RAPD分析

RAPD分析（精选10篇）

RAPD分析 篇1

石斑鱼作为海水养殖名贵的经济鱼类,具有病害少、生长快等优势,是海水养殖业进行海洋生物高值化技术开发最理想的选择之一。但因石斑鱼个体发育中普遍存在“先雌后雄”的性转变过程,雄性亲鱼均高龄化,使得石斑鱼的人工繁殖成为世界性海水养殖难题之一。世界不少国家和地区都投入大量人力和资金对石斑鱼人工繁殖技术进行攻关研究,希望人工育苗产业化。石斑鱼养殖经济效益巨大,而目前人工繁殖技术尚未完全攻克,自然苗种无法满足日益扩大的养殖规模,必然对石斑鱼的自然资源造成极其严重的破坏。为了使石斑鱼的自然资源得到更好的保护、开发和利用,避免种质退化,需对其遗传背景进行分析,弄清石斑鱼种群的遗传多样性和亲缘关系,建立种质标准和繁育保护体系。

文章采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术对5种石斑鱼进行了研究,分析它们种内和种间遗传多样性、种间亲缘关系和系统分化,并建立分子遗传标记,以期从分子遗传水平为保护、开发、管理和持续利用海洋渔业资源提供一定的基础数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

从2001年3月至2004年10月分批采集了5种石斑鱼的野生种各20尾,鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)和棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)采自中国台湾,驼背鲈(Cromileptes altivelis)采自印度尼西亚,斜带石斑鱼(E.coioides)和鲑点石斑鱼(E.fario)采自深圳,取背部肌肉或尾鳍,95%乙醇溶液保存。

1.2 基因组DNA的提取

称取0.1 g保存于95%乙醇溶液中的组织,加500 μL STE缓冲液,用剪刀剪碎组织,弃液体,加500 μL STE,混匀后加入终浓度分别为1%的SDS和200 μg·mL-1的蛋白酶K,56℃消化过夜。先后用等体积的苯酚(Tris饱和,pH=8.0),苯酚:氯仿(体积比V/V,1:1),氯仿:异戊醇(V/V,24:1)各抽提一次以去除蛋白质。最后上清液加2倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗涤沉淀2遍,室温干燥后,溶于适量TE(10 mmol·L-1 Tris-HCI,pH=8.0,1 mmol·L-1 EDTA,pH=8.0)或重蒸水中。用紫外分光光度计测定浓度,然后分装并置于4℃或-20℃保存。

1.3 引物筛选

该研究对6个系列120个引物进行筛选,筛选出19个重复性好、谱带清楚、位点数量适中且共同适用于这5种石斑鱼的引物(表1)。

1.4 RAPD反应体系

PCR反应体系为1×PCR Buffer(其中含50 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 Tris-HCl、1 g·L-1 Triton x-100)、2.0 mmol·L-1 MgCl2、dNTP各0.2 mmol·L-1、15 ng引物、20 ng DNA、1.5 U TaqDNA聚合酶、加ddH2O至25 μL。RAPD的PCR反应程序:94℃预变性200 s;94℃变性20 s,36℃退火40 s,72℃延伸70 s,40个循环;最后72℃延伸5 min。

1.5 扩增产物检测

RAPD扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 μg·mL-1 EB)中电泳检测,电压5 V·cm-1,电泳结束后用Tanon GIS-2008凝胶成像分析系统观察并拍照。

1.6 数据分析

使用Gel-Pro Analyzer凝胶图像分析软件对扩增片段大小进行计算。按公式[1]计算多态位点比例P=(群体的多态位点数/位点总数)×100%。参照LYNCH[2]的方法,Sxy=2Nxy∕(Nx+Ny)计算个体间的遗传相似系数,式中Nxy为2个个体x和y共享RAPD条带数,Nx和Ny分别为x和y拥有的RAPD条带数。用RAPDistance[3]软件计算群体内的遗传相似系数(S),用公式D=1-S[4]计算群体内的遗传距离。用POPGENE软件计算Nei基因多样性指数H[5]和Shannon信息指数Hi[6]:

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式中k为所统计的总位点数;pi为该种群第i个位点的等位基因频率。

群体间的遗传距离根据Nei的公式[7],采用POPGENE软件计算,遗传相似系数:

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其中xi,yi表示第i条带分别在群体x,y中出现的频率。群体间的遗传距离Dxy=-lnI。

聚类分析采用邻近结合法(NJ)和最小进化法(ME),用遗传距离为参数,使用Mega Ver. 3.0软件构建物种的系统发生树。

2 结果

2.1 种内遗传多样性

19个引物用于鞍带石斑鱼、驼背鲈、棕点石斑鱼、斜带石斑鱼和鲑点石斑鱼的扩增,依据电泳图谱计算得出遗传多样性结果如表2所示。

2.2 种间遗传多样性

参照Nei的方法,利用POPGENE软件计算出5种石斑鱼在19个引物中各种间的遗传相似系数(Ixy)和遗传距离(Dxy)。计算结果,鞍带石斑鱼与棕点石斑鱼之间的遗传距离值最大(0.6085),驼背鲈与鲑点石斑鱼之间的遗传距离最小(0.3964)。

为了更直观方便地看出5个种之间的相互关系,将Nei′s平均遗传相似系数和平均遗传距离列为表3。

注:对角线以上为Nei′s遗传相似系数,对角线以下为遗传距离 Note:Nei′s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal).

以种间的遗传距离(Dxy)作为参数,采用NJ法和ME法,对5种石斑鱼构建物种的系统发生树(图1和图2)。可以看出,NJ法和ME法得到的聚类图一致,5种石斑鱼分为2支,驼背鲈和鲑点石斑鱼首先聚为一支,然后和鞍带石斑鱼聚类,棕点石斑鱼和斜带石斑鱼聚为一支。结果表明,驼背鲈和鲑点石斑鱼,棕点石斑鱼和斜带石斑鱼两两亲缘关系最近。

2.3 种间特异性标记

在某引物的扩增图谱中,某个种的所有个体都拥有,但其它种的个体不具备的片段,称为某个种的特征片段或特异性片断,这些特征片断可以用来协助石斑鱼的种类鉴别。在所选出的19个引物的扩增产物中,大都能找到1～2种鱼的特征谱带。

M. PCR markers;1～6. 鞍带石斑鱼的6个个体;7～12. 驼背鲈的6个个体;13～18. 棕点石斑鱼的6个个体;19～24. 斜带石斑鱼的6个个体;25～30. 鲑点石斑鱼的6个个体;箭头所指谱带分别为鞍带石斑鱼、 驼背鲈和棕点石斑鱼(2个)的特异性谱带,从左到右依次为966,867,697,434 bp M. molecular size marker (DL1543);1～6. E.lanceolatus;7～12. C.altivelis;13～18. E.fuscoguttatus;19～24. E.coioides;25～30. E.fario;Arrow species-specific markers in E.lanceolatus, C.altivelis and E.fuscoguttatus (two), respectively, molecular weight from left to right, 966, 867, 697, 434 bp.

在引物S61的扩增产物中(图3),鞍带石斑鱼的特征片断为966 bp,驼背鲈的特征片断为867 bp,棕点石斑鱼特征片断有2个,分别为697和434 bp。这些特征片断可用作区别于其它石斑鱼种类的特征标记。

3 讨论

在RAPD分析中,多态性位点比例(P)和Nei基因多样性指数(H)以及Shannon信息指数(Hi)都是衡量群体内遗传多样性水平高低的重要指标,种群的遗传多样性水平越高,适应环境的能力就越强,反之,适应环境的能力就越弱,在长期的进化中被淘汰的可能性就增大。该研究对5种石斑鱼的遗传多样性研究结果显示,从多态性位点比率(P)的数值来看,鲑点石斑鱼的遗传多样性最丰富,达73.94%,驼背鲈次之(72.61%),然后是斜带石斑鱼(69.97%),鞍带石斑鱼(64.23%),最低是棕点石斑鱼(60.34%);从Nei基因多样性指数(H)来看,也是鲑点石斑鱼最高(0.1648),斜带石斑鱼次之(0.1439),然后是驼背鲈(0.1364),鞍带石斑鱼(0.1189),最低仍是棕点石斑鱼(0.1028);5种石斑鱼的Shannon信息指数(Hi)与Nei基因多样性指数(H)排序一致,分别为0.2434、0.2100、0.1992、0.1801、以及0.1530。3个指标所显示的5种石斑鱼的遗传多样性大小顺序基本一致。

郑莲与刘楚吾[8]、尹绍武等[9]和GOVINDARAJU与JAYASANKAR[10]分别利用RAPD对不同石斑鱼遗传多样性进行分析,结果表明,在野生群体中,中国南海石斑鱼的多态性位点比率为55.56%～86.75%,印度洋的为25.42%～49.15%,表明中国南海石斑鱼的遗传多样性较为丰富,种质资源比较良好,明显优于印度洋石斑鱼的遗传多样性水平。从另一方面说明了我国对海洋渔业资源保护所做出的努力。另外,养殖群体与野生群体比较,其遗传多样性指标下降明显,显示在人工繁殖过程中,由于有效繁殖群体小,近亲繁殖、遗传渐渗等原因造成石斑鱼养殖群体遗传多样性下降,应引起足够重视。

