过氧化物酶体激活受体（共4篇）
过氧化物酶体激活受体 篇1
摘要：过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是核转录因子中的超家族成员,它调控靶基因的转录,参与体内的许多病理生理过程。PPARγ通过改善胰岛素抵抗,糖代谢、脂代谢紊乱,发挥抗动脉粥样硬化作用;还可通过对巨噬细胞及核因子κB的影响,通过抑制炎症反应,抑制平滑肌细胞增殖、迁移,通过对血管内皮功能的影响,调节血管张力,阻止动脉粥样硬化的形成。
关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体γ,动脉粥样硬化
过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferators-actived receptorγ,PPARγ)是一类由配体激活的核转录因子超家族成员,是一种新甾体激素受体,其结构与糖皮质激素受体等核受体家族类似,可调控涉及葡萄糖的产生、转运、利用及脂肪代谢的调节等基因的表达。研究发现PPARγ具有多种病理生理学作用,是参与糖、脂代谢的重要因子,在血管、心脏组织均有表达,在心血管疾病的发生发展中,参与调节炎症,细胞凋亡,平滑肌迁移、增殖与动脉粥样硬化等病理过程[1]。本文就PPARγ与动脉粥样硬化的研究现状作一综述。
1 PPARγ的结构、组织分布、功能及其激活物
PPARγ属于核受体超家族,其分子结构包括以下4个区域:N末端的A/B区有非配体依赖性的转录激活功能,C末端有2个锌指与DNA结合,D转折区域是辅助因子结合区,EF羧基末端包括其他配体结合区和配体依赖性活化区。由于启动子和拼接方式不同,PPARγ可以分为PPARγ1、PPARγ2、PPARγ3三个亚型,但其功能基本相同。PPARγ1和PPARγ3在很多组织中均呈低水平表达,PPARγ2除脂肪细胞外,在骨骼肌、心肌和血管中也有表达。PPARγ的主要功能是调节基因转录。配体与PPARγ结合诱导核受体发生形态改变而激活,与视黄酸X受体(Retinoid X receptor,RXR)形成异二聚体,再结合于特定性DNA序列PPARγ反应元件(Peroxisome proliferators responsive element,PPRE,AGGTCA910AGGTCA)使靶基因活化。PPRE存在于许多与糖、脂代谢有关的基因编码蛋白中,如脂蛋白脂酶、脂肪酸结合蛋白、脂肪酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶及葡萄糖转运子4(Glu4)等。近年来发现,PPARγ能以非DNA结合方式干扰核因子-κB(NF-κB)、转录信息转导物和激活物(STAT)以及活化蛋白-1(AP-1)信息转导途径而抑制基因转录。PPARγ可能通过蛋白质-蛋白质的相互作用,或对辅助因子的抑制作用来干扰这些信息转导途径的功能。
目前已知PPARγ存在多种配体和激活物,可分为两大类,即天然配体和合成配体。天然配体主要以多不饱和脂肪酸及其衍生物为代表,如15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)及白三烯,来源于饮食及机体的代谢产物。另外,氧化代谢的产物9-羟基18烯酸(HODE)也是PPARγ的天然配体。合成配体主要有治疗糖尿病的噻唑烷酮类化合物(TZDs),又称格列酮类,包括罗格列酮(Rosiglitazone)、曲格列酮(Troglitazone)、吡格列酮(Pioglitazone)等。作为胰岛素增敏剂,TZDs能与PPARγ结合,参与调控脂肪细胞分化及胰岛素介导的外周组织对葡萄糖的摄取。一些非类固醇类抗炎药物如吲哚美辛、布洛芬、芬布芬等也能作为配体与PPARγ相结合[2]。最近多项临床研究发现血管紧张素Ⅱ1型受体阻滞剂(ARBs)作为一种降压药物,除有明显有效的降压作用及保护靶器官作用外,与其他降压药相比还可以降低2型糖尿病的发病率。动物实验显示,ARBs改善胰岛素抵抗动物模型的胰岛素敏感性[3],其机理可能与其部分激活PPARγ活性有关[4],目前仅发现替米沙坦(Telmisartan)和厄贝沙坦(Irbesartan)有此作用。
2 PPARγ与冠心病
冠状动脉粥样硬化的病理主要是冠状动脉内膜增生,平滑肌细胞增殖、迁移,粥样斑块形成及斑块基底部炎症。PPARγ在这几个方面均有程度不同的作用。
2.1 抗炎作用
动脉粥样硬化早期形成阶段,活化的内皮细胞表达黏附分子如血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)吸引单核细胞移行至内膜下成为巨噬细胞,释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等,加速血管平滑肌细胞(VSMCs)的生长、迁移,促进粥样硬化斑块形成。在激活的巨噬细胞中,PPARγ表达上调以阻止可诱导性NO合成酶、明胶酶B、清道夫受体A等的分泌,减少单核细胞分泌IL-6及TNF-α等细胞因子。进一步研究表明,PPARγ通过抑制NF-κB、STAT1及AP-1信号传递在转录水平反式抑制这些炎症递质的活性,发挥抗动脉粥样硬化作用。Jackson等[5]研究发现,PPARγ激动剂可部分抑制VCAM-1的表达,抑制佛波脂、脂多糖引起的单核细胞、中性粒细胞样HL60细胞与人体动脉内皮细胞的结合,限制慢性炎症,在粥样斑块区发挥抗炎作用。另外临床研究发现PPARγ激动剂可使血中的C反应蛋白、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI-1)降低,进一步证实PPARγ具有抗炎作用,抗动脉粥样硬化形成。
