生产企业选定的比对系统进行比对试验。每份样本按待测试剂及选定比对系统的要求分别进行检测，每份样本各测定1遍，用线性回归方法对两组结果进行线性拟合，得到线性回归方程的相关系数（r）和斜率，计算各个样本的待测试剂测定值与比对系统测定值的绝对偏差或相对偏差。
1.3回收实验 参考体外诊断试剂分析性能评估相关技术审查指导原则要求完成准确度（回收实验）评估。
方法：选择接近参考区间的常规检测样本，分为体积相同的3—4份，在其中2—3份样本中加入不同浓度相同体积的待测物标准液制备待回收分析样本，加入体积小于原体积的10%，制成2—3个不同浓度的待回收分析样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样体积的无待测物的溶剂，制成基础样本。用待评价系统对待回收分析样本和基础样本进行测定，通常对样本进行3次重复测定，计算均值，取其均值进行下述计算，求得回收率。
数据处理及结果报告：
用公式（2）计算回收率：
……（2）式中：R—回收率；
V—加入待测物标准液的体积；
V0—基础样本的体积 C—基础样本加入待测标准物质后的检测浓度；
C0—基础样本的检测浓度；
Cs—待测物标准液的浓度。
2.检出限（LOD）申请人应评估空白限（LOB）和检出限（LOD）。
空白限的建立可使用检测零浓度校准品或样本稀释液的方法进行。例如重复测定20次，根据测量结果的平均值（M）和标准差（SD），计算M+2SD及其对应的浓度值，结果应符合企业规定要求。
检出限的确立可采用系列稀释参考品的方法进行。建议使用国际参考品/国家参考品进行梯度稀释并进行至少60次检测，95%以上的检测结果高于空白限作为检出限。最低检出限应不高于12IU/ml。另外，应使用最低检出限或接近最低检出限水平的样本进行检出限的验证，结果应符合产品技术要求性能指标的要求。
3.线性 建立试剂线性范围所用的样本基质应尽可能与临床实际检测的样本相似，理想的样本为分析物浓度接近预期测定上限的人血清/血浆，且应充分考虑多倍稀释对样本基质的影响。建立一种定量测定方法的线性范围时，需在预期测定范围内选择7—11个浓度水平。例如，将预期测定范围加宽至130%，在此范围内选择更多的浓度水平，然后依据实验结果逐渐减少数据点直至表现出线性关系，确定线性范围。
验证线性范围时，可以采用高浓度样本稀释的方法验证线性，将接近线性区间上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。按试剂说明书操作，对每一浓度的样本均重复检测不少于2次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，计算线性相关系数r，应不低于0.9900，线性区间应不窄于[12，400]IU/mL。
4.重复性 重复性的评估应包括至少两个浓度水平的样本进行，两个浓度都应在试剂的测量范围内，且有一定的临床意义，通常选用该检测指标的正常参考值附近样本和病理高值样本，建议采用浓度为（30±6）IU/mL和（200±40）IU/mL的样本。
分别用不同浓度的样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值（M）和标准差（SD），根据公式（3）得出变异系数（CV）。
CV= SD/M×100% ……………………（3）5.批间差 用3个批号的试剂盒分别检测浓不同浓度（建议与重复性样本浓度的选择一致）的样本，各重复10次，计算每个浓度样本30次测量结果的平均值（M）和标准差（SD），根据公式（3）得出变异系数（CV），应不大于15%。
6.特异性 推荐参考CLSI的EP7-A2《临床生化干扰实验批准指南》或《WS/T416-2013 干扰实验指南》进行特异性评估。
6.1交叉反应：易产生交叉反应的其他抗体等的验证情况，应至少验证与抗甲状腺球蛋白抗体的交叉反应情况。
6.2干扰物质：样本中常见干扰物质对检测结果的影响，如血红蛋白、高脂、黄疸、类风湿因子、抗核抗体、嗜异性抗体、总蛋白以及说明书中声称其他的干扰物质对检测结果的影响。干扰物浓度的分布应覆盖人体样本生理及病理状态下可能出现的物质浓度。建议将研究结果在说明书中进行说明。
如无法获得含有高浓度干扰物质的样本，可采用纯品物质分别添加到健康人样本、参考区间附近样本、中浓度值样本中的方式进行验证。方法为对模拟添加样本分别进行验证，样本量选择应体现一定的统计学意义，说明样本的制备方法及干扰试验的评价标准，确定可接受的干扰物质极限浓度，被测物浓度至少应包括其医学决定水平的浓度。
7.钩状（HOOK）效应（如适用）说明不会产生HOOK效应的浓度上限或相关研究，如需稀释，应注明对稀释液的要求、最佳或最大稀释比例。每个浓度重复3份，对钩状效应进行合理的验证。建议在产品说明书上明示对钩状效应的研究结果。
过度稀释可能影响样本基质，研究过程应注意基质效应影响，必要时应提供基质效应研究有关的资料。
8.校准品及质控品（如适用）参照GB/T 21415—2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》的要求，提供企业（工作）校准品及试剂盒配套校准品定值及不确定度计算相关资料，提供质控品赋值及其质控范围确定的相关资料。Anti-TPO已有国家标准品和国际标准品，试剂盒配套校准品和质控品，应参照GB/T 21415—2008的要求溯源至国家（国际）标准品。如校准品或质控品的基体不同于临床常用样本类型，还应提交校准物质互换性的相关研究资料。
9.样本类型的研究（如适用）如果试剂盒适用样本类型包括血浆样本，应采用各种适用抗凝剂抗凝的血浆样本分别与血清样本进行对比实验研究，样本量的选择应符合统计学意义。方法为对比线性范围内的同一病人的血清和血浆样本，样本浓度应均匀分布且包含医学决定水平以及低值浓度，以验证申报试剂盒对于血清和血浆样本检测结果的一致性。如同一病人的不同抗凝剂抗凝的高值血浆样本难以获得，可采用高值血清样本分别添加到健康人的血清和不同抗凝剂抗凝的血浆样本中进行验证。
性能指标的评价方法并无统一的标准可依，可根据不同的试剂特征进行，前提是必须保证研究的科学合理性。具体研究方法建议参考相关国内外有关体外诊断产品性能评估的文件进行。
（五）参考区间确定资料 参考区间确定所采用的样本来源、确定方法及详细的试验资料。样本来源覆盖年龄、性别等因素，尽可能考虑样本来源的多样性、代表性。应明确参考人群的筛选标准，研究各组（如性别、年龄等）例数不应低于120例。建议参考CLSI C28-A3c或WS/T 402-2012《临床实验室检验项目参考区间的制定》进行相应研究。
参考值研究结果应在说明书【参考区间】项中进行相应说明。
（六）稳定性研究资料 稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂盒的稳定性和适用样本的稳定性研究。试剂盒稳定性主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开瓶（在机）稳定性、复溶稳定性（干粉或冻干粉）及热稳定性等研究，申请人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据以及结论，应涵盖产品中受稳定性影响的性能指标（如准确度、线性、重复性、检出限等）。
