抗氧化成分（共8篇）
抗氧化成分 篇1
摘要：研究丹参的化学成分分离与抗氧化活性,对丹参的化学成分进行溶液分离,使用Fenton体系和还原体系对丹参中化学成分的抗氧化活性进行研究。丹参中所含化学成分的抗氧化性和还原能力强。丹参具有较强的抗氧化活性,能够有效预防心脑血管疾病发展、扩张血管,具有防止脑血栓等药用价值。
关键词：丹参,化学成分分离,抗氧化活性
丹参主要能够入药的部位是其干燥根和根茎,丹参由于外观为红色又被称做赤参,在我国大部分地区都能够种植丹参。丹参能够缓减患者的痛感、消除淤血、疏通经络、促进气血活动、恢复患者神智及缓解疲劳的功效,可以用于治疗胸闷、心绞痛、腹胀腹痛、四肢麻痹、失眠、月经失调及经痛、浮肿及溃疡等症状。本文主要阐述了丹参的化学成分分离的方法及以其抗氧化活性的研究,现分析如下。
1 丹参化学成分及其抗氧化活性
丹参的化学成分主要分为两大类,脂溶性化学成分和水溶性化学成分。丹参中的脂溶性化学成分中二萜醌类化学成分占最大比重,其中又以橙黄色的丹参酮和橙红色的隐丹参酮为主[1]。丹参中水溶性化学成分中以酚酸类水溶性化学成分居多,酚酸类水溶性化学成分中主要有丹参素、迷迭香酸、丹酚酸、原儿茶醛等化学成分[2]。医学界目前对于丹参中的水溶性化学成分的研究中,掌握准确的化学成分主要有丹参素、迷迭香酸、原儿茶醛、丹酚酸A、B、C、D、E、F、G等[3]。丹参素是由2个HO分子、1个OH分子及以1个CH2分子和COOH分子构成,迷迭香酸是由2个O分子、2个HO分子和2个OH分子及1个COOH分子构成。
2 丹参的化学成分分离
将丹参碾成粉状,使用4倍分量70%浓度的乙醇浸泡提取4次,将丹参溶液浓缩至100 L,然后提取溶液,在常温中放置24 h后,使用清液将溶液中的乙醇去除,将溶液加热至室温,将溶液的pH值调至3,将乙醇浓度压缩至80%醇沉,将溶液中的乙醇过滤提取致无醇状态,将溶液的pH值调至5,使用乙酸乙酯对溶液萃取3次,将溶液浓缩得到提取物45 L,后添入45 L石油醚,将溶液中的沉淀物溶于乙酸乙酯中,得到无水硫酸溶液,将其脱水,最终分离出含丹酚酸类化合物的样品4.01 L。
将富含丹酚酸类化合物的样品放置烧杯中,使用硅胶进行第1次正相分离,放置8 h后,使用正己烷或乙酸乙酯进行第2次洗脱,后分成6份样品,分别为Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6。将Fr2样品使用SephadexLH-20柱层析,然后使用比例为40:9的甲醇进行水梯度对Fr2样品洗脱,得到含有迷迭香酸的样品,接着使用CG161柱层析,再使用比例为40:9的甲醇进行水梯度对含有迷迭香酸的样品洗脱,最终得到迷迭香酸。将Fr4样品使用SephadexLH-20柱层析,然后使用比例为60:13的甲醇进行水梯度对Fr4样品洗脱,得到含有丹酚酸B的样品,接着使用CG161柱层析,再使用比例为60:13的甲醇进行水梯度对含有丹酚酸B的样品洗脱,最终得到丹酚酸B。将Fr5样品在常压下使用硅胶柱层析,后使用正己烷或乙酸乙酯进行梯度洗脱,后得到25 g的样品,对25 g样品使用SephadexLH-20柱层析,然后使用比例为50:17的甲醇进行水梯度对25 g样品洗脱,得到含有丹酚酸A的样品,接着使用CG161柱层析,再使用比例为50:17的甲醇进行水梯度对含有丹酚酸A的样品洗脱,最终得到丹酚酸A。
3 丹参化学成分的抗氧化活性研究
目前对于化学成分的抗氧化活性研究方式主要是使用Fenton体系、邻苯三酚自氧化体系、还原体系、DPPH体系、抗卵黄脂质过氧化体系进行分析和研究[4]。本文使用其中两种方式分析丹参化学成分的抗氧化活性。
3.1 Fenton体系
Fenton体系主要是对于丹参中化学成分进行OH清除,其工作原理是在Fenton与丹参中的化学成分发生化学反应,产生OH,由此可得出丹参中化学成分的OH数量[5]。
检测方式：使用2.5 ml的乙酸乙酯溶液(7 mmol/L),然后加入1.5 ml硝酸钠溶解剂(pH 7.6;0.3 mmol/L),搅拌均匀后加入2.5 ml磷酸盐溶液(含二乙烯三胺；2.8 mmol/L),充分搅拌后加入纯净水,于常温中放置,后测得丹参中化学成分的OH数量。见表1。
3.2 还原体系
实验使用高锰酸钾比色法则判断丹参中化学成分的还原能力,当Fe3+分子与丹参中化学成分发生反应还原成Fe2+时,与高锰酸钾发生反应形成有色溶液,溶液的颜色越深,表示化学成分的还原能力越强[6]。
实验方法：在试管中放入2 ml的丹酚酸A样品,加入3 ml硫酸亚铁缓冲溶液(pH 6.7;0.3 mmol/L),3 ml高锰酸钾溶液,搅拌均匀,在常温中放置2 h,后加入纯净水3 ml,测得丹酚酸A的还原能力。见表2。
4 讨论
丹参是一种唇形科鼠尾草属植物,我国中医学对于丹参在病理治疗方面有着独特的研究,是传统中医学中经常使用的一种药材,且丹参中所含的化学成分非常丰富,能够制成抗氧化剂,并广泛应用于治疗各种疾病中。医学界目前对于水溶性酚酸类化学成分的研究有许多新发现,其中表面丹参中的化学成分具有较强的抗氧化活性效果,有着非常好的药用价值。
丹参能够效预防心脑血管疾病,能够发挥扩张血管、防止脑血栓作用。而丹参有特殊的化学成分,有较强的抗氧化活性,具有能够有效预防心脑血管疾病发展、扩张血管、防止脑血栓等药用价值。丹参中的化学成分广泛应用在临床治疗心脑血管疾病中的药物制作中,如复发丹参丸、丹参注射液、复方丹参口服液等。本文主要讨论了丹参的化学成分分离以及丹参化学成分抗氧化活性的实验,实验证实了丹参具有很好的抗氧化活性作用。
参考文献
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抗氧化成分 篇2
摘 要 实验采用黄丝菌（Canthar-ellus cibarius Fr）子实体，经热水提取、乙醇沉淀、柱层析以及透析处理，得到黄丝菌多糖（CC-1），采用三氟乙酸水解黄丝菌多糖样品形成单糖，结合高效液相色谱分析法（HPLC法）分析了其单糖成分；同时，研究了低浓度黄丝菌多糖的抗氧化活性。结果表明，黄丝菌多糖由甘露糖与木糖组成，比例为7∶1。抗氧化实验表明，黄丝菌多糖对ABTS+自由基的清除能力在0.5～5.0 mg/mL质量浓度范围内呈正相关，对DPPH-自由基也有一定清除作用。
关键词 黄丝菌多糖；高效液相色谱法；单糖成分；抗氧化活性
中图分类号：TS201.4 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2016）12--02
黄丝菌（Canthar-elluscibarius Fr.）又称鸡油菌、杏菌，是四川、云南地区一种常见野生食用菌。其子实体肉质，全菌杏黄色、蛋黄色或枇杷黄色，有浓郁的杏仁果香味[1，2]。本研究主要以黄丝菌菌体为原料纯化得到黄丝菌多糖（CC-1），通过高效液相色谱分析法（HPLC法）对黄丝菌多糖（CC-1）的单糖结构进行了分析，同时对低浓度黄丝菌多糖的抗氧化活性进行了初探，为黄丝菌多糖（CC-1）的开发利用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
1.1.1 实验材料
黄丝菌采自四川省小金县海拔3 500 m的高原地带，由西华师范大学丁祥教授鉴定。
1.1.2 药品试剂
