磷酸化Tau蛋白

磷酸化Tau蛋白（共3篇）

磷酸化Tau蛋白 篇1

Tau蛋白主要存在于中枢神经系统轴突中,以往人们对Tau蛋白与神经系统变性疾病之间的关系研究较多,但近几年研究发现,Tau蛋白也参与了缺血性脑损伤。

1 Tau蛋白的结构、分布和功能

1.1 Tau蛋白的结构

Tau蛋白是一种相对分子质量较小的微管相关蛋白(microtubule-associated protein,MAP)。人Tau蛋白由16个外显子构成的单基因编码,位于17q21。成人脑中外显子2、3、10通过不同剪接形成6种不同形式的Tau蛋白,分别以Taul～Tau6命名,长度约352～441个氨基酸,相对分子质量为(48～67)×103。Tau分子有四个结构区：氨基末端区,脯氨酸富含区,微管结合区,碳末端区。其氨基末端长度不定,可插入额外的外显子,并可以和肝素结合[1],脯氨酸富含区包含大量的磷酸化位点,与模体PPXXP或PXXP相邻,该模体与包含SH3结构域的蛋白相互作用[2]。微管结合结构域包含3～4个重复序列,这些重复片段由18个高度保守的氨基酸残基序列13～14个氨基酸保守序列组成这一重复序列只在成人脑中表达。碳末端也包含有一个脯氨酸富含区,存在磷酸化位点。有研究显示,Tau蛋白在Ser199,Ser202,Thr231,Ser396,Ser413等位点发生磷酸化。正常Tau蛋白是一种含磷蛋白质,每摩尔Tau含磷量为2～3 mol。

1.2 Tau蛋白的分布

Tau蛋白主要在中枢神经系统神经元的轴突表达,存在于星形胶质细胞和少突胶质细胞内,在外周神经系统的神经元轴突也有表达[3]。其亚细胞定位在细胞质,然而有报道Tau蛋白也在质膜上存在,该结合通过Tau蛋白的N末端进行,脯氨酸富含区的磷酸化则阻止了Tau蛋白的这种结合[4]。

1.3 Tau蛋白的功能

Tau蛋白是一种主要的神经细胞骨架蛋白,正常生理条件下Tau可促进微管蛋白聚集成微管并增强其稳定性,维持细胞的生长发育,并且在神经系统的生成和轴突的信息传递中也起到至关重要的作用[5]。最新研究发现,Tau可能还有其他生物活性。

2 脑缺血损伤后Tau蛋白表达的变化

1993年,Hesse[6]对卒中患者脑脊液中的Tau蛋白进行了研究,他发现患者脑脊液中的Tau蛋白在卒中后第2～3天开始升高达正常参考值的1.28倍,到第3周,脑脊液中的Tau蛋白量达正常参考值的3倍,持续升高直到3～5个月后才下降至正常水平,表明Tau蛋白是神经元缺血性损伤较为敏感的标志。近年来的研究发现,脑缺血后Tau蛋白表达明显增加。Irving等[7]发现大鼠MCAO 24 h后在少突胶质细胞(oligodendrocyte,OLG)中Taul染色蛋白明显增强,40 min后同侧白质OLG中Tau蛋白增强6～8倍,且Tau蛋白免疫反应性呈时间依赖性快速增强。在以后的工作Lrving又进一步证实上述观点[8]。Lorio等[9]观察发现Wistar大鼠MCAO90 min再灌注24 h和3 d后脑缺血组织中Tau蛋白表达增加并达到高峰。Green等[10]研究大鼠全脑缺血15 min,Tau蛋白磷酸化活性增强。同样,Minger等[11]发现持续性局灶性脑缺血大鼠缺血6 h后Tau蛋白表达增加(局灶性脑缺血后Tau蛋白免疫反应性增加的作用机制可能是磷酸化状态的改变造成的)。Sinigaglia等[12]将大鼠双侧颈总动脉夹闭同时放血造成低血压,10 min后再灌注,2个月后出现AD样病理改变:(1)海马出现星形胶质细胞;(2)皮质有β-淀粉样斑块形成;(3)细胞内有异常磷酸化的Tau蛋白。

3 Tau蛋白的过度磷酸化及其毒性作用

实验研究证明,脑缺血损伤后,主要导致Tau蛋白的过度磷酸化。受累神经元内蛋白激酶和(或)蛋白磷酸酯酶磷酸化系统失衡是导致Tau异常过度磷酸化的主要生化机制。在Tau的磷酸化调节中发挥重要作用的是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酿酶。异常过度磷酸化的Tau是通过获取细胞毒性作用,而不是因为丧失正常生物活性来引起神经退行性病变。Tau的异常过度磷酸化,引起微管解聚,影响物质在胞体和轴突树突之间的运输,最终导致神经元死亡和痴呆。另外,Tau的异常过度磷酸化,一方面使其容易相互聚积成PHF,另一方面促其与微管分离从而增加神经元胞浆中Tau的浓度。后者进一步促使PHF形成。聚积成PHF的Tau继续进行泛素化、非酶促糖基化、聚氨基化、硝酸化和部分水解等修饰,从而形成晚期PHF/NFT。与未聚积成PHF的异常过度磷酸化Tau不同,形成PHF/NFT的Tau似乎没有细胞毒性,但当其充满整个神经细胞后也会加速神经元的死亡。

