蒙古绵羊论文

2024-07-18

蒙古绵羊论文（精选3篇）

蒙古绵羊论文篇1

摘要：为了研究生长激素释放多肽(ghrelin)mRNA是否在蒙古绵羊卵丘细胞中表达,试验根据Gen-Bank中报道的绵羊ghrelin序列设计1对特异性引物,以蒙古绵羊卵丘细胞中的RNA为模板,采用实时定量RT-PCR技术扩增蒙古绵羊ghrelin的cDNA,并进行测序分析。结果表明:扩增得到的蒙古绵羊ghrelin cDNA为ghrelin的部分序列,将测序结果与已发表的绵羊ghrelin序列进行比对发现,233个碱基中有1个碱基的差异,该差异不影响翻译后多肽的序列;该cDNA片段包含长度为231 bp的开放读码框(ORF),编码77个氨基酸的绵羊ghrelin前原肽。

关键词：蒙古绵羊卵丘细胞,生长激素释放多肽(ghrelin),cDNA,克隆,序列分析

生长激素释放多肽(ghrelin)是新近发现的含有28个氨基酸残基的多肽,是生长激素促分泌素受体(GHS-R)的天然配体,可调节生长激素(GH)的分泌,是目前除了生长激素释放激素(GHRH)和生长抑素(SS)外,第3个调节腺垂体GH分泌的内源性物质。ghrelin由下丘脑、垂体和多种组织产生,在体内广泛分布,具有调节GH分泌、内分泌、摄食、能量代谢、胃肠功能、生殖与免疫、心血管等多种生物学作用,已引起人们广泛的关注,成为近年研究的热点。

1 材料

1.1 试验样品及处理

发育良好的1～2岁蒙古绵羊真胃胃底腺(作为阳性对照),收集于呼和浩特市回民屠宰场,用生理盐水冲洗后迅速放入液氮中备用。将蒙古绵羊卵巢放入装有37 ℃生理盐水的保温桶中,备用。带回实验室后,将蒙古绵羊卵巢倒入灭菌的大平皿中,用75%乙醇消毒过的眼科剪将卵巢附带的脂肪和结缔组织剔除干净,再用预热好的37 ℃生理盐水洗涤卵巢3次。收集发育良好的卵巢上直径为3～5 mm的卵泡壁层颗粒细胞,立即提取RNA。

1.2 仪器及试剂

低温高速离心机(型号为5417R)、紫外可见光分光光度计,德国Eppendorf公司生产;PCR仪(型号为RTC-100),美国MJ公司生产;DYY-Ⅲ型稳压稳流电泳仪,北京六一公司生产;凝胶成像分析系统(型号为Tanon Gis-1000),上海天能科技公司生产;超低温冰箱(ULT-1386-3-V),美国Thermo公司生产。

两步法反转录PCR试剂盒(型号为DRR019A),TaKaRa公司生产;溴化乙锭(EB)、溴酚蓝,Sigma公司生产;琼脂糖、总RNA提取试剂盒(型号为Z5110),Promega公司生产。

2 方法

2.1 RNA的提取及反转录

采用总RNA提取试剂盒(型号为Z5110),按照说明分别提取蒙古绵羊卵丘细胞、真胃胃底腺的总RNA,取3 μL用2%琼脂糖凝胶电泳(100 V,10 min)检测其完整性、纯度及含量,剩余RNA做好标后置于-70 ℃超低温冰箱中保存,备用。

反转录前直接将6.5 μL的RNA加到反转录体系中合成cDNA。反应体系(10 μL):总RNA 6.5 μL,5×Prime Script Buffer 2 μL,引物Random 6 mers 0.5 μL,引物Oligo dT Primer 0.5 μL,无酶水0.5 μL,采用PCR仪进行反转录。反应条件:37 ℃预变性15 min,85 ℃变性5 s。

2.2 PCR反应

根据GenBank中公布的绵羊ghrelin cDNA序列,利用DNAStar软件以跨内含子为原则设计特异性引物,以避免基因组污染的干扰。引物序列:5′-GCAGAGAAAGGAACCTAAG-3′,5′-GGGTTTCTTCGGCTTCTTC-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 PCR反应体系(20 μL):Ex Tq HS Buffer 10 μL,10 μmol/L上、下游引物各 0.4 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 7.2 μL,采用PCR仪进行ghrelin的PCR反应。扩增条件:94 ℃预变性2 min;90 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共45个循环;72 ℃再延伸2 min。以同样方法获得的蒙古绵羊真胃胃底腺cDNA为阳性对照,另外以RNA为模板直接进行PCR为阴性对照,检测引物是否扩增RNA中残留的少量基因组DNA。