DPPH试剂，Sephadex G-100 column，浓硫酸、苯酚、无水乙醇、氢氧化钠、三氟乙酸；维生素C；ABTS试剂；其他化学试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器
1260高效液相色谱分析仪，酶标仪（配有Gen5仪器控制及数据分析软件），离心机Centrifuge5418R；电热恒温水浴锅（W-1300083）。
1.2 实验方法
1.2.1 高效液相色谱法（HPLC）分析单糖成分
取多糖样品5 mg，用5 mL浓度为2 mol/mL的三氟乙酸溶解，在100 ℃水解6 h，除去三氟乙酸。将水解后的单糖产物以75%的乙腈作为流动相利用高效液相色谱分析法进行检测。
1.2.2 ABTS和DPPH自由基清除实验
参照相关文献ABTS和DPPH自由基清除实验[3]，实验组吸光度为A1；空白对照组吸光度值为A0；阳性对照组吸光度值为A2。
清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%
2 结果与分析
2.1 黄丝菌多糖的单糖组分鉴定
黄丝菌样品多糖经过高效液相色谱法处理后出现两个明显峰，时间分别是在6.923 min以及8.086 min，其峰值时间与木糖6.833 min和甘露糖7.975min对应单糖峰时间吻合，可知黄丝菌多糖的为木糖和甘露糖构成。两单糖对应的峰面积分别3.5831%和25.7403%，可知其两种单糖比例约为1∶7。
2.2 黄丝菌多糖清除ABTS自由基活性
在一定质量浓度范围内（0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mg/mL），ABTS的清除能力随着黄丝菌多糖浓度的增加而增强。黄丝菌多糖浓度为5.0 mg/mL时，清除率达至52.37%。当VC质量浓度为6 mg/mL时，对ABTS的清除率可达98.02%。
2.3 黄丝菌多糖清除DPPH自由基活性
在一定的浓度范围内（0.1、0.3、0.6、0.9、1.5、2.1、2.4 mg/mL），对DPPH自由基的清除能力不随着黄丝菌多糖浓度的增加而改变，清除率稳定在23.81%～32.91%。当黄丝菌多糖浓度为2.3 mg/mL时，DPPH自由基的清除率达32.91%，继续增加样品多糖浓度时，对DPPH自由基的清除能力没有提升。与VC相比，其DPPH自由基清除能力较弱。
3 讨论与结论
本实验采用黄丝菌子实体，经柱层析以及透析，得到黄丝菌多糖（CC-1），采用三氟乙酸全水解，结合高效液相色谱分析法（HPLC法）分析了其单糖成分[4，5]。结果表明，黄丝菌多糖由甘露糖与木糖组成，比例为7∶1。这是首次确定黄丝菌多糖（CC-1）的单糖类型和含量，为进一步确定其精细结构提供了很好的基础。
在细胞或组织的正常生理代谢过程中可诱导活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的产生，活性氧可以导致细胞内脂、蛋白和DNA等的氧化损伤，诱发氧化应激，从而导致各种肿瘤、风湿性关节炎、糖尿病以及中枢神经系统疾病等。本研究采用的ABTS+和DPPH- 检测黄丝菌多糖（CC-1）的总抗氧化能力。实验结果显示，黄丝菌多糖对ABTS+自由基的清除能力与浓度呈正相关，对DPPH-自由基也有一定清除作用。黄丝菌多糖（CC-1）作为一种高分子化合物，在水溶液中呈现一定的胶体性质，且多糖的羟基基团被水分子包裹，难于接近位于DPPH中3个苯环氮中心的自由基，这可能是导致黄丝菌多糖（CC-1）DPPH自由基的清除率低于对ABTS+自由基清除率。
综上，黄丝菌多糖（CC-1）可以作为一种天然来源的抗氧化剂资源。但是关于黄丝菌多糖（CC-1）的精细结构及抗氧化相关分子机制还有待于进一步研究。
参考文献
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抗氧化成分 篇3
如今, 随着生活水平不断提高, 人们关心的不再是温饱问题, 而是营养的问题。水果的种类很多, 研究抗老化的方法也很多, 在此, 本文总结了水果中常见的抗氧化物质的种类和常见抗氧化能力评价研究进展。
1 水果抗氧化作用的机理
医学及其相关领域的研究表明, 人类的动脉硬化、痴呆症等老年病以及癌症等难治病症发生的原因都和超氧化自由基 (O2-) 、过氧化氢 (H2O2) 、羟基自由基 (·OH) 以及其它各种自由基的作用有关[4,5]。
在郑炜[6]的研究中提到Rosenbtrg曾指出柑橘类水果富含抗氧化维生素C、维生素E和β-胡萝卜素, 能够预防白内障的发生。因此, 不少学者认为水果对于防治衰老可能是源于其抗氧化作用。在范娜等[7]所著的文中, 将其抗衰老的的机理归纳如下:
(1) 清除活性氧自由基。已有大量证据证明, 水果均有一定的清除氧自由基的能力, 这可能是其抗氧化作用的第一道防线。
(2) 增强抗氧化酶活性。水果可通过增强抗氧化酶活性而保护机体免受氧化损伤。
(3) 阻断脂质过氧化链式反应, 减少膜脂质过氧化损伤。不少水果可抑制过氧化产物MDA及脂褐素的生成。
(4) 减少DNA的损伤。
2 水果的主要抗氧化物质
2.1 黄酮类化合物
黄酮类化合物也称为生物类黄酮, 属于植物次生代谢产物, 是酚类化合物的一类。酚类化合物广泛存在于诸多植物中, 水果中含量较多的多酚类化合物是黄酮、黄酮醇类及花色苷类化合物, 其他类别的含量则相对有限[8,9,10]。大量体内外研究结果均证明一些黄酮类化合物具有较强的抗氧化以及清除自由基能力, 且有调节心血管系统、内分泌系统、抗癌防癌、抗衰老、抗辐射等作用[11,12,13]。单杨等[14]的研究表明柑橘黄酮的抗氧化以及清除羟基自由基的性能强, 并且在清除自由基方面的能力要比芦丁强。不同水果中黄酮类化合物的抗氧化活性也会有所差异, Sun等[15]试验了苹果、葡萄、草莓、菠萝、香蕉等11种常见水果的体外抗氧化作用, 发现其抗氧化活性与水果中黄酮类化合物的含量呈显著的正相关。
2.2 花色素苷类
水果色泽鲜艳, 果实色泽是决定果实商品价值的重要质量指标之一, 果实成色是因为它含有丰富的色素类物质, 例如原花青素、花色素等, 花色素苷是花色素的衍生物[16]。最新的大量研究证明, 花色素苷也有较强的抗氧化及清除自由基的功能, 并有抑制癌细胞增值和诱导癌细胞凋亡、预防DNA断裂和刺激细胞分化、抗菌消炎等多种生理功能[17,18]。屈景年等[19]的研究发现脂溶性花色素能够很好地抑制猪油自动氧化, 抗氧化效果较好。浆果中的蓝莓花色苷含量丰富, 抗氧化性极强, 被列为抗癌食品首选, 其中所含的花色苷还有促进视红素再合成, 抗溃疡, 抗炎症, 改善循环等多种药理活性[20]。
2.3 类胡萝卜素
类胡萝卜素是一类主要的植物色素, 已分离鉴定出天然存在的类胡萝卜素化合物有600多种, 类胡萝卜素不仅赋予水果红、橙、黄等不同的色泽, 而且是很强的抗氧化剂, 具有清除自由基、延缓衰老等作用。黄红英等[21]发现2种类胡萝卜素, 黄体素和β-胡萝卜素在离体条件下均具有清除自由基的能力, 其中黄体素清除能力较强;戚向阳等[22]的研究亦表明类胡萝卜素具有清除羟基自由基的作用。同时, 流行病学和药理实验均肯定α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素等类胡萝卜素具有抗癌作用, 其中, β-胡萝卜素对一些癌症和癌前病变如口腔粘膜白斑病, 鼻咽癌等有比较好的治疗效果。补充β-胡萝卜素可以降低癌症发病率[23]。此外, 类胡萝卜素尤其是β-胡萝卜素也是营养物质维生素A的合成前体[24], 其经人体摄入后, 可以转化成维生素A, 这种方式被认为是目前最安全的补充维生素A的方式。