4 Tau蛋白与Aβ

由于Aβ和Tau是AD病理改变中重要的标记性蛋白,两者是否存在相互联系也引起了人们的广泛兴趣。使用免疫组化的方法用抗PHF-Tau抗体标记AD脑中神经突触,PHF-Tau阳性的神经突触几乎都存在于淀粉样沉淀斑块中或其周围[13]。这些资料表明了Tau蛋白可以与APP特异部位尤其Aβ结构域结合,该改变可能发生在AD病理过程中。也有研究探索了Aβ沉积对Tau蛋白磷酸化的影响。吴琪等人在大鼠海马内注射线丝状Aβ,利用免疫组化染色方法观察神经元Ser202位点磷酸化的Tau蛋白(PS202-Tau)表达的变化,发现右侧海马注射Aβ42组双侧海马PS202-Tau的表达明显高于正常组和对照组。提示Aβ42具有诱导Tau蛋白超磷酸化的效应[14]。Rapoport等[15]从另一方面验证了Tau蛋白对于Aβ发挥毒性所必不可缺的作用。分别取野生型、Tau基因敲除纯合子、转入人类Tau基因的Tau先天缺乏鼠的胚胎海马神经元培养4周后,与Aβ纤维共孵育。24 h后Tau敲除的海马神经元没有观察到变性坏死,甚至96 h后,仍有(0.85±0.07)的神经元呈现出正常的形态特征。而野生型的海马神经元细胞在加入Aβ共同孵育24 h后有明显突触变性,96 h后,(0.90±0.05)的突触显示完全变性,(0.87±0.07)的神经元坏死。这一结果表明,Tau蛋白在Aβ纤维沉淀引起突触变性的机制中可能起到关键性的作用。

脑缺血患者及动物模型脑Tau蛋白发生异常改变,说明Tau蛋白参与脑缺血损伤的病理生理过程。因此,以Tau蛋白为靶点防止脑缺血损伤有可能成为新的治疗途径。

摘要：Tau蛋白高度磷酸化形成的神经无纤维缠结被认为是Alzheimer病的特征性病理改变之一。近年的研究表明,在缺血性脑损伤后,Tau蛋白免疫反应性明显增强,因此Tau蛋白也可能参与了缺血后脑损伤的发生与发展。本文就脑缺血损伤后Tau蛋白在脑组织中的表达、作用机制进行综述。

关键词：磷酸化Tau蛋白,脑缺血

磷酸化Tau蛋白 篇2

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂及仪器纯品5- 甲基二氢丙环庚烯亚胺马来酸(MK-801,美国Sigma公司),纯品二硝基喹酮(DNQX,美国Sigma公司),纯品L- 谷氨酸 (L-Glutamic acid,美国Sigma公司),兔抗人p-AT8 Ser202单克隆抗体 (美国Gene Tex公司),兔抗牛p-PHF1Ser396/404单克隆抗体(英国Abcam公司),兔抗人p-12E8Ser262多克隆抗体 (美国Life Span Biosciences公司),小鼠抗牛Tau5单克隆抗体 (美国Millipore公司),Morris水迷宫 (morris water maze, MWM)视频分析系统(北京军事医学科学院),HPLC色谱系统(美国Waters公司),蛋白电泳系统(美国Bio-rad公司),金盘多媒体图像处理系统(成都金盘电子科大多媒体技术有限公司),SM600全自动酶标仪(上海永创医疗器械有限公司)。

1.1.2实验动物选择无特定病源体级(specefic pathogen free,SPF,GB 14925-2001)SD大鼠,其鼠龄为24周,体重为275~300 g,由内蒙古医科大学动物实验部提供(批准文号:动第012号)。把大鼠放置在屏障性环境之中,使用标准的大鼠饲料喂养,使大鼠自由地摄食与饮水,进行皮肤触摸大约2 min/d, 使其适应所在实验室环境。