刘楚吾等[11]用RAPD技术对湛江近海军曹鱼(Rachycentron canadum)进行了分析,其中多态位点比例P为80.85%,Shannon信息指数Hi为0.4498,结果表明军曹鱼的遗传多样性比较丰富。丁少雄等[12]采用RAPD技术对状黄姑鱼(Nibea miichthioides)野生种群及人工繁育群体进行了DNA多态性检测,多态位点比率P分别为16.5%和15.7%,Shannon信息指数Hi分别为0.113和0.104,显示2群体间具有非常相近的亲缘关系,且遗传多样性水平都比较贫乏。综合比较,该研究5种石斑鱼的遗传多样性处于中等水平,说明人类的经济活动已经对石斑鱼的自然资源造成了一定的影响,如果不采取进一步的保护措施,将会对石斑鱼资源的可持续利用开发产生非常不利的影响。

该研究采用NJ法和ME法2种聚类方法,得到的聚类图一致。2种方法所得结果,均是5种石斑鱼先分为了2支,驼背鲈和鲑点石斑鱼首先聚为一支,然后和鞍带石斑鱼聚类,棕点石斑鱼和斜带石斑鱼聚为一支。其中,驼背鲈和鲑点石斑鱼,棕点石斑鱼和斜带石斑鱼两两首先聚为一支,说明驼背鲈和鲑点石斑鱼,棕点石斑鱼和斜带石斑鱼遗传分化程度最小,它们的亲缘关系最近。

郑莲与刘楚吾[8]和尹绍武等[9]分别对不同石斑鱼的亲缘关系进行了RAPD分析,结果均表明鲑点石斑鱼和蜂巢石斑鱼(E.merra)的亲缘关系较近。从形态特征来看,2种石斑鱼在体形、体长,前鳃盖骨具棘和鳍条有色斑等特征也极为相似[13,14,15]。其它的研究报道[16,17,18]也证实RAPD方法可以应用于种间和属间亲缘关系的研究。

该研究聚类分析与传统分类学方法并不完全一致,在鲑点石斑鱼上有一定差异。聚类分析显示鲑点石斑鱼和驼背鲈亲缘关系最近,鞍带石斑鱼和驼背鲈跟石斑鱼属有较近的亲缘关系。而传统分类学是把鲑点石斑鱼、棕点石斑鱼、斜带石斑鱼归入石斑鱼属,驼背鲈单列为驼背鲈属,鞍带石斑鱼为宽额鲈属[13,14,15]。这种差异可能是由于方法本身的特点所造成的,传统分类学主要是从形态学或表型性状上来检测遗传变异,但是遗传表达有时不太稳定,易受环境及基因显隐性的影响,所以得到的信息和结论不够准确、完善,很难建立饱和的遗传图谱。RAPD方法是随机引物的扩增,理论上是对整个基因组的扩增,只要使用足够多的引物,就可以较为客观地评估种群间的遗传分化。因此,在研究工作中,应结合实际情况对研究对象进行综合分析,找出最合适的方法或几种方法结合使用,互相印证,以期得到正确的结论。

大部分石斑鱼属鱼类外部形态特征相似,体色随环境变化,而且仔稚鱼和幼鱼与成鱼之间的形态和体色差异明显,这些均给石斑鱼的种类鉴别带来一定困难。该研究在RAPD研究中发现的一些种类特征性片断(图3),可以用来协助这些种类的鉴别,为石斑鱼种类鉴定和人工繁育及遗传育种提供科学依据。此外,每个引物在每种鱼中扩增的图谱均不相同,可称之为“RAPD的指纹图谱”,结合特征片断可对石斑鱼种类进行鉴别。

生物群体遗传多样性水平是评估生物资源的重要指标,与生物对环境的适应能力、生长速度、抗病能力、物种的进化速度等密切相关。石斑鱼是名贵海产经济鱼类,也是南方沿海重要的海水网箱养殖种类,因此,研究评估石斑鱼群体遗传多样性对今后的石斑鱼渔业资源的合理利用、开发、保护和遗传育种都有着重要的意义。

RAPD分析 篇2

矮牵牛组织培养及变异苗的RAPD分析

探索了矮牵牛组织培养的.配方,对组培过程中产生的表型变异植株进行了DNA水平的分析.并对矮牵牛叶片组织培养及产生变异的影响因素等进行探讨.

作 者：张汉尧 刘小珍 周健 龚秀会 杨宇明 ZHANG Han-yao LIU Xiao-zhen ZHOU Jian GONG Xiu-hui YANG Yu-ming 作者单位：西南林学院,资源学院,云南,昆明,650224刊 名：广西植物 ISTIC PKU英文刊名：GUIHAIA年，卷(期)：200626(1)分类号：Q943.1关键词：矮牵牛 组织培养 变异苗 RAPD

RAPD分析 篇3

关键词：罗汉果；二倍体；三倍体；遗传背景；RAPD

中图分类号： S567.903文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0241-03

收稿日期：2014-04-15

基金项目：国家科技支撑计划 （编号：2011BAI01B03）；国家自然科学基金 （编号：81373914）；广西自然科学基金（编号：2013GXNSFDA019021、2013GXNSFBA019170）

作者简介：韦荣昌（1983—），男，广西梧州人，博士，助理研究员，主要从事生药学研究。E-mail：wrc830612@163.com。罗汉果[Siraitia grosvenorii （Swingle） C. Jeffrey]是雌雄异株的葫芦科（Cucurbitaceae）罗汉果属多年生藤本植物[1]，为我国南方特有的珍贵药用植物和甜料植物，主产于广西壮自治区永福、临桂、龙胜、兴安和融安等地[2]。罗汉果果实含多种甜苷，其中甜苷V为世界上最强的非糖甜味物质之一，为蔗糖甜度的300～400倍，是一种综合性状极佳的天然甜味剂，广泛应用于食品、药品和保健品中，适合所有人群长期食用，是肥胖者、糖尿病人和高血压患者的理想糖替代品[3-4]。多倍体罗汉果可大幅提高根、茎、叶、果实等部位的生物量和产量，其中三倍体罗汉果还具有无籽的特性，大大提高了整果利用率和甜苷提取收得率，对整个罗汉果产业具有里程碑的意义[5]。罗汉果三倍体雌株经二倍体雄株授粉后所结的果实即为无籽罗汉果。本研究利用RAPD分子标记技术[6-9]探讨罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的选育提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

试验材料采自广西桂林兴安县漠川乡的罗汉果种植基地，总共采集到28份材料：二倍体雄株7份，三倍体雌株21份，利用二倍体（或四倍体）父本花粉对四倍体（或二倍体）母本柱头进行人工授粉杂交获得（表1）。每份材料选取生长状况良好的罗汉果单株3～5株，采集约10张健康成熟的叶片并混合成该份材料的样品，用硅胶干燥保存，带回实验室中待用。

1.2RAPD分析

采用改良CTAB（2×）法[10]提取罗汉果叶片的总DNA。

引物筛选：从材料中随机选出6份样品（包含2x、4x）进行引物筛选，从200条RAPD引物中筛选出20条扩增反应稳定、条带清晰、具有多态性的引物，并用于所有材料的扩增。20个RAPD引物名称、序列见表2。

琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物：将扩增产物置于1.5 %琼脂糖凝胶中电泳，凝胶上所加电压不超过5 V/cm，用 Lambda DNA/EcoRⅠ+HindⅢ Marker （MBI Fermentas公司）作为标准分子量对照，经溴化乙锭（EB）染色20～30 min，在凝胶成像系统上观察拍照、记录。

RAPD为显性标记，同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，相同迁移位置上有扩增条带记录为1，无扩增条带记录为0，构建0-1原始矩阵。仅清晰、稳定、可分辨的并且长度在400～2 000 bp范围内的ISSR扩增条带才被记录。用AFLP-SURV version 1.0[12]计算材料间遗传距离D，按D=-lnⅠ计算Nei & Li遗传相似性系数；用NTSYS-pc version 2.02[13]软件的UPGMA（unweighted pair group method using arithmatic average）方法进行聚类分析；用GenAIEx version 6.3[14]进行主坐标分析。

2结果与分析

2.1多态性分析

用20个RAPD引物对28份材料的总DNA进行PCR扩增，重复2次，2次扩增产物重复性好且稳定，扩增得到的总条带数及多态性条带数见表2。20个引物扩增条带数的范围为 6～17条，共同带在1～8条内，多态性条带数范围为3～13条，多态性百分比为25.00%～88.89%，且由总计的结果可知，扩增总条带数为239条（平均每个引物11.95条），其中最多，为17条；引物S170得到的条带最少，为6条。其中，引物S411的扩增图谱见图1。此外，在不同罗汉果品种间存在的多态性条带可作为鉴定品种的特征带。

2.2遗传相似性系数及遗传距离

28份材料间的相似性系数变化范围为0.691 0～0.920 6，其中F302與M202间的相似性系数最低（0.691 0），遗传距离最高（0.369 6）；而F305与F306间的相似性系数最高（0.920 6），遗传距离最小（0.082 7）。

2.3聚类分析

从图2可看出，F305和F306直接聚为一类，具有很高的相似性系数，两者距离最近；F321独成一支，与其余材料相距较远；基本上相似性系数较高的材料排列并聚为一类。

2.4双变量主坐标分析

主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）是基于Nei & Li遗传距离及相应的相似性系数进行的。因此，主坐标分析图中各个个体（品种）间的位置关系反映了它们在遗传上的相似性。由于每份试验材料都是通过选取生长状况良好的罗汉果单株3～5株，共采集约10张健康成熟叶片混合而成的，因此这28份材料的主坐标分析可看作“双变量主坐标分析”（double principal coordinate analysis，DPCoA：一种将物种与物种之间差异考虑到群体间相互关系的测度之中的排序方法）[15-16]。通过RAPD标记对28份材料进行DPCoA排序发现，前3个主坐标的方差贡献率分别为26.81%、21.86%