2.4 维生素
维生素是人和动物生长所必需的一种含量较少的有机化合物, 对机体的新陈代谢、生长、发育以及健康起到非常重要的作用。水果中含有的维生素主要以维生素C、维生素B为主, 少数水果中还含有维生素A、维生素E。维生素C具有清除自由基、抗氧化、防癌、抗癌的作用[25]。维生素B对调节新陈代谢, 维持皮肤、肌肉的健康, 增进免疫系统和神经系统的功能, 促进细胞生长分裂等具有重要作用[26]。维生素A在维持正常视觉功能上发挥着重要作用, 同时对预防感染性疾病和防止衰老也有一定的作用[27]。维生素E是一种极好的天然抗氧化剂, 既可以防止不饱和脂肪酸的氧化, 保护DNA和染色体不受破坏, 还可以提高动物的免疫功能[28]。
3 抗氧化评价方法
(1) 碘量法:主要测定过氧化物含量的变化[29]。该方法能够较准确指示氧化诱导期的终点。但是由于实验需要用大量有毒和有刺激性有机溶剂, 操作步骤烦琐, 并且有不利于结果的副反应发生, 所以该法不能客观评价果蔬的抗氧化活性。
(2) 硫酸亚铁法:利用过氧化物把二价铁离子氧化成三价铁离子。三价的铁离子和硫氰酸根形成的络合物在540 nm处有强吸收[30,31,32]。
(3) 增重法:利用底物吸氧后形成过氧化物增重的原理来测定其抗氧化作用。该方法简单易行, 费用较低, 但其反应条件是只适用于常温下的反应。
(4) 氧压法:根据反应过程中氧压与时间的关系来指示氧化诱导期的终点。但是此方法也只适用于常温条件下的反应, 因为在高温下, 部分分解产物所形成的气体会对氧压产生干扰。
(5) 硫代巴比妥酸反应物法 (TBARS) :通过测定反应生成的丙二醛来衡量果蔬抗氧化活性的大小[29]。类似硫代巴比妥酸反应物法[33,34,35,36]的方法还有茄茴香胺反应物法, 它能够测定出油脂自动氧化反应所生成的所有的醛的缩合反应在350nm处的吸收。
(6) 化学荧光法:通过过氧化物反应过程中发出的荧光来测定其抗氧化活性的。它最大的优点就是灵敏度较高。
(7) 克雷斯实验法 (kreis test) :用间三苯酚和脂类败产物的环氧醛的颜色反应, 用罗维朋比色。此反应对丙二醛也有反应。
(8) 气相色谱顶空法:根据油脂在氧化酸败的过程中有正己烷和正己醛的产生, 通过气相色谱法来测定某一小分子的变化, 从而确定氧化诱导期终点[37]。此方法较准确, 有较好的重复性。但是该方法只适用于常温下的反应。
(9) 分光光度法:基本原理是通过反应溶液颜色的变化间接测定羟基的量[38]。而据反应液中显色物质的不同又可分为两类:比色法和氧化显色剂法[39]。分光光度法仪器简单, 操作简便快速, 因此应用广泛, 可以作为筛选羟自由基清除剂的简单方法。
(10) 电子自旋捕捉法:灵敏度高, 检测限低, 可信度高, 是目前测定羟基自由基较理想的方法[40]。该法的主要研究对象是含有未成对电子的自由基与过渡金属离子及其化合物, 是利用捕捉剂与短寿命自由基结合生成相对稳定的自由基, 即自旋加合物, 用色谱技术对产物再进行分离, 然后用ESR测定。然而, 自旋加合物的寿命仍然很短, 只有几分钟或者十几分钟, 因此必须在捕捉后立即进行ESR测定, 所以限制了很多的实验研究。
4 结语
抗氧化成分 篇4
1 黄秋葵的化学成分
1) 实验材料与设备。采摘黄秋葵花、叶与种子, 洗净干燥、粉碎以备实验使用;选择美国瓦里安公司提供的Varian CP3800/1200L气象色谱-串联质谱联用仪, 色谱柱为HP-5, 30m×0.25mm, 0.25μm, 弹性石英毛细管柱。
2) 实验方法。利用固相微萃取技术, 提取黄秋葵花、叶与种子的挥发油, 借助气相色谱-质谱联用技术分离鉴定挥发油的化学成分, 同时测定挥发油化学成分含量。
在15m L顶空瓶内放置3g样品, 老化萃取头, 并将其插入在样品瓶顶空部分, 在50℃吸附30min, 此后取出萃取头, 并插入气相色谱样口, 在250℃解吸3min, 与此同时, 启动仪器, 对相关数据进行采集。
色谱柱为DB-WAX, 30m×0.25mm, 0.25μm, 弹性石英毛细管柱, 初始温度为40℃, 持续3min, 并以6℃/min的速度升温, 直至80℃, 再以106℃/min的速度升温, 直至230℃, 保持10min;进样口温度保持在250℃, 在其流速为0.8m L/min。
质谱条件为电离能量为70e V、离子源温度为200℃、传输线温度为250℃, 检测器电压为350V。
1.3实验结果
黄秋葵化中提取的挥发油成分共64种, 所占比重较高的有:15.01%丙烯酸丁酯、11.12%十二烷四烯、3.15%壬酸、2.98%丁酸丁酯;叶中提取的挥发油成分共62种, 其中所占比重较高的有:10.87%丙烯酸丁酯、4.56%苯甲醛、3.45%2-己烯荃、2.67%乙醛;种子中提取的挥发油成分共52种, 其中所占比重较高的有:22.76%2-甲基-丁酸-2-甲基丁酯、11.5%丙烯酸丁酯、4.56%乙酸乙酯、4.12%乙酸钾酯。根据上述数据可知, 黄秋葵不同部位提取的挥发油成分主要有19种, 分别为乙醇、乙酸丁酯、丙烯酸丁酯、十二烷四烯与壬酸等, 萜烯类化合物所占比重最高, 其中约37%为倍半萜类化合物, 而在叶中占13.5%、花中占22.5%、种子中占1.0%。
2 黄秋葵的抗氧化活性
近几年, 世界各国学者均十分关注蔬菜、水果的抗氧化活性研究, 主要是由于抗氧化物质具有显著的药理作用, 可用于预防与延缓癌症、痴呆、衰老与动脉粥样硬化等疾病。水果、蔬菜中的维生素与多酚类物质较为丰富, 特别是类黄酮类物质。当前, 我国学者纷纷对黄秋葵中天然抗氧化物质展开了研究, 其中研究焦点主要为黄酮类与多酚类物质化合物。根据相关研究报道显示[1], 黄秋葵的花、叶与果实中均含有丰富的黄酮类化合物与酚类化合物。本文比较了黄秋葵不同部位的抗氧化活性, 具体内容如下。
1) 实验材料、试剂与设备。采摘黄秋葵花、叶与种子, 洗净干燥、粉碎以备使用;选择Fe3+三呲啶三吖嗪, 铁氰化钾、三氧化铁、三氯乙酸、三氯化铁、无水乙醇、磷酸盐缓冲液等。选择瑞士Tecan提供的Infinite M 200酶标仪, UV-2102 PCS紫外可见光光度计、酶标板、挥发油提取器、粉碎机、恒温鼓风干燥箱、蒸发仪、超声波清洗器及电子天平。
2) 实验方法。采收样品, 在6月下旬至8月为黄秋葵的开花、结果与盛果期, 此阶段为样品采集期, 不同月份编号各异, 将不同批次的花、叶与果实进行自然阴干、粉碎, 以此对不同时期黄秋葵不同部位的抗氧化能力进行比较。
提取挥发油, 根据中国药典中的提取标准与要求, 借助水蒸气蒸馏法, 取黄秋葵花、叶与种, 各60g、400g、200g, 提取5h后, 用乙醚对其进行萃取, 并将挥发油样品收集在瓶内, 密封保存, 放置在-4℃的冰箱内。
制备样品溶液, 称取黄秋葵花、叶与种干燥粉末各1.0g, 分别用甲醇进行超声提取, 每种样品20min/次, 共3次, 合并滤液, 放置在蒸发仪上蒸干, 用蒸馏水溶解后放置在25m L容量瓶内, 定容。同时, 取挥发油200μL, 用无水乙醇稀释, 定容至10m L。
