蛋白激酶B（精选7篇）
蛋白激酶B 篇1
动脉血栓形成是缺血性心、脑血管疾病和其他血栓栓塞性疾病发病的关键环节,血小板聚集是动脉血栓形成的重要诱因。能否有效控制病理状态下血小板的活化、聚集是防治血栓性疾病的关键,临床上抗血小板药物的使用目前是心脑血管疾病防治的重要手段,在心脑血管疾病的一级及二级预防中广泛应用。因此,对抗血小板治疗药物的探索一直是预防血栓及心血管疾病基础与临床研究的热点。对我国中医药的研究中发现,许多具有活血化瘀作用的中药都含有抑制血小板聚集的有效组分。天然中草药与目前已上市的西药和生物技术产品相比,具有安全性好,口服有效且来源广泛等优点[1,2,3]。因此,发展纯天然的抗血栓药物是目前研制新型抗血栓药物的有效途径。白术内酯Ⅱ属倍半萜类内酯化合物,是常用中药白术的主要化学成分之一。有研究发现白术内酯Ⅱ能阻滞黑色素瘤细胞的细胞周期及诱导细胞凋亡,但其对血小板的作用目前尚不清楚[4,5]。本实验拟观察白术内酯Ⅱ对血小板活性是否有抑制作用,并探讨其可能的分子机制。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
健康人单采血小板由上海瑞金医院提供。胶原购自CHRONO-PAR(美国),蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购自瑞士的罗氏公司,三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)、前列腺素E(PGE1)、纤维蛋白原(Fg)购自西格玛公司(美国),磷酸化蛋白类激酶B(Akt473)抗体、GAPDH抗体购自Cell Signaling公司,鬼笔环肽购自美国生命技术公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠Ig G购自Jackson公司,Western发光液为Milipore公司生产,白术内酯Ⅱ购自上海纯优生物科技有限公司。血小板聚集仪(CHRONO-LOG,美国),正置荧光显微镜(Zeiss公司,德国),电泳仪(上海天能科技有限公司,上海)。
1.2 实验动物
C57BL/6野生型小鼠,6~8周,雌雄各半,体重(20±2)g,动物合格证号:2015000510330。动物饲养在上海交通大学医学院SPF级动物房,实验开始前1周进行适应性饲养,温度(23±1)℃,湿度(50±5)%,饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。
1.3 方法
1.3.1 小鼠血小板聚集
1%异戊巴比妥(0.2 m L/只)麻醉小鼠后,用加有抗凝剂枸橼酸钠的2.5 m L注射器抽取小鼠的腹主动脉血至15 m L BD管中,加入等体积的0.9%生理盐水,apyrase(终浓度1 U/m L)以及PGE1(终浓度为0.1μg/m L),颠倒混匀后室温离心,1050 r/min,10 min,吸取上层富含血小板血浆(PRP)至新的15 m L BD管中,加入apyrase(同上)和乙二胺四乙酸(EDTA,终浓度为5 mmol/L),颠倒混匀后室温离心,2100 r/min,10 min,弃上清,得到血小板,重悬于事先37℃预热好的台式缓冲液中,用全血细胞计数仪计数并将血小板稀释为3×108个/m L,37℃水浴静置1 h待用[6]。以二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂,配制白术内酯Ⅱ溶液。白术内酯Ⅱ(终浓度为10μmol/L)与小鼠洗涤血小板(每管300μL)孵育3 min后,使用血小板聚集仪检测在胶原诱导下白术内酯Ⅱ对小鼠血小板聚集程度的影响。
1.3.2 人血小板聚集
在富含人血小板血浆(PRP)中加入apyrase(终浓度2 U/m L)和EDTA(终浓度为5 mmol/L),室温离心,1900 r/min 10 min,得到血小板,重悬于台式缓冲液中,用全血细胞计数仪计数并稀释为3×108个/m L,37℃水浴静置1 h。不同浓度的白术内酯Ⅱ与洗涤人血小板(每管300μL)孵育3 min,使用血小板聚集仪检测在胶原诱导下白术内酯Ⅱ对人血小板聚集程度的影响[7]。
1.3.3 血小板在纤维蛋白原上的铺展
将制备好的洗涤人血小板稀释为3×107个/m L,取100μL加到已铺有纤维蛋白原的玻璃爬片上,置于37℃恒温箱中孵育1 h;洗去爬片上未与纤维蛋白原结合的血小板,每个爬片上加100μL鬼笔环肽染料,室温避光孵育30 min;封片;使用正置显微镜的油镜观察并拍照,用NIH Image J软件计算铺展血小板的面积[8]。
1.3.4 Akt473分子的磷酸化水平检测
人血小板样品用2×SDS裂解液裂解并煮沸,用10%的聚丙烯酰氨凝胶电泳分离,并转到聚乙二烯氟化物膜上,以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为相同上样量[9]。
1.4 统计学方法
采用Graphpad prism 5软件分析和作图,正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 白术内酯Ⅱ对小鼠血小板聚集的影响
在胶原(1.3μg/m L)的刺激下,白术内酯Ⅱ为10μmol/L时就能显著的抑制小鼠血小板的聚集,与DMSO组比较,差异有高度统计学意义(P<0.01)。见图1。
与DMSO组比较,**P<0.01;control:对照;ATL-2:白术内酯Ⅱ;DMSO:二甲基亚砜;
2.2 白术内酯Ⅱ对人血小板聚集的影响
结果显示:白术内酯Ⅱ为10μmol/L时能明显抑制在胶原刺激下小鼠血小板的聚集,因此检测相同浓度的白术内酯Ⅱ对人血小板聚集的影响,在胶原(0.67μg/m L)的刺激下,白术内酯Ⅱ为10μmol/L时也能显著的抑制人血小板的聚集,且随浓度降低其抑制程度,与DMSO组比较,差异有高度统计学意义(P<0.01),在白术内酯Ⅱ浓度为0.5μmol/L时基本无抑制作用。见图2。
与DMSO组比较,**P<0.01;control:对照;ATL-2:白术内酯Ⅱ;DMSO:二甲基亚砜
2.3 白术内酯Ⅱ对人血小板铺展的影响
在固态纤维蛋白原上的铺展,经过不同浓度(1、5、10μmol/L)的白术内酯Ⅱ的处理后,血小板在纤维蛋白原上铺展的平均面积分别为(3847.3±1738.7)、(1926.2±786.1)、(1467.2±591.5)像素,而DMSO组铺展的平均面积为(8697.1±1388.9)像素,由此说明白术内酯Ⅱ能抑制血小板在纤维蛋白原上铺展。见图3。
2.4 白术内酯Ⅱ对分子Akt473磷酸化的影响
PI3K/Akt是参与调节血小板活化的经典信号通路,因此,本研究探讨胶原(0.67μg/m L)刺激下白术内酯Ⅱ对血小板中Akt473分子磷酸化水平的影响。结果显示:白术内酯Ⅱ降低了人血小板中Akt473分子的磷酸化水平,并呈浓度依赖。见图4。
3 讨论
白术为菊科植物白术的干燥根,其性味甘、苦、温,具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效,可用于脾虚食少、腹胀腹泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等,是临床上常用的中药[10,11]。白术中主要含有挥发油和内酯类化合物,白术内酯Ⅱ是白术内酯类成分之一,具有抗炎抗肿瘤作用,具有调节胃肠道功能和促进营养物质吸收的功效[12,13]。有资料显示白术有抗栓作用[14,15],但其具体机制是通过影响血小板还是凝血系统以及有效成分为何目前尚无报道[11]。
冠状动脉疾病等血栓栓塞性疾病的发病率逐年增加,而血栓形成是一个复杂的病理过程,血小板激活在血栓形成过程中发挥着至关重要的作用,因此抗血小板聚集在防治血栓栓塞性疾病中具有重要意义[16]。胶原是常用血小板聚集的刺激剂[17,18],本研究显示白术内酯Ⅱ以较低浓度抑制了小鼠血小板在胶原刺激下的体外聚集,对人血小板也具有较强的抑制作用,且具有浓度梯度。血小板的铺展是由整合素介导的。血小板接收到其表面受体传递到细胞内部的活化信号后,通过一系列的下游蛋白激活和抑制将信号传递到整合素,从而使整合素活化,即为血小板的内向外信号传递,活化的整合素与纤维蛋白原特异性结合,从而向胞内传递外向内信号引起血小板活化信号的进一步放大。整合素所介导的双向信号在血小板聚集、铺展和稳定血栓形成中起着至关重要的作用[19,20]。白术内酯Ⅱ可能通过影响整合素的外向内信号从而抑制血小板的铺展。