样本稳定性研究主要包括样本在室温、冷藏或冷冻保存条件下抗甲状腺过氧化物酶抗体含量的稳定性验证，可以在合理的温度范围内选择温度点（温度范围），每间隔一定的时间段即对储存样本进行稳定性验证，从而确定不同类型样本的保存条件及使用期限。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行研究。
试剂盒稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中分别进行详细说明。
（七）临床评价资料 根据《关于公布新修订免于进行临床试验医疗器械目录的通告》（国家药品监督管理局通告2018年第94号），抗甲状腺过氧化物酶（TPO）抗体检测试剂可免于进行临床试验，申请人可依照《免于进行临床试验的体外诊断试剂临床评价资料基本要求（试行）》开展评价。申请人如无法或不适于按照上述要求对产品进行临床评价，则应按照《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的要求开展临床试验。
下面仅对临床试验中的基本问题进行阐述。
1.临床试验研究方法 选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，采用试验用体外诊断试剂（以下称考核试剂）与之进行比较研究试验，证明本产品与已上市产品等效或优于已上市产品。对比试剂尽量选择方法学相同、线性范围、参考区间及精密度等性能接近的同类产品。
2.临床试验机构的选择 2.1应在至少两家经国家食品药品监督管理总局备案的临床试验机构开展临床试验。
2.2临床试验机构应有能力提供临床试验所需的各类样本，实验操作人员有足够的时间熟悉检测系统的各环节（仪器、试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，考核试剂和对比试剂都应处于有效的质量控制下，定期对仪器进行校准，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。
3.临床试验方案 临床试验实施前，研究人员应从临床医学、检验医学、统计学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。各临床试验机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。
试验方案中应确定严格的样本纳入/排除标准，任何已经入选的样本再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。在试验操作过程中和判定试验结果时应采用盲法及样本随机分配以保证试验结果的客观性。待评价试剂的样本类型应不超过参比试剂的样本类型，且每种样本类型例数的选择应符合基本的统计学要求。
4.研究对象选择 4.1临床试验样本量的确定：在符合指导原则有关最低样本要求的前提下，还应符合统计学要求。
4.1.1对于同源的不同样本类型，其中一种样本类型临床试验的样本数至少为200例，其他样本类型在至少2家（含2家）临床试验机构共验证不少于100例受试者的自身血清、血浆样本测试结果间的一致性（采用考核试剂评价），其中不同浓度样本分布情况与总例数中分布情况应一致。
4.1.2应考虑样本量的分布，各临床试验机构样本量和样本分布应相对均衡。
4.2按说明书的样本要求，明确试验用样本的存贮条件、可否冻融等要求及避免使用的样本，血浆样本应明确抗凝剂的要求。实验中，尽可能使用新鲜样本，避免贮存。如无法避免使用贮存样品时，注明贮存条件及时间，在数据分析时应考虑其影响。
4.3各种类型的样本浓度应覆盖考核试剂线性范围，尽可能均匀分布。尽可能使不少于30%样本的测定值处于参考区间以外，但在线性范围内。
4.4变更事项相关的临床试验:涉及产品检测条件优化、增加与原样本类型具有可比性的其他样本类型等变更事项，产品临床试验总样本数至少为100例，并在至少2家（含2家）临床试验机构开展临床试验；
变更抗原、抗体等主要原材料的供应商、阳性判断值或参考区间的变化及增加临床适应症等变更事项，应根据产品具体变更情况，酌情增加临床试验总样本数。
4.5应考虑在临床试验中选择部分含干扰物质的标本进行对比研究，包括高脂、溶血、黄疸的样本、类风湿因子等阳性样本，易共存的其他自身免疫抗体同时升高的患者标本，以从临床角度验证试剂的特异性。
5.统计分析 对临床试验结果的统计应结合临床试验数据的正/偏态分布情况选择合适的统计方法，如离群值判断、相关分析、线性回归、Bland-Alraman分析（如绝对偏倚/偏差及相对偏倚/偏差分析）等。对于对比实验的等效性研究，最常用是对考核试剂和对比试剂两组检测结果的相关及线性回归分析，以y=a+bx和R2的形式给出回归分析的拟合方程，其中：y是考核试剂结果，x是对比试剂结果，b是方程斜率，a是y轴截距，R2是判定系数，r是相关系数，同时应给出b的95%（或99%）置信区间。结合临床试验数据的对比情况，统计学负责人进行统计分析，应可以证明两种方法的检测结果具有较好的相关性。
分别计算医学决定水平处或参考区间临界值相对偏倚/偏差及95%置信区间。医学决定水平处相对偏倚应不大于允许误差（建议参照1/2CLIA’88、1/2室间质评可接受范围、1/2来源于生物变异的总允许误差、卫生行业标准、准确度相对偏差等相关要求设定允许误差）。
6.结果差异样本的验证 对于比较研究试验中测定结果不符的样本，应采用“金标准”或其他合理的方法进行复核，以便对临床试验结果进行分析。如无需复核，应详细说明理由。
7.临床试验总结报告撰写 临床试验总结报告应对试验的整体设计及各个关键点给予清晰、完整的阐述，对整个临床试验实施过程、结果分析、结论等进行条理分明的描述，并包括必要的基础数据和统计分析方法。具体撰写内容应符合《关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）的要求。
（八）产品风险分析资料 申请人应考虑产品寿命周期的各个环节，从预期用途、可能的使用错误、与安全性有关的特征、已知及可预见的危害等方面的判定以及对患者风险的估计进行风险分析，应符合YY/T 0316—2016/ISO 14971：2007《医疗器械风险管理对医疗器械的应用》及附录H的要求。
风险分析资料应包含以下内容：
1.概述：简要介绍风险分析资料的编制依据、适用范围、产品描述、风险管理计划及实施情况等。
2.风险管理人员及其职责分工：明确风险管理小组成员及职责，制定风险管理流程图，明确风险管理活动的评审要求等。
3.风险可接受准则：明确风险可接受的准则。
4.预期用途和安全性有关特征的判定：以YY/T 0316—2016附录H为基础，判定产品预期用途和与安全性有关的特性，判定已知和可预见的危害、对患者风险的评估，并形成问题清单。