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和17.60%，相对应的累积贡献率分别为26.81%、48.67%和66.27%。一般认为，如果前3个主要特征向量的方差占总方差的40%以上，则排序效果是满意的[17]，本试验结果 28 份材料的前3个主要特征向量的方差累积贡献率高达6627%，说明降维效果较好。因此，保留DPCoA的前二轴对28份材料进行排序分析，应用GenAIEx version 6.3获取坐标轴特征值及样品特征向量，并据此划分出28份不同材料在DPCoA前二轴空间中的排序图见图3。

由Proj划分而得的28份材料在PCoA排序图中空间分布十分明显，除F316和F318有部分交叉重叠外，其余样品间均无交叉重叠现象。PCoA排序图把28份材料分为三大类。第一大类位于A区间，其中三倍体雌株4份（F312、F313、F320、F321），二倍体雄株2份（M201、M204）。第二大类位于B和第D区间，其中只包括三倍体雌株12份（F301、F302、F303、F304、F305、F306、F307、F308、F309、F310、F311、F314）。第三大类位于C区间，其中只包括三倍体雄株3份（F316、F318、F319）、二倍体雄株5份（M202、M203 、M205、M206 M207）。

比较图2和图3可知，对28份材料所进行的亲缘关系聚类分析和双变量主坐标分析的结果基本上是一致的，雌株和雄株间的距离相对较近聚在一起，而双变量主坐标分析能从多个方向、多个层面更直观和准确地反映材料间的遗传关系。

3结论与讨论

3.1罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株的RAPD相关遗传

根据RAPD分析结果可知，有的材料之间虽然是不同的种质，但遗传相似性系数较高，说明它们的亲缘关系近；如F315因为由Nongyuan B6与M204株系杂交而成，所以与M204关系较近，其相似性系数高达0.816 3。此外，在三倍体雌株中，如果其亲本相同或相似性系数较高，由于子代继承了亲本一定的遗传物质，因而子代间的相似性系数也会较高，如F318和F319，由于其母本都是Yongqing 1，因此其相似性系数高达0.912 3；而因为F305和F310也都为同一父本M205，所以其相似性系数也高达0.858 0。

3.2罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株的合理组配

F302与M202间的相似性系数仅为0.6910，还有M201與F302、F309及F312与M207间的相似性系数都仅为0.716 1，遗传距离较大；而且M202与母本间的相似性系数均在 0.6～0.7 之间。因此，初步推测罗汉果三倍体雌株与二倍体雄株中最适合作雌雄组配的是F302与M202，其次是F302与M204、F309与M204、F312与M207。

值得指出的是，虽然罗汉果三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景存在一定的复杂性，但大多遗传相似性系数较大，遗传距离较近，应该尽快采取相应措施，进行种质创新，丰富三倍体雌株和二倍体雄株的遗传背景，为无籽罗汉果优良品种的选育奠定坚实基础。

RAPD分析 篇4

虽然杂种优势很早以前就被人们发现并加以利用,也已组配了不少柞蚕杂交种,但有关柞蚕杂种优势的理论研究还不够深入,这在某种程度上影响了柞蚕杂种优势的充分利用。利用分子标记技术从基因的角度来探讨杂种优势产生的机理,为有效地利用杂种优势提供了可能,并且已在玉米[1]、水稻[2]等作物上加以应用。应用分子标记技术结合野外试验,可以用来指导杂交组合的选配、杂种优势的分析和预测,这样可以节省大量的人力和物力。

RAPD分子标记技术是最常用的分子标记技术之一。本文采用RAPD标记技术对柞蚕品种选大1号、沈黄1号及其杂交F1代、F2代、回交F1代共13个群体进行了分析,以探讨亲本及子代间的RAPD标记多态性,以期能更有效的对杂交后代进行研究分析鉴定,为杂种优势的利用提供分子生物学理论。

1 材料与方法

1.1 材料

黄蚕血统品种沈黄1号、青黄蚕血统品种选大1号及正反交F1、F2代和回交F1代。供试材料由沈阳农业大学柞蚕研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

基因组DNA的提取参考宋宪军[3]、赵巧玲[4]的方法,但略有改进,采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 RAPD—PCR扩增

引物序列参考聂磊[5]的报道(由大连宝生物公司合成),并筛选出8个扩增带丰富的引物(表1)。PCR反应体系为25μL:10.8μL ddH2O、2.5μL 10×buffer(含25 mmol·L-1 Mg Cl2)、1μL dNTP、7.5μL Primer、0.2μL Taq DNA酶(5U·μL-1,购自大连宝生物公司)、3μL模板DNA。反应程序为94℃预变性1 min,94℃变性0.5 min,40℃退火1 min,72℃延伸1.5 min;36个循环后,72℃延伸10 min。

1.2.3 电泳检测

PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,DNA Marker为DL2000(购自大连宝生物公司),采用凝胶成像系统观察拍照,记录电泳结果。

2 结果与分析

RAP D扩增产物的多态性

采用筛选出的8个不同RAPD引物对13个柞蚕群体分别进行扩增,结果见表1及图1。

注:1.选大1号;2.沈黄1号;3.选大1号×沈黄1号;4.沈黄1号×选大1号;5.选大1号×(选大1号×沈黄1号);6.(选大1号×沈黄1号)×选大1号;7.选大1号×(沈黄1号×选大1号);8.(沈黄1号×选大1号)×选大1号;9.沈黄1号×(选大1号×沈黄1号);10.(选大1号×沈黄1号)×沈黄1号;11.沈黄1号×(沈黄1号×选大1号);12.选大1号×沈黄1号自交F2;13.沈黄1号×选大1号自交F2。

RAPD-PCR扩增结果(表1):8个RAPD引物共扩增出74条重复性好、清晰的多态性条带,片段大小在250~2 300bp之间;每个引物扩增出的条带有6~12条,平均为9.25条;74个扩增位点中有65个位点具有多态性,多态性位点比率为87.84%。不同引物扩增出来的位点多态性有较大的差别,多态性位点比率在70%~100%之间。

8个RAPD引物对13个柞蚕群体的扩增谱带也存在着明显的差异(图1)。8个引物扩增出的片段数量和大小明显不同。所有的扩增位点也可分为以下几种类型:(1)正反交F1及F2代、回交F1代和双亲均有的扩增位点,共9个;(2)正反交F1及F2代、回交F1代与亲本一方共享的位点,在另一方不存在或出现频率很低,共1个;(3)正反交F1及F2代和回交F1代各自出现特异性的扩增位点(即非亲性扩增位点),共5个;(4)双亲中没有而在正反交F1及F2代、回交F1代中出现的位点,共29个。

以引物R1为例说明对选大1号、沈黄1号及其正反交F1代的鉴定。引物R1对13个柞蚕组合共扩增出12条带,其中第7条带为沈黄×选大所特有,第3、5两条带位置上在亲本沈黄1号没有带,其它三个都有;第9条带位置上就选大1号没有带,以此可以鉴定出选大1号、沈黄1号及其正反交F1代。同样可以鉴定的还有引物R2、R5、R7、R8。

3 讨论

本文采用RAPD标记技术对两个柞蚕品种选大1号和沈黄1号及F1、F2代、回交F1代作了初步研究。结果表明RAPD—PCR共扩增出特异性的扩增位点(即非亲性扩增位点)5个,占总数的6.76%。非亲性扩增位点的出现可能是在细胞分裂的过程中杂交种的染色体出现结构重排、断裂及丢失所致,因而在杂交后代中出现了非亲性扩增位点。Van Open[6](1994)认为这种情况是引物结合位点的竞争或是异质双链形成导致的。引物结合位点与基因组DNA的复杂程度和分子量大小有关,一般是复杂程度高的基因组被扩增。Jone[7](1983)和杨金水[8](1996)认为基因多态性的结构差异大多是存在于基因调控区,因为调控区与编码区相比能更灵活地适应自然选择的要求。在杂种子代中,双亲遗传物质结合后基因的调控区可能发生了改变,从而引起扩增位点多态性,出现了非孟德尔方式传递的扩增位点。这些调控区的变化会引起相应编码区等位基因显隐性关系的改变,从而使基因的表达模式发生改变,这可能是杂种优势形成的原因之一。

目前有关RAPD的分子标记研究的比较多,而本文采用RAPD分子标记对柞蚕亲本及其杂交种、回交种的分析,可以为柞蚕品种的选育特别是杂种优势的利用提供一些分子生物学理论。

摘要：本文采用RAPD分子标记技术对柞蚕品种选大1号和沈黄1号及其F1、F2代、回交F1代共13个群体的基因组DNA进行了分析,探讨了柞蚕品种的分子遗传机制。运用8个RAPD引物进行扩增,共扩增出74条清晰稳定的条带,其中有65条具有多态性,多态性位点比率为87.84%,其中也出现了特异性扩增位点。

关键词：柞蚕,RAPD,分子标记

参考文献

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[7]Jone MA,Strommer J H.Exceptionally high levels of restriction site polymorphism in DNA near the maize ADHI gene.Genitics,1983,105:733-743.

RAPD分析 篇5

应用RAPD技术对七种驼蹄瓣属植物及其近缘种霸王的亲缘关系进行了研究,16个引物共扩增出125条带,其中99条表现出多态性,占79.2%,表现出丰富的RAPD多态性;利用UPGMA构建了分子系统树,结果表明RAPD分析的`亲缘关系聚类基本上与经典分类相一致,表明RAPD技术适用于驼蹄瓣属植物亲缘关系的研究.