与DMSO组比较,***P<0.01;control:对照;ATL-2:白术内酯Ⅱ;PLT:血小板
与DMSO组比较,***P<0.01;P-Akt473:磷酸化蛋白激酶B;GAPDH:磷酸甘油醛激酶;ATL-2:白术内酯Ⅱ;DMSO:二甲基亚砜
在血小板的活化过程中有多种信号分子的参与,已有研究证实分子Akt在血小板黏附、聚集、铺展的过程中具有重要作用[21]。在白术内酯Ⅱ抗炎的相关研究中也发现其对PI3K-Akt信号通路有影响[22]。因此本研究检测了在胶原的刺激下,经过白术内酯Ⅱ处理后人血小板蛋白中Akt473分子的磷酸化水平变化[16,17]。结果显示,白术内酯Ⅱ处理后,人血小板中Akt473分子的磷酸化水平明显降低,提示白术内酯Ⅱ可能通过抑制PI3K-Akt通路,进而抑制血小板的活化。
综上所述,本研究结果表明,白术内酯Ⅱ能有效抑制胶原诱导的血小板聚集,并通过影响PI3K-Akt通路来抑制血小板的活化,为白术内酯Ⅱ成为新型抗血栓药物提供了可能。
植物蛋白激酶的研究进展 篇2
由于可逆的蛋白磷酸化作用在所有真核细胞基础功能调节中起重要作用, 如DNA复制、细胞周期控制、基因转录、蛋白质翻译、能量代谢、细胞与细胞之间的通讯和介导与周围环境的复杂相互作用, 所以, 生物体中有相当数量的蛋白激酶基因。在蚯蚓 (Caenorhabditis elegans) 这样较低等的多细胞动物中, 已鉴定出至少411个全长蛋白激酶基因和21个蛋白激酶基因的部分片段。人类蛋白激酶的结构、功能和进化, 尤其是酪氨酸蛋白激酶已经得到广泛的研究。上世纪末, 已有部分植物蛋白激酶被鉴定, 大多数是Ca2+依赖蛋白激酶。虽然植物蛋白激酶的研究发展迅速, 但仍然远远落后于动物和人类。许多蛋白激酶的生物学功能还不清楚。为促进蛋白激酶研究, 本文将对植物蛋白激酶研究进行综述。
1 植物蛋白激酶
1.1 钙依赖蛋白激酶 (Calcium-dependent calmodulin-indepen-dent protein kinases, CDPKs) 。
胞质Ca2+作为植物细胞信号转导中最基本的第二信使, 几乎介导了植物生长发育的全部反应。胞内Ca2+的分布严格区域化, 同时保持胞质Ca2+的稳态是细胞正常生长的前提条件[1]。当植物受到各种刺激, 包括光、环境胁迫、病原体侵染和植物激素 (赤霉素、脱落酸、生长素、细胞分裂素) 等都能引起细胞质Ca2+浓度的变化, 从而发出钙信号以传递所感受到的刺激信号。钙信号的进一步传递则需经Ca2+结合蛋白和钙依赖蛋白激酶等才能完成。但是与胞内Ca2+浓度变化相关联的信号转导途径的下游事件, 及其在基因表达和细胞代谢等方面还不清楚。在不同种类植物中的研究暗示, 一个大的钙赖 (除钙调素Ca M和磷脂外) 蛋白激酶 (CDPKs) 基因家族很可能在植物的钙信号传递过程中起着重要作用。
CDPKs是植物和一些原生生物所特有的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶, 它在胞内钙信号的放大并向下级联传递过程中起着十分重要的作用。研究表明, CDPKs参与到了植物环境胁迫反应、病原体的防御反应、生长发育过程、离子通道调节、激素信号等诸多信号传递过程。近年来, 国内外学者对CDPKs的研究十分活跃, 取得了许多重要成果[2]。
Ca2+在动植物细胞代谢和信号传导途径中起重要作用。Ca2+作为植物细胞的第二信使, 它对内源激素和外界因素, 如物理刺激、真菌激发子、细胞分裂素等有灵敏的反应, 并引起细胞内Ca2+浓度的波动。一部分Ca2+参与传导的信号需要依靠下游的蛋白激酶来放大[3]。Harmon等[4]首先报道了大豆中的一种Ca2+依赖蛋白激酶 (Calcium-dependent calmodulin-independent protein kinases, CDPKs) 。它不同于动物中的蛋白激酶C和依赖于Ca2+/CaM的蛋白激酶, 是一种新的仅依赖Ca2+的蛋白激酶。CDPKs广泛存在于植物体内, 是研究最深入的植物蛋白激酶。
CDPKs的特征[5]是:a.单肽链结构, 能直接与Ca2+结合;b.Ca2+的结合能活化该蛋白, 活化状态的蛋白分子具有丝/苏氨酸蛋白激酶的活性;c.在SDS-PAGE中显示出Ca2+依赖的迁移率改变;d.活化过程中钙调素 (calmodulin, CaM) 和磷脂都不是必需因子。
CDPKs从N端到C端依次为催化区、连接区和调控区。催化区由300多个氨基酸组成, 具有典型的丝/苏氨酸蛋白激酶的亚结构域, 该区的同源性较高, 一般在80%以上。连接区由20~30个氨基酸组成, 是蛋白激酶活性自抑制的区域和最保守的区域。调控区是钙结合的部位, 也是CDPKs区别于其它蛋白激酶的特征区域, 它与典型的CaM序列有大于40%的同源性, 是CDPKs中最不保守的结构域[6]。另外, 在催化区前端的N末端有一段长短不一的可变结构域, 各类CDPKs在此区很少有同源关系。某些CDPKs的N端与N-肉豆蔻酰化所需的保守序列 (MGxxCS/QxxT) 有同源性。N-肉豆蔻酰化是膜蛋白常见的一种翻译后的修饰方式。信号传导系统的许多重要元件都有该结构, 它参与蛋白质与膜的可逆结合以及蛋白质之间的相互作用。
CDPKs以膜结合和可溶性两种形式广泛分布于植物的根、茎、叶、花和种子细胞中。Ca2+对CDPKs的激活机制仍不清楚。CDPKs的底物广泛, 并具有共同序列:碱性氨基酸X-X-Ser (X为任意氨基酸) 或Ser-Phe-Lys[7]。
拟南芥在盐胁迫和干旱胁迫后1h可观察到CDPKs的m RNA增加。CDPKs可能在盐、干旱胁迫和机械刺激等环境胁迫的信号传导中起作用。真菌激发子可引起质膜H+-ATPase磷酸化状态的改变, 在接种2h后, 会发现脱磷酸化的H+-ATPase被CDPK重新磷酸化[8]。研究发现, 许多运输离子的蛋白受CDPKs的调节。植物激素ABA信号转导研究证明, CDPK可能通过对保卫细胞内钾离子通道的调节, 介导了ABA调控气孔运动的信号转导过程[9]。
1.2 钙/钙调素依赖蛋白激酶 (calcium/calmodulin-dependent protein kinase, CaMK) 。
钙/钙调素依赖蛋白激酶是一类活性受钙和钙调素调节的蛋白激酶。除了直接依赖钙的钙依赖蛋白激酶 (CDPKs) , 钙调素是又一个细胞间Ca2+的初级受体, 当被Ca2+激活后它作为其结合蛋白的调节者起作用。与哺乳动物的钙/钙调素依赖蛋白激酶相似, 植物的钙/钙调素依赖蛋白激酶具有N-端激酶域和一个钙调素结合域。Watillon[10]等首次报告了从苹果中分离的与动物CaMK同源的植物CaMK。随后, Lu等又从玉米中分离了2个钙/钙调素依赖蛋白激酶基因MCK1和MCK2, 并进行了特征分析、物理定位和表达分析。玉米的钙/钙调素依赖蛋白激酶基因 (MCK1和MCK2) 的表达具有时空性, 在玉米的生长发育中起作用[11]。
1.3 类受体蛋白激酶 (Receptor-like kinases, RLKs) 。
类受体蛋白激酶是蛋白激酶的一个亚族, 由一定的胞外配体结合域 (extracellular ligand-binding domain) 、跨膜域 (transmembrane domain) 和胞内激酶域 (cytosolic kinase domain) 组成[12]。它被认为在胞外信号传导中起关键作用。当有胞外配体存在时, RLKs可能会发生构象变化, 从而导致胞内靶蛋白的磷酸化。与动物系统不同, 虽然已用遗传学的方法鉴定了两个植物RLKs的推测配体, 植物中配体与这些膜结合受体的结合假说仍未得到充分验证[13]。当RLK序列间在蛋白激酶域高度保守时, 可根据胞外域的差异进一步分为3个类型。最大的一组是具有LRR结构的RLKs, LRR结构为至少有5个串联重复的富亮氨酸保守区。例如拟南芥的Clavata1和Bri1, 分别控制分生组织的大小和对油菜素类固醇 (brass inosteroids) 的反应。第2组包括序列与自交不亲和位点编码蛋白同源的S型RLKs。第3组有待于进一步划分。包括类似于肿瘤坏死因子受体 (tumour necrosis factor receptor, TN-FR) , 上皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF) , 病程相关蛋白 (pathogenesis-related protein, PRs) , 或外源凝集素结合域 (Lectin-binding domain, LB) 的RLKs。