2.2 对动脉粥样硬化的作用
单核/巨噬细胞被PPARγ与RXR配体激活后,其CD116、CD18、CD14表达明显增加,氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)、清道夫受体CD36表达增加,导致巨噬细胞对Ox-LDL的摄取增加,Ox-LDL又可上调巨噬细胞PPARγ表达,形成一正反馈,促进泡沫细胞的形成。这在抗动脉粥样硬化中是不利的一面,但研究发现合成的PPARγ配体无促进泡沫细胞形成的副作用。最近的多项研究表明,PPARγ抑制多个与动脉粥样硬化有关的基因表达。在巨噬细胞内,激活的PPARγ抑制NO合成酶、明胶酶B、清道夫受体A基因转录,通过与NF-E2相关因子2相互作用,抑制血栓素合成酶基因转录[6]。Nichoson等[7]研究发现,PPARγ激动剂可通过上调肝脏X受体(LXR)-α促进胆固醇逆转运蛋白(ABCA1)的转录,加速胆固醇逆转运出巨噬细胞而发挥抗动脉粥样硬化作用。另外,PPARγ还能抑制血管内皮细胞表达内皮素-1及Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂,抑制血管紧张素Ⅱ1型受体m RNA表达,而这些基因表达有利于动脉粥样硬化形成[8]。
2.3 抑制平滑肌细胞增殖与迁移
平滑肌细胞的增殖、迁移是动脉粥样硬化发生、发展的重要环节,也是冠心病患者血管成形术后再狭窄的一个重要因子。基质金属蛋白酶的表达增加,可使血管平滑肌增殖并向内膜下迁移,促进动脉粥样硬化形成,PPARγ激动剂曲格列酮及15d-PG12能选择性抑制佛波脂诱导的血管平滑肌基质金属蛋白酶(MMP-9)表达,干扰细胞外基质降解从而抑制血管平滑肌迁移,但不影响MMP-1、2表达[9]。此外,PPARγ激动剂能抑制c-fos基因诱导以及血浆反应元件诱导的转录激活,抑制平滑肌增殖迁移,并能减轻血管内球囊损伤模型中血管再狭窄;抑制血小板源生长因子BB诱导血管平滑肌迁移。血栓素和血管紧张素均可诱导平滑肌细胞增殖,Sugawara等[10]研究发现PPARγ与其配体结合可使血栓素受体的表达下降;有作者报道PPARγ激动剂抑制血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达[11,12],从而抑制平滑肌细胞增殖,发挥抗动脉粥样硬化作用。
2.4 PPARγ与血管张力
PPARγ尚可影响张力系统(儿茶酚胺、肾素-血管紧张素系统),调节血管的收缩与舒张。C型利钠肽是一种新发现的内皮源性舒血管肽,而内皮素则是强烈的血管收缩因子,且可促进平滑肌细胞的增殖、迁移。Itoh等[13]研究发现,PPARγ能通过PPARγ途径抑制内皮素分泌,刺激内皮细胞分泌C型利钠肽,从而使血管舒张。血管紧张素与其1型受体(AT1R)结合引起血管收缩,Sugawara等[11]在小鼠的研究中发现,15d-PGJ2可抑制小鼠细胞AT1R基因的表达,使得血管紧张素与AT1R的结合减少,抑制血管收缩。
2.5 对血栓形成的影响
人血管内皮细胞表达PPARγm RNA及其蛋白,PPARγ可调节PAI-1在内皮细胞的表达,而PAI-1抑制纤维蛋白溶解,其血浆浓度与心肌梗死、静脉血栓的危险程度明显相关[14]。另外,TNF-α能刺激内皮细胞表达及分泌PAI-1,而PPARγ则通过抑制TNF-α表达途径抑制PAI-1表达[15],从而减少纤维蛋白形成,抑制血栓形成。
2.6 PPARγ对动脉粥样硬化的间接影响
胰岛素抵抗、高血糖、高血脂是动脉粥样硬化的危险因素,而合成的PPARγ配体则可通过改善胰岛素抵抗、减低血糖、纠正脂代谢紊乱,间接发挥抗动脉粥样硬化的作用。PPARγ激动剂在脂肪细胞中诱导脂蛋白脂肪酶m R-NA表达,使其活性增强,而脂蛋白脂肪酶是一种关键性脂肪分解酶,其活性增强可使脂肪分解,血浆甘油三酯水平下降[16]。PPARγ与RXR形成杂二聚体并结合到靶基因的PPRE后,能控制靶组织中参与脂肪代谢的靶基因表达,表现为:降低三酰甘油、非酯化脂肪酸、总胆固醇水平,并升高高密度脂蛋白水平[17]。PPARγ还可通过改善靶组织(如肝脏、肌肉组织、脂肪组织等)对胰岛素的敏感性而增强胰岛素功能,加快胰岛信号传递,提高组织中脂联素水平表达,而降低血糖。
3 PPARγ与TZD和ARBs
TZDs在20世纪80年代作为一种抗氧化剂被应用,能降低糖尿病患者血糖水平而不增加血浆胰岛素浓度,进一步研究表明TZDs是PPARγ的配体,能激活PPARγ调控多种基因的转录,降低血浆甘油三酯、游离脂肪酸、低密度脂蛋白胆固醇水平,增加高密度脂蛋白胆固醇水平等。TZD存在一定不良反应,如肝脏损害,液体潴留等,使其在临床应用受限。
最近有报道发现[18],抗高血压药ARBs中的替米沙坦、厄贝沙坦具有增加PPARγ在组织中的表达,且增强其活性的作用,改善血脂谱,提高胰岛素敏感性,降低血压,减少前炎症因子的产生和控制动脉粥样硬化危险因素,从而发挥心血管保护和对代谢综合征相关靶器官损害的保护作用,具有巨大的临床应用价值。
综上所述,PPARγ可能广泛参与心血管疾病的发生,深入研究其机制,开发研制特异性、高亲和力的PPARγ配体将会为防治动脉粥样硬化开辟新领域。