作 者：张辰波 史雪松 宛涛 曹艳伟 张晓明 ZHANG Chen-bo SHI Xue-song WAN Tao CAO Yan-wei ZHANG Xiao-ming 作者单位：张辰波,史雪松,宛涛,曹艳伟,ZHANG Chen-bo,SHI Xue-song,WAN Tao,CAO Yan-wei(内蒙古农业大学农学院,内蒙古,呼和浩特,010019)

张晓明,ZHANG Xiao-ming(海拉尔学院,内蒙古,海拉尔,025000)

RAPD分析 篇6

关键词：掌叶大黄,RAPD,亲缘关系,遗传多样性

0 引言

大黄(Rheum officinale Baill)是我国传统中药材,为蓼科植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.Ex Balf.)或药用大黄(Rheum officinale Baill.)的干燥根及根茎[1]。具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经之功效[2]。掌叶大黄是我国药用大黄的主要栽培品种,主产于甘肃、青海、西藏、四川等地的高寒、高海拔地带[3]。

RAPD技术是在PCR基础上,利用随机合成的一般为10个碱基的寡核苷酸序列为引物,分别与DNA的两条单链结合,在DNA聚合酶作用下,对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。 RAPD技术因其具有广泛性和通用性,简便易行,分析速度快,可实现自动化、DNA样品量少、成本低等优点,已成为中药研究领域最广的分子标记技术,在中药的分类和遗传关系分析、遗传多样性评价、资源保护等方面起到非常重要的作用[4]。

甘肃是全国药材主产地之一,据调查,甘肃省大黄商品主要为掌叶大黄[5],由于临床对大黄的广泛应用,大黄市场需求量很大,但长期无节制的采挖,野生资源严重破坏甚至枯竭,现多为人工栽培。目前,对掌叶大黄有效成分及含量、药理作用、组织培养研究较多,但在分子水平上对掌叶大黄的研究较少。本研究采集甘肃6个地区掌叶大黄为样品,应用RAPD技术对其进行遗传多样性和亲缘关系分析,为甘肃栽培品掌叶大黄的品质鉴定、质量评价和种质资源保护提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

2008年8月采集掌叶大黄根及根茎部,采集地点及编号(表1),置于硅胶中快速干燥,用于DNA的提取,所有样品经甘肃中医学院晋玲副教授鉴定。凭证标本存放于遵义医学院珠海校区细胞生物学研究室。

1.1.2 试剂

Taq酶、dNTPs、MgCl2、随机引物、EDTA均购于上海生工生物技术有限公司,琼脂糖(Amresco)、CTAB(Sigma)、巯基乙醇(Sigma)、DL 15 000 bp 、DL 2000 bp DNA Marker由大连TaKaRa公司提供,其余化学试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

Hema-8000型PCR仪(珠海黑马仪器厂);岛津UV-2550型紫外分光光度计(日本岛津);DYC型电泳仪(北京六一仪器厂);WFH-202B紫外透射分析仪(上海精科实业有限公司);5810R型冷冻高速离心机(eppendorf)。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

采用CTAB法,并做适当修改。提取的DNA测定OD值,计算其浓度,琼脂糖凝胶电泳检测提取质量,-20℃冰箱备用。

1.2.2 PCR扩增及电泳

以2个随机个体的基因组DNA为模板,对120条随机引物进行初筛,筛选出具有多态性的引物,用其对每个样品进行PCR扩增。

为提高RAPD的稳定性和特异性,通过预试验对PCR反应条件进行优化,最终确定反应体系总体积为20μl,其中包含模板25ng、随机引物0.3μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U、4种dNTP各0.4mmol/L、MgCl2 1.5 mmol/L。反应程序为94℃预变性8 min;94℃变性1 min;36℃,退火1min;72℃延伸1.5 min;共40个循环;72℃后延伸6 min。PCR反应结束后,扩增产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测,观察并拍照。每个引物对各个样品扩增2次。

1.2.3 数据记录与处理

根据PCR扩增产物电泳结果进行统计分析,在某个迁移位置,如果有清晰可辨电泳条带记为1,无条带记为0,应用Ntsys2.10软件进行分析,计算任意2个样品间的遗传距离和不同居群间的遗传相似性,非加权组法(UPGMA)法进行聚类分析并建立亲缘关系树系图。

2 结果与分析

2.1 多态性引物的筛选及PCR扩增结果

扩增结果至少在两个样品间有差异的引物作为多态性引物,在120条随机引物筛选出10条扩增条带清晰、重复性好的引物作为多态性引物,引物序列及RAPD扩增多态性百分率(表2),对所有样品进行扩增。部分扩增结果(图1),共获得51条大小在250～1 600bp之间谱带,其中33条(64.7%)显示多态性。

M:DL2000 marker;1～6:样品编号同表1。

M:DL2000 marker; 1-6:Materials No.is same as in Table 1.

2.2 亲缘关系聚类分析

RAPD标记聚类结果表明,漳县三岔乡和岷县岷山乡品种亲缘关系最密切,相似系数最高,遗传差异性最小,首先聚在一起,而后再与岷县麻子川乡、漳县碧峰乡的品种聚在一起,表明品种来源越近,并不能完全代表亲缘关系越近,聚类分析结果显示6份甘肃不同地区品种在聚类图相似系数为0.65附近聚为一类,虽然6份样品来源地不同,但都属于同一省份的掌叶大黄。

1～6 实验样品采集地编号同表1。

1-6:The locations of experimental sample that are the same as in Table 1.

3 讨论

遗传多样性是指地球上所有生物个体基因中的遗传信息的总和,物种所在群体的遗传多样性越高,其稳定性越高[6]。而DNA分子标记技术,也称DNA分子诊断技术,是通过直接分析遗传物质的多态性来 诊断生物内在基因排布规律及其外在形状表现规律的技术[7],已被广泛应用于植物的遗传图谱构建、植物分类和鉴定、物种进化与亲缘关系分析、遗传多样性和差异分析等研究领域[8,9,10]。由于该方法具有准确、可靠、高效率等优点,它有效弥补了药材质量评价经典方法中采用的性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定的不足,在药材品质鉴定等方面,逐步呈现更好的趋势并发挥独特的作用。

对甘肃省六个地区掌叶大黄样品,本课题组曾通过核糖体DNA(ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列对其进行亲缘关系分析,ITS序列基因片段短,大小约为700bp的片段,试验结果显示6个不同产区掌叶大黄rDNA ITS序列均相同[11],在此基础上,本研究再次对样品进行RAPD分析,RAPD技术是利用一系列随机引物对生物整个基因组DNA进行多态性检测,由于检测区域覆盖整个基因组,因此对不同品系的微小差异都可以检测[12],RAPD结果能提供丰富的遗传信息,极大地提高遗传多样性的分辨率。实验中通过控制PCR条件和增加实验重复次数来增强RPAD技术的可靠性,经RAPD分析,结果显示,10条多态性引物共扩增得到51条电泳条带,大小在250～1 600bp之间,33条为多态性条带,多态性比率为64.7%,虽然六个地区掌叶大黄样品地理位置较近,但仍表现出一定程度的多样性,证明品系之间稳定性较高。

从聚类图上分析,漳县三岔乡和岷县岷山乡品种亲缘关系最密切,表明地理位置与亲缘关系不一定完全正相关,但这两个品种与岷县麻子川乡、漳县碧峰乡相对亲缘关系较近,表明与其所处的地理位置也表现了一定的相关性,聚类分析结果最终将6份样品在聚类图相似系数为0.65附近聚为一类,表明都来自同一省份的掌叶大黄亲缘关系相对较近。

参考文献

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RAPD分析 篇7

关键词：单叶蔓荆,遗传多样性,随机扩增多态性

单叶蔓荆(Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.)的干燥成熟果实为我国传统中药材蔓荆子的来源之一,蔓荆子始载于《神农本草经》[1],在我国已有2 000余年的栽培和药用历史,有疏散风热、清利头目之功效,用于治疗风热感冒、头痛、齿龈肿痛、目赤多泪、目暗不明、头晕目眩等[2]。单叶蔓荆主产于山东、江西等省,而蔓荆子的另外一种药源植物蔓荆(Vitex trifolia L.)则主要分布在广西等地。近年来,随着各地引种栽培活动的频繁以及规范化种植的需要,对蔓荆子种质资源遗传多样性的研究日益受到人们的关注。运用显微鉴别方法、薄层色谱和紫外吸收光谱法可以辨别蔓荆子及其混淆品牡荆子[3],而利用扫描电镜法可以区分单叶蔓荆和蔓荆,但是种内的遗传多样性不明显[4]。1990年美国杜邦公司农产品研究中心的Williams等[5]第一次用随机排列的10碱基寡核苷酸作为单引物扩增寻找多态性DNA片段获得成功,他们称之为随机扩增多态性(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)技术。Nakai等[6]用RAPD技术对淫羊藿属8种植物进行了DNA分析,此后,应用RAPD技术对药材道地性的研究逐渐增多,RAPD技术以其快速、微量、特异性强、准确可靠且不受生育阶段、供试部位、环境条件、储藏因素等的影响,在中药分类、鉴定研究中展示了广阔的应用前景。本研究采用RAPD技术对7个不同产地的野生单叶蔓荆进行了遗传多样性分析。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

