血浆病毒灭活（共4篇）
血浆病毒灭活 篇1
自人类发现血型以来, 输血作为一种治疗措施在临床上得到了广泛应用, 挽救了无数患者的生命。血液成分病毒灭活的各个操作环节均十分重要, 本文主要探讨血浆病毒灭活操作中注射亚甲蓝后在血浆中停留时间对血浆颜色的影响, 报告如下。
1 材科与方法
1.1 血浆来源选用我血站无偿献血400 m L全血, 于采后24 h内3 000转/min离心10 min, 制备血浆100份备用。
1.2 试剂与仪器亚甲蓝光照袋、医用病毒灭活箱。
1.3 病毒灭活分为4个批次进行光照:
第一批:25袋血浆加入亚甲蓝后以最短的时间放入 (4±2) ℃医用病毒灭活箱光照;第二批:25袋血浆加入亚甲蓝后在5 min后放入 (4±2) ℃医用病毒灭活箱中光照;第三批:25袋血浆加入亚甲蓝后30 min后放入 (4±2) ℃医用病毒灭活箱光照;第四批:25袋血浆加入亚甲蓝后在60 min后放入 (4±2) ℃医用病毒灭活箱中光照。
2 结果
第一批:25袋血浆光照时间35 min后悬挂滤白柜中过滤, 血浆颜色为正常的淡黄色;第二批:25袋血浆光照时间35 min后悬挂滤白柜中过滤, 血浆颜色为浅的淡黄色;第三批、第四批共50袋血浆光照时间35 min后悬挂滤白柜中过滤, 血浆颜色为灰白色。
3 讨论
亚甲蓝静注后作用迅速, 并在组织内迅速还原为白色亚甲蓝。亚甲蓝本身系氧化剂, 根据其在体内的不同浓度, 对血红蛋白有两种不同的作用。病毒灭活为低浓度时6-磷酸-葡萄糖脱氢过程中的氢离子经还原型三磷酸吡啶核苷传递给亚甲蓝, 使其转变为还原型的白色亚甲蓝, 因此注射后血浆放置时间长均会变成灰白色。
血浆颜色的改变与亚甲蓝在血浆中停留的时间长短以及及时的光照和过滤有直接关系, 不可以让亚甲蓝在血浆中停留时间过长而不进行光照和过滤, 否则会影响血浆的颜色。因此建议注射亚甲蓝后应迅速进行光照和过滤。
血浆病毒灭活 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
在2011年3月至2012年3月中，每个月均随机抽取血浆5袋，每袋血浆为200m L，总数量为60袋，经过统计，其中A型20袋，男女各10袋；B型20袋，男女各10袋；O型血浆10袋，男女各5袋；AB型10袋，男女各5袋。该60袋血浆的采集制备过程均符合相关操作规程，且从采集到制备完成，时间均不超过6h，将每个血型血浆分为两份，一组使用亚甲蓝光化学法进行病毒灭活，另一组则不进行该项处理
1.2 一般方法
1.2.1 仪器及材料
仪器：威图半自动生化分析仪、贝克曼（J6-HC）大容量低温离心机、ACL-7000型血凝仪、HDME～1A型医用病毒灭活箱。
试剂与耗材：Fg含量和凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ活性的检测试剂盒、TP含量测定试剂盒、MBPF-B200ML型一次性使用病毒灭活输血过滤器等。各种医疗耗材及仪器的质量均达到标准。
1.2.2 病毒灭活过程
把血浆与一次性病毒灭活输血过滤器相连接，并使血浆处于水平位置较高的地方，便于少量的血浆导向MB外加元件，并保持一分钟的时间，血浆会先流经MB外加元件，再流入光照袋，并将其进行均匀混合，使之充分反应。再把已经混合了MB的血浆，且需要将光照袋和过滤器置于病毒灭箱内，采用光照额的方式杀灭血浆中的病毒。温度调整至5℃，摆动频率60次/min，光照强度3.5×104Lux，时间为30min左右。上述活动完毕后，将已经过灭活的血浆导出，并进行排气等后续处理。
1.2.3 观察指标及统计学处理
在本组实验中，主要是对血浆在进行亚甲蓝光化学法后的质量变化影响进行烟研究，对其的凝血因子的活性和总蛋白含量为主要考察指标。将两组结果数据进行统计学，计量资料使用 (χ—±s) 来进行直观表述，两组数据使用t值检验，并计算P值。当P<0.05，则显示两组数据有显著差异。