1.2实验方法

1.2.1动物实验原则实验按美国医学研究协会 《实验动物处理原则》及美国科学学会和国家卫生研究院《实验动物使用和处理指南》进行,循双盲原则,行孤笼饲养。

1.2.2实验动物分组和干预选择SD大鼠,平均体重大约250 g,适应性喂养1周后用于造模。雌性和雄性大鼠按1∶2合笼,以次日雌鼠阴道精液涂片阳性为妊娠第1天。此后加强孕鼠的营养,每天除标准饲料外,添加牛奶和鸡蛋等有助妊娠发育的饲料,于受精后第10天观察孕鼠腹部是否膨隆以及能否触及膨大的子宫。若于受精10 d后仍无妊娠表现则为该例动物受孕失效。通过随机数字发生器将48只孕鼠随机分为6个实验组,每组8只(3%苦味酸单色涂背标记),S组经尾静脉注射2 ml生理盐水;M组经尾静脉注射2 ml MK-801 5 mg/kg;D组经尾静脉注射2 ml AMPAR拮抗剂DNQX 5 mg/kg;SE组经尾静脉注射2 ml生理盐水 + 施行宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激,即夹闭孕鼠的子宫动脉2/3持续10 min; ME组经尾静脉注射2ml MK-801 5 mg/kg+ 施行宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激,即夹闭孕鼠的子宫动脉2/3持续10 min;DE组经尾静脉注射2 ml AMPAR拮抗剂DNQX 5 mg/kg+施行宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激,即夹闭孕鼠的子宫动脉2/3持续10 min。 受孕18 d的实验SD大鼠按照参考文献[1,2,3,4]的操作步骤制作模型。用天平称量动物体重;3.5%水合氯醚尾静脉注射,用量为1 ml/100 g体重;仰卧位固定动物于鼠板之上,5%碘伏消毒腹部皮肤2次;无菌条件下, 取下腹正中切口,暴露妊娠子宫,观察双侧宫腔内的活胎;将两个小动脉钳分别靠内侧钳夹于一侧子宫的上下端,造成子宫胎盘循环障碍诱发胎鼠宫内窘迫,达到所需缺血缺氧时间后去除动脉钳造成再灌注后,将胎鼠回纳子宫,逐层关腹,继而回笼饲养达到SD大鼠的足月妊娠时间后,再次麻醉开腹,剖宫产取出新生鼠。夹闭子宫动脉的小动脉钳选用特制的微型无损伤血管钳;无齿柄有三格扣,所以可以夹闭1/3、2/3以及3/3。剖宫产术后将新生鼠置入暖箱内常规饲养,期间每天进行抚摸和称重,饲养至4周时进行游泳能力测试,淘汰不会游泳或运动障碍的大鼠。

1.2.3 MWM视频分析系统检测大鼠的认知全部宫内窘迫处置结束后母鼠继续妊娠至新生鼠娩出,待新生鼠生长至12周时开始MWM的检测过程。 强迫受试大鼠游泳,使其学习寻找淹没在水中的实验平台,评价受试动物对空间方向的感觉等空间学习记忆能力[5]。MWM被分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个象限。水迷宫内盛自来水,加墨汁浑浊,检测前将平台置于Ⅰ 象限水面下2 cm。所有实验在9∶00~15∶00进行,室内安静,物品放置及灯光状态一致,水温(24± 1)℃。Morris 1.0软件跟踪记录分析相关数据。第1~6天行定位航行实验:按逆时针方向分别从Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个象限将大鼠面向池壁放入水中,观察并计时120 s,检测前将平台置于Ⅰ象限正中水面下2 cm。摄像系统记录大鼠寻找并爬上平台的时间为逃避潜伏期(escape latency,EL),若120 s内还未找到平台,则引导其至平台,停留30 s,EL记为120 s。 检测结束后以第1~6天EL的平均值作为学习成绩,其越短显示学习能力越好。第7天行空间探索实验:撤除平台,将大鼠从距原平台最远Ⅲ象限面向池壁放入水中,摄像系统记录大鼠在60 s内各象限游泳时间,以原平台象限Ⅰ象限游泳时间即空间探索时间(space exploration time,SET)作为记忆成绩, 其越长显示记忆能力越好。

1.2.4取材在MWM测试结束后24 h内取大鼠海马,其具体操作步骤如下:取材前8 h对实验大鼠进行禁食,但不禁水,尾静脉注射1.5 g/kg 20%的动物麻醉剂脲乙烷进行麻醉后,使用自制的大鼠专用断头台迅速将实验大鼠断头,开颅,最后取出全脑; 在去除二乙基焦炭酸盐(diethyl pyrocarbonate,DEPC)的冰面之上,充分吸去脑组织中的血液,自信分离受试大鼠的双侧海马。左侧海马称重,加1 ml甲醇与水配制的离心液,在低温下进行匀浆处理,继而取出一部分匀浆液置于4℃、12 000×g离心15 min,最后取出上清液,经滤膜过滤处理之后,置于 -80℃冰箱保存,待测Glu的含量。右侧的海马组织放置在4℃ 10%多聚甲醛之中进行3 d的固定处理,再经过脱水处理之后,使用石蜡进行包埋,将其用切片机进行切片处理(其厚度大约为1μm),该标本进行免疫组织化学SP(immunohistochemistry-streptavidin-perosidase,IHC-SP)法检测和显色。