过氧化物酶体激活受体 篇2
1 PPARβ
PPARβ有441个氨基酸序列, 与PPARα和PPARγ一样, 分子结构由4个功能区域和6个结构片段组成。研究发现, 在胚胎发育时期的中枢神经系统PPARβ在E8.5时开始出现表达, E13/5时表达最高, 然后其表达逐渐下降, E18.5时接近成熟水平, 这表明在中枢神经系统中, 它可能在细胞分化中发挥重要作用[1]。PPARβ表达在中枢神经系统内的所有主要细胞, 包括星形胶质细胞、血管内皮细胞、小神经胶质细胞、神经元和少突胶质细胞。这些细胞参与了中枢神经系统炎症反应的病理过程。氧化应激和炎症反应在神经元退变病理过程中有十分重要的意义。脑损伤后氧自由基和活性氧族明显增加, DNA、蛋白质损伤, 脂质过氧化, 最终导致神经元凋亡。抗氧化应激和抑制炎症反应可能是治疗神经系统疾病的两个重要环节。PPARβ的激活可抗氧化应激和抑制炎症反应, 对中枢神经系统的急慢性损伤起到神经保护作用。
2 PPARβ与神经系统疾病
2.1 PPARβ
与脑卒中PPARβ可以保护卒中相关的缺血性损伤[2]。PPARβ基因敲除鼠局灶性脑缺血后梗死面积比野生鼠显著增加[3], 而梗死面积的差异是在诱导缺血后30 min检测, 表明PPARβ在缺血早期就起保护作用[3]。在大脑中动脉闭塞模型 (MCAO) 中, 血管平滑肌细胞PPARβ特异性缺失的小鼠脑血管通透性和梗死面积增加[2]。此外给予大鼠注射PPARβ激动剂L-165041可显著减少MCAO后24h缺血性脑损伤, 说明PPARβ激动剂可能在脑缺血后起保护作用[4]。可能的保护机制包括调节氧化应激和炎症反应, 维持基质细胞连接, 及促进细胞存活。
增强的氧化应激和炎症反应被认为是导致脑缺血后神经元死亡的主要原因。在MCAO体内模型中, PPARβ基因敲除鼠脂质过氧化标记丙二醛增加, 但抗氧化剂、胱甘肽和抗氧化酶、锰超氧化物歧化酶水平减少, 这表明PPARβ基因敲除小鼠在脑缺血后氧化应激反应增加[5]。此外, 在小鼠的血管平滑肌细胞中特异的敲除PPARβ, 在小鼠大脑缺血后24h促炎症介质显著增加, 包括白细胞介素-1β (IL-1β) , IL-6、细胞间黏附分子-1、单核细胞趋化蛋白-1的mRNA水平增加[2], 这表明脑缺血后炎症反应增加, PPARβ在脑缺血后可能通过调节以上过程发挥保护作用。PPARβ可以激活抗氧化基因如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的转录[6];PPARβ也可以控制结合到PPARs基因的转录;PPARβ可以通过直接与核因子-κB (NF-κB) 作用抑制其转录, 抑制促炎症转录因子的激活[6];PPARβ可通过将其产生的B-细胞淋巴瘤蛋白6结合到促炎基因的启动子区域抑制巨噬细胞的转录[7], 抑制转录是PPARβ许多抗炎作用的基础。PPARβ的激活也可增强IL-1受体的表达, 其可竞争IL-1β结合到IL-1受体上, 因此, 抑制受体信号转导从而减轻脑缺血后炎症反应[8]。
脑缺血后破坏了基质细胞的连接, 这会导致血脑屏障的破坏, 最终导致神经元死亡和脑损伤。使用PPARβ激动剂GW501516处理血管平滑肌细胞, 可降低氧糖剥夺24h后基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 的活性。血管平滑肌细胞选择性PPARβ基因敲除小鼠表现出在MCAO后MMP-9表达增加, 并抑制MMP-9使用shRNA来减少梗死面积和血管通透性[2]。PPARβ可通过降低MMPs的活性减少结构蛋白在基质细胞外的降解减轻缺血引起的组织及血管损伤。然而, 对于PPARβ调控MMP-9表达的机制尚不清楚, 需进一步实验以明确。
PPARβ还可以促进缺血性脑损伤后细胞存活。在体内试验, GW501516可通过抑制miR-15a的表达, 直接调节抗凋亡蛋白-2使其表达增加, 减少高尔基体破碎, 降低caspase-3的活性抑制血管内皮细胞死亡, 进而又降低脑血管通透性和脑梗死体积[9]。PPARβ已被证明在应激条件下可促进神经元存活。研究表明GW501516可显著降低SH-SY5Y细胞曝露于细胞毒素如内质网Ca2+ATP酶抑制剂毒胡萝卜素而产生的细胞凋亡。PPARβ可能是由于抑制细胞凋亡促进神经元存活, 而其PPARβ激动剂可通过显著降低细胞毒素处理过的细胞中caspase-3和caspase-7的活性而促进神经元存活[4]。
2.2 PPARβ与阿尔茨海默氏病 (AD)
阿尔茨海默病患者表现出由淀粉样肽Aβ1-42和Aβ1-40的积聚而形成淀粉样蛋白斑沉积和tau蛋白缠结形成神经原纤维, 导致神经退行性病变[10]。炎症性细胞因子可能导致Aβ肽的增加, 促进AD的进展。神经递质去甲肾上腺素 (noradrenaline, NA) 能保护神经元抵抗各种炎症的刺激, 包括接触Aβ肽。在原代培养的大鼠皮层神经元, 使用PPAR拮抗剂GW9662, NA抑制Aβ肽诱导的细胞凋亡的作用降低。此外, 研究测定GW0742阻止细胞凋亡的程度与NA相同[11]。NA可能通过激活PPARβ抑制Aβ肽诱导的细胞凋亡。