测定黄秋葵的抗氧化能力利用FRAP方法, 取FRAP200μL、提取液50μL, 反应10min后, 测吸光值, 计算样品的抗氧化活性, 前者数值越大, 抗氧化活性越强。
3) 实验结果。黄秋葵不同部位甲醇提取物的抗氧化能力有所不同, 其中最强的为花, 其次为叶与种子, 三者IC50的大小关系为:花>叶>种子法, 分别为44.50mg Trolox/g DM、35.78mg Trolox/g DM、19.32mg Trolox/g DM。
3 实验讨论
本实验采用了固相微萃取方法, 此方法属于非溶剂萃取法, 其在挥发性成分研究领域扮演着重要的角色。固相微萃取方法作为新型的样品预处理技术, 其优点为萃取简便, 并且具有较高的灵敏度, 因此, 它满足了易于挥发成分的分析需求。固相微萃取法主要是借助吸附、脱附技术与相关分析仪器实现的, 前者主要是对样品中的挥发性与半挥发性成分进行富集, 后者主要对富集有机物展开分析与测定。在实验中, 借助固相微萃取法的石英纤维表面的固定相充分发挥了其吸附作用, 从而实现了试样基质中组分的有效萃取, 在试样前处理结束后, 利用进样口的高温解析吸附组分, 并且对其展开了定性定量分析。与传统方法相比, 如:液-液萃取、蒸馏、与层析等, 固相微萃取方法操作简便、用时较短、用量较小、无需萃取溶剂等优点均十分显著, 将此方法应用于黄秋葵化学成分分析, 保证了分析的速率, 同时增强了分析的灵敏度[2]。
黄秋葵挥发油的化学成分含量最高的为萜烯类化合物, 此类物质作为天然化合物, 具有较强的生理活性, 其药理作用主要为杀菌、消炎、镇痛、解热与调节免疫力等。同时, 根据相关文献报道可知[3], 倍半萜烯类化合物还拥有抗病毒、抗过敏与抗癌症等功效。黄秋葵不同部位的抗氧化活性各异, 其强弱顺序分别为花、叶、种子。根据相关报道显示[4], 黄秋葵的抗氧化活性与其所含有的黄酮与酚酸含量有关, 同时, 黄酮类物质具有抗肿瘤、抗衰老、降血脂、抗炎、抗病毒等作用。
4 结论
综上所述, 黄秋葵作为保健蔬菜, 其相关性研究得到了各国学者的广泛关注, 为了促进黄秋葵的综合开发与利用, 本文以其花、叶与种子为研究对象, 重点分析了化学成分与抗氧化活性, 通过分析明确了黄秋葵具有多重功效, 如消炎、镇痛、调节免疫力、抗病毒等, 其用药价值显著。
摘要：本文以黄秋葵的花、叶与种子为研究对象, 研究了其化学成分与抗氧化活性, 主要采用固相微萃取法、气相色谱联合质谱法测定了黄秋葵不同部位的化学成分含量, 其结果为黄秋葵不同部位挥发油中萜烯类化合物所占比重最高, 其中约37%为倍半萜类化合物;黄秋葵花的抗氧化能力最强, 其次为叶与种子, 三者IC50的大小关系为:花>叶>种子, 此结果表明, 黄秋葵不同部位的抗氧化活性与挥发油浓度呈正比例相关。
关键词：黄秋葵,化学成分,抗氧化活性
参考文献
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[3]南志奇.箭叶秋葵营养成分分析及摘除花蕾对产量的影响[D].重庆:西南大学, 2011:16-18.
抗氧化成分 篇5
目前有研究表明甘蔗叶含有黄酮类、多糖类、多酚类、苷类、过氧化物酶类等抗氧化成分, 具有抗菌、降血糖、抗肿瘤、抗神经炎症等药理作用, 是人体外源性抗氧化物质的重要来源[7,8,9], 因此其提取物的抗氧化研究日益受到关注, 并获得了许多成果。本文就甘蔗叶提取物抗氧化活性成分进行简要概述, 以期为甘蔗叶资源的充分利用及其提取物的抗氧化活性成分研究提供依据。
1 甘蔗叶提取物抗氧化成分及其药理作用
目前植物抗氧化研究大多集中于来源丰富且价格低廉的植物资源中, 甘蔗叶是其中的一种典型代表。为了充分挖掘甘蔗叶的抗氧化作用, 我们需要先了解甘蔗叶抗氧化成分的研究现状。目前, 甘蔗叶中的抗氧化活性成分研究集中在黄酮类、多糖类、多酚类化合物和其他类化合物, 具有抗肿瘤、抗菌、抗炎, 降血糖等药理作用。
1.1 黄酮类成分及药理作用
黄酮类 (flavonoids) 化合物多以2-苯色原酮为基本母核, 即2个苯环 (A-与B-环) 通过中央三碳链 (C环) 相互连接而成的一系列衍生物, 用C6-C3-C6表示。其主要可以分为:黄酮类 (flavone) 、黄酮醇类 (flavonol) 、二氢黄酮 (flavanone) 、异黄酮 (isoflavone) 、查耳酮 (chalcone) 、花色素 (anthocyanidin) 等[10,11]。黄酮类化合物的结构不同, 生物活性也有所差异。相关研究表明, 黄酮类化合物关键的药效基团是α, β不饱和吡喃酮, 而C7位羟基糖苷化和C-2-C-3位双键氢化会使其生物活性降低, 而A、B、C三环的各种取代基决定其不同的生物活性[12,13]。黄酮类化合物是甘蔗叶中一类重要且抗氧化活性最强的一种成分[7,14,15]。阎欲晓等[16]对甘蔗叶黄酮粗提物进行实验研究证明, 甘蔗叶黄酮对羟自由基、超氧自由基和亚硝酸根都具有清除能力。吴建中等[7]研究表明甘蔗叶中的黄酮物质主要为花青素、花黄素, 它们都含有C6-C3-C6的碳骨架, 在4位碳都连接一个羰基, 在苯环上都具有两个以上的羟基。这类黄酮类化合物可引入供电子基团, 具有清除自由基作用, 可阻止自由基链式反应、抑制脂质过氧化。冯纪南等[17]研究了甘蔗叶中黄酮类化合物的提取工艺, 分别考察了乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液比等提取因素对黄酮化合物提取率的影响, 但并未进一步深入阐明甘蔗叶中黄酮类化合物的具体种类或成分。侯小涛等[18]在炎症渗出和肿胀模型的实验中, 发现甘蔗叶总黄酮能显著抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀并明显降低醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高, 即说明甘蔗叶总黄酮成分具有抗炎作用, 但并未对其总黄酮的具体单体成分及其抗氧化活性机理进行阐述。截至目前, 现有研究多应用甘蔗叶总黄酮提取物进行体内外实验, 对于总黄酮中具体单体成分及其抗氧化活性的研究还不够深入, 这也是今后甘蔗叶抗氧化活性成分的研究方向。
1.2 多糖类成分及其药理作用
多糖 (polysaccharides) 又称多聚糖, 是一种由10个以上单糖聚合而成的高聚合物, 广泛存在于各种植物中。与蛋白质和核酸一样, 多糖也是维持生命活动的重要生物大分子[19,20]。多糖的结构有4级概念:1级结构主要指糖基的组成、排列顺序、相邻糖基的连接方式、构型与分支情况;2级结构主要指多糖骨架的氢键结合的聚合体;3级结构包括多糖1级结构的重复顺序;4级结构包括多聚链间非共价链结合形成的聚合体[21]。活性多糖具有一定的相对分子质量范围, 相关研究表明, 多糖相对分子质量过高或过低都会影响其活性。相对分子质量过高的多糖不利于其跨越细胞膜进入生物体内发挥生物活性;相对分子过低容易影响渗透压, 也不利于其发挥生物活性[21]。甘蔗叶多糖是甘蔗叶中主要功能成分之一。江恒等[22]对甘蔗叶多糖进行提取分离并对其多糖结构进行初步分析, 表明甘蔗叶多糖成分主要为多糖, 同时显示了一定的抗肿瘤活性。近年来, 植物多糖的抗氧化作用也得到了广泛认可[23,24]。桂意云等[25]进一步通过水提醇沉的方法提取甘蔗叶多糖, 并对其进行了对OH·清除作用、对OH·致DNA损伤的抑制作用进行实验, 发现甘蔗叶多糖对OH·清除率较高, 对OH·致DNA损伤有明显的保护作用。江恒等[26]用热水浸提法、酶水解法、H2O2法除色素和DEAE-纤维素层析柱法相结合提纯甘蔗叶多糖, 进一步应用MTT法分析甘蔗叶多糖对人鼻咽癌细胞株CNE2生长的抑制作用, 表明甘蔗叶多糖具有一定的抗肿瘤活性。胡珊等[27]进一步发现甘蔗叶多糖可降低心肌梗死大鼠血清中cTnI含量和促进VEGF的表达及微血管的生成, 促进侧枝循环的建立, 对心肌细胞有一定保护作用。侯小涛等[28]进一步研究了甘蔗叶多糖颗粒剂具有一定的抑制血糖升高的作用。这些研究给我们筛选天然抗氧化剂提供了一定的依据。但截至目前, 甘蔗叶多糖的具体种类与结构尚不清楚, 需要进一步研究分析。