来源于不同居群的野生蔓荆于2009年8月份定植于山东中医药大学药圃内,分别编号为V1~V7,不同居群蔓荆的产地及生长环境,见表1。蔓荆株行距1 m×1.2 m,于2010年7月份每居群选取1株,每株剪取15 cm左右长度的新梢3支,于浓度0.9%的蔗糖水溶液中暗培养48 h,取叶片以去离子水洗净,拭干。

1.2 仪器与试剂

Eppendorf Mastercycler gradient PCR仪;Universal HoodⅡ型紫外凝胶成像系统;RAPD随机引物(购于济南博亚生物技术有限公司,长度为10 bp)。

2 方法与结果

2.1 总DNA的提取

DNA提取参照CTAB法[7],各样品取少量叶片(约0.1 g),置于1.5 ml离心管中,液氮充分冷冻,用预冷的塑料研杵迅速充分研磨至粉状。每管加入800μl的2%CTAB抽提缓冲液[0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、0.02 mol/L EDTA(pH 8.0)、1.5 mol/L NaCl(pH 8.0)、2%CTAB(W/V)],轻轻摇动混匀,置于60℃水浴中,约10 min摇动1次,30 min后取出;冷却2 min后,加入氯仿至满管,剧烈震荡3 min,轻轻颠倒混匀;12 000 r/min离心5 min,上清转至装有800μl预冷异丙醇的EP管中,轻轻颠倒混匀,静置5 min。吸出上清,沉淀用70%乙醇洗涤2次,吹干,用50μl 0.5×TE缓冲液(含Rnase)溶解,37℃放置15 min,BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪测定DNA样品浓度,-20℃保存备用。

2.2 随机引物的筛选

按照各模板DNA的浓度计算所取体积,最终配置该含有等浓度7种DNA样品的混合样品(Pool),对160个随机引物进行筛选,得到10个条带较多且清晰、多态性较好的引物。见表2。

2.3 扩增

RAPD-PCR反应体积为25μl,其中包括1×buffer、2.5 mmol/L MgCl2、100μmol/L dNTP、0.2μmol/L引物、1 U Taq酶及30 ng模板DNA。扩增条件为:94℃预变性3 min;94℃预变性30 s,40℃预变性60 s,72℃预变性90 s,40个循环;72℃预变性5 min;4℃保存。

2.4 RAPD扩增产物检测

从上述10个条带中随机选取两个引物进行PAPD扩增产物检测,即P20和P27。取5μl扩增产物加1μl上述缓冲液,混匀,于含0.05%溴化乙锭的0.7%的琼脂糖凝胶上电泳检测,电极缓冲液为0.5×TBE,电压为5 V/cm,Maker 2 000为参照,用紫外凝胶成像系统拍照,电泳结果见图1。

2.5 数据记录与统计

RAPD为显性标记,同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性。将PCR扩增的DNA电泳条带作为位点记录下来,若某个扩增条带在一个样品中出现,记作“1”,未出现的记作“0”。原始数据的整理采用Excel软件,利用NTSYS-2.10e软件进行遗传相似系数计算和UPGMA方法聚类分析,结果分别见表3和图2。

注:“-”表示此处数据与对角线对称位置数据相同,故不再重复标出

3 讨论

3.1 蔓荆基因组DNA的提取

在提取DNA之前,新梢和叶片在0.9%的蔗糖水溶液中暗培养48 h可以降低淀粉、色素等干扰物质对DNA提取的干扰。本研究采用CTAB小量法提取DNA,所得基因组DNA的提取率和纯度都比较高,对DNA样品进行RAPD扩增分析,结果表明,这些DNA样品均可以扩增出谱带,且扩增带型清晰度较高,有效地排除了叶绿素及次生代谢产物对PCR扩增结果的影响。另外模板中残留的氯仿、异丙醇等小分子有机物会影响Taq酶活性,为了得到纯度较高、有保证的扩增结果,最好用70%乙醇抽提2~3次,然后以含Rnase的TE缓冲液溶解,排除样品中少量RNA的影响。因为提取过程中各重复结果之间也会出现一定的差别,所以在使用之前每管所得DNA模板都必须在测定浓度之后,根据浓度确定PCR所需模板DNA溶液的体积,否则可能会导致条带不清晰、假阳性等异常结果。

3.2 各产地野生蔓荆RAPD标记遗传多样性

本实验利用RAPD分子标记对我国蔓荆子主要产地山东、江西、安徽等7个地区的野生蔓荆进行了遗传多态性分析,从160条RAPD引物中筛选出扩增条带清晰、重复性高的引物10条(表1)。RAPD扩增的条带在250~2 500 bp之间,10条引物共扩增出88条带,多态性条带为46条,多态性比率为52.3%。

由聚类分析(图2)可见,各种质之间均存在一定的遗传差异,7个样本大致可以分为4组,在相似系数0.84的水平上V3和V5聚为一组,V6和V7聚为一组,而在0.80的水平上V1和V2聚为一组,V4单独一组。说明V3和V5、V6和V7相似系数较高,V1和V2次之,另外,V1、V2、V3、V5之间的遗传相似性较强,而它们与V4、V6、V7的遗传关系较远。这种遗传关系可能是在人工引种的基础上[8],由长期的自然变异导致的,尚需进一步的考证。

3.3 小结

根据吴永忠等[9]的报道,其测定的样品中山东牟平姜格庄、江西星子蓼花和江西都昌多宝与本研究所采样品在地域分布上相距较近,可以认为是来自相同产区的样品;研究发现,江西两地所产蔓荆子药材中蔓荆子黄素含量为0.218 9%和0.197 6%,是山东牟平所产蔓荆子含量(0.074 3%)的2~3倍。而本研究结果显示,V2(山东牟平)与V5(江西多宝)之间的遗传相似性要高于V5与V6(江西都昌)之间的遗传相似性,是什么因素导致了蔓荆子化学多样性与其种质的遗传多态性之间的差异呢?初步判断可能由以下原因造成:第一,RAPD分析的遗传多态性并不一定能够体现相关化学成分合成途径中关键基因的表达差异,本实验数据显示,各种质之间均具有一定程度的遗传差异,但所有的种质之间的最大遗传差异为0.307(表3中V7与V2、V4的交叉处),这充分说明对于蔓荆而言种内的遗传关系总体来说是较近的,而少量遗传物质的差异是否直接与相关化学成分的合成有关还不得而知;第二,环境因素对相关化合物含量的影响可能大于遗传距离的影响,干旱、盐碱等胁迫条件是否促进了植物的逆境应答,在应答机制里面相关成分是否起到了重要作用。以上研究都与植物逆境生理及植物功能基因组学有着密切的关系,这些问题的解答必将促进药用植物化学多样性与遗传多态性的关系研究,同时为药材资源的整理、创新以及规范化栽培提供科学参考。

参考文献

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RAPD分析 篇8

1 材料和方法

1.1 材料来源

根据2004年9~12月和2005年3~5月2次印度洋西北部公海海域鸢乌贼资源调查结果,在27个站点中共采集鸢乌贼肌肉样本200尾(表1),其胴长范围为20.3~53.0 cm,平均胴长为36.7 cm。肌肉样本用75%的酒精固定并保存于4℃的冰箱中备用。根据形态学特征及其空间分布,选取了12个站点48尾鸢乌贼的肌肉样本进行RAPD分析(图1)。

1.2 试验方法和数据处理

1.2.1 基因组DNA的提取和检测

取肌肉样本25~30 mg加液氮后碾碎,-70℃保存备用。采用基因组DNA纯化试剂盒(SK1252,Sangon公司生产)提取基因组DNA。用Beckman DU-650紫外分光光度计检测DNA的含量,并用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量。检测后的基因组DNA放置于-20℃冰箱中备用。

1.2.2 PCR-RAPD扩增反应及电泳

PCR-RAPD所采用的随机引物由上海Sangon公司合成。扩增反应中体积为25 μL,其中包括10×Taq buffer 2.5 μL,dNTPs(Fermentas公司生产,25 mol·L-1)0.5 μL,MgCl2(Fermentas公司生产,25 mmol·L-1)2.5 μL,Taq DNA Polymerase(Fermentas公司生产,5 μ·μL-1)0.2 μL,随机引物(Sangon公司生产,50 μmol·μL-1)0.5 μL,基因组DNA 1μL(50~100 ng·μL-1),ddH2O 17.8 μL。

PCR扩增在GeneAmp PCR System 9700 PCR仪上进行,所有样本对每一个引物都进行1~2次扩增反应。反应条件为经94℃预变性2 min后,接着40个循环,每个循环包括94℃变性15 s,35℃复性60 s,72℃延伸90 s,最后是72℃终延伸10 min,4℃保温。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,EB染色,凝胶成像系统(genius bio imaging system,GENE公司生产)观察、拍照并记录。

1.2.3 数据处理

根据电泳后记录下清晰的扩增条带进行数据统计,在RAPD图谱中相对位置无条带的用“0”表示,在相对位置有条带的用“1”表示,将RAPD图谱转化成0、1矩阵,利用Popgene 1.31软件计算不同站点鸢乌贼样本的遗传相似度(S)和遗传距离(D)。计算公式为:

undefined;D=1-S

式中Nxy为X、Y 2个样本共有的扩增条带,Nx、Ny分别为X、Y样本各自拥有的扩增带。

采用PHYLIP(phylogeny inference package,

Ver.3.5)软件包中的NEIGHBOR程进行UPGMA(unweighted pair-group method with arithmetic average)聚类分析。参照恽锐等[10]的方法,用Shannon多样性指数计算种群的遗传多样性,其平均值即为种群的遗传多样性。计算公式为:

h=-∑pilog2pi

式中pi为某位点的表型频率,包括有带样本的频率和无带样本的频率,h为该位点的表型多样性,即样本在该位点出现“有带”或“无带”的不确定性。

利用Arlequin2.0软件进行分子方差分析(analysis of molecular variance,AMOVA),计算其遗传分化指数(GST),GST即为种群间的遗传多样性占种群多样性的比例,以检测鸢乌贼种群内和种群间的遗传变异情况的显著性。计算公式为:

undefined

式中HT为种群的总遗传多样性,HS为种群内平均遗传多样性。

2 结果

2.1 RAPD扩增结果

PCR-RAPD试验所使用的16个随机引物中,经过筛选,选取扩增条带丰富且稳定性好的8个引物进行分析,引物序列见表2。每个引物均可得到条带清晰且重复性好的扩增图谱,扩增条带为3~8,其分子量大小为200~1 500bp。图2为引物R8的扩增图谱。