5.风险评价、风险控制和风险控制措施：对每一判定为危害的不正确结果的风险进行评价，并制定相应的风险控制方案及措施。
6.综合剩余风险的可接受性评价：对比采取风险控制措施前后的风险情况，对剩余风险的可接受性进行评价。
7.风险控制措施验证：对风险控制措施的有效性进行验证分析。
8.生产和生产后监测：对产品生产和生产后的性能进行内部和外部的监测。内部监测包括生产过程控制，外部监测包括用户投诉、不良事件、第三方性能评价等。本项内容由产品上市后补充，产品注册时提供监测信息表格的设计内容。
9.风险管理评审结论：风险管理小组下达风险评审结论。
（九）产品技术要求 产品技术要求应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号）和《关于发布医疗器械产品技术要求编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号）的相关规定。
产品技术要求不得低于行业标准YY/T 1458—2016《抗甲状腺过氧化物酶抗体定量检测试剂（盒）（化学发光免疫分析法）》的要求。
作为定量检测试剂盒，产品技术要求应主要包括以下性能指标：外观、装量、检出限、线性、准确度、重复性、批间差等。若有国家标准品或国际标准品、参考品，准确度首选国家标准品或国际标准品、参考品进行评估。
如注册单元中包含校准品或质控品，其性能指标的检验方法应在技术要求中予以描述。应至少包含外观、装量（干粉试剂可不做）、赋值准确度、均匀性。冻干型校准品和质控品还应检测批内瓶间差和复溶稳定性。
（十）产品注册检验报告 根据《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的要求，首次申请注册的第二类产品应该在国家食品药品监督管理部门认可的、具有相应承检范围的医疗器械检测机构进行样品的注册检测。Anti-TPO已有国家参考品、标准品，在注册检测时应采用国家参考品、标准品进行注册检验。注册申报资料中应包括相应的注册检验报告和产品技术要求预评价意见。注册审查时提出补充检验要求的，应在原检验机构进行检验。
（十一）产品说明书 说明书承载了产品预期用途、样本要求、检验方法、检测结果的解释以及注意事项等重要信息，是指导使用者正确操作、临床医生针对检验结果给出合理医学解释的重要依据，因此，产品说明书是体外诊断试剂注册申报最重要的文件之一。产品说明书的编写应符合《关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书的一致性，翻译力求准确且符合中文表达习惯。产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致，如某些内容引用自参考文献，则应以规范格式对此内容进行标注，并单独列明文献的相关信息。
根据《关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求并结合抗甲状腺过氧化物酶抗体本身的特点，对试剂说明书的重点内容进行详细说明，以指导注册申报人员更合理地完成说明书编制。
1.【产品名称】 （1）通用名称：试剂盒名称由三部分组成：被测物名称、用途、方法或原理。例如：抗甲状腺过氧化物酶抗体测定试剂盒（化学发光免疫分析法）。名称中不应当出现样本类型及定量等内容。
（2）英文名称（如有）应当正确、完整，可直译，不宜只写缩写。
2.【包装规格】 （1）应与产品技术要求中所列的包装规格及型号一致。
（2）注明装量或可测试的样本数，如××测试/盒、××mL。
（3）注明各包装规格的数量，如20mL×2。
（4）如申报产品的包装规格较多，不同包装规格之间应按照分隔层次分别使用顿号、逗号、分号进行区分，统一以句号结束。如仅单一包装规格，其后可以不加标点符号。
3.【预期用途】 第一段：产品的预期用途建议描述为：本产品用于定量检测人血清或血浆中抗甲状腺过氧化物酶抗体的含量。适用的样本类型应结合实际的临床研究情况进行确认。
第二段：简要介绍抗甲状腺过氧化物酶抗体的临床意义。注：临床适应症相关信息应提供文献出处（标注并在【参考文献】列出）。
4.【检验原理】 详细说明检验原理、方法，必要时可采用图示方法描述。
5.【主要组成成分】 5.1说明产品包含试剂组分的名称、数量等信息，涉及的英文缩写首次出现应全部以中文表述。
5.2对于多组分试剂应明确说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。如可互换，应提交相关验证材料。
5.3如试剂盒中包含耗材，应列明耗材名称、数量等信息。
5.4对于产品中不包含，但对该试验必需的试剂组分，应列出此类试剂的名称，提供稀释或混合方法及其他相关信息。
5.5试剂盒中如包含校准品和/或质控品，应说明其主要组成成分及其生物学来源：应注明校准品的定值及其溯源性，溯源性至少应写明溯源到的最高级别，包括：标准物质的发布单位。质控品的靶值范围如为批特异，可注明批特异，并附单独的靶值单。
6.【储存条件及有效期】 根据产品的实时稳定性、开瓶稳定性、在机稳定性等稳定性研究结果，对产品的储存条件及有效期做以下说明：
6.1说明产品的储存条件及有效期，如：2℃~8℃、-18℃以下或其他温度条件保存的有效期限。
6.2如果打开包装后产品或组分的稳定性不同于原包装产品，则打开包装后产品或组分的储存条件也必须注明。
6.3如试剂盒各组分的稳定性不一致，则应对各组分的储存条件和有效期分别进行描述。
6.4对于可以冷冻的试剂盒应注明冻融次数限制。
6.5增加“生产日期、使用期限或者失效日期：见标签”的字样。
注1：保存条件不应有模糊表述，稳定期限应以月或日或小时为单位。
注2：保存条件不应有模糊表述，如“常温”、“室温”，应明确贮存温度，如2℃~8℃，有效期12个月。
7.【适用仪器】 说明可适用的仪器及型号，应写明具体适用仪器的型号，不能泛指某一系列仪器。适用仪器需写明厂家及型号，如不同包装规格适用于不同的机型，可写明适用关系。
8.【样本要求】 重点明确以下内容：
8.1明确本产品适用的样本类型，血液样本应当说明对采血管及抗凝剂的要求，其他样本应说明样本采集、处理及保存方式。
8.2样本采集：采集时间点是否受临床症状、用药情况等因素的影响，尽量减少由于样本采集或处理不当对实验造成的影响。
8.3样本处理、运送及保存：明确样本处理方法、样本的保存条件及期限（短期、长期）等。冷藏/冷冻样本检测前是否须恢复室温，冻融次数的要求。
8.4应与样本稳定性的研究一致。
9.【检验方法】 详细说明实验操作的各个步骤，包括：
9.1实验条件：实验环境的温度、湿度等注意事项，检验试剂及样本复温、试剂孵育温度等要求。
9.2试剂准备及配制方法、注意事项。
9.3待测样本的预处理方法、步骤及注意事项。
9.4明确样本检测的操作步骤，如样本满足临床检测需要的加样量及观察时间。
9.5校准：校准品的使用方法、注意事项、校准曲线的绘制方法。对适用于具有校准曲线保存功能检测仪器的产品，应注明校准周期。