在5xFAD小鼠中, 通过过表达淀粉样蛋白前体蛋白和早老素1, 出现斑块沉积、炎症反应、神经元损伤和认知功能受损。给予GW0742可显著降低淀粉样蛋白斑块在5xFAD小鼠的沉积。研究发现这与脑啡肽酶、淀粉样蛋白分解酶表达增加相关, 在体外实验证实GW0742能激活脑啡肽酶启动子驱动的荧光素酶表达, 在5xFAD小鼠脑组织中GW0742也可导致星形胶质细胞的活化减少[12]。PPARβ可能在AD的治疗中有应用价值。
在小鼠脑内给予链脲霉素 (STZ) 耗尽脑胰岛素水平, 可诱导进行性的神经退行性疾病而建立AD模型。在AD小鼠大脑内观察到, 胰岛素和胰岛素样生长因子信号受损以及这些异常的信号因子会随着痴呆程度而增加[13]。通过Morris水迷宫测试, 使用PPARβ激动剂L-160, 043治疗显示其可抑制STZ诱导的神经功能障碍和改进认知功能, L-160, 043的作用是由于增加胰岛素受体的信号, 降低tau蛋白磷酸化, 增加胆碱乙酰转移酶和减轻炎症反应和氧化应激。上述作用与GW0742的作用一致, L-160, 043还可降低胶质纤维酸性蛋白的水平。另外, 已发现在AD小鼠大脑内氧化应激标记物8-羟基鸟嘌呤和4-羟基的水平升高[14], 在STZ处理的动物给予L-160, 043可降低这两种标记物的水平, 表明PPARβ激动剂可能是有效的抗氧化剂, 改善与AD相关的氧化应激。已有研究表明L-160, 043的作用比PPARα激动剂GW7647, 或部分PPARγ激动剂F-L-Leu的作用更显著[15]。
2.3 PPARβ与帕金森氏病 (PD)
PD的进展与活性氧和多巴胺氧化相关。PPARβ激动剂可能对PD患者有好的治疗效果。合成的阿片剂1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶 (MPTP) 可通过药物成瘾诱导PD。在小鼠实验中, 在其第一次注射前24h给予GW501516可显著改善纹状体多巴胺及其代谢产物的减少。PPARβ激动剂也能保护人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y被多巴胺能神经毒素诱导的细胞凋亡, 这种保护作用与caspase-3的减少相关, GW501516在PD实验模型中的神经保护作用可能与caspase-3减少相关[4]。PPARβ在PD中的保护作用尚不明确, PPARβ激动剂是否可调节与PD相关的氧化应激和炎症反应尚需进一步研究。
2.4 PPARβ与多发性硬化症 (MS)
多发性硬化症是一种自身免疫性疾病, 表现为髓鞘的破坏和神经胶质细胞的激活。实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) , 可作为MS的一个模型[16]。肿瘤坏死因子α (TNF-α) 可抑制PPARβ表达在少突胶质前体细胞, 该模型提出降低PPARβ表达导致长链脂肪酸积累, 这会引起细胞毒性作用和脱髓鞘。因而PPARβ激动剂可能对于MS是有益的[17]。
在小鼠EAE模型中, 在小鼠疾病进展期间给予GW0742可起到更大的作用。GW0742可减轻新皮层病变, 增加蛋白脂质蛋白的mRNA水平, 并减少IL-1β水平, 但GW0742并没有改变γ-干扰素 (INF-γ) 的水平。其保护作用可能通过减少炎症细胞的激活起作用[18]。GW501516也可有效地改善EAE症状。在小鼠脑组织中, GW501516可使促炎细胞因子IL-2和IL-23的表达减少, 抗炎细胞因子IL-4和IL-10的表达增加, T辅助细胞1和17细胞产生的INF-γ和IL-17表达减少[19]。在EAE的PPARβ基因敲除鼠会出现损伤性的炎性反应, 这会导致PPARβ基因敲除鼠恢复时间延长, 其与IFNγ, IL-17, IL-12p35, IL-12p40持续的表达相关。PPARβ可调控EAE相关的炎性因子的表达, 抑制炎症反应[20]。
在脑细胞聚集的体外实验模型中, GW501516可有效地减少IFN-γ或脂多糖诱导的TNF-α或诱导型一氧化氮合酶mR-NA的水平, 但增加了IL-6的mRNA表达。在脱髓鞘抗体抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白存在时, GW501516无法阻止髓鞘碱性蛋白的下降[21]。在EAE模型, PPARβ激动剂的保护作用可能是由于其抗炎特性, 而不是他们对髓鞘基因和少突胶质细胞的作用。PPARβ激动剂可改善EAE模型中的炎症反应, 并可能从治疗途径改善MS的进展。
2.5 PPARβ与脊髓损伤 (SCI)
脊髓损伤与少突胶质细胞和神经细胞死亡所致的轴突传导障碍和运动功能障碍相关。SCI伴随着炎症和水肿, 导致炎症细胞渗出, 炎症因子的释放, 血管通透性增加, 并最终坏死[22]。PPARβ可以调节上述反应。在脊髓损伤后的小鼠给予GW0742可显著改善运动功能。PPARβ拮抗剂GSK0660可阻断GW0742对运动功能的改善作用, 表明激动剂的保护作用依赖于PPARβ受体的激活。GW0742的作用与减少在脊髓的氧化应激和炎症反应相关, 其可减少TNF-α, IL-1β和诱导型一氧化氮合酶的表达, NF-κB的活化, 中性粒细胞浸润, 硝基酪氨酸和脂质过氧化等反应[23]。GW0742在SCI前1h给药可减少培养的小鼠脊髓细胞死亡和炎症减轻是由于减少环氧化酶-2表达及NF-κB活化。也提出PPARβ减轻SCI是由于促进损伤后少突胶质前体细胞的增殖及分化。在大鼠脊髓损伤后, PPARβ阳性细胞在白质中表达增加, 可沿着病灶边缘表达长达两个星期。PPARβ在脊髓损伤后给定的时间和空间表达, 可能可以调节损伤后氧化应激和炎症反应。