类受体蛋白激酶在发育过程中的作用可能是转换外界环境的信号和/或来自邻近细胞的信息, 因此引发特异性应答反应。体细胞胚的形成就是这样一种过程, 培养细胞的胚形成反应不仅依赖于所用的细胞类型, 而且与培养基的组成有关。在对胚性潜力与特定基因表达谱的相互关系试验中, 从胡萝卜中分离到SERK (somatic embryogenesis receptor-like kinase) 基因[14]。SERK的表达开始于单“潜能”细胞, 持续到球状胚时期。这种短暂表达现象与假说一致, 即SERK能转换培养基中存在的一种信号物而启动胚发育, 在其姊妹细胞中没有SERK的表达则不发生胚性发育。Baudino等在玉米中进行了类似的试验。克隆和鉴定了2个类似于SERK的LRR型类受体蛋白激酶基因Zm SERK1和Zm SERK2。最近证明, 拟南芥茎细胞特异性蛋白CLAVATA3 (CLV3) 被输出到细胞外空间, 以发挥它激活CLV1/CLV2受体复合物的功能。
1.4 促分裂原蛋白激酶 (MAPK) 。
促分裂原蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK, 又称为ERK, external-signal-regulat-edprotein kinase) 是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。分子量大多在38~55kD之间, 含有蛋白激酶活性所需的11个亚功能域, 在第7和第8亚功能域之间有高度保守的Tx Y基序。酵母和动物中Tx Y基序的x常为E、P或G, 而植物中的x常为E或D, 因此, TDY基序为植物所特有。MAPK最早发现于受促细胞分裂原 (mitogen) 刺激的动物细胞中。起初认为它只是动物促细胞分裂原的传递体, 后来发现MAPK还参与激素、环境胁迫以及细胞分化等有关的多种信号传递。
1.5 核糖体蛋白激酶 (ribosomal-protein kinas) 。
从拟南芥中分离到的2个蛋白激酶基因ATPK6和ATPK19所编码的氨基酸序列与动物核糖体蛋白S6激酶P70s6k和PP90rsk高度同源[15]。它们的表达均被干旱、高盐和低温所诱导。
1.6 转录调控蛋白激酶 (transcription-regulation protein) 。
从拟南芥中分离出一种编码与酵母 (Saccha-romycescerevisiae) dbf2基因编码的氨基酸序列高度同源的基因, 且该基因能补偿酵母dbf2突变体的功能缺陷, 因此定名为At-dbf2[16]。拟南芥At-DBF2激酶属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类。低温、高盐和脱水均能很快诱导At-dbf2基因的表达。
2 小结
植物CDPKs的研究起步较晚, 但发展很快。对于CDPKs的生理功能和作用机理都还处于探索阶段, 很多结论都有待于进一步证明。生物细胞信号转导途径很多, 而且往往是相互交叉协作进行才能完成一个信号转导。展望今后的研究工作, 一是继续利用现代分子生物学技术进行CDPKs基因的离和鉴定;二是在不断获得新结论的同时, 对已有的结论采用多种方法和技术在更宽广的范围内进行再印证;三是加强对CDPKs下游事件的研究, 将会进一步了解CDPKs的生理功能和作用机制的重要环节。
植物细胞中可能既存在类似于动物细胞的一些信号转导因子及机制, 同时又存在植物细胞特有的信号转导因子及调节机制。
近年来, 蛋白激酶的研究取得了很大进展, 但仍有很多方面尚未了解, 如一些激酶的催化、调控机制以及生化性质分析等, 有待进一步研究。
摘要：蛋白激酶是酶中的一个大家族, 在诸如发育、自交不亲和、雄性不育、抗逆和抗病反应中起重要作用。为了促进蛋白激酶的研究, 本文对植物蛋白激酶如:钙依赖蛋白激酶 (Calcium-dependent calmodulin-independent protein kinases, CDPKs) 、钙/钙调素依赖蛋白激酶 (calcium/calmodulin-dependent protein kinase, Ca MK) 、类受体蛋白激酶 (Receptor-like kinases, RLKs) 、促分裂原蛋白激酶 (MAPK) 、核糖体蛋白激酶 (ribosomal-protein kinas) 、转录调控蛋白激酶 (transcription-regulation protein) 的研究现状进行了综述。
蛋白激酶B 篇3
美国健身专家玛姆强调说,跳绳能增强人体心血管功能,而心血管疾病的治疗和预防就是通过对RNM代谢血糖干预实现。心血管疾病是指心血管机体内某些组织的细胞发生异常增殖,呈膨胀性生长,似吹气球样逐渐膨大,临床表现主动脉压迫、静脉回流等症状,通过跳绳运动进行有氧锻炼干预,促进白激酶(RNM)代谢,实现对血糖的干预,改善心血管功能[4,5,6,7],本文研究在短时跳绳运动作用下的RNM代谢血糖干预效果并对生理指标的促进功能,构建短时跳绳运动对RNM代谢血糖影响的数学关系模型,通过RNM代谢血糖的干预效果分析,进行数学统计显著性分析,证明短时跳绳运动对RNM代谢血糖的干预效果。分析短时跳绳运动对人体的心血管机能等改善和促进作用,计算RNM代谢血糖抑制指数,对RNM代谢血糖的影响关系模型定量分析,提高疾病预防的科学性和合理性。
1 研究对象和方法
1.1 研究对象
短时跳绳运动对运动技能和运动量方面的要求不高,为了体现本文研究课题的客观性,本文建立短时跳绳运动对RNM代谢血糖干预效果影响模型,研究对象为随机选择的跳绳运动爱好者进行测试,进行为期三个月的持续性的跳绳运动锻炼,并对受试者的身体状态进行跟踪观察。受测着的年龄分布为19~65岁,平均年龄37岁,其中,受测人员中男性占24例,女13例,受测人员中患有心肌梗塞的队员有2例、缺血性心力衰竭的有3例、具有遗传性心血管疾病的为2例,其他受测队员身体健康,所有研究测试对象血压均处于正常范围。以上述测试对象为基础,研究血糖干预下的心血管疾病患者体内的核酸基与蛋白多肽特征,分析短时跳绳运动对RNM代谢血糖干预效果。
1.2 研究方法
鉴于短时跳绳运动对心血管独特的保健作用,本文通过跳绳运动进行血糖干预,分析心血管疾病患者体内的核酸基与蛋白多肽具有差异性特征,研究通过短时跳绳运动对体内RNM代谢血糖的影响,建立起与心血管疾病的预防和干预模型。对短时跳绳运动对心血管的RNM代谢血糖聚合能力进行分析,具体方法描述如下:
在最佳实验条件下,采用短时跳绳运动对实验对象和患者进行DLS测试,结合Ti O2光催化造影方法,采用50μmol/L鲁米诺的浓度[8,9,10],测定Ti O2光催化反应中产生的同化激素,当p H>11时I/I0值减小,随着心血管中的血糖代谢同化激素I/I0减小,将测试组TG与对比组CG2进行对比,显著性差异P<0.05,因此,选择p H=11为最佳的实验条件。采用分子动力学(MD)的方法模拟嵌段共聚物P(PEGMEMA16)对同化激素分泌影响,通过跳绳运动和药物治疗,得到的一种蛋白成分,其中含糖4.5%~9.5%,其亚单位相对分子质量为22~25万。根据上述结果,建立短时跳绳运动对RNM代谢的转化动力学分子模型如图1所示。
在心血管疾病患者进行短时跳绳运动过程中,比较O2·—和H2O2的生成过程,根据鲁米诺和O2·—化学关系,检测短时跳绳运动对超氧自由基(O2·—)的影响。同时进行O2·—和H2O2代谢作用,结合光催化机制,分析得到短时跳绳运动心血管疾病患者的I型含有Cag A和Vac A基因并表达两种蛋白,采用均方根误差计算心肌酶谱同化激素的生成当量,利用公式(1)表示。