9.6质量控制：明确质控品的选择、质控品的使用方法、对质控结果的必要解释以及推荐的质控周期等；
建议在本部分注明以下字样：如果质控失控时，应分析原因并采取纠正措施。
10.【参考区间】 10.1应注明常用样本类型的正常参考区间，并简要说明参考区间确定的依据，如样本量、人群、年龄、统计方法等。
10.2建议注明以下字样“建议各实验室根据实际条件及接触人群建立自己的参考区间”。
11.【检验结果的解释】 对所有可能出现的结果进行合理的解释：
11.1本试剂盒的检测结果仅供临床参考，不得作为患者病情评价的唯一指标，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。
11.2分析异常值出现的可能因素，明确说明何种情况下需要进行重复检测，以及在重复检测时对待测样本可能采取的优化条件等进行详述。
11.3超出检测范围的样本怎样报告结果，如要得到准确的结果需怎样处理，如需稀释，应注明稀释方法、最佳或最大稀释比例等。
12.【检验方法的局限性】 12.1干扰物质及钩状效应（HOOK效应，如适用）对检测结果的影响，结果应量化表示，禁用轻度、严重等模糊表述。
12.2有关假性升高或降低结果的可能性分析。
12.3抗凝剂对检测结果的影响（如适用）。
13.【产品性能指标】 根据产品技术要求对性能指标进行描述。应至少包括：检出限、准确度、线性、重复性、批间差等。
14.【注意事项】 应至少包括以下内容：
14.1仅用于体外诊断。
14.2有关人源组分（如有）的警告，如：试剂盒内质控品或其他可能含有人源物质的组分，虽已经通过了HBsAg、HIV1/2-Ab、HCV-Ab和Anti-TP等项目的检测，但截至目前，没有任何一项检测可以确保绝对安全，故仍应将这些组分作为潜在传染源对待。
14.3使用不同生产商的试剂盒对同一份样本进行检测可能会存在差异。
14.4如无确切的证据证明其安全性，对所有样本和反应废弃物都视为传染源进行处理。
14.5有关实验操作、样本保存及处理等其他注意事项。
15.【标识的解释】 如有图形或符号，请解释其代表的意义。如没有，本项可以缺省。
16.【参考文献】 注明引用的参考文献，并在说明书相应内容处标注参考文献编号。参考文献的格式参考论文规范要求。
17.【基本信息】 根据《关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求编写。
17.1注册人与生产企业为同一企业的，按以下格式标注基本信息：注册人/生产企业名称、住所、联系方式，售后服务单位名称、联系方式、生产地址、生产许可证编号。
17.2委托生产的按照以下格式标注基本信息：注册人/生产企业名称、住所、联系方式、售后服务单位名称、联系方式，受托企业的名称、住所、生产地址、生产许可证编号。
18.【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】 注明该产品的注册证编号/产品技术要求编号。
19.【说明书核准日期及修改日期】 注明该产品说明书的核准日期。如曾进行过说明书的变更申请，还应该同时注明说明书的修改日期。
三、审查关注点 （一）技术要求中性能指标的设定及检验方法是否符合相关行业标准的要求；
技术要求的格式是否符合《关于发布医疗器械产品技术要求编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第9号）的相关规定。
（二）产品说明书的编写内容及格式是否符合《关于发布体外诊断试剂说明书编写指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第17号）的要求。
（三）分析性能评估指标及结果是否满足产品技术要求的规定；
是否满足本指导原则中分析性能评估的要求。
（四）参考区间确定使用的方法是否合理，数据统计是否符合统计学的相关要求，结论是否与说明书声称一致。
（五）产品稳定性研究方法是否合理，稳定性结论是否与说明书声称一致。
（六）临床试验采用的样本类型是否满足产品声称的预期用途，样本量及临床试验机构的选择、对比试剂的选择、统计方法及研究结果、临床方案及报告撰写的格式等是否符合《关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告》（国家食品药品监督管理总局通告2014年第16号）或《免于进行临床试验的体外诊断试剂临床评价资料基本要求（试行）》（国家食品药品监督管理总局通告2017年第179号）对相关内容的规定。
（七）产品风险分析资料的撰写是否符合YY/T 0316—2016《医疗器械风险管理对医疗器械的应用》的要求。
脂质过氧化物酶 篇5
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
(1) SD大鼠, 广西医科大学动物实验中心提供;动物证号:广西眼镜蛇毒, 广西医科大学蛇毒研究所提供, 淡黄色冻干粉。
(2) TU1800紫外-可见分光光度计, 上海通用公司。
(3) 1, 1, 3, 3-tetrae horypropane (TEP) , 瑞士;L-半胱氨酸, 上海伯泉生物科技有限公司;2-硫代巴比妥酸 (TBA) , 中国医药 (集团) 上海化学试剂公司;其余试剂均为分析纯。
1.2 肝匀浆脂质过氧化测定
(1) 10%肝匀浆的制备
取SD大鼠, 禁食一天, 颈椎脱臼法致死, 称重, 取肝脏, 用预冷到4℃的含0.15mol/L葡萄糖磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 冲洗四次, 清除表面残余血, 用滤纸吸干, 称重。剪碎混合后匀浆。用含糖PBS稀释成20%肝匀浆, 3000r/min离心10min, 取上清液, 用含糖PBS等体积稀释, 制成10%肝匀浆备用液, 置于-20℃备用。临用前解冻, 用无糖PBS溶液稀释到50ml[3]。
(2) 考马斯亮蓝法测定肝匀浆的蛋白含量[4]
采用考马斯亮兰法制作蛋白含量测定的标准曲线, 以蛋白浓度为纵坐标, 吸光度为横坐标, 得回归方程为y=0.749x+0.0258, 相关系数r=0.9990。计算得用无糖PBS稀释后肝匀浆蛋白质的含量为C=0.564mg/ml。
(3) MDA测定[5]
精确量取肝匀浆稀释液1ml, 加入不同浓度的样品液, 再加1mmol/L硫酸亚铁溶液0.1ml、0.01mol/L半胱氨酸溶液0.02ml, 用无糖PBS补充到相同体积, 混匀, 37℃水浴20min。加入20%醋酸溶液2ml终止反应, 最后加入0.67%TBA溶液1ml, 混匀, 沸水浴中加热15min, 冷却至室温。3000r/min离心10min, 取上清液。在530nm处测定吸光度值, 以获取脂质过氧化终产物MDA含量。空白管为1.00ml肝匀浆稀释液加无糖PBS溶液, 对照管不加样品, 以0.1mlTEP (50umol/L) 产生的MDA作为标准。
(4) 统计学处理
SPSS 13.0统计软件包对资料进行统计学分析, 结果以均数±标准差 (-±s) 表示, 各组与对照组比较, P<0.05表示有显著差异。