2.6 PPARβ与癫痫
细胞凋亡是癫痫后脑神经元死亡的形式之一, 可导致星形胶质细胞的反应性增生, 也是异常兴奋性突触环路形成的重要原因。PPARβ受体激动剂神经保护作用, 可能对癫痫发作后神经损伤具有潜在的治疗价值。PPARβ激动剂在大鼠癫痫模型中可通过抑制细胞凋亡, 而对癫痫后海马神经元起保护作用。
3 结语
PPARβ激动剂作为潜在的治疗药物, 在治疗中枢神经系统疾病中有广泛应用前景。PPARβ激动剂的神经保护作用, 在很大程度上是通过调节氧化应激和炎症反应过程实现的。未来的研究需通过体外和体内方法进一步研究PPARβ抗氧化和抗炎作用机制, 并为今后PPARβ激动剂的临床应用建立基础。
摘要：过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPARs) 是配体活化的转录因子, 调节广泛的细胞过程, 包括炎症、增殖、分化、代谢和能量平衡。其三种密切相关的亚型已经被确定分别是PPARα, β, γ。该三种亚型在中枢神经系统均有表达。PPARα和PPARγ表达在中枢神经系统的特定区域, 而PPARβ表达更为广泛, 是主要的亚型。给予PPARβ激动剂可对中枢神经系统的急慢性损伤起到神经保护作用, PPARβ激动剂的抗炎和抗氧化特性被认为是神经保护作用的基础。本文系统回顾了过氧化物酶体增殖物激活受体在中枢神经系统PPARβ的神经保护作用, 尤其是PPARβ激动剂的抗炎和抗氧化作用机制。
过氧化物酶体激活受体 篇3
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择2010年9月至2011年5月在我院诊断为ACS的患者67例,其中男48例,女19例,年龄(62.3±8.6)岁, ACS诊断标准按美国心脏病学会(ACC)及美国心脏病协会(AHA)制定的标准[2],其中不稳定型心绞痛38例,急性心肌梗死29例,所有患者均经选择性冠状动脉造影明确诊断。所有病例经询问病史及体检均排除4周内服用降脂药物,维生素E等抗炎、抗氧化作用药物及恶性肿瘤、肝纤维化、近期手术、严重感染、急性脑血管病、周围血管病变等情况。对照组20例,为我院住院病人,均已行选择性冠状动脉造影排除冠心病。所有患者均签署知情同意书。
1.2 研究方法
清晨空腹抽肘静脉血2ml,肝素抗凝,2000r·min-1离心10min, 血液分为3层。取上层血浆至1.5ml EP管中,取中间层白细胞移至试管中,用作淋巴细胞总RNA的提取。
1.2.1 总RNA的提取和定量
按照1∶1的体积比例,向装有白细胞的试管加入D-hanks液,混匀后1000 r·min-1 离心5min,取中间膜状物加入到装有1ml淋巴细胞分离液的1.5ml EP管中, 进行单个核细胞的提取,采用吸附柱过滤法分离淋巴细胞。经PBS液洗涤后加1mlTrizol于旋涡振荡器上低速震匀,室温放置5～10min。加氯仿0.2ml,混匀,室温静置3min,于4℃加0.5ml异丙醇, 4℃、12000r·min-1离心10min。弃去上清液,加DEPC及新配制的75%乙醇1ml洗涤总RNA,4℃、7500r·min-1离心5min,弃去上清液,瞬时离心后用小吸管吸尽残留液体,置冰浴盒上,自然干燥,置-70℃冰箱保存。
1.2.2 cDNA的合成
取RNA2μg,加Olig(dT) 18μl,于60℃水浴10min,再放冰上骤冷,而后加RNA酶抑制剂、M- MuLV逆转录酶等,60℃孵育60min,加灭活酶95℃灭活5min,最后将将逆转录产物用于PCR。
1.2.3 PCR扩增
PPAR- γ引物:上游5′- TCTCTCCGTAATGGAAGACC- 3′,下游5′- GCATTATGAGACATCCCCAC- 3′,产物长度474bp。内参照β- actin,引物上游5′- ATCATGTTTGAGACCTTCAACA- 3′,下游5′- CATCTCTTGCTCGAAGTCCA- 3′,产物318bp。 RT- PCR反应体系:94℃预变性5min, 94℃变性30s,62℃退火30s, 72℃延伸30s,循环35次,最后72℃延伸7min。取5μl PCR产物在含有溴化乙锭(EB)的1.5%琼脂糖凝胶中电泳。以凝胶成像系统进行图像分析,测灰度值,以PPAR γ/β- actin光密度比值表示PPAR γ mRNA表达水平。
1.3 统计学处理
采用SPSS 16.0统计软件包进行统计学分析,计量指标以undefined表示,组间、组内比较采用非配对t检验和配对t检验;计数指标组间比较采用χ2检验。P< 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同组间一般资料比较
急性心肌梗死组、不稳定心绞痛组及对照组一般资料的比较见表1。3组受试者的年龄、体重指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和尿酸(UA)等差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.2 不同组间PPAR γ表达比较
ACS患者及对照组外周血单核细胞均可见PPAR γ的表达(图1),ACS患者PPAR γ mRNA的表达均较对照组低(P<0.05),其中急性心肌梗死组、不稳定心绞痛组、对照组外周血单核细胞PPAR γ的表达分别为0.51±0.62、3.23±0.88、5.91±0.74,差异均有统计学意义(P<0.05)。