1.2.5高效液相色谱法采用高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography,HPLC)检测Glu在海马中的含量[6]。检测样品为处理好的大鼠海马匀浆上清液。色谱条件:18-ODS色谱柱,柱温35℃,流动相A为0.1 mol醋酸钾,流动相B为甲醇, 进行二元梯度洗脱,梯度洗脱程序:(T,B%)(0,45%) (1,65%)(6,75%)(20,40%)。流动相经0.45μm滤膜过滤,超声脱气。流速1.0 ml/min,激发波长250 nm, 发射波长410 nm,以Glu峰面积定量。氨基酸标准液的配制:Glu标准品配成100μmol的标准溶液,测前稀释。衍生及分析:取100μl标准液或者组织样品液于EP管中,加入100μl衍生化试剂反应2 min后进样20μl。Glu标准曲线的建立:配制浓度分别为0.150、0.300、0.735、1.470、2.940、3.675和5.880 mg/L的Glu标准溶液,衍生化处理后测定,应用外标法进行定量分析。海马中Glu含量的测定:海马匀浆上清液解冻,加入冷冻的甲酸(1 mol/L,2 ml),冰浴下匀浆。将匀浆液于4℃、7 000 r/min离心30 min,取上清液于 -20℃保存。每1 ml脑组织匀浆上清液加0.75 ml 4%的碳酸氢钠溶液混匀,4℃、3 000 r/min离心5 min,取上清液过0.45μm滤膜,分装。取该分装液24μl,进样瓶中加入衍生试剂12μl,四硼酸钠缓冲液(p H值9.18)960μl,混匀,温度控制在20℃ 下静置3 min后进样,梯度洗脱,测定Glu含量。

1.2.6 IHC-SP法检测Tau蛋白(Tau蛋白5、pPHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262) 在受试大鼠海马组织中的表达[7]。海马标本石蜡切片经常规脱蜡和乙醇水化以及蒸馏水冲洗后,0.01 mol/L的PBS溶液浸泡5 min,3%双氧水H2O2再浸泡15 min,置于0.01 mol/L的枸橼酸溶液(p H 6.0)中,煮沸15~20 min修复抗原,室温冷却20 min,以10%的白蛋白(羊血清)孵育15 min。在处理后的样本之中加入相应的抗体,即小鼠抗牛Tau蛋白5的单克隆抗体(1︰400)、 兔抗牛p-PHF1Ser396/404的单克隆抗体(1︰400)、兔抗人p-AT8Ser199/202的多克隆抗体(1︰400)、兔抗人p12E8Ser262的多克隆抗体(1︰400)50μl,37℃孵育2 h, 加入50μl生物素标记的Ig G工作液后,37℃再孵育25 min,加入50μl辣根酶标记的工作液(链霉卵白素),37℃进一步孵育25 min,滴加DAB显色液显色5 min,0.01 mol的PBS溶液冲洗,苏木精复染,脱水以及透明处理,中性树胶封片,拍照并进行统计分析。阴性对照组则使用0.01 mol的PBS溶液代替一抗实验。每只受试大鼠均随机抽取10张石蜡切片,400倍光镜下随机选取10个镜下视野,对该视野进行阳性细胞计数(注:镜下阳性反应的产物应该呈现黄褐色)。采用成都市金盘处理系统(多媒体和图像采集和编辑软件)测定镜下阳性细胞的积分吸光度值(阳性细胞的积分吸光度值与Tau蛋白在海马中的表达成正比)。

1.3统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,对各组行方差齐性检验,如果经过检验证明方差齐,则使用析因设计方差分析以分析各因素的交互效应和主效应,应用单因素方差分析法分析各因素的单独效应,P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1实验大鼠的认知能力

宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激和Glu受体拮抗剂都能够造成受试大鼠学习和记忆等脑功能障碍,即可以延长受试大鼠的EL(宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激:F =20.078,P =0.000;Glu R拮抗剂:F = 9.302,P =0.000)、缩短受试大鼠的SET(宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激:F =8.366,P =0.006;(Glu R拮抗剂:F =22.185,P =0.000);该2个干预因素的效应呈互相减弱的效果(EL:F =112.366,P =0.000;SET:F = 110.566,P =0.000),即宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激和Glu受体拮抗剂叠加之后,学习记忆障碍的程度明显减轻。SNK-q检验两两比较,HFD喂养组和HFD+STZ组,单独组与对照组的EL、SET比较以及两者间比较,差异有统计学意义。见表1、2。

2.2HPLC法检测神经递质谷氨酸在海马中的含量

宫内窘迫可以明显增加受试大鼠海马组织中Glu的浓度(F =280.158,P =0.000);实验药物(MK-801和CNQX)对受试大鼠海马组织中的Glu浓度无明显影响(F =0.099,P =0.906);宫内窘迫和Glu受体拮抗剂也未见到显著的交互效应 (F =0.392,P =0.678)。 SNK-q检验两两比较,HFD喂养组和HFD+STZ组, 单独组与对照组的Glu比较以及两者间比较,差异有统计学意义。见表3。