式(1)中,N表示有氧运动和无氧运动的蛋白质差异性总原子数;i代表同化激素;ra表示第i个同化激素的位置矢量;ra,ref代表第i个同化激素位置的传递函数。
式(2)中,N表示有氧运动和无氧运动的蛋白质差异性总原子数,ra表示第i个同化激素的位置矢量,心肌酶谱同化激素的生成当量对血糖的代谢特征的底物普适性功能进行再次优化,得到短时跳绳运动下RNM代谢血糖重要官能团状态方程。
采用Valsalva试验,通过纤状管由口腔直接采集血糖含量,将PMMA支撑的高结晶晶体进行淬灭反应,淬灭后,结合RNM代谢血糖重要官能团状态方程,短时跳绳运动对人体的血糖干预过程如图2所示。
利用Kinase-Glo Luminescent测定短时跳绳运动溶解蛋白脂的指标参数,用表面活性剂进行蛋白激酶的光谱(Raman,PL)测定。非特异性标记下,通过短时跳绳运动,通过电子显微镜(DF-TEM)蛋白增长荧光,荧光淬灭效应作用下可用UVP GelDoc-It成像观测RNM代谢的二次谐波(SHG)过程,得到激发波长为356 nm,利用LEEM/LEED的方法得到RNM代谢血糖的衍射斑点,采用动力学分析的方法建立短时跳绳运动对RNM代谢血糖干预的抑制关系模型,得到RNM代谢血糖的衍射斑点如图3所示。
对RNM代谢血糖的衍射斑点进行酚标记,然后与共聚物P孵育10 min,在低氧射线下,利用UVP Gel Doc-It表达RNM代谢血糖干预的代谢水平和Cag A和Vac A基因并表达蛋白的增长水平,将血红蛋白的混合液体的发射波长设定为510 nm,由此实现RNM代谢血糖干预的蛋白激酶的活性测定。采用SPSS 13.0软件进行PCP的降解程度的统计分析,当P<0.05为差异性特征,对受测着进行体内的脂质体和蛋白脂质体的β-半乳糖苷酶分解,得到RNM代谢血糖干预下的脂质体和Agr C蛋白脂质体的p H。蛋白激酶的活性测定中,利用BF-LEEM图像进行Kinase Assay Kit测定,构建P-糖蛋白衍射斑点体系,通过P-糖蛋白测试氨基酸转运蛋白的值,利用DF-LEEM对质谱(ESI-MS)、红外(IR)光谱,得到血糖α细胞分泌胰的电流密度达到38.1μA/cm2,不同Mo S2样品的覆盖度为80%。采用M06-2X方法DEC溶剂下Au催化剂一分子醇助异构化反应,分析心血管患者全身脂肪特征,由于脂肪分布比较均匀,没有内分泌紊乱现象,也无代谢障碍性疾病,实验中蛋白质在表面采用分子动力学(MD)的方法模拟了免疫球蛋白的增长模型,在阶段性规律性运动强度下生成的细胞纤连蛋白是多聚体,诱发的血糖代谢紊乱功能疾病的概率≥1.8 mm,在p H=9的条件下,选用Wells-Dawson型POM簇和T8型POSS簇作为酸苄酯己内酯造影剂,选用Wells-Dawson型POM簇和T8型POSS簇作为目标簇-簇杂化分子的构筑单元,分析短时跳绳运动对RNM代谢血糖干预的水平。
2 结果
通过短时跳绳运动,可以建立完善的促进生理指标体系。在RNM代谢血糖干预下,进行P-糖蛋白测试结果表明:RNM代谢血糖干预下,对心血管的P-糖蛋白供血具有良好的调控机能,使用元素分析表征血管代谢数据的支持信息,将d(0.25 g)溶于(6.15 g,0.037 mol)的热水中,酮洗涤除去激发波长下的乙酰氨基-超支物,血管功能的蛋白激酶采用20 mmol·L-1HEPE的P-糖蛋白进行造影分析,得到血糖分泌的耐药性生理指标体系。在无催化剂存在情况下,纤连蛋白的数值为0.055%Brij-35,对P-糖蛋白进行对比,当差异值P<0.05和P<0.01,用注射器注入80 m L 2,4-二氯苯硫酚,使得HPPSNT的荧光强度增强,抑制RNM代谢血糖干预在一价金离子跟醇复合时可形成二配位的醇-金络合物,而不同浓度的七异丁基下进行代谢的幅度测量,在与对照组CG2分析过程中,通过血管收缩能有效清除过氧化作用的产物,参与到机体的缓解调节过程中,得到RNM代谢血糖干预的概率≥1.8mm,生理反应过程如图4所示。
分析图4可知,蛋白质对RNM代谢血糖干预生理指标测试系统具有影响,短时跳绳运动会产生摄氧量增加的效果。在人体大量能量消耗的过程中,氨基丙基-3,5,7,9,11,13,15生成金属离子,如Ag+、Cu2+、Fe3+、Hg2+,这些金属离子也是代表RNM代谢血糖干预效果的重要指标。所以,对其离子荧光强度进行测定,可以准确反应短时跳绳运动对血糖干预的影响:首先设定血液造影速率为3m L/s,动态光散射测度值为405 nm,芳基硼酸均衡作用下多肽核酸Q-PCR检测结果为(P<0.05),将上述参数设定好之后,利用ATP比色/荧光分析检测试剂盒对RNM血糖代谢参量Ag+、Cu2+、Fe3+、Hg2+的荧光强度进行测定,得到自由基抑制剂对血糖干预下的RNM代谢参量测定结果如图5所示,通过短时跳绳运动作用,得到RNM代谢血糖干预结果如图6所示。
分析图6可知,采用短时跳绳运动进行RNM代谢血糖干预,得到核酸基和蛋白多肽的适合浓度为50 mmol·L-1,包含20μg的Agr C蛋白,20 mmol·L-1多层螺旋核酸基(p H 7.4),产生10 mmol·L-1Cu SO4·5H2O,在0.055%浓度时,跳绳运动下蛋白多肽为35 mmol·L-1,而比对实验组的蛋白多肽为10 mmol·L-1。其中,自由基抑制剂对血糖干预下的心血管RNM代谢参量Ag+、Cu2+、Fe3+、Hg2+的荧光强度平均约为21.9 a.u.、9.5 a.u.、0.26 a.u.、1.74 a.u.,而进行短时跳绳运动后的心血管RNM代谢参量Ag+、Cu2+、Fe3+、Hg2+的荧光强度平均约为83.4 a.u.、33.4 a.u.、10.12 a.u.、512.5 a.u.,上述结果表明:通过短时跳绳运动锻炼,各项功能指标优于没有进行短时跳绳运动锻炼的测试组。
图5自由基抑制剂对血糖干预下的心血管RNM代谢参量测定结果Fig.5 Metabolism of free radical inhibitor on blood sugar under the intervention of cardiovascular RNM parameter determination results
为了定量分析短时跳绳运动对RNM代谢血糖干预的效果,通过数值分析方法,将空腹血糖(FPG)、口服葡萄糖糖耐量试验2 h血糖(OGTT2h PG)、胰高血糖素作为评价干预效果的指标,比较短时跳绳运动、其他运动和对照组的三个指标大小,得到详细的实验结果见表1。
分析表1可知,与干预前相比,干预后短时跳绳运动组胰高血糖素Glu、FPG和OGTT2h PG和有明显的下降,下降率分别为17.05%、6.75%和19.76%;其他运动组胰高血糖素Glu、FPG和OG-TT2h PG和有明显的下降,下降率分别为1.25%、2.35%和11.94,对照组中的三个指标值基本不变,实验证明:通过短时跳绳运动,对RNM代谢血糖干预具有显著性特征,改善了α细胞分泌胰高血糖素的水平,使得血糖值控制在6.1 mmol/L以下,避免了高血糖等疾病的发生。
3 结论
短时跳绳运动对蛋白激酶(RNM)代谢具有促进作用,通过短时跳绳运动增强RNM代谢,改善心血管功能。构建短时跳绳运动对RNM代谢血糖影响的数学关系模型,通过RNM代谢血糖的干预效果分析,进行数学统计显著性分析,证明短时跳绳运动对RNM代谢血糖的干预效果;分析短时跳绳运动对人体的心血管机能等改善和促进作用,计算RNM代谢血糖抑制指数,对RNM代谢血糖的影响关系模型定量分析,采用短时跳绳运动进行RNM代谢血糖干预,得到核酸基和蛋白多肽的适合浓度为50 mmol·L-1,通过短时跳绳运动锻炼,各项功能指标优于没有进行短时跳绳运动锻炼的测试组。通过短时跳绳运动,对RNM代谢血糖干预具有显著性特征,改善了α细胞分泌胰高血糖素的水平,使得血糖值控制在6.1mmol/L以下,避免了高血糖等疾病的发生,改善心血管功能。
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蛋白激酶B 篇4
PKC的同工酶表达于几乎所有的组织。PKCα、β和δ是在各种组织中含量最丰富的。各种PKC同工酶的激活产生不同的细胞效应。并且, 各种同工酶之间有着很大的影响, 所有的反应好像都依赖于在特殊细胞类型中其他同工酶的存在或是活化。举个例子, 正常的表皮分化模式通常由PKCα和PKCδ协同完成, PKCα起抑制作用, 而PKCδ起促进细胞分化的作用[1]。本综述概述了PKCs的功能和调节以及其与癌肿演化的关系。我们主要的重点放在α、β和δ同工酶, 因其在组织中表达最为丰富, 同时也是被最广泛研究的同工酶。