1. 对照组; 2. 不稳定心绞痛组; 3. 急性心肌梗死组
3 讨论
在ACS发生发展中脂质和炎症的相互作用日益受到关注。低密度脂蛋白(LDL)进入内膜,发生氧化修饰,被修饰的LDL能促进巨噬细胞和血管壁其它细胞上黏附分子、趋化分子、促炎症因子和其它炎症介质的表达。单核- 巨噬细胞在动脉粥样硬化起关键性的作用,一方面,单核- 巨噬细胞黏附于受损的内皮,迁入内膜,通过清道夫受体摄取氧化修饰的脂蛋白转化为组成粥样斑块的主要成分——泡沫细胞;另一方面,单核- 巨噬细胞可以分泌许多的细胞因子,调节动脉粥样硬化的炎症反应,同时调节自身清道夫受体的表达。体外的细胞培养研究结果提示,氧化LDL可以直接激活单核- 巨噬细胞[3]。单核细胞参与动脉粥样硬化的起始及发展,是参与ACS发生及发展最重要的细胞之一。
PPAR γ是一类由配体调节的核激素受体,在单核细胞、巨噬细胞、泡沫细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、动脉粥样硬化病灶中均有表达,是脂质代谢和细胞迁移、分化的关键转录调节因子。它能够调节脂质代谢、脂肪细胞分化和胰岛素敏感性[4,5,6],在巨噬细胞激活可诱导ABCA1转运蛋白的表达,促进胆固醇的逆向转运[7],在许多细胞信号通路中能够起关键调节作用。斑块不稳定可导致ACS的发生,部分原因是由于细胞外基质中纤维帽的降解。PPAR γ激活可抑制基质金属蛋白酶- 9(MMP- 9)分泌基质降解蛋白[8],从而减少ACS发生的可能,减轻冠状动脉病变程度[9]。PPAR γ还参与血小板聚集的调节,其激活可抑制血栓素合成酶的表达[10],从而抑制血小板聚集,防止动脉粥样硬化斑块的破裂和随后的血栓形成[11]。PPAR γ参与脂质代谢和炎症因子的调控,而ACS的发生与脂质与炎症密切相关。
本研究结果显示:对照组及ACS患者外周血单核细胞中均有PPAR γ的表达, ACS患者较对照组PPAR γ的表达明显降低,随着ACS病情加重PPAR γ的表达进一步下降。PPAR γ在急性心肌梗死组表达低于不稳定心绞痛组(P<0.05),而不稳定心绞痛组低于正常对照组(P<0.05),说明外周血单核细胞中PPAR γ的表达程度可反映患者冠状动脉疾病严重程度。我们推测:外周血单核细胞PPAR γ的表达与冠状动脉粥样斑块局部PPAR γ的表达具有一致性。动物实验显示,提高局部PPAR γ的表达,可改变心肌缺血预后[12],而激活ACS人群外周血单核细胞PPAR γ的表达,可否改善ACS患者预后,这尚需进一步研究以证实。
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过氧化物酶体激活受体 篇4
关键词：青蒿琥酯,非酒精性脂肪性肝炎,过氧化物酶体增殖物激活受体γ,固醇调节元件结合蛋白-1c
非酒精性脂肪性肝病 (nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD) 是世界范围内常见肝脏疾病之一, 近年来在我国的发病率迅速上升, 是继病毒性肝炎后第2位常见肝病。NAFLD从病理上分为单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎 (NASH) 、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化[1]。因此, NAFLD是对人类健康产生严重威胁的慢性肝病之一, 对NAFLD发病机制及防治方法的探讨已经成为当前研究的核心, 但其病理分子机制还不完全明确, 故临床治疗上无特效药物且疗效欠佳。根据Day[2]提出的“二次打击学说”, 本实验拟从其发病机制出发, 研究过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ) 和固醇调节元件结合蛋白-1c (SREBP-1c) 在脂肪代谢中的调节作用, 初步探讨青蒿琥酯对NASH的保护作用。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Leica2235轮转式切片机 (德国) , Biofuge 28RS低温高速离心机 (德国Heraeus公司) , Olympas B41显微镜 (日本Olympas) , 生物安全柜 (Thermo scienrific, 1384) , 数显立式高压灭菌锅 (上海博讯实业有限公司, YXQ-LS-30SⅡ) , 低温冰箱 (Thermo scientific, MDF-U538-C) 和纯化水制水系统 (象山和信制药设备有限公司, FST-2B型) 。
1.2 试药
青蒿琥酯 (广西桂林制药二厂, 批号:010901) 、易善复 (赛诺菲安万特制药有限公司, 批号:D1157) , 丙二醛 (MDA) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 和谷胱甘肽-过氧化物酶 (GSH-Px) 试剂盒 (南京建成生物工程研究所, 批号分别为:A001-2, ba8150, 20100107) 。SREBP1兔抗 (Santa Cruz Biotechnology, 批号:C0907) ;Envision二步法免疫组化试剂盒 (丹麦Dako公司, 批号:00029661) 。