2.3 IHC-SP 法

IHC-SP法检测Tau5 、p-PHF1Ser396/404、pAT8Ser199/202、p-12E8Ser262蛋白在海马组织内的神经元的表达。在海马组织内Tau蛋白在海马CA1区锥体细胞表达,在CA3区亦有表达,Tau蛋白的阳性细胞沿着细胞层的长轴多呈点状分布,而且阳性染色位于胞浆之中,呈现黄褐色的颗粒。

宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激和Glu受体拮抗剂对受试大鼠海马组织中海马总Tau蛋白的表达没有显著的影响:Tau5-IR阳性细胞数(宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激:F =1.397,P =0.244;Glu R拮抗剂:F =0.000,P =1.000),Tau5-IR阳性细胞的吸光度值(FIUD:F =1.601,P =0.213;Glu R拮抗剂:F =0.004, P =0.996)。宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激和Glu R拮抗剂无交互效应(Tau5-IR阳性细胞数:F =0.034,P =0.967;Tau5-IR阳性细胞吸光度值:F =0.030,P = 0.970)。

宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激能够显著增加受试大鼠海马组织内磷酸化Tau蛋白的表达:IR阳性细胞数(p-PHF1Ser396/404:F =401.365,P =0.000;pAT8Ser199/202:F =4.187,P =0.047;p-12E8Ser262:F =319.379, P =0.000),IR阳性细胞的吸光度值(p-PHF1Ser396/404: F =214.582,P =0.000;p-AT8Ser199/202:F =339.751,P = 0.000;p-12E8Ser262:F=199.613,P =0.000)。而Glu受体的拮抗剂能够减少海马组织中磷酸化Tau蛋白的表达:IR阳性细胞数(p-PHF1Ser396/404:F =301.432,P = 0.000;p-AT8Ser199/202:F =18.557,P =0.000;p-12E8Ser262: F =135.179,P =0.000),IR阳性细胞的吸光度值(pPHF1Ser396/404:F =338.946,P =0.000;p-AT8Ser199/202:F = 272.451,P =0.000;p-12E8Ser262:F =206.543,P =0.000)。 该两个干预因素的效应呈互相减弱的效果,IR阳性细胞数(p-PHF1Ser396/404:F =36 . 744 ,P =0 . 000 ;pAT8Ser199/202:F =12.464,P =0.000;p-12E8Ser262:F =48.095, P =0.000),IR阳性细胞的吸光度值(p-PHF1Ser396/404: F =17.659,P =0.000;p-AT8Ser199/202:F =37.746,P =0.000; p-12E8Ser262:F =18.515,P =0.000),即Glu R拮抗剂可使宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激造成的受试大鼠海马组织内磷酸化Tau蛋白的表达增强的幅度减小。SNK-q检验两两比较,HFD喂养组和HFD+STZ组,单独组与对照组的Tau5-IR阳性细胞数、Tau5IR阳性细胞的吸光度值、PHF1-IR阳性细胞数、 PHF1-IR阳性细胞的吸光度值、AT8-IR阳性细胞数、AT8-IR阳性细胞的吸光度值、p-12E8Ser262-IR阳性细胞数及12E8-IR阳性细胞的吸光度值比较以及两者间比较,差异有统计学意义。见图1~4和表3~10。

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

注:1)主效应的 F 统计量和 P 值;2)交互效应的 F 统计量和 P 值

3讨论

Tau蛋白是高度不对称磷蛋白[8,9,10,11]。Tau蛋白能够稳定轴突,维持微管之间的恰当距离和正常轴突运输[12,13,14,15]。Tau蛋白被过度磷酸化后能够显著削弱其稳定微管的能力,从而导致微管组装障碍,造成神经递质运输和释放发生障碍,最终导致学习记忆障碍[16,17,18,19,20,21,22]。 胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后患儿多半会出现学习记忆障碍[23,24],这可能与谷氨酸系统功能异常有密切关系[25],因此其可以引起作用于中枢神经元诸多的氧化应激反应[26,27,28,29,30,31],导致海马组织泛发的长时程增强[32],造成神经元功能失调。Glu与学习记忆等脑功能关系非常密切[33,34,35,36,37,38,39,40]。例如,Glu的兴奋可引起细胞膜的去极化,导致神经元的内钙离子超载,进而激活磷酸肌醇环路,破坏受试者神经元的超微结构,使神经元凋亡乃至于死亡。那么,胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激引起的海马组织内的Glu浓度过度升高是否能够导致Tau蛋白的过度磷酸化,继而造成学习记忆障碍,以及Glu受体的阻滞剂是不是能够阻止这一过程,成为众多研究者关注的焦点。