1在癌肿中的PKC
几十年来, PKC在致癌作用中所扮演的角色是被公认的。在致癌作用的模式中, 诱变启动细胞群的同源细胞的增殖需要促进因素。促进因素又能够增加遗传的不稳定性和自然突变的危险性, 癌肿相关基因的突变最终导致癌肿的发生。接下来化学肿瘤促进因子也作为PKC的特殊激活因子。肿瘤促进剂 (如PMA) 与PKC的甘油二酯结合位点的结合具有高度亲和力, 并且促使PKC激活时间的延长, 而接下来的酶会负向调节。肿瘤促进因子是否来源于PKC 同工酶的激活, 还是长期的酶的激活的缺失, 还不是很清楚。
1.1 PKC在癌肿中的表达
已了解PKC同工酶在癌肿进展过程中有着不同的表达形式, 这依赖于各种不同的癌肿类别。在癌肿发展过程中最为常见的同工酶类型为α、β和δ, 但其他种的同工酶也会发生异常的表达。关于PKCα免疫组织化学的研究发现, 其在高度恶性的膀胱、前列腺和子宫内膜癌中有着过度的表达, 然而在低度恶性的肿瘤和正常的各个器官的表皮细胞却有着明显的低度表达[2]。相反, 在乳腺、结肠、肝细胞及基底细胞癌PKCα低度表达[4,5]。已知PKCβ在结肠癌和前列腺癌的表达是正向调节的[3], 而在膀胱癌是负向调节。cPKC的表达同样, PKCδ既能正向调节 (肝细胞癌) 又能负向调节 (膀胱癌) 。其他类别的PKC同工酶在癌肿中的表达还未被广泛地研究。举个例子, PKCι、ε和λ在胰腺癌的表达减低[7], PKCη在肾癌中升高[8], PKCλ在卵巢癌中升高[6]。关于PKC同工酶在患者预后生存率的表达只有很少量的研究, PKCι通常认为是一个关于卵巢癌预后的负向表达因子[9], PKCγ则是B细胞淋巴瘤的正向表达因子[10]。
PKC同工酶在癌肿进程中的变更是可调节的, 并且依赖于癌肿细胞的类别。一般而言, 关于致癌作用的表达方式还没有一个定论。现已了解由于同工酶转录后的调节而使PKC同工酶蛋白的表达与其各自的mRNA水平并不是必然相关的。有一点可以设想, 在癌肿中很常见的PLC的刺激受体就像EGFR的持续激活, 可以导致PKCs激活时间的延长并进一步消耗更多的酶。这就可以解释PKC同工酶在表达方面所呈现的变异性以及在PKC mRNA和恶性肿瘤的蛋白表达两者之间明显的差异。
1.2 PKC在癌肿中的功能
在体内外的癌肿模式中阐明了在恶性肿瘤中不同种类同工酶更为特别的作用。大量的研究数据现已证明, PKCα活力的增加与癌肿细胞的侵入以及活力的增加有着很大的相关, 而PKCα的抑制物有着明显相反的表现[12,13,14]。PKCα介导的发病的产生一般通过抑制结合点和桥粒的黏附而导致, 以及抑制β4-integin介导的半桥粒[14], 从而使β1-integrin介导的细胞基质结合点产生改变[12]。PKCα在癌肿细胞增殖过程中所起的作用由于癌肿类型的差异而产生更为复杂多变的反应。PKCα还与减低或增强增殖作用有关。此外, PKCα还可以抑制或是促进癌肿细胞的凋亡。 然而, 绝大多数的研究更为注重PKCα在诱导增殖和抑制细胞凋亡方面的作用。由于PKCα的活力能够增长P-糖蛋白的稳定性和其表达, 从而使PKCα的活力和多向性抗药 (MDR) 相关。
PKCβ在对癌肿细胞的作用方面与PKCα很相似, 特别是在肠道癌肿方面。PKCβ在肠道癌肿中表现出更强的侵袭力[11]和增殖程度。此外, PKCβ在肿瘤血管发生中也有一定的作用。PKCβ能够调节血管内皮生长因子 (VEGF) , 并且能够抑制上皮细胞增殖的减少以及缩减恶性肿瘤的新生血管形成[15]。
PKCδ最为重要的作用就是能够促进细胞的凋亡。半胱天冬酶间接激活PKCδ的分裂, 从而释放出有活性的催化区。并且PKCδ的激活还能够进一步促进PKCδ的分裂, 这一过程是一个正反馈的反应。PKCδ的激活能够导致大量的前细胞凋亡信号如p53 型肿瘤抑制基因的表达和稳定性的增强, 线粒体细胞色素C的释放, 以及c-Abl的激活。在恶性肿瘤中, PKCδ活力的减低使正常的细胞的凋亡被抑制以及对于DNA损伤剂抵抗力的下降[15]。在癌肿中PKC其他同工酶的作用还没有像PKCα、β、δ那样广泛地被研究, 并且它们在恶性肿瘤中潜在的作用还很难弄清楚。
总之, PKCα和PKCβ都能够增强侵袭力、增殖、抗药性和基因的不稳定性, 而PKCδ能够促进细胞的凋亡。然而PKC活化所有的反应都似乎依赖于其他同工酶的存在和效能。对于PKCα/β的抑制可以抑制恶性和正常的上皮细胞的增殖、侵入和诱导凋亡。有意思的是, 这些对于PKCα/β的抑制作用能够同时反向地部分对于PKCδ起到抑制的作用[16]。不同的同工酶各有特征和它们相互协调的作用使得我们可以假定改变的PKC激活的平衡 (增加了PKCα/β对PKCδ的比活性) 在癌肿的侵占性中起到重要的作用。
2 PKC和致癌作用
现在已经公认PKC在致癌作用中起着重要的作用。PKC在癌肿中的作用显然不是由于PKC基因的变异, 这不同于在致癌中起作用的大多数基因就像肿瘤基因和肿瘤抑制基因。在人类的癌肿中PKCs编码的基因变异非常少见。PKCs在癌肿中所起的作用似乎由于其作为肿瘤促进因子的受体或是作为生长因子受体下游的靶目标, 其他癌相关基因的变异可以改变一个组织最初的同工酶的外形和通过特殊的同工酶的激活对致癌起到促进作用。
许多遗传性的和继发的致癌因子都可以调节PKC同工酶的表达和活化, 因此这些致癌因子被考虑在癌肿演进中有一定的作用。化学致癌物如亚硝胺, 在烟草烟雾可存在, 认为可以调节PKC同工酶的含量。特别的是, 亚硝胺可以诱导PKCα、β的表达和活化而降低PKCδ的活性。 把致癌的Ras注射入角质化细胞表现出正调节PKCα向下调节PKCδ的激活, 抑制在Ras变异细胞中PKCα的表达导致更大的分化的表现型。此外, 致癌的Ras表现出能在结肠癌细胞中诱导PKCα的过表达。c-myc癌基因诱导PKCβ的增强表达, PKCβ被认为是部分间接c-myc诱导的恶性表型。p53介导的信号通路也与PKCα表达的调节有关, 因为野生型p53通过转录阻断禁止PKCα的表达[17]。以这些概念为根据, 我们可以推测, Ras、c-myc和p53在人类癌肿中的非常频繁的变异可能至少部分地解释一些癌类型中增加的PKCα/β活性或表达。
3在癌治疗中PKC被当作靶标
由于在癌形成和进展中PKC有显然的作用, 许多种PKC的抑制剂被开发出来, 已经在癌模型的活体内和活体外被检验, 也在某种程度上用于人类癌肿的治疗。在编码PKCs的基因中变异的缺乏使得这种酶适合作为癌肿治疗的靶标。人们推测当一种特殊的癌型不表现出PKCs的过表达时不适用PKC的抑制剂进行治疗。可是, PKC的激活导致它的降解, 表达的向下调节能够支持连续地活性而不是酶的失活。
不论是广谱的或是同工酶特异性的PKC抑制剂, 都有在癌肿模型活体内外抗癌的特性。但是不幸的是, 它们的临床功效很低。最有效最常用的抑制剂是PKC412 (广谱抑制剂) , UCN-01 (针对传统的蛋白激酶C的广谱抑制剂) , ISIS3521 (PKCα反义的寡聚脱氧核苷酸, 也称为aprinocarsen, LY900003, CGP64128A或者Affinitak) , LY317615 (PKCβ抑制剂) , Go6976 (PKCα/β的抑制剂) 。这些化合物有抗肿瘤的效应, 因为被评价能在活体内外减少癌细胞的生长, 抑制血管生成, 或减少侵袭。PKC412、ISIS3521、Go6976已经证明是抗侵袭的试剂[18]。UCN-01、PKC412、ISIS3521、Go6976表现出可以减少癌细胞的生长[19]。这些抑制剂能诱导生长障碍的机理被认为是因为细胞周期停滞, 和在某种程度上增强的编程性细胞死亡[19,20,21], PKCβ的抑制剂LY317615在异种移植物癌模型中表现出能够抑制血管发生和血浆的VEGF水平。