2 结果
脂质过氧化测定结果:加入不同浓度的蛇毒蛋白Natrin后, 各组的MDA含量均减少, 各浓度组与对照组间比较, 均有显著差异 (P<0.01) 。浓度为0.1mg/ml时MDA含量最低, 抑制率为49.54%。 (见表1)
与对照组比较, *P<0.01
3 讨论
脂质过氧化物是生物膜和亚细胞膜中磷脂质所含多元不饱和脂肪酸被自由基损伤, 氧化而成的过氧化产物。它可引起膜损伤、酶抑制、溶酶体释放、蛋白质交联、DNA和RNA结构破坏等生物毒性反应, 造成机体衰老和多种疾病, 因此近年来对它的研究引起了广泛重视【6, 7】。正常情况下, 机体靠抗氧化酶 (如SOD、CAT) 等的作用使代谢过程中活性氧自由基的产生与消除处于平衡状态。金属离子铁常常参与自由基反应, 在有机体内, 铁还原H2O2生成毒性极强的·OH, 后者是已知最强的氧化剂, 虽然寿命极短但能和所有的细胞成分发生反应, 造成氧化损伤。正常组织匀浆在体外自氧化受FeSO4/L-CYS激发的自氧化, 可产生MDA。MDA能使膜蛋白、酶发生交联反应, 使膜通透性增加, 导致细胞膜结构、功能和代谢发生改变, 对机体造成伤害。MDA产量的多少可表示过氧化程度的大小。MDA生成抑制率反映了TFB清除自由基的能力【8】。
通过硫代巴比妥酸分光光度法测大鼠肝脏脂质过氧化的二级分解产物MDA含量来研究广西眼镜蛇毒中Natrin对大鼠肝脏脂质过氧化作用的影响, 发现Natrin能抑制由亚铁离子激发的·OH引起的脂质过氧化产物MDA的生成, 发挥抗脂质过氧化作用, 并呈剂量依赖性, 说明它对细胞可能具有一定的保护作用。
参考文献
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脂质过氧化物酶 篇6
1 对象与方法
1.1 对象
来院疗养的潜艇艇员63例,入院疗养时间22~25d,均为男性,最小年龄为21岁,最大年龄35岁,平均年龄(31.3±2.57)岁。
1.2 标本采集
疗养入院时和疗养结束时,空腹静脉采血,分离血清当天测定血液过氧化脂质(B-LPO)。
1.3 检测方法
采用比色分析法检测,试剂由南京建成工程研究所生产。
1.4 统计学处理
计量资料用均数±标准差(x-±s)表示,显著性检验用t检验,以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
潜艇艇员疗养后比疗养前的血液过氧化脂质,明显下降t=9.71,P<0.001,见表1。
3 讨论
(1)机体抗氧化能力与不断产生氧自由基和脂质过氧化能力之间保持动态平衡,若自由基和脂质过氧化产生过多或机体抗氧化能力下降,将导致机体损伤,大量的自由基和脂质过氧化的产生可直接损伤细胞膜或具有膜结构的内质网、溶酶体和线粒体,同时可损伤细胞DNA等结构,促进某些疾病的发生发展[1]。
(2)潜艇艇员的过氧化脂质疗养前显著高于疗养后,说明疗养前他们在特殊的环境中[2]各种有害因素促使他们体内脂质过氧化明显加剧。在疗养期间,疗养院采用各种疗养措施,如疗养体疗、理疗、游览、膳食、文化娱乐以及疗养院的各种自然疗养因子的集合作用,从而使他们消除疲劳、阻断有害因子对他们的连结作用,让他们情绪得以松弛,身心充分休息,加快了他们的肌体得到恢复,此研究结果表明疗养后的过氧化脂质低于疗养前,与周应玉等[3]报道的相符,疗养后他们的体内脂质过氧化反应明显减弱,那么血液过氧化脂质可以作为评定疗养效果的一个指标。为做好海勤卫生保障有重要意义。疗养不同于一般的休息,保健疗养是对艇员实行的一种健康保护制度,疗养院严格按潜艇人员疗养工作规定实施,完成疗养的全过程,通过保健疗养,使其达到在躯体上、心理上、社会上完好状态的健康水平。
(3)疗养效果是疗养质量综合效应的集中体现,评价疗养质量应具有较强的客观性、真实性、可比性、科学性。疗养效果评价有主观、客观、心理、体力等6个指标[4]。除了6个指标外,可增加反映机体氧化和抗氧化的指标,来达到保健疗养综合评价的可比性、科学性。
参考文献
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脂质过氧化物酶 篇7
1材料与方法
1.1实验动物
健康ICR清洁级小鼠,雄性,体重(23±2)g(吉林大学基础实验动物部)。
1.2实验分组与染毒
按照随机分组原则,分为玉米油溶剂对照组,BaP染毒5、10、20、40mg/kg组,每组6只小鼠。灌胃给药0.01mlg,连续给药3d,小鼠在灌胃前后禁食水3h。
1.3样品制备
将染毒24h后的小鼠称重,断头处死。剖腹迅速取出肝脏,称重。肝脏组织用预冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH值为7.4)清洗,剪碎,PBS悬浮细胞,过4层纱布,收集肝细胞悬液,800r/min(离心半径6mm);4℃离心5min,PBS洗涤2次,过200目尼龙网,细胞密度调整为1×106个/ml,每样品取100μl细胞悬液进行吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色。
1.4主要试剂
苯并(a)芘(纯度>98%)、溴化乙啶(EB)和吖啶橙(AO)均为美国Sigma公司,MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所
1.5主要仪器
光学显微镜,激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司),低温离心机MTX-150(日本TOMY公司),722分光光度计(上海第三分析仪器厂
1.6方法
AO/EB染色法检测肝细胞凋亡,每样品取100μl肝细胞悬液,加4μlAO/EB(包含100μg/ml)混合染液,混匀染色1min,PBS洗去染液,取10μl滴于玻片上,加盖玻片后立即在激光共聚集显微镜下观察。正常细胞细胞核发绿色荧光,密度不均,呈现结构样特征。早期凋亡细胞,核发出明亮的绿色荧光,核出现一至数个大小不等的斑块状或圆珠状小体。晚期凋亡细胞,细胞同时也被EB染色,核形态与早期凋亡细胞凋亡一致,但呈橙黄色或橙红色荧光。死亡细胞,无凋亡小体,核染色不均,呈橙红色荧光每样品计数200个细胞,凋亡细胞率=凋亡细胞/200×100%。
1.7统计分析
应用SPSS 13.0统计软件,进行单因素方差分析组间均数差异的统计学分析及直线相关性检验。
2结果
2.1 BaP对肝细胞凋亡的影响
AO/EB双染结果分析表明,各染毒组与对照比较,差异有统计学意义(P<0.05),说明BaP各染毒剂量组肝细胞凋亡发生率均高于对照组。随染毒剂量的增加,2040mg/kg剂量组与5mg/kg剂量组比较,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。
2.2 BaP对肝脏MDA含量的影响