1.3 实验动物
SPF级雄性SD大鼠购自浙江省医学科学院实验动物中心 (动物许可证号SCXK浙-20080033) 。大鼠普通饲料及高脂饲料由浙江省医学科学院实验动物中心加工生产, 高脂饲料配方为:普通饲料82%、蛋黄粉5%、猪油10%、胆固醇2%、胆盐1%。
2 方法
2.1 实验分组
95只SD大鼠经适应性饲养1周后, 随机分为正常组15只 (每天予以标准饲料喂养) , 造模组80只 (每天予以高脂饲料喂养) , 连续喂养12周;第12周结束后随机在造模组中处死5只。取肝脏进行病理切片检查HE染色法, 评定非酒精性脂肪性肝炎程度, 对已成模的大鼠分成5组, 每组15只, 分别是模型组、易善复组、青蒿琥酯低、中和高剂量组;青蒿琥酯低、中和高剂量组青蒿琥酯分别按5、15、45 mg/g剂量每日灌胃;易善复组给予易善复按300 mg/g剂量每日灌胃;正常组和模型组给予同等剂量的生理盐水, 给药治疗8周后, 处死各组大鼠, 迅速取肝右叶中部切取数块肝组织, 立即投入液氮中冻存, 3 h后移入-80℃冰箱中保存备用。
2.2 各组大鼠肝组织MDA、SOD和GSH-Px含量测定
过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合, 形成红色产物, 在532 nm处有最大吸收峰。取各组动物血清, 严格按试剂盒说明书操作, 稀释倍数为1倍, 上样量为10μL, MDA含量公式为:
(10 nmol/m L) +样本测试前稀释倍数。
通过黄嘌呤和XOD反应系统产生O2-, O2-氧化羟胺形成亚硝酸盐 (NO2-) , 同时在显色剂的作用下呈现紫红色, 测定其吸光度。通过公式计算出被测样品中SOD活力:
根据酶促反应中谷胱甘肽 (GSH) 的消耗, 可以求出酶的活力, 然后取各组动物血清, 严格按照说明书操作, 稀释倍数为30倍, 通过公式测定血清中GSH-PX含量。公式为:
2.3 肝组织病理
常规HE染色观察肝组织脂肪变、炎症及纤维化程度。病理诊断标准参考中华医学会学分会脂肪肝和酒精性肝病学组2006年2月修订的《酒精性肝病诊疗指南》[3]。
2.4 肝组织免疫组化
取上述石蜡标本切片, 采用免疫组化二步法进行免疫组化染色。每张切片于阳性表达区域选择10个无重叠视野, 阳性细胞表现为胞浆或胞核呈棕黄色颗粒。着色细胞阳性范围:无着色为0分, 着色阳性细胞小于1/3为1分, 着色阳性细胞1/3~1/2为2分, 着色阳性细胞大于1/2为3分;将每张切片着色程度与着色细胞阳性范围得分各自相加取平均值为其最后计分。
2.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行分析, 计量资料数据以均数±标准差 (±s) 表示, 两组独立样本采用t检验, 多组比较采用方差分析, 两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示, 采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 各组大鼠肝组织MDA、SOD和GSH-Px含量测定结果
与正常组相比, 模型组大鼠肝组织MDA显著增加, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;与模型组比较, 青蒿琥酯各剂量组大鼠肝组织MDA显著下降并且呈剂量依赖性, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;与正常组比较, 模型组大鼠肝组织SOD和GSH-Px显著降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;与模型组比较, 青蒿琥酯各剂量组大鼠肝组织SOD和GSH-Px显著增加并且呈剂量依赖性, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结果见表1。
3.2 各组大鼠肝脏组织HE染色结果
光镜下, 正常组大鼠肝脏肝小叶轮廓清晰, 结构正常, 细胞索排列整齐, 肝细胞呈无明显病变, 核结构清晰。模型组大鼠肝组织可见中到重度脂肪肝, 肝索出现紊乱, 胞质疏松可见大小不一的脂滴空泡, 肝小叶内出现点状坏死, 汇管区有炎症细胞浸润;青蒿琥酯组可见轻度到中度脂肪变, 细胞肿胀, 胞浆内可见大小不等的脂肪空泡, 肝小叶未见明显炎症细胞浸润。见封三 (图1) 。
注:超氧化物歧化酶:与模型组比较, t=0.423, (1) P=0.026<0.05;t=27.58, (2) P=0.019<0.05;t=29.08, (3) P=0.041<0.05;t=71.2, (4) P=0.017<0.05;t=65.91, (5) P=0.027<0.05;与青蒿琥酯高剂量组比较, t=6.197, (6) P=0.023<0.05;t=7.041, (7) P=0.011<0.05。丙二醛:与模型组比较, t=0.278, aP=0.012<0.05;t=30.031, bP=0.020<0.05;t=30.08, cP=0.017<0.05;t=30.236, dP=0.033<0.05;t=30.872, eP=0.043<0.05;与青蒿琥酯高剂量组比较, t=1.226, fP=0.037<0.05;t=6038, gP=0.016<0.05。谷胱甘肽-过氧化物酶:与模型组比较, t=1.253, @P=0.044<0.05;t=13.006, #P=0.035<0.05;t=12.305, $P=0.019<0.05;t=11.092, ^P=0.017<0.05;t=30.481, &P=0.010<0.05;与青蒿琥酯高剂量组比较, t=6.842, *P=0.031<0.05;t=7.041, ~P=0.029<0.05