PKC抑制剂已经被试验用于联合经典的化疗试剂或离子辐射, 它们显示出累加效应, 被认为是通过抑制MDR和或G2检查点的废除而发生的[22,23]。G2检查点的废除已经引起了许多研究人员的兴趣, 因为许多高级的癌肿用p53变异阻止G2检查点来适应离子辐射或化疗诱导的DNA损伤。G2废除能导致有丝分裂的突变和编程性细胞死亡, 因此增强了对一般的癌肿治疗的应答率。ISIS3521、UCN-01、PKC412已经被用于联合经典的化学治疗药物在人的I～III期试验。UCN-01和PKC412在人体试验中没有显示出有意义的临床效应, 这可能是由于它们强有力地结合于血浆蛋白, 因此限制了生物利用度。Go6976与UCN-01相比结合血浆蛋白有较小的亲和力, 但是迄今为止没有关于Go6976的人体研究[23]。
4结论
烟草烟雾或饮食因素等肿瘤促进因子的特殊刺激作用使PKC在致癌作用中扮演了一个很重要的角色。此外, 在体内外众多的研究表明, PKC能够影响高度恶性的癌肿的表型, 所以这些都支持PKC不仅仅在癌肿的早期有作用而且对于癌肿的演进过程也起到一定的作用。PKCα和PKCβ都与癌肿增加的侵袭力、增殖、耐药机制和遗传的不稳定性有着密切的关系, 而PKCδ能够促进细胞的凋亡。这些观点都支持着这一关于PKC活化平衡的理论 (PKCα/β对PKCδ的比活性) 作为癌肿演进过程中的一个重要因素。人类高度恶性的癌肿基因经常发生突变就像p53、Ras、c-myc, 这样就可能导致癌细胞增殖率、转移灶以及抗吞噬能力的增加, 并能够抵抗化学和射线的治疗。改变PKC的活化平衡可能会抑制这些癌前因素的产生。关于癌肿中PKC同工酶外在表型在组织学上的研究显示出较为复杂的结论, 可以部分地解释是由于PKC活力的负反馈调节环路而使其降解。总之, PKCs在癌肿演进过程中的作用是明显的, PKC射靶疗法在癌肿的治疗过程中可能是有效的。
蛋白激酶B 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病例
选取2007~2008年我院肺癌根治术标本77例为实验组,另选取20例良性肺疾病组织为对照组。全部病例均经病理诊断证实。其中,男性58例,女性19例;年龄39~73岁,平均64.7岁。组织学分类:腺癌16例,鳞癌54例,腺鳞癌2例,肉瘤样癌3例,小细胞神经内分泌癌2例。高分化10例,中分化14例,低分化46例。转移状况:有淋巴转移42例,无转移28例。同时收集肺大疱10例,肺结核6例,肺脓肿4例,共计20例作为对照。
1.1.2 试剂
兔抗人ERK2多克隆抗体购自北京中杉金桥公司,使用浓度为1∶100。二抗、即用型二步法检测试剂盒PV-9000和DAB染色试剂盒购自北京中杉金桥公司。
1.2 方法
以ERK2为阳性的乳腺癌组织为阳性对照,PBS代替一抗为阴性对照,采用SP法进行染色。具体步骤如下:石蜡标本行4μm厚连续切片,脱蜡,对切片进行预处理。3%过氧化氢去离子水孵育10 min,阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗,2 min×3次。滴加一抗,4℃湿盒过夜。PBS冲洗3次,2 min×3次。滴加PV-9000工作液,37℃湿盒内孵育30 min,PBS冲洗,2 min×3次。选用DAB显色,自来水充分冲洗,复染,脱水,透明,封片。
1.3 结果判断
DAB显色法阳性染色为棕黄色颗粒,ERK2主要表达于细胞质中,细胞核中偶见散在阳性物质表达。参照1996年5月北京《全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会》标准[3],每张切片随机观察5个高倍视野(×400)。计数每个视野中染色阳性细胞数。阳性细胞<20%为(-),>20%为(+)。
1.4 统计学方法
应用SPSS 11.5统计软件进行χ2检验,P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 肺癌中ERK2蛋白的表达
本组77例肺癌标本中,ERK2的阳性率为51.9%,明显高于良性肺疾病组(20.0%),两者比较,有显著性差异(P<0.05)。
2.2 ERK2蛋白表达与肺癌主要病理特征的关系
77例肺癌标本中,腺癌16例,鳞癌54例,腺鳞癌2例,小细胞神经内分泌癌2例,肉瘤样癌3例。因腺鳞癌、小细胞神经内分泌癌、肉瘤样癌例数过少,没有进行统计学分析。腺癌中有10例ERK2阳性(阳性率为62.5%),和鳞癌的ERK2阳性率之间相互比较(鳞癌中有27例阳性,阳性率为50.0%),两者无显著性差异(P>0.05);组织学分级:高分化10例(阳性2例,阳性率为20.0%),中分化14例(阳性4例,阳性率为28.6%),低分化46例(阳性31例,阳性率为67.4%),低分化和高、中分化的阳性率之间有显著性差异(P<0.05);无淋巴结转移28例(阳性8例,阳性率为28.6%),有淋巴结转移42例(阳性29例,阳性率为69.1%),两者之间ERK2表达有显著性差异(P<0.05)。见表1。
与高、中分化比较,#P<0.05;与有淋巴结转移比较,&P<0.05Compared with well-differentiated and moderate-differentiated,#P<0.05;compared with lymph node metastasis,&P<0.05
3 讨论
ERK信号通路在细胞的增殖、分化和转移等方面起着关键作用[4]。目前研究显示,ERK在肝癌、乳腺癌、头颈部鳞癌及前列腺癌等多种肿瘤组织中异常表达或活性增强[5,6,7,8],Bang等[9]在胃癌组织中检测到ERK蛋白表达增强,而Price等[10]及Mandell等[11]在神经胶质瘤和前列腺癌组织中的研究表明,肿瘤组织中ERK蛋白表达未见明显增加。在肺癌中,ERK蛋白的表达结果目前也不甚一致,ERK1/2在肺癌中表达升高,与患者的年龄、性别、肿瘤类型无相关性,ERK1/2的蛋白表达与肿瘤的淋巴结转移、分化程度及TNM分期密切相关[12]。Greenherg等[13]发现ERK在肺癌组织中的活性无明显增强。本研究结果显示,ERK2在肺癌中蛋白阳性率为51.9%,高于良性病变组织,两者有显著性差异(P<0.05)。
谷艳娇等[14]发现ERK1/2在肺癌组织中按照年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、有无淋巴结转移比较无显著性差异(P>0.05);按照肿瘤分化程度比较,高分化组表达较低,中分化组次之,低分化组表达最高,具有显著性差异。而Kiyokawa等[15]研究了胃癌组织中ERK mRNA的表达情况后发现,高分化癌高表达比例高于低分化癌。本实验结果表明,ERK2的蛋白表达在腺癌和鳞癌中无显著性差异;和组织学分级、有无淋巴结转移有关。低分化组的阳性率最高,中分化组次之,高分化组最低;无淋巴结转移的肺癌阳性率低于有淋巴结转移。
目前已知的ERK通路:细胞外信号→细胞受体→细胞内酪氨酸激酶和适配蛋白→Ras→Raf→MEKK1→MEK1→ERK1/2→转录因子→细胞增殖、转化相关基因表达→细胞增生、转化。由上述的激活途径来看,ERK通路是一条瀑布似的反应链,因此其启动因素对于该通路的激活至关重要。由此也提出一个问题:ERK通路激活的原因到底是什么?ERK/MAPK活性增高可能是高水平生长因子刺激一肿瘤来源或内源性生长因子自主的、持久的自分泌或旁分泌反馈环的存在;或者是其上游信号分子突变的结果。已有一些研究发现一些细胞因子如转化生长因子、表皮生长因子等能激活该通路,但还有待进一步的研究和探讨。
蛋白激酶B 篇6
研究显示,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号转导系统在肿瘤化疗耐药中发挥重要作用,化疗药物能够引起MAPKs信号传导系统的激活及MDR的产生,而MAPKs信号转导通路特异性阻断剂体外可逆转MDR细胞的耐药性[2]。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)是MAPKs家族中的重要成员。有报道显示,ERK1、ERK2和肿瘤细胞化疗耐药性的发生有关[3];而ERK5是MAPKs信号转导通路中相对较新的一条通路,其在肿瘤细胞MDR方面的研究较少[4]。Bad是Bcl-2家族中与Bcl-2、Bcl-x L相关的促凋亡基因,具有促凋亡活性, 广泛分布在机体各种组织,对防御自身免疫、维持造血细胞稳态有重要意义,并有肿瘤抑制因子活性[5]。 膀胱癌细胞MDR中Bad的作用及与ERK家族的内在联系目前尚未明确。