1.3 多酚类成分及其药理作用
植物多酚类化合物 (polyphenolic substance) 是多羟基类化合物, 又称鞣质、单宁, 广泛存在于植物体内 (果实、皮、根和叶中) 。甘蔗叶含有的多酚化合物大多在酶的作用下从肉桂酸和黄酮类的前身衍生而来, 其结构包含一个独特的共振电子体系, 对pH特别敏感, 多由一个或多个苯环与一个或多个羟基链合而成, 其苯环上的羟基极易失去氢电子, 所以多酚类化合物作为良好的电子供体通过中断氧化反应以起到抗氧化作用[29,30]。相关研究表明甘蔗叶中含丰富的植物多酚, Saska等[31]研究发现分子量≥5 000的高分子多酚类物质在蔗叶中占33%。扶雄等[32]对甘蔗中抗氧化活性成分做了进一步研究, 发现甘蔗提取物的扰氧化活性与其色值呈正相关, 而其中高氧化性的多酚类是甘蔗颜色的主要组成成分。阎欲晓等[33]研究甘蔗叶多酚化合物提取液对羟自由基 (OH·) 、超氧阴离子自由基 (O2-·) 有较好的清除作用。目前对于植物多酚的研究表明, 其一般具有抗肿瘤、抗氧化、抗动脉硬化、防治冠心病与中风等心脑血管疾病以及抗菌等多种生理功能[34], 甘蔗叶中的芹菜素、芸香甙、异橙皮成、麦黄酮、苯甲酸衍生物、肉桂酸衍生物等都属于多酚类衍生物。但是目前对于甘蔗叶中多酚类其他抗氧化成分及其抗氧化机理研究仍较少, 有待进一步深入研究。
1.4 其他类成分及其药理作用
除了以上黄酮类、多糖类、多酚类抗氧化活性成分, 甘蔗叶提取物中还有一些其他类型的抗氧化活性成分, 如皂苷类、有机酸类、氧化酶类等[22,33,35]。但是单一成分及其相应的药理作用研究较少。大多对其总提取物的提取工艺及其药理作用进行研究。如侯小涛等[35]在研究中发现甘蔗叶可能有减缓肝糖原分解、肌糖原酵解、阻碍糖异生的作用, 对糖尿病有抑制作用。邓家刚等[36]在实验中发现甘蔗叶水提物对四氧嘧啶引起的血糖升高有一定的缓解作用。侯小涛等[37]对甘蔗叶不同溶剂提取物进行体外抗菌实验, 发现甘蔗叶提取物对除链球菌以外的6种人体常见致病菌均有抑制作用, 且甘蔗叶醇提物的抑菌效果最为明显。邓家刚等[38]通过MTT法与集落形成法发现甘蔗叶醇提物对胃癌细胞株SGC7901、宫颈癌细胞株Hela、肝癌细胞株BEL7404有明显抑制作用, 且乙酸乙酯部位为主要活性部位。因此对于甘蔗叶中的其他抗氧化成分的研究有待进一步深入。查阅近年文献发现, 对甘蔗叶的药理作用研究主要集中于抗肿瘤、抗菌、抗炎, 降血糖等作用, 而对于提取物中其他活性成分及其药理作用和作用机理不甚了解, 这也是以后甘蔗叶药理作用的研究方向。
2 展望
我国目前对甘蔗叶提取物抗氧化活性成分的研究大部分还停留在未纯化或部分纯化的萃取物上, 如醇提取物、乙酸乙酯提取物、水提取物等。而对其所起作用的单体化合物以及对应的母核结构的研究并不深入, 如多糖类化合物的结构和多酚类化合物的结构;对其与抗氧化活性及稳定性关系、抗氧化机理、多组分协同作用等关系研究也并不透彻, 以上这些方向也是我们今后的研究重点, 同时也能为发现有效的先导化合物提供一定的实验基础, 为抗氧化新药开发作出贡献。
另外, 查阅近年的文献发现目前大多数抗氧化研究均采用体外实验, 整体或体内实验资料较少, 难以系统全面地了解甘蔗叶提取物的抗氧化机理。如何建立一套快速、有效的体内动物模型来探讨抗氧化作用机理也是今后研究的方向。最后对于甘蔗叶提取物的抗氧化机理, 目前研究大多数都停留在推测, 可能与哪些自由基、哪些酶、哪些金属离子有关, 这使得我们在分子水平上去研究中药提取物的抗氧化机理受到较大限制, 以上方面都有待我们进一步研究探讨。
摘要：自由基对机体的氧化损伤会引起一系列疾病, 如血管粥样硬化、高血压、糖尿病、肿瘤、老年痴呆症等。为了治疗这些疾病, 寻找资源丰富、高效、廉价、低毒的天然抗氧化剂成为趋势。甘蔗叶是一种资源丰富且价格低廉的植物, 该植物中的许多成分是人体外源性抗氧化物质的重要来源。就甘蔗叶提取物中黄酮类、多糖类、多酚类及其他类抗氧化成分和药理作用进行综述, 为甘蔗叶提取物的抗氧化活性成分研究提供参考。
抗氧化成分 篇6
关键词：短果茴芹,提取物,抗氧化,O.-2清除率,.OH清除率,H2O2损伤
短果茴芹[Pimpinella brachycarpa (Komar) Nakai]又名大叶芹、山芹菜、假茴芹, 为伞形科 (Umbelliferae) 多年生草本植物, 主要分布在我国的东北部和俄罗斯远东地区[1]。短果茴芹为吉林省Ⅲ级重点保护植物[2], 是东北地区大宗出口山野菜, 在国际市场深受欢迎[3]。研究认为短果茴芹可入药, 具有活血降压、清热解毒、利湿、止痛等功效[4]。目前, 短果茴芹的保健作用研究仅见菜籽精油化学组成分析和全草的营养成分分析[5,6,7], 而其具体的保健作用机制及其活性成分研究未见报道, 本文主要对短果茴芹抗氧化活性成分进行提取并对提取物的抗氧化能力进行考察, 为短果茴芹山野菜资源开发及保健食品研发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
短果茴芹为吉林省长白山区野生山野菜, 阴干后粉碎成粉末 (40～60目) 备用。
1.2 仪器和试剂
全自动酶标仪 (RT-6000) 、分析天平 (1/10 000, HZK 210) 、8道微量移液器 (Finnpipette) 、粉粹机 (F2102) 、电热恒温水浴锅 (HH-8) 、旋转蒸发仪 (RE-52A) 、CO2培养箱;二甲亚砜 (DMSO) 、噻唑蓝 (MTT) 为美国Sigma产品, PRM 1640为GIBCO产品, 小牛血清为杭州四季青, 其他试剂均为国产分析纯。人肝癌细胞株BEL-7404购自中科院上海细胞库。
1.3 抗氧化活性成分提取
将短果茴芹按m ∶V=1 ∶7的比例加入90%乙醇回流提取3次, 每次2 h, 将提取液合并浓缩, 得浸膏。向浸膏中加入蒸馏水混悬, 按1 ∶1的体积比加入石油醚萃取3次, 回收石油醚, 获得石油醚层提取物;按1 ∶1的体积比加入乙酸乙酯萃取3次, 回收乙酸乙酯, 获得乙酸乙酯层提取物:按1 ∶1体积比加入水饱和正丁醇萃取3次, 回收正丁醇, 获得正丁醇层提取物;减压回收水溶液, 得水层提取物。将各提取物干燥, 研成粉末备用。
1.4 具有O清除能力的活性成分筛选