MDA含量分析结果表明,40mg/kgBaP染毒剂量组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。说明BaP在40mg/kg染毒剂量下会使脂质过氧化产物MDA含量增加,见表1。
注:与对照组比较,aP<0.05;与5mg/kg组比较,bP<0.05。
3讨论
机体在氧代谢过程中会产生ROS,ROS对大多数细胞都具有毒性作用。在正常生理条件下,机体内ROS的产生和清除处于动态平衡状态。如果ROS的产生增多或清除能力下降,机体就会出现氧化应激而导致机体组织脂质过氧化水平升高,引起DNA氧化损伤和蛋白质的表达异常,对机体造成损害。本研究结果显示,MDA的含量逐渐增高,在40mg/kg最高染毒组升高最为明显(P<0.05),表明肝细胞在BaP作用下可发生脂质过氧化作用。
细胞凋亡是在基因控制下按照一定程序进行的细胞死亡,是机体的一种生理机制,在维护机体内环境稳定方面发挥重要作用,但细胞凋亡过高或过低都会对机体产生不利的影响。本实验采用AO/EB荧光双染方法,运用激光共聚焦显微镜观察了BaP对肝细胞凋亡情况。结果表明,BaP可以诱导肝细胞凋亡,并随染毒剂量的增加凋亡发生率增高。
进一步探讨了BaP引起细胞凋亡与脂质过氧化之间的关系,发现两者之间存在明显的正相关关系(r=0.990,P<0.05)。体内自由基代谢的失平衡是导致细胞发生氧化应激和细胞凋亡的物质基础,有关研究已表明氧化应激可引起细胞凋亡[6,7]。这提示我们一定剂量的BaP引起的肝细胞氧化损伤也可诱导肝细胞凋亡的发生。本研究中还发现,肝组织中MDA的含量只在40mg/kg剂量组增加明显,而肝细胞凋亡率在各个剂量组均持续增高。分析其原因,细胞凋亡的调控是一个复杂的网络系统,BaP还可能通过其他途径诱导肝细胞凋亡,其作用机制还有待于深入研究。
摘要：目的探讨苯并(a)芘(BaP)对小鼠肝细胞凋亡及其与脂质过氧化的关系。方法ICR小鼠灌胃染毒,染毒剂量分别为0、5、10、20、40mg/kg,应用吖啶橙/溴化乙啶(A0/EB)荧光双染法检测肝细胞凋亡情况并测定肝组织脂质过氧化主要终产物丙二醛(MDA)的含量。结果BaP各染毒剂量组肝细胞凋亡发生率与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),MDA含量40mg/kgBaP染毒剂量组与对照组比,较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论BaP可诱发小鼠肝细胞发生凋亡和脂质过氧化,氧化损伤参与了介导细胞凋亡的过程。
关键词：苯并(a)芘,肝细胞,细胞凋亡,脂质过氧化
参考文献
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脂质过氧化物酶 篇8
1 资料与方法
1.1 一般资料
2006年3月至2008年5月因脊柱疾患进行脊柱手术的老年患者40 例, 男20 例, 女20 例, 年龄61～79 岁, 平均68 岁。无严重心脑血管病、糖尿病及其他疾患。术前常规检查无明显异常, 近3个月内未用过激素类药物或者其他影响免疫系统的药物。患者随机分为四组, 每组10 例, 即对照组 (A组) , 维生素E组 (B组) , 1, 6-二磷酸果糖组 (C组) 及维生素E加1, 6-二磷酸果糖组 (D组) 。
1.2 手术方法
1.2.1 40 例患者采用全麻, 术前用药为鲁米那100
mg、阿托品0.5 mg, 术前30 min肌注。诱导用丙泊汾1.5～2.0 mg/kg, 芬太尼4～5 μg/kg, 阿曲库铵0.6～0.8 mg/kg静注, 气管内插管, 术中用丙泊汾4.0～6.0 mg/kg·h, 阿曲库铵0.6～0.8 μg/kg·h, 并根据情况加用芬太尼0.1～0.2 mg, 间断吸入七氟醚维持。
1.2.2 颈椎病
12 例根据患者情况行前路椎间盘切除、植骨融合与钢板内固定或后路椎管减压与脊柱内固定术。腰椎
间盘突出症13 例根据患者情况行后路椎板切除与髓核摘除脊柱内固定术。腰椎管狭窄症9 例行后路椎管减压与脊柱内固定术。腰椎滑脱6 例行后路椎管减压与复位、椎间植骨融合脊柱内固定术。手术均由同一组医生完成。术后常规抗炎预防感染, 逐步康复训练。
1.2.3 检测方法
A组为对照组。B组在手术前3 d开始口服维生素E, 每日3次, 每次100 mg, 至手术日晨。C组于手术开始后30 min FDP 10g静脉滴注;D组在手术前3 d开始口服维生素E, 每日3次, 每次100 mg, 至手术日晨, 同时于手术开始后30 min FDP 10g静脉滴注。各组均在手术前1 d、术后1、3、5、7、14 d抽取清晨空腹静脉血2 mL, 对照组抽取空腹静脉血2 mL。所有标本肝素抗凝置于-20℃冰箱内保存, 同批测定。丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 试剂由南京建成生物研究所提供。将抗凝全血过棉柱洗脱, 去除白细胞、血小板, 再用生理盐水洗涤3次得红细胞。首先取1/2样品红细胞测定MDA的含量, 利用氧自由基与不饱和脂肪酸过氧化作用成比例增加的脂质过氧化物降解产物MDA间接检测氧自由基的变化, 根据脂质过氧化物在酸性条件下加热分解生成MDA, 可与硫代巴比妥酸缩合成红色色素, 以红色程度推算出脂质过氧化物的含量, 以 (MDA) nmol/mL单位表示, 结果反映机体内脂质过氧化程度。
1.3 统计学方法
统计学方法实验数据用均数±标准差表示undefined, 采用方差分析, 使用SPSS 13.0 软件进行处理, P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结 果
A组10 例患者行脊柱手术后1、3、5、7、14 d, 红细胞中MDA的浓度含量明显较术前增高, 于手术后5 d左右升至最高, 术后7 d开始好转, 术后14 d逐渐恢复接近术前水平。数据结果见表1。
B组、C组及D组术后第1、3天MDA的浓度分别与术前相比稍有升高, 但无统计学意义 (P>0.05) , 在同一时间点与A组相比, 丙二醛的水平则明显低, 统计学处理P<0.05;但术后第5、7天, B、C组在同一时间点与D组及术前相比丙二醛浓度明显增高 (P<0.05) , 而D组与术前相比则无明显升高 (P>0.05) , 术后14 d接近正常。数据结果见表2。
3 讨 论