2.3 RT-PCR产物的序列测定

取RT-PCR产物5 μL经2%琼脂糖凝胶电泳(100 V,10 min)确定扩增片段大小,送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

2.4 序列分析

采用DNAStar软件进行核酸、蛋白质氨基酸序列比较分析及预测。

3 结果与分析

3.1 总RNA的检测

为了检测RNA的完整性、含量及纯度,分别吸取蒙古绵羊卵丘细胞和真胃胃底腺总RNA 5 μL,经2%琼脂糖凝胶电泳检测,结果得到清晰、无拖尾的2条带(见图1),即28S、18S,说明样品RNA是完整的。通过凝胶成像系统分析软件得出28S RNA的含量为102 ng,18S RNA的含量为 64 ng,28S RNA的含量约为18S RNA的2倍,说明所提取的RNA是完整的,并分析得出总RNA的含量约为80 ng。经紫外可见光分光光度计检测OD260、OD280值分别为1.90,1.82,说明RNA的纯度较高。

1.卵丘细胞总RNA;2.真胃胃底腺总RNA;M.DL-2 000 Marker。

3.2 RT-PCR扩增

RT-PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,在目的片段233 bp处出现与预期扩增片段大小相符的单一条带(见图2)。以真胃胃底腺cDNA为阳性对照的PCR在相同位置出现1条带,阴性对照(以RNA为模板)的PCR无扩增产物,说明通过跨内含子设计的引物进行PCR扩增时能有效排除基因组DNA的污染,故无需经DNaseⅠ对所得RNA进行消化。

1.阴性对照;2.阳性对照;3.卵丘细胞ghrelin RT-PCR产物; M.DL-2 000 Marker。

3.3 RT-PCR产物测序的分析

根据上海生工生物工程技术服务有限公司的测序结果可知,共测出233个核苷酸序列,蒙古绵羊卵丘细胞ghrelin测序结果与NCBI上已发表的绵羊ghrelin序列比对后同源性为99%(见图3),其中1个碱基的差异不影响翻译后多肽的序列。采用DNAStar软件进行蛋白质氨基酸序列预测(见图4)。233 bp的蒙古绵羊ghrelin cDNA中包含231 bp的开放读码框(ORF),编码77个氨基酸的绵羊ghrelin前原肽。结果与已发表的绵羊ghrelin序列基本一致,且与从胃底腺克隆的ghrelin cDNA结果一致,表明引物设计合乎要求,特异性地扩增出蒙古绵羊ghrelin 基因的cDNA部分片段。

3.4 蒙古绵羊ghrelin cDNA 与其他哺乳动物 ghrelin cDNA 的同源性比较

通过DNAStar软件比较得出蒙古绵羊ghrelin的cDNA与山羊、牛的亲缘关系最近,分别为97.9%、96.2%;其次与猪、狗、人、猴的亲缘关系较近,同源性分别为80.3%、79.9%、79.1%、78.6%;与小鼠、大鼠的同源性较远,分别为76.1%、75.2%(见图5)。该段绵羊ghrelin cDNA与其他哺乳动物(山羊、牛)的ghrelin cDNA相同,均含有由231个核苷酸组成的ORF,编码77个氨基酸的绵羊ghrelin前原肽(见图6)。

注:*表示氨基酸高度保守的位置

3.5 蒙古绵羊ghrelin部分氨基酸序列与其他哺乳动物ghrelin氨基酸序列的同源性比较

根据蒙古绵羊ghrelin的cDNA序列推导其编码的氨基酸序列并与其他哺乳动物ghrelin的氨基酸序列比较可知,哺乳动物ghrelin的氨基酸序列在特定区段具有严格的保守性(见图6)。根据遗传进化树分析可知,蒙古绵羊ghrelin编码的氨基酸序列与山羊、牛的亲缘关系最近,其次为猪、狗、人、猴,与大鼠、小鼠的亲缘关系最远(见图7)。

4 讨论

ghrelin在胃肠道和中枢神经系统均有分布,属于一种脑肠肽,在小鼠和人胃的相关分泌细胞及下丘脑弓状核中均有发现。免疫组化显示,ghrelin免疫活性神经元在中枢神经系统中主要分布于下丘脑弓状核,在小肠和大肠组织中也存在。此外,在多种组织器官,如卵巢、肾上腺、心房、乳腺、颊黏膜、回肠、输卵管、脂肪等中均能检测到ghrelin mRNA表达[1,2,3,4]。有研究发现,ghrelin的受体主要存在于垂体,而很少存在于甲状腺、胰脏、脾脏、心肌及肾上腺。ghrelin在肾脏、胃、下丘脑等局部产生,并能以内分泌和旁分泌的形式与其受体结合而发挥作用。ghrelin的主要功能是刺激垂体前叶释放GH,增加食欲、调节能量平衡,促进胃酸分泌;ghrelin对生殖也有影响。