参考文献[8]的方法, 采用邻苯三酚自氧化体系产生Oundefined, 对4种提取物清除Oundefined的能力进行观察。以0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液 (pH=8.2) 、去离子水和10 mmol/L邻苯三酚组成自氧化体系, 受试物组以不同浓度受试物代替去离子水, 25 ℃反应20 min, 测定不同受试物在405 nm处的吸光度值, 计算抑制率。抑制率 (%) =k0-k1/k0×100%, k0为自氧化体系吸光度值, k1为去除了本底值的受试物吸光度值。
1.5 具有清除·OH能力的活性成分筛选
参考文献[9]的方法, 采用Fenton反应体系产生·OH, 了解4种提取物清除·OH能力。以6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L水杨酸、6 mmol/LH2O2和去离子水为自氧化体系, 受试物组加入不同浓度受试物代替去离子水, 测量520 nm处的吸光度值, 计数抑制率。抑制率 (%) =k0-k1/k0×100%, k0为自氧化体系吸光度值, k1为去除了本底值的受试物吸光度值。
1.6受试物体外抗H2O2氧化损伤的能力
参考文献[10]的方法, 采用50 mmol/L H2O2诱导的氧化损伤模型, 观察提取物对人肝癌细胞BEL-7404氧化损伤的保护效果。BEL-7404以3×105/ml接种于96孔版, 受试物处理23 h后, 加入1 mmol/L H2O2处理1 h, 去上清, 每孔加入MTT (0.2 mg/ml) 共同孵育4 h, 去上清, 每孔加入150 μl DMSO, 测定492 nm处的吸光度值。
2 结果
2.1 具有O清除能力的活性成分筛选undefinedundefined
邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化, 生成有色中间产物和O-·2;该有色中间产物的含量可以反映O-·2的含量。本实验通过测定各提取物对反应体系有色物质的含量的影响了解清除O-·2的能力, 结果见图1。
由图1可以看出, 石油醚层提取物、乙酸乙酯层提取物、正丁醇层提取物对反应体系中的Oundefined均有清除作用, 且与剂量呈正相关。其中石油醚层提取物、乙酸乙酯层提取物作用最强, 在0.675 mg/ml浓度时, 其作用与同浓度维生素C相似;正丁醇层提取物在>0.375 mg/ml浓度时才有清除Oundefined的作用;水层提取物只有微弱的Oundefined清除能力。
2.2 具有·OH清除能力的活性成分筛选
在Feton体系中H2O2+Fe2+※H2O+·OH+Fe3+, 水杨酸捕捉·OH后产生有色物质, 该有色物质的含量可以反映·OH的含量。本实验通过测定各提取物对反应体系有色物质的含量的影响, 了解·OH清除能力, 结果见图2
由图2可以看出, 石油醚层、乙酸乙酯层和水层提取物均具有较强的·OH清除作用, 且与剂量呈正相关。正丁醇层提取物在>0.375 mg/ml 浓度时才有清除·OH作用, 4种提取物清除·OH的能力, 均强于同等浓度的甘露醇。
2.3 提取物对H2O2诱导的氧化损伤的保护作用
H2O2是一种强氧化剂, 可造成机体的氧化损伤, 为探讨H2O2对人肝癌细胞BEL-7404所致氧化损伤的合适浓度和作用时间, 我们首先对H2O2的浓度进行了筛选, 结果发现50和100mmol/LH2O2作用1h能使人肝癌细胞BEL-7404的增殖分别抑制48%和57%, 见图3。因此, 选择50mmol/LH2O2为氧化损伤剂量各提取物对H2O2诱导的氧化损伤的保护效果见图4。
由图4可以看出, 50 mmol/L的H2O2可以明显导致人肝癌细胞BEL-7404氧化损伤;4种提取物中除石油醚层提取物外在浓度0.25～2 mg/ml时, 皆有促进人肝癌细胞BEL-7404增殖的作用, 且与剂量呈正相关, 尤其乙酸乙酯层和正丁醇层提取物作用明显;而石油醚层提取物剂量依赖地抑制人肝癌细胞BEL-7404增殖。除石油醚层提取物外, 其他几种提取物都具有保护H2O2诱导的人肝癌细胞BEL-7404氧化损伤的作用, 并与剂量呈正相关, 其中乙酸乙酯层提取物作用最明显, 而水层提取物作用最弱。
3 讨论
自由基是一类上层轨道含有未配对电子的原子团或特殊状态的分子, 其中与人体关系最为密切的是氧自由基, 其中以Oundefined形成最早, ·OH作用最强。自由基可引起脂质的过氧化和DNA损伤, 导致细胞膜和体内酶系统的损伤, 从而引起一系列的病理改变[11]。现已证明自由基的氧化损伤与心脑血管疾病、癌症、肿瘤、糖尿病、衰老等密切相关[9], 因此, 从天然植物中提取抗氧化成分的研究已经成为当前的热点[12]。
本实验研究发现, 所获得的4种提取物均具有抗氧化作用, 其中石油醚层和乙酸乙酯层提取物具有最强的Oundefined和·OH清除作用, 正丁醇层提取物具有较强的O-·2和较弱·OH清除作用, 水层提取物只具有较强的·OH清除作用。石油醚层和乙酸乙酯层提取物对Oundefined的清除能力与维生素C相似, 4种提取物对·OH的清除能力尤于甘露醇。除石油醚层提取物外, 其他3种提取物都具有保护H2O2诱导的人肝癌细胞BEL-7404氧化损伤的作用, 并有剂量依赖性, 其中乙酸乙酯层提取物保护作用最明显, 而水层提取物作用最弱。这可能与乙酸乙酯层提取物既具有较强的Oundefined清除能力, 又具有较强的·OH清除作用有关, 而水层提取物质只具有较强的·OH清除作用。以上结果表明, 短果茴芹含有抗氧化活性成分, 具有较好的抗氧化和保护细胞免受氧化损伤的能力, 具有进一步开发的价值。另外, 石油醚层提取物除具有良好的抗氧化作用外, 还具有抗肿瘤的效果。其研究结果有助于短果茴芹资源的深入研发, 但是4种提取物中抗氧化成分的分离、鉴定及抗氧化机制仍需进一步探讨。
参考文献
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抗氧化成分 篇7
1 材料
1.1 主要药物与试剂
野生铃兰,采自吉林农业科技学院左家校区后山。
DPPH·,TCI公司生产;95%乙醇、双氧水、邻苯三酚,均购自天津市致远化学试剂有限公司;水杨酸,购自北京化工厂;硫酸亚铁,购自天津市永大化学试剂有限公司;盐酸,购自沈阳市新化试剂厂;三羟甲基氨基甲烷(Tris),购自天津市大茂化学试剂厂。
1.2 主要仪器
紫外分光光度计(型号为UV-2450),购自日本岛津公司;电子分析天平、p H值计,均购自梅特勒-托利多仪器上海有限公司。
2 方法
2.1 野生铃兰抗氧化物质的提取
野生铃兰抗氧化物质的提取工艺详见参考文献[5]。准确称取铃兰的提取物1.000 0 g,溶于一定量的95%乙醇中,然后定容至100.0 m L。分别移取上述溶液1.00 m L、2.00 m L、3.00 m L、4.00 m L、5.00 m L、6.00 m L、7.00 m L、8.00 m L、9.00 m L、10.00 m L于50.0 m L容量瓶中定容,待测。
2.2 DPPH·清除率的测定