2.2 UPGMA分析

将RAPD图谱转化成0、1矩阵,经过POPGENE1.31处理,根据NEI[11]的方法可得出各个样本间的遗传相似性指数(S)和遗传距离(D)。根据遗传距离,利用PHYLIP软件包中的NEIGHBOR程序进行UPGMA聚类分析,得出48尾鸢乌贼样本的聚类图(图3)。

由图3可知,18°N~20°N海域4个站点的16尾样本聚集在一起,且样本间的最大遗传距离为0.4858,可以推测认为,该海域的鸢乌贼形成一个种群。而在13°N~18°N海域的8个站点的32尾样本中,除第23号样本外,其余样本都聚集在一起,且样本间的最大遗传距离为0.4767,该海域的鸢乌贼也同样形成一个种群。因此,根据UPGMA聚类分析,可以得出在13°N以北的印度洋西北部海域鸢乌贼存在2个不同种群,且2个种群之间的遗传距离为0.1338,遗传相似性指数为0.8748。

2.3 遗传多样性

利用Shannon多样性指数计算印度洋西北部海域鸢乌贼种群的遗传多样性,其平均值即为种群的遗传多样性。计算结果表明,印度洋西北部海域鸢

乌贼种群平均每个位点的多样性指数为0.3676±0.1801,由此可以看出其种群的遗传多样性较高,种群分化较大。

2.4 DNA多态性与遗传分化

根据获得的RAPD扩增带,计算种群间的多态位点比例(表3),2个种群多态位点比例分别为68.75%和93.75%,这说明印度洋西北部海域鸢乌贼2个种群均保持较高的遗传多样性。以种群内不同扩增图谱类型之间的遗传差异值为基础,计算种群的遗传多样性,18°N~20°N海域鸢乌贼种群的遗传多样性为0.2072,13°N~18°N海域鸢乌贼种群为0.1656,其平均值为0.1864。

GST是用来判断种群间的遗传分化情况,当GST<0.05时,种群间没有遗传分化;当0.050.25时,种群间的分化程度非常高。印度洋西北部12°N以北海域鸢乌贼种群总遗传多样性为0.2375,种群内平均遗传多样性为0.1864,可以得出其种群间遗传分化指数为0.2150,即21.5%的遗传变异来自于种群间,而78.5%来自于种群内。该结果表明,不同种群间在遗传背景上存在较

大的差异,且种群内的遗传变异水平较高。

3 讨论

3.1关于印度洋西北部海域鸢乌贼种群结构的探讨

通过对印度洋西北部海域鸢乌贼样本的RAPD分析,并根据遗传距离对其进行UPGMA聚类,发现18°N~20°N海域4个站点的16尾鸢乌贼样本聚集在一起,形成了一个种群,而13°N~18°N海域8个站点的32尾鸢乌贼样本聚集在一起,形成了另一个种群。对这2个不同种群的形态学参数进行统计,18°N~20°N海域鸢乌贼胴长为45.4~53.0cm,平均胴长为48.9±2.81cm,而13°N~18°N海域胴长为20.3~51.2cm,平均胴长为36.3±8.03cm,优势胴长为32.0~42.0cm。经单因素方差(ANOVA)分析2个种群间的胴长的P=0.00002<0.05,差异性显著。陈新军等[12]认为印度洋西北部海域鸢乌贼分为形态特征存在一定差异性的3个种群:大型种群、中型种群和小型种群,其中大型种群主要分布在18°N以北海域,中型种群主要分布在12°N~18°N海域,小型种群主要分布在12°N以南及赤道附近海域,且这3个种群重叠分布;谷津明彦[3]也认为该海域的鸢乌贼存在3个不同体型的种群,此文所得出的种群结构与陈新军、谷津明彦等研究的结果基本一致。因此,印度洋西北部13°以北海域鸢乌贼种群在形态学与遗传上都可以被区分为18°N~20°N、13°N~18°N2个不同的种群。

3.2 印度洋西北部海域鸢乌贼的遗传多样性

Shannon多样性指数表示种群间的多样性占总多样性的比例,可以用来估测遗传多样性在种群内和种群间的分布,即估测种群的遗传分化程度。利用Shannon多样性指数计算出的印度洋西北部海域鸢乌贼的遗传多样性指数为0.3676±0.1801,为较高的水平。由于其遗传多样性水平较高,种群分化较大,从侧面可以说明印度洋西北部海域鸢乌贼2个种群在形态上差别很大的原因。

另外,此研究结果还揭示,与18°N~20°N海域鸢乌贼种群相比,13°N~18°N海域鸢乌贼种群拥有较高的多态性位点比例,而遗传多态性却相对较低(表3),这一结果可能与所选用8条RAPD引物有关;笔者因此推测出13°N~18°N海域鸢乌贼可能所受的捕捞压力相对较大,生长速度较快。基于此研究的分析结果,该海域鸢乌贼2个种群间在遗传背景上存在较大的差异,且种群内的遗传变异水平较高,笔者认为,对该海域鸢乌贼资源的规模性开发还处于较合理水平。

3.3 RAPD结果的分析方法

种以下类群包括亚种、品种及地理种群等,遗传分析的目的在于了解遗传多样性、鉴别种群、分析种群间的差异大小和微进化等,多数学者采用2种方法对RAPD结果进行处理并对上述问题进行探讨[13,14,15]:(1)寻找种群的特有遗传标记,据此可以鉴别不同的种群;(2)基于遗传相似率的分析,包括相似率比较、遗传距离分析、聚类分析等。此研究在进行RAPD实验过程中未能寻找到用于区分印度洋西北部海域鸢乌贼2个种群的RAPD分子标记,这可能是由于在此次实验中使用引物较少的原因所造成的。因而,此研究选用了第2种分析方法。

RAPD分析 篇9

RAPD(Random amplified polymorphic DNAs)技术具有简便、快速、灵敏度高等特点,被广泛应用于水产动物群体遗传学中种属分类鉴定[4、5]、动植物遗传连锁图谱的建立[6、7]、基因定位和分离以及杂交后导入基因的追踪[8]等。本研究采用RAPD技术对取自长江下游南京江段、高邮湖以及太湖3个地区的日本沼虾样品的遗传多样性进行检测,以期了解不同地区的虾群之间的遗传差异,为日本沼虾种质资源的保护和合理开发利用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用日本沼虾于2007年5月~7月分别取自长江下游南京江段、高邮湖和太湖,共51尾,分别记为:长江种群(CJ,17尾)、高邮湖种群(GY,17尾)、太湖种群(TH,17尾)。取样点剪下其肌肉组织,无水乙醇-20℃保存。

1.2 基因组DNA的提取

每尾取约100 mg背部肌肉剪碎,加裂解缓冲液600 m L于1.5 m L离心管中,缓慢混匀;再加蛋白酶K(20 mg/m L)至终浓度100μg/m L,混匀,56℃放置3 h;然后再加适量的RNA消化酶,37℃消化30 min,等体积混合液(酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1)抽提多次至无中间蛋白质层后加入等体积氯仿抽提1~2次;最后,用75%的乙醇和无水乙醇各洗两次,常温下晾干,加适量TE溶解。用凝胶电泳检测法和紫外分光光度计检测法检测所提取的DNA样品质量。

1.3 随机引物

本研究所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,从20个随机引物中筛选出10条条带清晰、多态性好、重复性佳的引物进行扩增,引物见表1。

1.4 RAPD-PCR反应

RAPD反应总体积为25μL,其中包括10×PCR buffer 2.5μL(成分:100 mmol/L Tris-HCl,500mmol/L KCl);Mg Cl2(25 mmol/L)2.0μL;d NTPs(各2.5 mmol/L)1.6μL;RAPD引物(10μmol/L)1.0μL;模板DNA 20 ng;Taq酶(Ta Ka Ra,5U/μL)0.2μL;用dd H2O补足体积。RAPD反应在Bio-Rad Mycycler扩增仪上进行,94℃预变性4min后进入40个PCR循环,每个循环包括94℃30 s、37℃30s、72℃1 min,最后于72℃延伸10 min。每次反应均设不含模板的空白对照。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,EB染色,紫外灯下检测,拍照。

1.5 数据分析方法

根据观察结果,扩增条带有且清晰记为1,否则记为0,构建原始数据表征矩阵,并据此统计位点总数和多态位点比例,遗传相似度(I)和遗传距离(D)根据Nei[9]的公式计算,群体的遗传多态度(H)根据Shannon多样性指数[10]计算,聚类分析及群体分化系数(Gst)的计算均由Pop Gen软件完成;采用非加权的组平均法(UPGMA)对遗传距离系数矩阵进行聚类分析,构建聚类关系图。