3.3 各组大鼠肝脏组织免疫组化结果
采用免疫组化二步法进行免疫组化染色, PPARγ主要定位于肝细胞核内, 呈棕黄色颗粒主要分布在汇管区周围肝细胞胞核内;与正常组相比, 模型组PPARγ阳性表达细胞明显减少 (P<0.05) ;青蒿琥酯中、低剂量组与模型组相比, PPARγ阳性表达细胞增多, 并且呈剂量依赖性 (均P<0.05) , 青蒿琥酯高剂量组和模型组相比差异有高度统计学意义 (P<0.01) ;SREBP-1c表达于胞浆质中, 可见肝细胞质中散在分布浅黄色颗;与正常组相比, 模型组SREBP-1c阳性表达增强细胞质中可见大量棕褐色颗粒沉积, 同时大部分细胞核也呈阳性着色, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.05) ;青蒿琥酯中、低剂量组与模型组相比, SREBP-1c阳性表达细胞减少, 并且呈剂量依赖性减少, 青蒿琥酯高剂量组和模型组相比差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见封三 (图2、3) , 表2。
4 讨论
青蒿素是从植物黄花蒿中提取得到的一种内酯化合物。青蒿素及其衍生物具有抗病毒、抗肿瘤和免疫抑制等多方面药理作用。青蒿琥酯为青蒿素水溶性的衍生物[4]。有学者发现青蒿琥酯对醋氨酚 (AAP) 与四氯化碳 (CCl4) 引起的小鼠急性肝损伤有保护作用[5,6];来丽娜等[4]发现青蒿琥酯能降低牛血清白蛋白致大鼠肝纤维化程度。因此, 本实验初步探讨青蒿琥酯是否能通过PPARγ和SREBP-1c途径阻断NASH的形成。
注:过氧化物酶体增殖物激活受体γ:与模型组比较, t=0.116, (1) P=0.028<0.05;t=2.307, (2) P=0.015<0.05;t=2.025, (3) P=0.013<0.05;t=5.062, (4) P=0.042<0.05;t=3.801, (5) P=0.0012<0.01;与青蒿琥酯高剂量组比较, t=0.402, (6) P=0.016<0.05;t=0.019, (7) P=0.013<0.05。固醇调节元件结合蛋白-1c:与模型组比较, t=0.231, aP=0.014<0.05;t=3.046, bP=0.025<0.05;t=10.905, cP=0.038<0.05;t=11.206, dP=0.022<0.05;t=9.401, eP=0.0025<0.01;与青蒿琥酯高剂量组比较, t=0.146, fP=0.015<0.05;t=0.401, gP=0.042<0.05
氧化应激与脂质过氧化是“二次打击”学说的核心环节。正常情况下肝线粒体与内质网在脂肪酸β氧化过程中产生大量的活性氧 (reactive oxygen species, ROS) , 使氧化和抗氧化处于动态平衡。在病理情况下, 肝细胞内一旦ROS的过量产生与抗氧化能力降低, 能促使氧化物与抗氧化物之间的动态平衡失调, 从而导致脂质过氧化, 很容易导致氧化应激状态[7]。SOD是体内一种重要的自由基清除剂, 能够平衡机体的ROS, 避免超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应。脂质过氧化终产物MDA可形成蛋白加合物, 刺激机体产生抗体介导的免疫损伤[8]。GSH-Px是机体内存在的一种含硒抗氧化酶, 它能特异性地催化GSH对H2O2的还原反应, 进而清除H2O2, 从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。如果过氧化氢酶 (CAT) 在肝脏中含量极高, 可以促使H2O2分解为分子氧和水, 从而使细胞免于遭受H2O2的损害[9]。因此, 提高SOD、GSH-Px活性与降低肝MDA含量对抗氧应激状态, 提高肝脏抗氧化能力。本研究结果表明青蒿琥酯可通过增加机体SOD和GSH-Px活性, 增强机体抗氧化能力, 加速自由基的清除, 抑制脂质过氧化反应, 清除过量的MDA, 从而保护肝脏的结构和功能。
PPAR有3种亚型分别为α、β、γ, 其中PPARγ是由多种脂肪酸及其衍生物激活, 是胰岛素细胞间信号传递和脂肪细胞基因表达的主要调控者, 参与了脂代谢的调节及脂肪细胞分化, 因此在NAFLD中起着重要作用[10]。SREBPs是一类膜连接蛋白, 其位于内质网上。SREBP-1也是一种核转录因子, SREBP-1c是其中一个亚型, 它主要参与糖代谢和脂肪酸的代谢, 是脂肪合成基因转录的主要调节因子, 与脂肪变性有密切联系[11]。本实验从蛋白水平结果显示:PRARγ和SREBP-lc与肝细胞病变程度有很好的一致性关系, 两者可能协同作用参与并促进了非酒精性脂肪性肝病的发生、发展。进一步验证青蒿琥酯抑制PRARγ和SREBP-lc的不适当表达可能是预防和治疗NASH的一条有效途径。
A:正常组;B:模型组;C:青蒿琥酯高剂量组
A:模型组;B:青蒿琥酯高剂量组