3.1 Tau蛋白的过度磷酸化导致学习记忆障碍的分子机制

本研究揭示,Tau蛋白磷酸化程度与认知能力相关。Tau蛋白是不对称磷蛋白,分布于额叶和颞叶以及海马区神经元的轴突之内。Tau蛋白结构的特点是具有诸多氨基酸残基重复区,即由Pro-Gly-GlyGly重复串联构成Tau蛋白的结合区,以稳定微管装配并保持微管之间的恰当距离,最终调控神经元的轴突运输能力。生理状况下,Tau蛋白的过度磷酸化能够降低神经元轴突的运输效率,导致神经元的突触退化以及神经元凋亡,最终造成认知损害。本实验的结果与相关的研究一致,即胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激可以导致Glu在海马组织的中的浓度显著升高,继而诱导海马组织神经元内的Tau蛋白发生过度磷酸化变化。此外,本实验表明在Tau蛋白诸多磷酸化的位点之中,p Ser199/202位点的过度磷酸化与胎儿宫内窘迫应激关系最为紧密。本实验结果提示,因为Ser199/202位点位于Tau蛋白的结合区,故而其磷酸化程度决定Tau蛋白的微管结合活性。

3.2谷氨酸的兴奋性毒性反应与学习记忆障碍

Glu是最为重要的兴奋性递质,而且其对学习和记忆具有双向作用,即适当神经元内适当浓度的Glu可以恰当地激动其受体,继而促进其学习和记忆能力;但若Glu过度生成并释放,可过度激动Glu受体, 继而诱发认知障碍。本研究发现,胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激能够导致兴奋性毒性;而Glu受体的拮抗剂则能缓解Glu浓度过度升高造成的Tau蛋白的过度磷酸化,并且因此改善强应激导致的学习记忆障碍,本实验结果反映的分子机制值得研究者深入研究和探讨。

3.3总结和展望

胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激能够造成海马组织中的Glu过度合成和释放,继而诱发兴奋性毒性反应,使得海马组织内的Tau蛋白发生过度磷酸化反应,最终造成学习和记忆等脑功能受损。Glu受体的拮抗剂(包括NMDA受体拮抗剂和AMPA受体拮抗剂)均能缓解过高浓度Glu诱发的神经元兴奋性毒性反应,减缓海马组织内Tau蛋白的过度磷酸化程度,从而最终改善胎儿宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激造成的认知损害。

摘要：目的 通过观察兴奋性氨基酸受体拮抗剂对宫内窘迫后新生鼠认知能力和Tau蛋白过度磷酸化的影响,探讨兴奋性氨基酸受体拮抗剂对Tau蛋白过度磷酸化的调节及两者对新生鼠认知能力的影响。方法采用析因设计,将每只大鼠视为1个单位,予2个处理因素,即宫内窘迫处置和否(2水平:无处置,施行宫内窘迫,即夹闭孕鼠的子宫动脉2/3持续10 min)和兴奋性氨基酸受体拮抗剂使用和否[3水平:注射生理盐水N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂MK-801、黄芪总苷]的所有组合。全部宫内窘迫处置结束后母鼠继续妊娠至新生鼠娩出,待新生鼠生长至12周时开始Morris水迷宫(MWM)检测认知能力后留取海马。HPLC法检测谷氨酸(Glu)在海马内的浓度;免疫组织化学SP法检测Tau蛋白5(总Tau蛋白)以及磷酸化Tau蛋白pPHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262在海马中的表达水平。结果 宫内窘迫和Glu受体拮抗剂造成大鼠学习和记忆等脑功能障碍,即延长受试者的逃避潜伏期(EL),缩短受试者的空间探索时间(SET),两干预因素的影响结果呈现相减的效果。宫内窘迫可增加海马中Glu的浓度;Glu受体拮抗剂对海马内的Glu浓度无显著的影响。宫内窘迫和Glu受体拮抗剂对海马总Tau蛋白表达无影响。宫内窘迫可增加海马中磷酸化Tau蛋白的表达;Glu受体拮抗剂可缓解海马Tau蛋白的过度磷酸化程度;两者叠加的影响可以呈现相减的效果。结论 Glu受体的拮抗剂和黄芪总苷可以缓解宫内窘迫诱发的缺血缺氧强应激后的神经元损伤,其具体机制与阻断兴奋性毒性和缓解海马内Tau蛋白的过度磷酸化程度有关。

磷酸化Tau蛋白 篇3

1 tau蛋白的结构和功能

tau蛋白是微管相关蛋白家族(microtubule associated protein,MAP)中一种在成熟神经元的轴突集中可见的具有高可溶解性、天然状态下不具固定结构的磷酸化蛋白[1]。tau蛋白也可见于神经元细胞体树突的隔室和核中,并在星形胶质细胞和少突胶质细胞[2]中小范围存在。在成年人脑内,通过mRNA选择性剪接生成分别包含352到441个氨基酸的6种tau蛋白异构体[3]。6种异构体中3种为包含3个重复序列的异构体,而其余3种为包含4个重复序列的异构体。这些重复序列是构成tau蛋白丝状物的核心,并可与一些相邻的序列构成微管结合区域。研究表明在AD患者的脑部成像中,全部6种异构体均能在丝状物中呈现。