2 结果

2.1 RAPD扩增结果

本实验筛选出的10个引物(见表1)共产生54条扩增带(平均每个引物产生6条带),片段大小在200~2 500 bp。多态性带有47条,多态位点占总位点的比例为87.04%(图1)。

注:C1-C17分别表示长江群体17个个体;M:Marker(DL2000)

2.2遗传多样性与聚类分析

对3个不同野生群体日本沼虾进行群体内与群体间的遗传多样性分析,结果显示:长江、高邮湖、太湖各群体的多态位点数分别为39、29、34,多态位点比例分别为72.22%、53.70%、62.96%,基因多样性指数分别为0.2878、0.2380、0.2635,其中,长江群体获得的多态位点最多,为39个,比例最大(72.22%);高邮湖群体的多态位点数目最少,为29个,比率最低(53.70%)。各群体的基因多样性指数分别为:长江(0.2878)>太湖(0.2635)>高邮湖(0.2380),平均值为0.2631(见表2)。群体间的遗传距离和遗传相似度如表3所示,遗传距离最大值表现在长江和高邮群体之间,为0.2417;最小在长江和太湖群体之间,为0.0977;各群体两两之间的Gst和Nm值分别在0.1199-0.2387和1.5949-3.6708(见表4)。

3讨论

生物群体的遗传多样性是评价生物资源状况的一个重要依据,它是物种适应多变的环境条件、维持长期生存和进化的遗传基础。宋平等[11]对黄颡鱼进行RAPD标记,检出A,B两个群体的黄颡鱼多态性位点数占总位点数的百分率分别为28.42%和26.09%,初步分析认为黄颡鱼具有较丰富的遗传多样性;权洁霞等[12]进行了梭鱼(Liza haematocheila)群体的RAPD分析,遗传多样性指数为0.2124(养殖群体)和0.2271(野生群体),认为黄河口海域梭鱼遗传多样性比较丰富。本文研究结果显示,在所检测到的54个位点中47个位点显多态性,多态位点比例为87.04%,遗传多样性指数为0.2380-0.2878,相比之下,长江、高邮湖和太湖群体野生日本沼虾基因组存在一定水平的遗传变异,遗传多样性较丰富。

本研究的3个日本沼虾的地方种群分别采自长江流域南京江段、高邮湖和太湖,且均为野生群体。结果表明,长江群体和太湖群体间的遗传差异较小,遗传距离是0.0977,高邮湖和太湖群体之间的遗传距离为0.1106,长江和高邮湖群体之间遗传距离较大,为0.2417。可见,遗传距离与实际的地理距离与水系有一定的相关性,如长江下游南京江段与高邮湖之间实际地理距离最远且分属长江、淮河两大不同水系,长江群体和高邮湖群体间的遗传距离也最大;长江南京江段和太湖之间实际地理距离最近且同属长江水系,所以,长江群体和太湖群体之间的遗传距离也最小。

不同地方日本沼虾种群的遗传多样性研究不仅具有理论意义,而且对日本沼虾的资源保护和遗传育种材料的选择具有十分重要的意义。尽管我国淡水养殖的虾类很多,但广泛分布的本土虾类只有日本沼虾,因此日本沼虾是我国生物资源的重要组成部分,有必要进行多态性调查和资源保护。另一方面,日本沼虾的退化,需要对日本沼虾的种质进行改良,而对各地方种群的特性及相互间差异的了解则是遗传育种的基础。本研究获得的日本沼虾RAPD谱带遗传多样性数据可以作为一种相对的指标,对今后日本沼虾遗传变异水平及其变动趋势的分析提供依据,并将促进青虾种质资源评价的科学化。

参考文献

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[9]Nei M.The theory of genetic distance and evolution of human races[J].Human Genetics,1978,23(4):341-369.

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[11]宋平,潘云峰,向筑,等.黄颡鱼的RAPD标记及其遗传多样性的初步分析[J].武汉大学学报(理学版),2001,47(2):233-237.

RAPD分析 篇10

RAPD又称随机扩增多态DNA技术, 是由WILLIAMS等[14]及WELSH和MCCLELLAND[15]等人于1990年同时创立的, 因RAPD技术具有简单快速、灵敏度高、通用性好等优点, 被广泛应用于物种的鉴定、种群结构分析以及遗传多样性研究等领域。线粒体DNA (mitochondrial DNA, mt D-NA) 具有母性遗传、进化速度快、多态性强等特点, 已成为鱼类进化生物学和群体遗传学研究的重要遗传标记[16,17]。同时线粒体Cyt b基因是线粒体DNA上的蛋白质编码基因, 其进化速度适中, 适合种群水平差异的检测, 是探讨种间和种内遗传分化程度的良好标记[18]。文章采用RAPD和线粒体Cyt b基因序列分析2种技术针对广东沿海斜带石斑鱼的3个养殖群体 (惠州、深圳、湛江) 进行遗传差异分析, 目的是从DNA水平上揭示其遗传背景, 了解人工养殖对遗传多样性的作用和影响, 从而为斜带石斑鱼的资源保护和利用、人工繁殖与养殖、遗传改良与育种等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与DNA提取

斜带石斑鱼3个群体样品分别取自广东3个养殖基地石斑鱼繁育群体的子一代 (惠州澳头、简称HZ, n=26;深圳南澳、简称SZ, n=15;湛江东海岛、简称ZJ, n=34;n为样本数) , 这些养殖群体的繁育群体是由从当地海域捕获的野生个体组成。值得一提的是, 由于斜带石斑鱼野生资源衰退, 这些繁育群体的数量非常有限。剪取鱼体尾部少量组织放入-180℃液氮罐中保存, 运回实验室后转入超低温冰箱 (-80℃) 备用。基因组DNA的提取方法参照SAMBROO等[19]的方法进行, 略调整。具体为取鱼体尾部组织约50mg, 置于1.5 m L Eppendorf管中, 用STE缓冲液漂洗2次;加500μL STE缓冲液, 用干净的剪刀剪碎组织, 混匀后加入10%SDS溶液50μL和蛋白酶K (20 mg·m L-1) 5μL, 56℃消化4 h;用等体积的苯酚 (Tris饱和, p H=8.0) , V (苯酚) ∶V (氯仿) ∶V (异戊醇) =25∶24∶1抽提2次 (混合5 min, 离心3 min, 取上清) , 再用1倍体积氯仿抽提1次 (混合5 min, 离心3 min, 取上清) ;加2倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA (12 000 r·min-1离心5 min, 弃上清) ;用70%乙醇洗涤沉淀2遍, 管壁倒扣、室温干燥1.5 min;最后加入200μL TE或无菌超纯水溶解DNA, 4℃过夜后-20℃保存备用。

1.2 RAPD检测

PCR反应条件如蒙子宁等[11]所述, PCR反应体系总体积为25μL, 内含10×Taq缓冲液2.5μL、25 mmol·L-1Mg Cl21.5μL、2.5 mol·L-1d NTP (MBI) 1μL、5μmol·L-1引物 (上海生工) 1μL、5U Taq DNA聚合酶 (MBI) 0.2μL、以及10 ng·μL-1基因组DNA 2μL, 用16.8μL超纯水补足体积至25μL。PCR反应过程为95℃预变性5 min、后经过45个循环 (94℃1 min→36℃1 min→72℃2min) , 最后72℃延伸10 min。PCR产物用含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳分离, 于Gel Doc2000 (Bio-RAD) 自动成像仪上观察。所用引物购自或委托上海生物工程技术服务有限公司 (上海生工) 合成。

1.3 线粒体Cyt b基因片断扩增及测序

从斜带石斑鱼每个群体中随机选取各4尾进行线粒体Cyt b基因片断的扩增及测序。所用引物序列为上海生工合成 (表1) 。PCR反应条件同样参照蒙子宁等[11]的条件, PCR反应体系总体积为25μL, 包括2.0 mmol·L-1Mg Cl2、0.2 mmol·L-1d NTP、0.2μmol·L-1引物 (上海生工, 表1) 、1 U Taq plus DNA聚合酶 (MBI) 、1×Taq聚合酶缓冲液、及30 ng基因组DNA。PCR反应过程包括94℃预变性2 min、后经过30个循环 (94℃45 s→50℃1 min→72℃1 min) , 最后72℃下延伸10min。PCR产物用UNIQ-5 (上海生工) 柱式纯化试剂盒纯化后, 在ABI 377型自动测序仪 (Perkin Elmers) 上进行双向测序。

1.4 数据分析

RAPD电泳图谱中的每一条清晰、明亮而且重复性好的条带记为1个位点, 出现带的记为1, 没有出现带的则记为0, 建立“1/0”矩阵。应用PopGene 1.31软件对矩阵进行统计处理, 分别统计多态位点百分率 (P) 、基因多样性 (h) 和香农信息指数 (i) 等遗传参数 (H) , 用以评估斜带石斑鱼群体遗传多样性水平。对h和i进行t检验, 用以检测群体遗传多样性的差异程度和水平。采用TFPGA软件来计算斜带石斑鱼群体间的遗传相似度 (I) 和遗传距离 (D) 。

应用Clustal X 1.83和Genedoc软件对线粒体Cyt b基因序列进行拼接, 同时结合人工校正进行对位排序。通过MEGA 4.1软件统计基因序列的碱基组成, 采用非加权组平均法 (UPGMA) 和邻接法 (NJ) 分别构建分子系统树, 通过Bootstrap 1 000检验分子系统树各分枝的置信度。用Dna SP 5.1软件计算出变异位点、核苷酸多样性及平均核苷酸差异数。