0.1 mmol/L DPPH·-乙醇溶液的配制:准确称取DPPH·0.003 95 g,用95%的乙醇溶液溶解并定容于100 m L的容量瓶中。将1.5 m L样品液添加到1.5 m L含0.1 mmol/L DPPH·的95%乙醇溶液中,混合震荡,在室温下放置5 min,然后在波长517 nm处检测(A1)值[5]。清除率(S)计算公式:S(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%,其中A1、A2和A3分别为样品管、对照管及空白管测定的吸光度值。
2.3·OH清除率的测定[6]
在试管中依次加9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液0.5 m L、不同浓度的待测样品1.0 m L、9 mmol/L FeSO4溶液(现配)0.5 m L,0.01 mol/L H2SO4溶液2 m L,最后加入9 mmol/L H2O2溶液0.5 m L,启动芬顿(Fenton)反应,摇匀后在37℃的恒温水浴锅中加热30 min,在波长510 nm处测定吸光值A1。每个样品重复3次,取平均值。另取2支试管,分别做空白(A2)和样品对照(A0)。各待测样品对·OH清除率的计算公式为,S(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%,其中A1为加入9 mmol/L Fe SO4溶液测得的吸光值;A2为以0.5 m L纯化水代替9 mmol/L Fe SO4溶液测得的吸光值;A0为1.0 m L 60%乙醇-水溶液代替待测样品测得的吸光值。
2.4 超氧阴离子清除率的测定[7]
邻苯三酚自氧化速率(V对照):对照组和空白对照组加入纯化水4 m L和0.1 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(p H值为8.2)4.5 m L,25℃水浴20 min后,样品组加入0.2 m L(或0.3 m L)3 mmol/L邻苯三酚溶液,空白组以相同体积纯化水代替,震匀后马上在320 nm处测定吸光值。迅速混匀并开始计时,每隔30 s读取吸光值,4 min后结束,以空白对照组调零。做吸光度随时间变化的回归方程,其斜率为邻苯三酚自氧化速率V对照(V对照应在0.050~0.065 A/min之间,否则应调整邻苯三酚加入量)。
样品自氧化速率(V样品):样品组和空白组均加入一定浓度的样品溶液4 m L,0.1 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(p H值为8.2)4.5 m L,25℃水浴20 min后样品组加入0.2 m L(或0.3 m L)3 mmol/L邻苯三酚溶液,空白组以相同体积纯化水代替,震匀后马上在320 nm处测定吸光值。迅速混匀并开始计时,每隔30 s读取吸光值,4 min后结束,以空白管调零。做吸光度随时间变化的回归方程,其斜率为邻苯三酚自氧化速率V样品,抑制率计算式为,S(%)=(V对照-V样品)/V对照×100%,其中V对照为对照组邻苯三酚自氧化速率;V样品为样品组邻苯三酚自氧化速率。
3 结果与分析
3.1 铃兰提取物对DPPH·的清除作用
见图1。
从图1可见:随提取物浓度的增加,其清除能力增强,当浓度达到7 mg/m L时,清除率与维生素C接近。说明铃兰提取物是一种较好的DPPH·清除剂。
3.2 铃兰提取物对·OH的清除作用
见图2。
从图2可见:铃兰对·OH的清除率很小,但是也是存在的,并且同样是随着提取物浓度的增大而逐渐上升。在提取物浓度达到8 mg/m L时清除率与维生素C相当,为74.9%。说明铃兰提取物对于·OH具有良好的清除能力。
3.3 铃兰提取物对超氧阴离子的清除作用
见图3。
由图3可见:铃兰对超氧阴离子的清除能力随着铃兰提取物的浓度的增大而不断增大,以维生素C作对比可以看出,维生素C的抗氧化能力较铃兰要强。在320 nm下浓度为4 mg/m L时铃兰提取物的还原力几乎和维生素C相同,相关系数水平达到0.998 5。说明铃兰提取物对超氧阴离子有较好的清除作用。
4 讨论
本试验结果表明:铃兰提取物其对DPPH·、·OH和超氧阴离子具有明显的清除及抑制作用。在试验过程中对铃兰提取物的抗氧化性能与维生素C进行对比发现,铃兰提取物的抗氧化能力随浓度的增加而增大,且在一定浓度后表现出与维生素C相近的抗氧化能力。说明铃兰提取物具有很好的抗氧化性。大量试验结果表明,氧自由基与冠心病、高脂血症、干细胞损伤有关。因此,铃兰提取物对上述疾病的治疗有一定意义;而铃兰提取物在防治心脑血管疾病、护肝等方面的作用有待进一步研究。
参考文献
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抗氧化成分 篇8
1 仪器与材料
1.1 仪器
FZ UV-2000型紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司);TP-114电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SG2200HPT超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)。
1.2 材料
二苯代苦味酰基自由基(DPPH,上海晶纯生化科技股份有限公司);2,2′-连氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS,上海晶纯生化科技股份有限公司);PG(propyl gallate,没食子酸丙酯)、BHA(Butylated hydroxyanisole,丁基羟基茴香醚)、BHT(Butylated hydroxytoluene,二丁基羟基甲苯)(上海晶纯生化科技股份有限公司)。95%乙醇、过二硫酸钾均为分析纯。
野草香于2013年10月采集于贵州省贵阳地区,经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为香薷属野草香(Elsholtzia cypriani(pam p.)C.Y.Wu et S.Chow)的全草。
2 试验方法
2.1 样品制备
野草香干燥全草25kg粉碎,用75%工业乙醇热回流提取3次,时间分别为3h、2h和1h,减压回收溶剂并合并浸膏,加适量水分散,依次用石油醚和乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯部位采用多种层析方法进行分离和纯化,通过理化数据测定、波谱分析等手段,分离鉴定了7个黄酮类单体化合物,分别为:5-羟基-7,8-二甲氧基黄酮(1)、木犀草素(2)、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷(4)、槲皮素(5)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷(6)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(7)。这7个黄酮化合物作为抗氧化活性测定的样品。
2.2 DPPH法测定抗氧化活性[8,9]
2.2.1 DPPH溶液制备准确称取0.005 9g DPPH,用体积分数为95%的乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中,DPPH浓度为0.06mmol/L,避光保存(0~4℃)。