试验利用RT-PCR方法,从蒙古绵羊卵丘细胞中成功获得了233 bp的ghrelin cDNA 部分片段,经DNA序列分析确认PCR产物为预期的cDNA。该233 bp的蒙古绵羊卵丘细胞内ghrelin cDNA中包含231 bp的ORF,编码77个氨基酸的绵羊ghrelin前原肽。与其他哺乳动物的ghrelin比较,PCR扩增得到的cDNA具有ghrelin保守序列,因此认为此cDNA为ghrelin前原肽的部分序列。用NCBI网站上的Blast功能将测序结果与已发表的绵羊ghrelin序列进行比对发现,233个碱基中有1个碱基的差异,且该差异不影响翻译后多肽的序列。试验结果表明,蒙古绵羊卵丘细胞中确实存在ghrelin mRNA的表达。经同源性分析,蒙古绵羊ghrelin与已报道的其他哺乳动物ghrelin cDNA序列和其编码的氨基酸序列均具有较高的同源性,特别是与山羊和牛的同源性最高。再次证实了ghrelin mRNA在蒙古绵羊卵丘细胞内的表达。这一结果与郭志凯等[5]报道的绵羊卵巢上存在ghrelin的结果一致。试验结果为进一步阐明家畜生殖系统内ghrelin的功能奠定了基础。

参考文献

[1]VOLANTE M,FULCHERI E,ALLIA E,et al.Ghrelin expression infetal,infant and adult human lung[J].J Histochem Cytochem,2002,50(8):1013-1021.

[2]吕东媛,曹贵方,李淑凤,等.绵羊生殖道中ghrelin基因的克隆技术[J].中国兽医科学,2008(3):134-138.

[3]GUALILLO O,CAMINOS J,BLANCO M,et al.Ghrelin,a novel pla-cental-derived hormone[J].Endocrinology,2001,142(2):788-794.

[4]杜晨光,杨燕燕,李海军,等.Ghrelin在绵羊体内卵母细胞和早期胚胎的表达[J].动物学研究,2008(2):134-138.

[5]郭志凯,李国俊,杜晨光.绵羊卵巢上Ghrelin部分序列鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2010(4):9-11.

蒙古绵羊论文篇2

内蒙古农业大学动物生物技术重点实验室传出喜讯：第一批共计25只转基因克隆绵羊诞生。这是我国迄今为止诞生的规模最大的一批转基因克隆绵羊，标志着绵羊现代生物育种技术有了新的突破。据了解，这项研究是国家转基因生物新品种培育的重大专项课题，由内蒙古农业大学动物生物技术重点实验室主任周欢敏教授带领的科研团队承担。从2009年起，这支科研团队开始开展绵羊转基因品种培育工作。经过技术攻关，2010年12月11日～22日，25只转基因羔羊相继诞生。另外，还有9只转基因羔羊预计将于2011年3月初出生。

该项研究成果运用了分子生物学、基因转染、体细胞克隆、胚胎移植等方面的技术，突破常规育种无法实现的跨物种基因转移，从而使物种可以根据人们的意愿与需求，设计和创造出新的性状，改变家畜的生产性能，同时大大缩短育种进程，加快遗传育种的改良速度，促进畜牧业快速发展。[摘编自中国畜牧业信息网]

蒙古绵羊论文篇3

目前, 有关于肉类中脂肪或蛋白质含量测定的研究报道很多[2,3,4,5,6,7,8], 但关于山羊肉和绵羊肉中蛋白质和脂肪含量的对比分析报道较少。笔者采用索氏抽提法测定羊肉中的脂肪含量, 凯氏定氮法测定羊肉中的蛋白质含量, 以期为进一步的研究提供试验基础。

1 材料

1.1 样品

山羊肉和绵羊肉共40个样品, 采购于呼和浩特市东瓦窑市场。

1.2 主要仪器

分析天平 (型号为FA2004N) , 上海菁海仪器有限公司生产;烘干箱 (型号为JC2005E) , 济南精诚仪器公司生产;恒温水浴锅 (50~80℃) , 金坛市华城润华实验仪器厂生产;九阳绞肉机, 九阳股份有限公司生产。

1.3 主要试剂

硫酸铜、硫酸钾、硫酸、2%硼酸溶液、40%氢氧化钠溶液、0.05 mol/L硫酸标准溶液、海沙、盐酸、95%乙醇、乙醚、石油醚 (30~60℃沸程) , 均为分析纯, 所有试剂由天津大茂化学试剂厂生产;混合指示液, 由2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