本研究诱导建立人膀胱癌MDR细胞及其亲本细胞。通过检测ERK1、ERK2和ERK5蛋白的表达和研究Bad基因和蛋白水平的变化,初步探讨Bad在膀胱癌细胞MDR中的作用及与ERK可能的内在联系,为逆转膀胱癌细胞MDR提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株人膀胱癌细胞株T24,购自中南大学细胞生物中心,所有实验重复3次。
1.1.2主要试剂DMEM高糖培养基和胎牛血清购自美国Hycone公司,CCK-8 kit购自美国Sigma公司,化疗药物异环磷酰胺 (Ifosfamide,Ifex)、顺铂 (Cisplatin,CDDP)及多西他赛(Docetaxel,DOC)购自中国齐鲁制药有限公司,MRP-1、P-gp、ERK5、Bad、 GAPDH和 β-actin一抗购自美国Abcam公司 , ERK1/2、p-ERK1/2一抗购自美国Cell Signalling公司,Goat Anti-rabbit二抗和Rabbit Anti-goat二抗购自中国博士德公司,ECL kit购自美国Bio-rad公司,高纯度总RNA快速提取试剂盒和转录试剂盒购自日本Ta Ka Ra公司,荧光定量PCR试剂IQ SYBR Green Supermix购自美国Bio-Rad公司。
1.1.3主要仪器全波长酶标仪购自美国MD公司,荧光定量PCR仪和凝胶成像仪均购自美国Biorad公司。
1.2实验方法
1.2.1耐药细胞株的诱导采用小剂量缓慢诱导法[6],接种对数生长期膀胱癌细胞T24,待细胞增殖至80%左右融合时,加入Ifex 0.01μg/ml作用12 h, 恢复常规培养5 d,随后逐步提高Ifex的质量浓度至细胞在0.1μg/ml的浓度下死亡率 <5%,将获得的耐药细胞株命名为T24/Ifex。
1.2.2耐药细胞对化疗药物敏感性的检测检测前将细胞脱药培养10 d,取生长状态良好、处于对数生长期细胞,制备单细胞悬液,采用CCK-8法分别检测T24及T24/Ifex细胞对Ifex、DOC和CDDP等化疗药物的敏感性。线性拟合法计算获得半抑制浓度 (half maximal inhibitory concentration,IC50)值,耐药指数(resistance index,RI)= 耐药细胞IC50值 / 亲本细胞IC50值,RI<5为低度耐药;5~15为中度耐药; >15为高度耐药。
1.2.3 Western blot检测相关蛋白的表达按分子克隆实验指南第3版的方法进行裂解、抽提细胞总蛋白,采用BCA法测定蛋白浓度。将所得的蛋白于10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳(恒流,25 m A),电转恒流,200 m A至PVDF膜,5%脱脂牛奶或5%BSA封闭1 h后,分别加入相应一抗4℃孵育过夜。加辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2 h。ECL试剂盒显影,结果在图像分析系统中进行分析。
1.2.4荧光定量PCR检测Bad m RNA表达Trizol法提取细胞总RNA,置于 -80℃冰箱冷冻保存,按逆转录试剂盒提供的操作步骤合成c DNA,置于 -20℃ 冰箱冷冻保存。Bad上游引物:5'-GTCGTATCCAGT GCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3', 下游引物 :5'-GCAACCCGTAGATCCGAACTT-3', GAPDH上游引物:5'-TGCGGGTGCTCCGCTCCGCA GC-3'; 下游引物 :5'-CAGTGCACGCTCCGA-3'。 12.5μl扩增反应体系中加入c DNA模板10.5μl(稀释比例为1∶10),上、下游引物各1.0μl。扩增条件: 50℃预变性3 min,95℃变性3 min,95℃退火10 s, 59℃延伸20 s,共40个循环,72℃继续延伸20 s。
1.3统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,两组比较用t检验,多组比较用 χ2检验,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1耐药细胞对化疗药物的敏感性
耐药细胞T24/Ifex不仅对诱导药物Ifex产生耐药,还对其他抗肿瘤药物DOC和CDDP产生不同程度的耐药。其中,耐药细胞T24/Ifex对Ifex的RI为7.359,符合耐药中介标准[7]。见表1。
2.2MDR相关蛋白的表达变化
Western blot结果显示,MRP-1和P-gp蛋白在耐药细胞T24/Ifex中的表达显著高于亲本细胞T24, 差异有统计学意义。见图1和表2。
2.3ERK1、ERK2和ERK5蛋白的表达变化
Western blot结果显示,ERK1和ERK2蛋白在耐药细胞T24/Ifex中的表达水平高于亲本细胞T24, 差异有统计学意义(见图2);同时,耐药细胞T24/Ifex中ERK2磷酸化水平较亲本细胞下降,而ERK1磷酸水平无显著变化,并且p-ERK1/2与ERK1/2的比值下降(见图2);耐药细胞ERK5蛋白表达较亲本细胞上调,差异有统计学意义(见图3和表3)。
2.4Bad的mRNA和蛋白表达变化
实时荧光定量PCR检测发现,耐药细胞T24/Ifex中的Bad m RNA表达水平低于亲本细胞T24,约为亲本细胞T24的0.5倍(P <0.01),差异有统计学意义。Western blot检测发现,耐药细胞T24/Ifex中Bad蛋白表达水平(0.36)较亲本细胞T24(0.23)下降(P < 0.01),差异有统计学意义。Bad基因和蛋白水平变化一致。
3讨论
化疗药物体外诱导肿瘤细胞耐药,是目前最常用的建立体外肿瘤细胞耐药模型的方法。本研究采用小剂量缓慢诱导法,使人膀胱癌耐药细胞T24/Ifex达到中度耐药,并对其他几种结构、机制不同的化疗药物有不同程度耐药,MDR相关蛋白MRP-1和P-gp表达显著上调,证实人膀胱癌MDR细胞模型建立成功。
MAPKs信号转导通路在肿瘤化疗耐药中的作用日益受到重视。有证据表明,通过影响肿瘤细胞MAPKs家族蛋白表达水平有可能逆转肿瘤细胞MDR。目前,大多数研究认为过度表达的ERK1和ERK2能上调耐药相关基因蛋白的表达,从而促进肿瘤MDR的发生[8]。ERK5是ERK家族的重要组成部分,也是MAPKs信号通路中研究最少的通路,其在肿瘤组织新生血管生成及肿瘤细胞侵袭和转移中都发挥重要作用。与其他MAPKs家族成员一样, ERK5对于正常细胞的生存、增殖和分化起着极其重要的作用。但ERK5与膀胱癌化疗MDR的关系尚不明确。本研究Western blot结果显示,与亲本细胞T24比较,人膀胱癌MDR细胞T24/Ifex中,ERK1、ERK2和ERK5蛋白表达水平升高,ERK1蛋白磷酸化水平无显著变化,p-ERK2磷酸化水平下降,提示ERK1、ERK2和ERK5蛋白表达与化疗耐药性成正相关。KISUCK譧等[9]研究发现,小鼠白血病细胞株L1210/VCR MDR与ERK持续上调活化有关,其机制可能是引起P-gp表达增加,使细胞内VCR浓度降低,而MEK特异性抑制剂PD98059和U0126可抑制ERK1和ERK2的活性,从而提高细胞内VCR浓度并且逆转L1210/VCR的耐药性。SUN等[10]发现,非甾体类抗炎药舒林酸可以激活ERK通路并使COX-2表达上调,而通过PD98059抑制ERK1和ERK2的活性可抑制COX-2表达,并显著增加舒林酸引起的结直肠癌细胞凋亡。这些研究结果提示ERK1、 ERK2和ERK5与肿瘤细胞MDR的发生、发展存在关联。