2.2.2 测试方法
DPPH方法:取0.1mL供试样品溶液加入3.5mL DPPH自由基工作液,混合均匀,在室温下静置30min后,在515nm波长下检测DPPH吸光度值;同上,将0.15mL 95%乙醇溶液加入3.5mL DPPH自由基工作液,混匀后测其吸光度。每份样品平行操作3次,取平均值。同时设置阳性对照,通过如下公式计算得到样品消除自由基的能力:
消除率(%)=[(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100%
式中,Acontrol为DPPH本身在测定波长的吸收度,Asample为样品对DPPH作用后的吸收度数值(除去样品自身吸收)。用系列溶液的抑制率绘制曲线,由曲线读取DPPH自由基清除率为50%时各样品溶液浓度,计为IC50,以IC50值表示化合物清除DPPH自由基能力,IC50值越小,表示清除能力越强。
2.2.3 DPPH测定PG、BHA、BHT的抗氧化活性
测定PG(没食子酸丙酯)、BHA(丁基羟基茴香醚)、BHT(二丁基羟基甲苯)的抗氧化活性与测定野草香的步骤一样,同上操作。得到数据可以与野草香的数据形成对照。
2.3 ABTS法测定抗氧化活性
2.3.1 ABTS溶液的制备
准确称取0.192 3g ABTS,用体积分数为95%的乙醇溶解并定容于50mL容量瓶中,浓度为7.0mmol/L。再称取0.033 1g过硫酸钾用少量的蒸馏水溶解并用95%的乙醇定容,浓度为2.45mmol/L。然后将两容量瓶中的溶液混合后避光保存12h。
2.3.2 测试方法
ABTS方法:取0.15mL供试样品溶液加入2.85mL ABTS自由基工作液,混合均匀,10min后测定734nm处吸光度;同上,将0.15mL 95%乙醇溶液加入2.85mL ABTS自由基工作液混匀后测其吸光度。每份样品平行操作3次,取平均值。同时设置阳性对照,通过如下公式计算得到样品消除自由基的能力:
消除率(%)=[(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100%
式中,Acontrol为ABTS自由基本身在测定波长的吸收度,Asample为样品对ABTS自由基作用后的吸收度数值(除去样品自身吸收)。用系列溶液的抑制率绘制曲线,由曲线读取DPPH自由基清除率为50%时各样品溶液浓度,计为IC50,以IC50值表示化合物清除DPPH自由基能力,IC50值越小,表示清除能力越强。
2.3.3 ABTS测定PG、BHA、BHT的抗氧化活性
测定PG(没食子酸丙酯)、BHA(丁基羟基茴香醚)、BHT(二丁基羟基甲苯)的抗氧化活性与测定野草香的步骤一样,同“2.3.2”操作。得到数据可以与野草香的数据形成对照。
2.4 结果与分析
2.4.1 实验结果
(±s)
注:BHT、BHA、PG为阳性对照品;NT:未测定(初筛抑制率小于50%)。
2.4.2 结果分析
由表1可以看出,所测得的单体化合物中除化合物(1)和(4)外均有一定的清除DPPH和ABTS自由基的能力,初筛抑制率都达到90%以上。其中具有抗氧化活性的单体化合物除化合物(7)外,清除DPPH自由基的能力均强于阳性对照品BHT(IC50=(17.31±1.32)mg/L);所有样品清除DPPH自由基的能力均弱于阳性对照品BHA(IC50=(7.87±0.11)mg/L)和PG(IC50=(2.95±0.11)mg/L)。化合物(2)清除DPPH自由基的能力(IC50=(9.25±0.48)mg/L)最强,约为BHT作用的1.9倍。化合物(3)和(5)清除DPPH自由基的能力(IC50=(11.42±0.54)mg/L和IC50=(11.23±0.18)mg/L)相差无几,都约为BHT作用的1.5倍。化合物(6)清除DPPH自由基的能力(IC50=(14.87±1.07)mg/L)与BHT相当。所有单体化合物清除ABTS自由基的能力均弱于阳性对照品BHA(IC50=(2.40±0.11)mg/L)和阳性对照品PG(IC50=(1.00±0.03)mg/L);除化合物(3)和(5)外,其他具有抗氧化活性的单体化合物清除ABTS自由基的能力也弱于阳性对照品BHT(IC50=(4.48±0.35)mg/L);其中化合物(5)清除ABTS自由基的能力(IC50=(3.44±0.09)mg/L)约为BHT(IC50=(4.48±0.35)mg/L)作用的1.3倍。化合物(3)清除ABTS自由基的能力(IC50=(4.13±0.03)mg/L)约为BHT(IC50=(4.48±0.35)mg/L)作用的1.1倍。化合物(2)清除ABTS自由基的能力(IC50=(4.69±0.21)mg/L)与BHT相当。综合两种测试方法结果,化合物(2)和(5)的抗氧化能力较好。
化合物(2)和(5)分别为木犀草素和槲皮素,均为黄酮苷元,他们的清除自由基活性都强于相应的苷(3、6、7)。这两个化合物结构具有一定的相似性,在黄酮母核上具有多个羟基取代,化合物(2)有4个羟基,化合物(5)则有5个羟基,多个羟基的取代增加了化合物的抗氧化活性;当苷元与糖成苷后,羟基数目减少,相应的抗氧化活性也随之降低。此外,所有具有氧化活性的单体化合物在C环的3,4位都存在邻二酚羟基结构,而没有抗氧化活性的单体化合物(1)和(4)则没有此结构。因此,邻二酚羟基结构可能是该类化合物具有抗氧化活性的必须基团。
3 结语
本试验对黔产苗药野草香中分离得到的黄酮类化合物分别进行DPPH法和ABTS法抗氧化活性测定。DPPH法和ABTS法具有相对简单、测试效率高、能连续检测等优点,对水溶性和脂溶性化合物都适用,也适合野草香黄酮化合物的抗氧化活性测定。实验结果表明:除了化合物(1)、(4)在DPPH和ABTS法中未通过初筛外,其他化合物对DPPH和ABTS自由基均存在一定的消除能力,并且清除率在一定抗氧化浓度下都能达到90%以上。通过对IC50的对比,化合物(2)和(5)的抗氧化能力较好,该研究工作可为贵州苗药野草香植物资源的进一步开发应用提供理论依据。
摘要：目的:对苗药野草香中提取分离的黄酮类成分进行抗氧化活性研究。方法:采用DPPH和ABTS两种方法测定。结果:木犀草素(2)、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、槲皮素(5)、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷(6)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷(7)对DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除活性(IC50分别为9.25±0.48、11.42±0.54、11.23±0.18、14.87±1.07、39.48±1.16和4.69±0.21、4.13±0.03、3.44±0.09、8.52±0.27、23.58±0.15)。结论:综合两种测定方法结果,化合物(2)和(5)的抗氧化能力最好。
关键词：苗药,野草香,黄酮类化合物,抗氧化活性,DPPH法,ABTS法
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