2 方法

2.1.1蛋白质含量的测定

样品处理:精密称取1.0 g固体样品, 移入干燥的100 m L定氮瓶中, 加入0.2 g硫酸铜, 3 g硫酸钾及20 m L硫酸, 稍摇匀后于瓶口放1个小漏斗, 将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热, 待内容物全部炭化, 泡沫完全停止后, 加强火力, 并保持瓶内液体微沸, 至液体呈蓝绿色澄清透明后, 再继续加热0.5 h。取下放冷, 小心加20 m L水。放冷后, 移入100 m L容量瓶中, 并用少量水清洗定氮瓶, 洗液并入容量瓶中, 再加水至刻度, 混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

样品的测定:参考GB/T 5009.5—2010《食品安全国家标准》食品中蛋白质的测定中的凯氏定氮法[9]进行测定。对1号山羊肉样品和1号绵羊肉样品在重复性条件下进行2次独立的精密度测定。

2.1.2脂肪含量的测定

样品处理:取肉样在干燥箱 (50~80℃) 烘干3 h, 除去水分。用小型绞肉机绞碎, 精密称取2 g置于蒸发皿中, 拌以海砂10 g于沸水浴上蒸干后, 再于95~105℃干燥, 研细, 全部移入滤纸筒内。蒸发皿及附有样品的玻棒均用沾有乙醚的脱脂棉擦净, 并将棉花放入滤纸筒内。

样品的测定:参照GB/T 5009.6—2010《食品安全国家标准》食品中脂肪含量的测定中的索氏抽提法[10]进行测定, 所测得的脂肪为游离脂肪。对1号山羊肉样品和1号绵羊肉样品在重复性条件下进行2次独立的精密度测定。

3 结果与分析

3.1 精密度测定

见表1。

由表1可见, 蛋白质和脂肪2次测定的精密度均小于5%, 符合精密度的要求。

3.2 山羊肉与绵羊肉中的脂肪、蛋白质含量的测定

g·100 g-1

结果见表2。

由表2可见:20个山羊肉样品中的脂肪含量范围为30.56~35.07 g/100 g, 含量最低的为6号样品, 含量最高的为2号样品, 平均值为33.21 g/100 g;20个山羊肉样品中的蛋白质含量范围为13.35~15.90 g/100 g, 含量最低的为1号样品, 含量最高的为19号样品, 平均值为14.82 g/100g。

20个绵羊肉样品中的脂肪含量范围为34.61~36.80 g/100 g, 含量最低的为8号样品, 含量最高的为1号样品, 平均值为35.77 g/100 g;20个绵羊肉样品中的蛋白质含量范围为11.35~13.76 g/100 g, 含量最低的为10号样品, 含量最高的为12号样品, 平均值为12.67 g/100 g。

4 讨论与结论

食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解, 产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离, 用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定, 根据酸的消耗量乘以换算系数, 即为蛋白质的含量。

本试验结果表明, 不同的样品中脂肪含量和蛋白质含量各不相同, 但从均值来看, 绵羊肉的脂肪含量均值高于山羊肉的脂肪含量均值, 并且蛋白质含量低于山羊肉的蛋白质含量。相比较而言, 山羊肉含有低脂肪, 高蛋白质, 比绵羊肉更有益于人体。

作为以畜牧业为主的内蒙古自治区应大力发展养羊业, 组织羊肉的产业化生产, 大幅度增加羊肉产量和改善羊肉品质。为内蒙古自治区的畜牧业提供广阔的市场前景和机遇, 大力发展优质羊肉生产, 尤其对内蒙古自治区的畜牧业和经济起着重要的推动作用。

参考文献

[1]热孜瓦古丽·米吉提, 买买提伊明·巴拉提, 依巴代提·米吉提, 等.绵羊羊肉氨基酸成分的比较研究[J].新疆农业科学, 2012, 49 (8) :1552-1556.

[2]彭爱红, 陈艳红, 邓清莲.酸水解法测定午餐肉中脂肪含量的微型实验研究[J].内蒙古民族大学学报, 2009, 15 (4) :126-127, 129.

[3]彭爱红.超声波提取法测定午餐肉中脂肪含量[J].食品工业科技, 2003, 24 (9) :82-85.

[4]李晓艳.浅谈凯氏定氮法测定食品中蛋白质注意事项[J].计量与测试技术, 2008, 35 (8) :74-77.

[5]冯正滔.试析食品中蛋白质含量的测定方法[J].广西质量监督导报, 2008 (9) :78, 80.

[6]尉立刚, 张生万, 齐尚忠, 等.光度法测定肉制品中蛋白质含量的方法研究[J].山西大学学报 (自然科学版) , 2010, 33 (2) :267-269.

[7]潘能斌.双缩脲比色法测定面粉、肉类食品中的蛋白质[J].浙江预防医学, 2001, 13 (2) :64.