2 结果

2.1 RAPD分析

通过生物软件Pop Gene 1.31对RAPD条带所构建的“0/1”矩阵进行分析统计, 斜带石斑鱼3个群体的P为28.30%~32.08%、i为0.142 9~0.163 8、h为0.094 8~0.108 7 (表2) ;t检验各群体的遗传多样性差异不显著 (P>0.05) (表3) ;3个群体间的I很高 (0.967 1~0.980 8) 、D很小 (0.019 4~0.033 5) (表4) , 表明群体间无明显遗传分化。

2.2 线粒体Cyt b

测序得到长度为469 bp序列 (Gen Bank登录号DQ448043~DQ448045) 。通过与NCBI数据库中的相关序列进行比对分析, 所得序列前1~39 (39bp) 为tRNAGlu基因, 47~469 (423 bp) 为Cyt b基因 (起始密码子为ATG) , 两基因之间有7 bp的间隔区。斜带石斑鱼3个群体的线粒体Cyt b基因序列经比对未见插入和缺失, 423 bp序列中只存在4个变异变点, 均发生在密码子的第三位点, 为C/T转换替代, 核苷酸多样性 (0.003 8) 和平均核苷酸差异数 (1.621) 均非常低。就碱基组成而言, T、C、A和G平均含量分别为28.5%、30.6%、25.8%和15.1%;A+T含量为52.8%。密码子第一位点和第二位点各碱基相对均匀, 无明显偏倚;但密码子第三位点的碱基明显偏倚, 特别是鸟嘌呤G (2.1%) , 远低于平均含量15.1% (表5) 。

从Gen Bank取得尖吻鲈 (Lates calcarifer) (登录号NC_007439) 的相应线粒体Cyt b基因片段作为外群 (outgroup) 序列。NJ和UPGMA系统树拓扑结构基本一致 (图1) , 所检测个体并没有按照各自所属群体聚类, 而是相互聚在一起。显然, 斜带石斑鱼3个群体之间无明显的遗传分化。

3 讨论

3.1 RAPD与线粒体Cyt b的多态性

RAPD和线粒体Cyt b基因序列分析广泛应用于鱼类的物种鉴定、种群结构分析及遗传多样性研究[20]。该研究利用这2种分子标记技术分析了广东斜带石斑鱼主要养殖地区 (惠州、深圳、湛江) 3个养殖群体。试验仅用17条随机引物就检测到高达40.57%的多态位点, 但在所测定的斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因只检测出4个变异位点, 且变异位点仅存在少数个体中。可见, 对研究斜带石斑鱼种内遗传变异, RAPD技术较线粒体Cyt b基因序列分析具有更高的灵敏性和多态性, 这与BARDAKCI和SKIBINSKI[21]在进行罗非鱼遗传分析时得出的结论一致。究其原因, RAPD技术是利用寡核苷酸引物对核DNA进行随机扩增, 它不仅继承了聚合酶链式反应 (PCR) 高效灵敏的特性, 而且因其扩增的区域大多为非编码的核基因组, 积累较多变异, 因而RAPD标记又具有很高的多态性[22];与之相反, 线粒体Cyt b为蛋白质编码基因, 承受较大的选择压力, 变异性较小[23]。因此, 在应用线粒体基因于石斑鱼种内遗传分析时, 应选择变异较大的NADH脱氢酶基因或控制区, 以获得更多的遗传信息。

3.2 斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因的特点

此研究中斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因以ATG为起始密码子, 没有发现插入或缺失, 与tRNAGlu之间有7 bp的间隔区。一般认为, 鱼类的线粒体基因组结构较核基因组更为紧密, 蛋白质编码不含内含子且基因间分隔不到10个碱基, 使得线粒体基因组难以发生重排, 从而维持基因次序的稳定[24]。此外, Cyt b是鱼类线粒体基因组中较为保守的基因[23], 此研究所检测到的变异位点均位于密码子第三位点, 为沉默突变, 不导致氨基酸替代, 体现出该基因的保守性。斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因A+T含量为52.8%, 在已报道的硬骨鱼亚纲14种鱼类 (52%~60%) 接近下限[25]。斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因密码子第三位点的碱基偏倚明显, 鸟嘌呤G (2.1%) 远低于平均含量15.1%, 这种强烈的反G偏倚在鱼类中普遍存在。

3.3 斜带石斑鱼养殖群体的遗传差异

1) 群体内遗传多样性。尽管许多石斑鱼种类具有很高的经济价值, 但迄今有关石斑鱼遗传学的研究报道不多, 且集中在物种鉴定、种群结构和系统进化等方面, 涉及种内遗传多样性的有关于蜂巢石斑鱼 (E.merra) [26]的研究报道。P是反映物种遗传多样性水平的重要指标, 通过比较得出斜带石斑鱼的P (40.57%) 较蜂巢石斑鱼 (65.58%) 的低。除了物种差异外, 由于对它们的遗传背景知之甚少, 尚难究其原因。但值得指出的是, 蜂巢石斑鱼目前资源状况较好, 尚未被列入IUCN之濒危物种红色名录, 而作为印度洋-太平洋沿岸国家重要渔业对象的斜带石斑鱼承受着巨大的捕捞压力, 过度捕捞使斜带石斑鱼的自然种群破坏严重, 这势必会影响其遗传结构。此外, 该研究中的斜带石斑鱼为养殖群体, 不可避免受到养殖过程中瓶颈效应、遗传漂变和近交等因素的影响。

2) 群体间遗传差异。进一步对斜带石斑鱼3个养殖群体之间的遗传差异进行研究, RAPD分析表明, 群体的遗传多样性差异性不显著 (t检验, P>0.05) , 而且群体间具有很高的遗传相似度、遗传距离很小;进而Mantel检验得出群体间的遗传距离与地理距离无显著相关 (R=0.090 9) 。显然, 斜带石斑鱼群体间的遗传差异很小, 具有相似的遗传背景。线粒体Cyt b基因序列所检测到的核苷酸多样性和平均核苷酸差异数均非常低、通过NJ和UPGMA不同方法构建的系统树中, 所检测个体并没有按照各自所属群体聚类, 而是相互聚在一起, 表明斜带石斑鱼群体之间无明显的遗传分化, 这与RAPD的分析结果一致。该研究中斜带石斑鱼取自惠州的澳头、深圳的南澳和湛江的东海岛, 最近相距仅数十公里, 最远达五百公里, 但RAPD和线粒体Cyt b基因序列分析结果均表明, 这3个群体间的遗传差异很小。由此可见, 广东沿海斜带石斑鱼养殖群体具有较为相似的遗传背景。

3.4 保护斜带石斑鱼遗传多样性的建议

养殖群体繁育后代时普遍出现遗传多样性下降的问题[27,28], 这是制约水产养殖健康持续发展的一个主要因素。斜带石斑鱼是中国南方沿海省份主要海水养殖经济鱼类, 蒙子宁等[12]曾利用分子标记技术对其亲本及繁育后代的遗传多样性水平进行跟踪检测, 发现繁育群体规模小以及将繁育后代性成熟个体补充进入繁育群体, 将会产生较高的遗传漂变和近交效应, 这是导致繁育后代遗传多样性水平降低的主要原因。因此, 为避免人工养殖中斜带石斑鱼遗传多样性的丧失以及近交衰退的出现, 应1) 适当增加亲本数量, 维持一定的有效繁育群体大小;2) 补充与现有繁育群体遗传背景差异较大的亲本, 尽可能避免选择补充亲缘关系很近的群体, 一般来说野生种群的遗传多样性较高, 其性成熟个体应为补充亲本的首选。

然而随着斜带石斑鱼自然资源的日益衰退, 这样的首选亲本变得越来越少。可行的替代办法是选择地理相距较远, 遗传背景与现有繁育群体有一定差异的养殖群体中的性成熟个体作为补充亲本。该研究中, 广东沿海斜带石斑鱼养殖群体具有较为相似的遗传背景, 补充亲本的采集地点尽可能避免在省内, 应考虑中国海南岛、台湾或距离更远的泰国、新加坡等地, 甚至更远的国家或地区, 并进一步对各地斜带石斑鱼群体的遗传背景进行深入研究或跟踪了解, 以为人工增养殖提供参考。

摘要：斜带石斑鱼 (Epinephelus coioides) 为中国南方重要的海水增养殖经济鱼类, 但过度捕捞和人工养殖的快速扩张导致了其自然资源衰退和遗传多样性降低。文章采用随机扩增多态DNA (RAPD) 和线粒体细胞色素b (Cyt b) 基因序列分析方法, 对惠州、深圳和湛江3个斜带石斑鱼养殖群体进行了遗传多样性状况和遗传差异的研究。结果表明:1) 相比较于线粒体Cyt b基因序列分析, RAPD技术在研究斜带石斑鱼种内遗传变异方面具有更高的灵敏性和多态性;2) 相比较于其他已经报道的石斑鱼类, 斜带石斑鱼的遗传多样性较低, RAPD检测到的多态位点百分率 (P) 为40.57%, 究其原因, 可能是受过度捕捞和人工养殖的影响;3) RAPD检测到的群体间遗传相似度 (I) 高达0.967 1~0.980 8, 而Cyt b的核苷酸多样性仅为0.003 8;斜带石斑鱼养殖群体间的遗传差异显然很小, 具有相似的遗传背景。文章还探讨了斜带石斑鱼线粒体Cyt b基因的特点, 并针对目前斜带石斑鱼的养殖现状提出了相应保护遗传多样性的对策与建议。