手术创伤、应激和麻醉等使患者的内环境发生改变, 机体通过神经内分泌调节产生大量氧自由基, 超氧化物岐化酶通过歧化反应清除体内氧自由基, 其活力强弱代表机体抗氧化能力[8]。而氧自由基是一种呈不稳定状态, 具有活性的化学性质, 细胞膜中的多价不饱和脂肪酸是最易受氧自由基影响的物质而发生脂质过氧化反应, 形成对细胞结构和功能有害的脂质过氧化物。因此脂质过氧化物的变化可反映组织代谢障碍, 细胞结构与功能损害。MDA是脂质过氧化物的代谢产物, 它是由能自发荧光的脂肪色素组成, 易于检测, 其含量反映机体内脂质过氧化程度, 间接反映细胞受损的程度。脂质过氧化物具有强烈的细胞毒性, 可损伤细胞膜及亚细胞膜并引起膜蛋白和酶类功能障碍。本研究提示脊柱手术术后红细胞脂质过氧化增强, 和文献报道一致[8,9]。究其原因可能为手术后交感性内分泌增加, 激活脂肪酶而使游离脂肪酸升高, 后者抑制氧化磷酸化偶联, 启动生物膜的脂质过氧化反应;此外, 下列因素也是可能的原因:a) 手术本身所带来的创伤、失血;b) 手术操作对血管造成的直接干扰, 如腰椎的前路手术[10];c) 术中俯卧对于下腔静脉、骼静脉和股静脉的压迫;d) 人工材料的植入, 如骨水泥[11,12]或人工骨的热量释放对血管的灼伤;e) 麻醉, 特别是脊髓麻醉或全麻[13];f) 脊柱创伤合并脊髓神经损伤[14], 或下肢瘫痪;g) 术后长时间卧床或制动。上述因素可造成血管损伤, 椎体附近肌肉缺血, 术后可能发生缺血与再灌注损伤, 这些都会导致氧自由基的大量释放, 造成红细胞的损伤。氧自由基可与Na+-K+-ATP酶的活性巯基作用, 影响其活性, 使细胞膜渗透性增加, 大量Na+及水分进入细胞内, 造成细胞肿胀, 体积变大。这些肿胀变形能力减弱的红细胞, 加之红细胞碎片等原因, 使血液中微栓颗粒增加, 导致循环淤滞, 从而引起深静脉血栓。以往认为, 术后较长时间卧床, 下肢静脉血回流缓慢, 血液淤滞是下肢深静脉血栓的主要原因, 近年的研究提出手术创伤、应激和麻醉可使红细胞过氧化损伤, 损伤变形及能力下降的红细胞是术后血栓形成的主要触发因素之一[6,7]。本研究发现红细胞脂质过氧化损伤术后比术前明显增加。统计学有显著性差异, 说明手术创伤可引起患者机体红细胞脂质过氧化增强。维生素E和FDP具有重要的抗氧化和保护细胞膜的作用, 前者能保护过氧化氢酶和谷胱甘肽氧化酶的活性, 预防和抑制生物膜脂质过氧化反应, 又通过多价不饱和脂肪酸竞争性与烷过氧基结合, 而终止过氧化的链式反应, 在抗氧化系统中起最后一层保护作用;后者作为糖酵解过程中的中间产物, 能激活糖酵解途径中的限速酶—磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶, 间接向细胞内供能, 且能直接进入细胞内作为能量底物供能, 使细胞内ATP含量增加, 并能激活Na+-K+-ATP酶, 促进细胞保钾排钠, 提高细胞内激化, 防止细胞水肿凋亡。由此可见维生素E和FDP在预防红细胞脂质过氧化方面的作用机制是不同的。本研究发现, 术前单用维生素E或术中单用FDP, 术后MDA含量在术后第1天和第3天与术前相比增高不明显, 但在术后第5天和第7天MDA的含量比术前提高, 提示单独应用维生素E或FDP不能在术后持久地预防红细胞脂质过氧化反应;而术前应用维生素E并联合术中应用FDP, 术后各时间点测量的MDA含量与术前变化不明显, 表明术前和术中联合应用维生素E和FDP能有效预防脊柱手术所引起的患者机体红细胞脂质过氧化和抗氧化能力降低。
摘要：目的 探讨脊柱手术对红细胞脂质过氧化的影响及维生素E、1, 6-二磷酸果糖 (fructose 1, 6-diphosphate, FDP) 对脂质过氧化的防治作用。方法 脊柱手术患者40例, 在全麻下行手术治疗, 随机分为四组:对照组、术前应用维生素E组、术中应用FDP组及术前应用维生素E联合术中应用FDP组。每组10例, 于手术前1 d、术后1、3、5、7、14 d抽取血样, 测定红细胞丙二醛含量。结果 脊柱手术后红细胞中丙二醛含量明显比术前增高 (P<0.05) ;术前应用维生素E联合术中应用FDP比单纯应用维生素E或FDP能在围手术期更有效地保护红细胞免受脂质过氧化的损伤 (P<0.05) 。结论 脊柱手术术前服用维生素E和术中应用FDP, 可以预防围手术期氧自由基和过氧化脂质等有害因子对红细胞的破坏, 以及因红细胞损伤可能出现的深静脉血栓形成等并发症。
脂质过氧化物酶 篇9
蜂胶 (Propolis) 是工蜂从植物的新生枝条、叶、芽或树皮等组织上采集到树脂状分泌物后, 混入其上鄂腺等腺体的分泌物和蜂蜡等加工而成的芳香胶状物, 具有广泛的生理和药理作用, 被广泛应用于临床实践中。蜂胶的化学成分极其复杂, 主要成分黄酮类化合物能够提高机体抗氧化酶的活性, 清除过量自由基, 是公认的天然抗氧化剂。因此, 本实验通过给运动小鼠灌服蜂胶, 观察蜂胶对运动小鼠血液自由基代谢的影响及对红细胞形态的保护作用, 为蜂胶更好的应用于运动领域提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蜂胶:由沈阳天兴蜂业有限公司提供, 蜂胶纯度为95%以上。
SOD试剂盒、MDA试剂盒、ATP酶试剂盒:购自南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 实验动物
5周龄KM小鼠64只, 雌雄各半, 体重18-23克, 由中国医科大学动物中心购入。
1.2.2 运动及给药
小鼠购进后, 适应性喂养一周, 按体重随机分4组, 16只/组, 常规分笼饲养, 自由饮食水, 室内温度20~25℃, 相对湿度50~60%, 自然光照, 通风良好。隔日更换垫料, 鼠笼每周消毒2次。小鼠每日上午均灌胃, 给药方案见表1。
小鼠在长100cm, 宽60cm, 高70cm的玻璃泳缸中游泳, 水深45cm, 水温控制在32±2℃,
及时清理泳缸中的小鼠粪便以保证水质, 每次游泳结束后迅速烘干体毛。各运动组小鼠每周游泳6次, 每次运动时间为:第一周30min, 第二周60min, 第三周90min, 第四周120min。
1.2.3 样本的收集和处理
1.2.3. 1 样本的收集
所有小鼠在最后一次训练结束后次日摘眼球取血, 肝素抗凝。取抗凝血350ul, 置于弹头试管中用于ATP酶的测试。余血1500rpm离心10min, 取上层液体 (血浆) 置于弹头试管中, 待测。沉淀进一步处理。
红细胞固定液的制备:下层沉淀加入0.86%Na Cl, 1500rpm离心10min, 弃上清, 重复洗涤3次。在沉淀中加入0.2mol/L磷酸缓冲液配制的2.5%戌二醛溶液, 1500rpm离心10min, 使固定液与红细胞分开, 弃上清。再向沉淀中加入戊二醛固定液, 置于0~4℃冰箱保存, 待测红细胞形态。
1.2.3. 2 指标测定
血浆MDA、SOD、红细胞ATP酶均用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测试, 测试过程严格按其说明书操作。
红细胞形态的观察:取已制备好的红细胞固定液分别以50%、70%、80%、95%、100%酒精系列脱水 (每级10min) ;尔后粘台, 干燥, E-1010离子溅射仪镀膜;在HITACHI S-450扫描电子显微镜下观察红细胞形态和计算红细胞畸形率。
1.3 数据处理
应用SPSS软件包对数据进行统计学分析, 数据均以X±SD表示, 对数据进行组间单因素方差分析及相关分析。
2 实验结果
2.1 四周游泳训练后各组小鼠红细胞畸形率比较
注:*为与A组相比p<0.05△为与C组相比p<0.05