微管是所有真核生物细胞骨架的组成部分,主要是由α和β微管蛋白所形成的管状聚合物的异二聚体组成,而tau蛋白的主要功能就是促进微管的聚合和稳定,起到维持细胞骨架的作用,并作为通路使细胞器、囊泡、蛋白质和信号分子在胞内运输[4]。磷酸化tau蛋白的活性主要受其磷酸化程度及个体发育情况的影响,这种影响在早期发育的过程中对细胞支架的可塑性非常重要。tau蛋白磷酸化也能影响神经元的蛋白结构、分布和功能[5]。

tau蛋白病是一类神经变性疾病,具有高度磷酸化以及将微管相关蛋白tau蛋白(microtubule associated protein tau,MAPT)聚集成为螺旋状或者束状纤丝状,从而在脑内形成神经纤维的特性。在多种神经变性疾病中都发现有tau蛋白的聚集,例如进行性核上性麻痹(progressive supranuclear palsy,PSP)、皮质基底节变性(corticobasal degeneration,CBD)、皮克病、额颞叶痴呆症以及包括AD在内的许多其他疾病。人们已经将MAPT基因的突变与几个家族早发性tau蛋白病联系起来。超过50种致病的基因突变被证实存在于MAPT基因中[6],证明了仅仅tau蛋白的改变就足以引发神经退行性变。已有的证据表明,异常的tau蛋白过磷酸化会损害其与微管的结合能力,限制微管的组合,从而导致其聚集成NFTs,使微管解体,并最终导致轴突微管的运输能力受损[7,8]。

2 tau蛋白过度磷酸化与tau蛋白的去磷酸化

经过多年的研究,人们并未在AD患者体内发现tau基因突变,因此目前的研究主要集中在tau蛋白的翻译后修饰,而其中研究最为广泛的是tau蛋白过磷酸化。在正常情况下,tau蛋白翻译后要经过多个修饰过程,其中蛋白激酶活性增高和磷酸酯酶活性降低是导致tau蛋白过度磷酸化的直接原因[9]。

在体外tau蛋白被大量激酶磷酸化[10],而究竟哪些激酶参与了tau蛋白在体内生理或病理的磷酸化过程至今仍不明确。研究者们通过实验发现,抑制其中某种激酶的活性不能够完全降低病理条件下tau蛋白的过磷酸化水平,因此推测在tau蛋白磷酸化过程中可能涉及若干激酶。同时研究表明,tau蛋白激酶主要分为定向脯氨酸激酶和非定向脯氨酸激酶两种。在拥有大量丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化tau蛋白中,定向脯氨酸tau蛋白激酶糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK-3)和细胞周期素依赖蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,CDK5)是重要的tau蛋白激酶,并且在AD的tau蛋白病理改变中扮演着重要的角色[11]。此外,GSK3的活化和CDK5的过量表达也均被证明可诱导相关的tau蛋白病[12]。非受体酪氨酸激酶的活性(如Fyn和c-Abl)也被指出与AD的病理学相关[13]。在体外通过对双重特异性酪氨酸(Y)磷酸化调控激酶1A[dual-specificity tyrosine(Y)phosphorylation regulated kinase 1A,DYRK1A]和CDK5激酶上GSK31介导的tau蛋白磷酸化[14]效果的观测,研究者们发现在某些特定磷酸化位点的残基更易于被磷酸化。因此基于现有研究,研究者们推测被不同激酶磷酸化的tau蛋白或许遵循一定的规律。GSK-3β激活是诱导tau蛋白发生过度磷酸化、聚积的多种因素之一[15]。此外,一种激酶的活化可通过“激酶级联”激活第二个激酶,这种现象可在CK1和c-Abl激酶对CDK-5的激活中观察到[16]。在体外能够使tau蛋白去磷酸化的磷酸酯酶包括蛋白磷酸酯酶(protein phosphatases,PP)PP1、PP2A、PP2B和PP5[17]。在AD患者脑中磷酸酯酶的活性显著降低,所以研究认为恢复磷酸酯酶的活性可成为一种潜在的AD干预手段。与磷酸酯酶PP2B和PP1相比较,PP2A对于tau蛋白的去磷酸化活性更强[18],并且其可作为体内tau蛋白去磷酸化的重要调节因子[19]。升高PP2A活性可降低tau蛋白磷酸化,从而改善神经元功能和学习记忆[20];PP2A活性增高还可促进神经元轴突生长[21]。PP2A的抑制可诱导tau蛋白过度磷酸化、导致轴突转运功能异常并使动物学习记忆发生障碍。

在体外,PP2A可使从AD患者脑中分离的异常tau蛋白上多个位点去磷酸化,从而恢复其生物学功能[22],而低温可导致PP2A在调节过磷酸化的tau蛋白时活性降低[23]。另外,激活GSK-3可上调PP2A抑制因子2(I2 PP2A)的表达水平,并抑制PP2A的活性从而使tau蛋白过度磷酸化,导致NFTs聚集并使神经元出现功能性障碍,最后导致神经退行性变。综上所述,研究者们发现在AD患者中,PP2A的表达和活性均显著降低[24]。因此,适时适度地对诱发tau蛋白发生过度磷酸化的关键因素进行干预,如GSK-3β和PP2A等,可能会在一定程度上阻止或延缓AD的神经退行性变。