Bad基因,是一种促凋亡基因,编码产物可通过与Bcl-2家族中的凋亡抑制基因Bcl-2和Bcl-x L的表达产物结合为异源二聚体,通过浓度依赖性方式替换Bcl-x L/Bax、Bcl-2/Bax二聚体中的Bax,从而达到促进细胞凋亡的目的。Bad基因如何作用于特定的肿瘤细胞并影响其功能目前尚不清楚,其在肿瘤细胞凋亡中是否发挥重要作用在不同学者的研究中也是众说纷纭。刘艳等[11]发现,Bad蛋白能够逆转肺癌雷帕霉素耐药性。本研究发现,在人膀胱癌MDR细胞T24/Ifex中Bad基因和蛋白水平的表达下降, 提示Bad表达下调,可能是肿瘤细胞MDR形成的关键。Bad表达的调控非常复杂,在不同的细胞有不同的方式,涉及到转录水平调节、亚细胞定位调节、磷酸化调节、蛋白酶体依赖的降解等多个方面。OLAV ARR魱A等[12]研究发现,MAPKs信号通路一定程度上参与Bad表达的调控,ERK1/2的磷酸化可以促进Bad的表达及活化,发挥其促凋亡作用。冯云等[13]研究发现一氧化碳中毒后,大鼠海马神经ERK1/2表达下调,Bad早期表达上调后又回落,提示ERK1/2、Bad蛋白介导海马区神经元的凋亡,参与DEACMP的发生。然而在膀胱癌细胞MDR中,ERK5和Bad的关系尚不明确。
蛋白激酶B 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
实验中用到的3 d龄SD大鼠 (SPF级, 雌雄不计,体重8~10 g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2007-0001],充入的氮氧混合气体(8%O2+92%N2) 由首都医科大学附属北京友谊医院(以下简称“我院”)提供,本实验室自制封闭容器。
1.2 缺氧模型的建立
实验所用到的3 d龄SPF级SD大鼠, 日常在我院SPF级动物房饲养,条件如下,照明时间;黑暗时间=12 h∶12 h,温度:23~25℃,湿度保持在40%。将乳鼠随机分为两组:对照组和缺氧组,每组各24只,对照组不做处理, 缺氧组放入本实验室自制容器,在37℃水浴中充以氮氧混合气 (O2占8%),持续时间为90 min,之后回笼,继续行母乳喂养。
1.3 大鼠脑组织标本获取
分别于缺氧模型建立后第1、3、7、14、21天和第28天6个时间点处死两组大鼠 , 其中每个时间点对照组和缺氧组大鼠各4只,每组大鼠的左侧脑组织立即放入10%的中性福尔马林溶液固定,之后进行切片、备用,右侧大脑立即放入液氮保存,用于进行Westernblot检测。
1.4 HE 染色
将脑组织用10%的中性福尔马林液中固定8 h,依次放入20%、30%蔗糖溶液分别过夜(24~48 h)沉底,组织沉底之后即可进行冰冻切片,切片厚度为12μm,进行HE染色,参见既往发表文章[9],拍照保存。
1.5 Western blot 检测 ERK-1 表达量
预冷RIPA蛋白抽提试剂, 加入蛋白酶抑制剂Protease inhibitor cocktail(Roche)。按组织重量9倍比例加入裂解液,冰上用组织匀浆器进行匀浆3次。冰上进行孵育20 min后,4℃15 000 r/min离心20 min,取上清,分装深低温冰箱保存,按照BCA蛋白定量试剂盒(cwbiotech)测定蛋白浓度。之后进行蛋白PAGE凝胶电泳,10%分离胶,5%浓缩胶(丙烯酰胺,双丙烯酰胺,TEMED,Amresco)。电泳条件:浓缩胶恒压90 V,约20 min;分离胶恒压130 V,通过预染蛋白Marker(Biomed)来确定电泳停止时间。湿转法 ,转膜条件 :300 m A恒流 ;0.45μm孔径PVDF膜 (Millipore),转膜时间1 h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色,观察转膜效果。之后将膜完全浸没TBST溶液中(含5%脱脂牛奶),室温下摇床孵育1 h。将膜与ERK-1一抗(Santa cruz)或者β-actin一抗(Santa cruz,封闭液稀释)一起孵育,ERK-1的一抗稀释浓度1∶500,β-actin的一抗稀释浓度1∶1000,4℃冰箱过夜。次日TBST洗膜3次。二抗孵育:羊抗兔Ig G HRP(1∶20 000),孵育40 min(在室温),洗膜。滴加ECL,反应3 min;曝光,显影,定影。照相,用Lab Works软件对图像进行灰度分析,计算出每个样本的ERK-1灰度值与相应的β-actin的灰度值,取其比值进行计算,并进行统计学分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验 ;计数资料用率表示 ,组间比较采用χ2 检验 ,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠乳鼠缺氧后表现
缺氧后早期大鼠出现兴奋症状的表现: 躁动不安、翻滚,呼吸加深加快,45 min~1 h后逐渐出现抑制症状:反应迟缓淡漠、间断发作的痉挛、抽搐等。最后进入比较稳定的反应淡漠期,此反应一直持续至缺氧完成,恢复氧供后乳鼠反应逐渐恢复正常。
2.2 HE 染色结果
对照组大鼠脑组织结构清晰, 海马锥体细胞致密、完整,缺氧组大鼠海马锥体细胞核淡染、甚至细胞核缺如,见图1。
2.3 两 组大鼠 不同时间点 细胞外 信号 调节蛋白激酶 1表达情况比较
缺氧组ERK-1表达呈现动态性变化, 与对照组相比, 缺氧后ERK-1表达量基本处于低于正常对照的水平,但是与对照组的变化趋势趋于一致,第14天时ERK-1的表达较对照组有所升高, 到第21、28天时ERK-1的表达与对照组比较又有所降低。虽然有变化趋势,但是经过统计学t检验分析,差异均无统计学意义(P > 0.05),具体见表1,图2、3。
3 讨论
缺氧性脑损伤的病理发生是一个多因素的复杂过程,在此过程中,众多分子参与其中,ERK-1蛋白在脑内广泛存在,是脑功能活动中重要的信号转导分子[10],ERK-1接受刺激信号后活化为磷酸化的ERK-1,从胞浆转位至胞核,通过磷酸化转录因子等途径发挥细胞调节作用。脑缺血再灌注损伤中有ERK-1广泛参与, 但其所发挥的是保护性作用还是损伤性作用,目前仍存在很大争议[11,12,13]。有文献报道, 自由基清除药———依达拉奉可以通过激活ERK-1来减轻缺氧/复氧诱导的神经元损伤中毒[14]。Ban等[15]的研究发现抑制ERK-1能够恶化肠缺血/再灌注损伤。缺氧发生之后ERK-1的表达模式如何尚不明确, 本研究通过探讨缺氧发生后ERK-1的动态表达模式来进一步明确缺氧发生过程中ERK-1的可能作用,研究发现,缺氧后脑组织ERK-1表达水平呈现动态变化, 缺氧后第1天开始ERK-1表达降低, 一直到缺氧后第7天达到表达的最低值,之后出现表达情况的上升,缺氧后第14天时表达高于正常情况, 表达情况一直持续到缺氧后第21天达到最高峰,但是低于正常情况,缺氧后第28天时表达又有所降低。根据折线图可以看出,ERK-1在大鼠乳鼠发育过程中呈现一种动态模式的表达情况, 存在一个表达高峰和一个表达低谷,提示ERK-1在细胞的正常发育过程中也发挥着重要作用,缺氧组的ERK-1的表达总体比正常情况低下,虽然经过分析差异无统计学意义(P > 0.05),但是存在降低的趋势,提示在大鼠乳鼠脑组织缺氧损伤过程中ERK-1也存在剂 量的变化 。需要进 一步研究ERK-1基因与其他缺氧相关的基因 , 如缺氧诱导因子(hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)等基因表达的相互关系,从而更加明确其参与缺氧脑损伤过程的作用机制。
摘要：目的 通过了解细胞外信号调节蛋白激酶1(ERK-1)在缺氧脑损伤大鼠脑中的表达,了解其参与缺氧脑损伤的过程。方法 48只3 d龄新生SD大鼠,随机分成2组:对照组和缺氧组,每组各24只,缺氧组SD大鼠置于自制密闭容器中,充以含8%氧气的氧氮混合气体,时间为90 min,对照组SD大鼠不进行处理。分别于造模后6个时间点——1、3、7、14、21 d和28 d后留取两组SD大鼠脑组织,采用Western blot检测ERK-1总蛋白在脑组织中的表达情况。结果 缺氧组大鼠脑组织ERK-1呈现动态表达;变化规律:在缺氧早期(缺氧后1~7 d),ERK-1总蛋白的表达均有降低的趋势,缺氧后第14天开始其表达具有升高的趋势,缺氧后第21天和第28天ERK-1表达量又有所下降,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 缺氧造成新生大鼠脑损伤时,ERK-1总蛋白的表达谱没有明显变化的趋势,提示在早产儿缺氧性脑损伤时ERK-1并不通过剂量的变化对缺氧后脑组织损伤进行调节。