由表2可见, 与安静组相比训练组红细胞畸形率显著高于安静组 (p<0.05) , 见图3;安静蜂胶组红细胞畸形率有降低趋势, 但无显著性 (p>0.05) , 见图2;与训练组相比, 训练蜂胶组红细胞畸形率显著降低 (p<0.05) , 见图4。
2.2 四周游泳训练后各组小鼠血浆MDA含量、SOD活性比较
注:*为与A组相比p<0.05△为与C组相比p<0.05
由表3可见, 与安静组相比训练组血浆MDA显著升高 (p<0.05) , SOD活性显著降低 (p<0.05) ;安静蜂胶组MDA显著降低 (p<0.05) , SOD活力显著升高 (p<0.05) 。与训练组相比, 训练蜂胶组MDA显著降低 (p<0.05) , SOD活力显著升高 (p<0.05) 。
2.3 四周游泳训练后各组小鼠红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性比较
注:*为与A组相比p<0.05△为与C组相比p<0.05
由表4可见, 与安静组相比训练组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著降低 (p<0.05) ;安静蜂胶组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著升高 (p<0.05) 。与训练组相比, 训练蜂胶组Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著升高 (p<0.05) 。
2.4 各指标间的相关分析
注:**为显著性水平为0.01。
由表5可见, 红细胞畸形率与MDA正相关 (P<0.01) , 与SOD负相关 (P<0.01) , 与红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶负相关 (P<0.01) ;红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶与MDA负相关 (P<0.01) , 与SOD正相关 (P<0.01) 。
3 讨论
3.1 4周递增负荷游泳运动对小鼠红细胞形态的影响
红细胞形态是反映红细胞膜结构是否正常的重要指标, 它与红细胞的流动性和变形能力密切相关, 也是反映红细胞膜功能的重要指标。红细胞的正常形态呈双凹圆盘状 (见图5) , 使红细胞具有强大的变形能力, 保证红细胞能顺利通过比自己直径小的毛细血管。当红细胞形态发生改变, 出现棘形 (见图6) 、球形 (见图7) 、帽形、口型等形态时, 均使红细胞变形性下降, 不利于顺利通过毛细血管, 从而影响组织的供氧, 也是引起贫血的重要因素之一[3]。在临床医学和运动医学研究中通常采用电镜观察红细胞畸形率来反映红细胞形态的变化。
大量研究表明, 长期高强度训练会使人体或实验动物的红细胞畸形率增加[4,5,6]。本实验小鼠经递增负荷游泳训练后, 红细胞畸形率显著增加 (见图3) , 与文献报道结果一致。导致红细胞形态发生改变的主要原因是:红细胞膜受内外因素改变而导致的膜结构和功能变化。红细胞直接暴露在高氧分压下、膜上含有大量多不饱和脂肪酸, 并且血红蛋白中含有Fe2+, 所以红细胞非常容易发生脂质过氧化反应。自由基作用于膜骨架蛋白, 使其发生聚集交联[7];或使脂肪酸链断裂;Hb氧化变性, 形成高铁血红蛋白沉积于膜上[8];脂质过氧化产物MDA会影响脂质成分和蛋白之间的相互作用, 产生膜结构重排[9], 或使膜蛋白分子交联并裂解为碎片, 使膜骨架的网状结构稳定性及伸展性降低。这些均可使膜的结构发生改变, 进而使红细胞形态出现棘形、球形等变化。本实验中, 四周递增游泳训练使小鼠红细胞畸形率增高的同时, 血浆MDA含量升高, SOD活性下降, 且相关分析显示红细胞畸形率与血浆MDA含量正相关 (P<0.01) , 与SOD活性负相关 (P<0.01) 。证实大强度运动增加了机体脂质过氧化反应程度, 降低机体抗氧化能力, 进而造成红细胞形态发生改变。
此外, 红细胞膜上的ATP酶功能异常, 也可以使红细胞形态发生改变。Na+-K+-ATP酶又称为钠钾泵 (Na, K-Pump) , 是一种高分子蛋白质, 镶嵌并贯通整个脂质双分子层, 存在于多种生物膜上。它在物质运送、能量转换、信息传递以及维持细胞内外离子平衡方面具有重要的作用。红细胞Na+-K+-ATP酶的基本功能是将细胞内的Na+转移到细胞外, 将细胞外的K+运送入细胞内, 维持细胞内外的渗透压平衡和跨膜电化学梯度。如果酶活性异常, 会导致过量的水随Na+进入细胞内, 使红细胞体积增大而变成球形, 这可能是一些运动性贫血和运动后红细胞溶血增强的原因之一。Ca2+-Mg2+-ATP酶不但可维持膜脂的不对称分布, 而且对维持细胞内Ca2+的浓度起重要作用。当红细胞Ca2+-Mg2+-ATP酶活性下降时, 红细胞泵出Ca2+的能力下降, [Ca2+]升高可影响膜蛋白相互作用, 降低膜粘弹性, 使膜变僵硬, 并可导致RBCM脂质与细胞膜骨架蛋白的分离, 使膜稳定性和流动性降低, 红细胞形态改变, 变形能力下降[10、11]。本实验中, 四周递增游泳训练使小鼠红细胞畸形率增高的同时, 红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著降低, 且相关分析显示红细胞畸形率与红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈负相关 (P<0.01) , 而红细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性与血浆MDA含量负相关 (P<0.01) 。说明自由基可导致红细胞膜ATP酶功能异常, 进而引起红细胞形态发生改变。
3.2 蜂胶对游泳运动小鼠红细胞形态的影响
蜂胶的抗氧化作用已基本得到公认[12,13,14]。可能的机制如下: (1) 蜂胶可以提高机体抗氧化酶 (如SOD、CAT) 的活性, 阻止自由基反应的引发。 (2) 蜂胶黄酮类可以阻断自由基导致的链式反应。 (3) 蜂胶中其它物质如果糖、氨基酸、VE、Se等的抗氧化活性。 (4) 通过螫合金属离子而削弱金属离子的促氧化作用。以上综合作用的结果提高了机体的抗氧化能力, 减弱了自由基对机体的氧化损伤。
本实验结果显示, 服用蜂胶四周可以显著降低由运动造成的畸形红细胞比例, 原因在于补充蜂胶可以显著提高运动状态下小鼠的SOD活性, 降低MDA含量, 提高机体的抗氧化能力, 减少红细胞发生氧化损伤的机会;此外蜂胶还可以通过阻止自由基直接作用于红细胞膜, 提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性, 稳定红细胞膜的结构和功能, 避免红细胞发生肿胀或缩水变形。本实验结果提示蜂胶也可以显著提高安静状态下机体的抗氧化能力, 但红细胞形态并无明显改变, 原因可能是安静状态下红细胞畸形改变较少的缘故。
4 结论
4.1 4周递增负荷游泳训练使机体脂质过氧化程度加重, 红细胞在氧化损伤作用下形态发生改变, 畸形率显著升高。