3 tau蛋白过度磷酸化与神经毒性

在生物学中,tau蛋白磷酸化是机体所必需的,但是研究发现tau蛋白过度磷酸化与AD的发病机制密切相关。在3个不同突触体区域中PHF是NFTs的主要组成部分[25],而研究表明,NFTs是AD病理学的主要病理特征之一。1986年,在PHF的核心蛋白成分中,研究人员鉴定出两组不同的与微管结合过磷酸化的tau蛋白[26]。

一些临床研究在对认知状态和病理结果的相关性进行分析[27]后认为,NFTs的数量与认知功能下降有密切的关系。因此,绝大多数研究主要集中在NFTs与神经退行性变的关系上。Arriagada等是最先认为新皮层NFTs的数量与痴呆的严重程度之间呈正相关性的团队之一[27,28]。在过去的几年中,日内瓦小组已进行了一系列的关于痴呆患者和非痴呆患者的临床病理学分析研究[29,30],结果显示,NFTs的数量被证明是与认知功能障碍密切相关的,尤其是在海马CA1区域、内嗅皮质以及大脑的9号区域均可见大规模的NFTs[31]。

在关于NFTs的研究中,Tomlinson等率先指出在认知完整的老年人中存在NFTs[32]。此后,若干研究也表明NFTs在正常老化的脑组织中存在[33],尤其在诸如内嗅皮质、海马CA1领域以及颞叶皮层等区域均可被发现。研究者们发现根据嗅皮层或大脑的9号区域中NFTs的数量可以预测大部分患者在简易智力状况检查法(mini-mentalstateexa-mination,MMSE)评分的趋势。时至今日,大量的研究表明,NFTs似乎是引起额颞痴呆(frontotemporal dementia,FTD)的重要因素。

综上所述,tau蛋白过度磷酸化导致NFTs快速聚集,而NFTs会引发FTD,所以若要阻止或缓解tau蛋白的神经毒性作用,可从控制tau蛋白过度磷酸化、抑制tau蛋白聚集成NFTs以及如何将tau蛋白在细胞内降解等方面开展研究。

4 AD中的tau蛋白与PET技术

在几种统称为tau蛋白病的神经退行性病变中,tau蛋白在脑内逐渐累积被认为是与神经变性及认知功能障碍密切相关的。虽然脑脊液中tau蛋白的含量和tau磷酸化的定向评估在当前被认为是神经退行性病变的标志,并且也被认为与AD中认知功能的损害相关。但是,腰椎穿刺收集脑脊液是一种侵入性的有创检查,并且多个实验室的检查结果多有不同,妨碍了整体数据的准确与稳定[34]。此外,脑脊液检查中tau蛋白和磷酸化tau蛋白的水平无法反映大脑中tau蛋白的病理位置分布,而tau蛋白的病理分布位置对于某些tau蛋白病变的鉴别诊断是至关重要的。由于tau蛋白的错误折叠被认为是神经退行性病变潜在的重要过程,针对这一过程研究者们开发了诸多对于神经退行性变的治疗手段,包括减少tau蛋白磷酸化、抑制tau蛋白原纤维聚集和提升微管的稳定性[35]。因此,非侵入性检查方法的发展对tau蛋白病理检测和临床试验性治疗提供了更好的发展前景。

目前,对于tau蛋白在脑内特定沉积部位的无创检查被认为对疾病早期预测及诊断是很有帮助的。正电子发射断层显像(positron emission tomography,PET)是一种无创性分子成像方法,可对人脑生物学进程进行广泛的定量分析。近几年,研究者们发现了一些tau蛋白PET示踪剂并将其成功用于脑内神经纤维疾病的病理改变显像,其中包括T807、THK-5117和PBB3。PET利用这些tau蛋白放射性示踪剂实现了对局部以及全体tau蛋白的精确显像。这项技术的发展将为临床上提供更加及时、准确的鉴别诊断,并且在监测疾病进展和实验性临床治疗上提供更多的帮助。

对于作为AD的病理生物标志物tau蛋白,PET所采用的放射性药物示踪剂应具有对PHF-tau蛋白的高选择性和高亲和性,从而避免与脑中大量存在的Aβ蛋白和其他蛋白沉积物结合。随着研究的进一步深入,研究人员将继续评估tau蛋白特异性示踪剂的可靠性及安全性,并验证其在体内对tau蛋白的选择性,达到可检测不同的tau蛋白异构体,包括AD及其他神经变性疾病中的tau蛋白包涵体。

tau蛋白PET成像对于发现疾病早期病理的改变、对药物疗效的评估以及对理解AD的病理生理机制研究是有推动性作用的。而在未来,人们可能进一步利用PET技术来阐明人脑内tau蛋白与Aβ蛋白的相关性,并且该技术可为神经退行性疾病病情进展的研究提供更好的平台。

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