2 结果
对血浆使用亚甲蓝光化学法进行病毒灭活前和病毒灭活后，凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ的活性及Fg和TP的含量检验结果的具体数据如表1所示。
对数据使用统计学处理，计算t值进行检验，P>0.05，显示两组数据没有统计学差异。
3 结论
人体如果存在病毒感染，某些病毒会在血浆中存在，采集了病毒感染者的血液，在临床上血浆输注时，即存在将病毒一同输入受血者体内的风险。随着科学技术的不断发展，防患经输血传播病毒的手段的不断提高，如对献血者的的严格筛选及对所采集的血液进行病原标志物的严格检测，使该情况有了很大的改善，但血液内的某些病毒存在一定的窗口期，有可能造成病原体标志物的假阴性，而且血液内可能存在新型的传染性病毒，无法检出，因此对于血浆进行有效的处理对于输血的安全是十分重要的。医学上一般使用的是亚甲蓝光化学法进行血浆灭活。亚甲蓝作为一种解毒剂，其一般在亚硝酸盐和氰化物中毒上应用。其对血浆的病毒灭活机制为亚甲蓝是多靶点的光致敏剂，其在波长在600～700nm之间的可见光照射的条件下等释放出自由基，如单线态氧等，该活性氧可存在于使核酸链上的鸟嘌呤变化为8-羟鸟嘌呤，导致脱嘌呤和核酸链断开，也可在蛋白质之间、蛋白质与核酸间产生共价交联，且其还能与病毒的脂双层相结合，使病毒膜受到不可恢复的损伤[1,2,3]，因此可以达到病毒灭活的效果。但是不管是何种技术的过滤，都会对血浆的质量产生一定的影响，经过试验证明亚甲蓝光化学法对血浆质量的影响较小，不会对血浆使用效果产生不良影响，值得在临床中推广应用。
参考文献
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动物血清病毒灭活研究进展 篇3
关键词：动物血清,病毒,灭活
动物血清作为医药生物技术产品中重要的原辅材料之一,是细胞培养用培养基的主要成分。细胞培养在现代生物技术制药尤其在基因工程药物和疫苗研究生产过程中具有特殊的作用和价值,不但生物技术药物很多是通过细胞培养来实现的,而且细胞工程、杂交瘤单克隆抗体、基因治疗、发酵工程和酶工程等同样也依赖于细胞培养的过程来实现。而在细胞培养的发展过程中,培养基的质量又是其中的关键,直接影响着生物技术药物的质量安全。随着现代生物技术制药的进步,细胞培养用动物血清的安全性愈来愈受到关注。
目前美国等国家提出用“三重安全网”(triple safety net)来保证动物血清等血液制品的安全[1]。即:加强血源管理;增加必要的检验项目和提高要求;改进工艺,在制造过程中引入去除或灭活病毒的步骤。其中,对血液制品进行灭活病毒处理被认为是行之有效的措施,也是保证血液制品安全非常重要的环节。
一、动物血清的特性及主要病毒
动物血清是一种很复杂的混合物,其具有促细胞贴壁、分裂生长、抑制胰蛋白酶、解毒等功能,人类已知的主要成分有激素类蛋白、α2-巨球蛋白、转铁蛋白、成纤维促细胞生长因子、表皮细胞促细胞生长因子等多肽以及胰岛素、促生长激素等激素和与蛋白相结合状态的微量元素和氨基酸,对培养细胞的生长繁殖发挥着极其重要甚至是难以替代的作用[2]。
目前动物血清作为各种培养基中的主要成分,其质量起着重要的作用。供组织培养、细胞培养和诊断试剂等用的动物血清主要是新生牛血清,此外,按不同研究及使用目的,还包括胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清及小白鼠等实验动物血清。动物血清中含多种病毒,如牛兰舌病毒、牛腺病毒、牛细小病毒、牛病毒性腹泄病毒、狂犬病病毒、呼肠弧病毒、牛呼吸道合胞病毒、副流感病毒Ⅲ型、口蹄疫病毒等。大多数病毒由于感染率高,危害特别严重,因此如何减少动物血清制品的风险,提高其安全性,一直是国内外重点关注的课题。
二、动物血清制品中病毒的灭活技术
近年来发展起来的血液成分病毒灭活技术,在提高血液制品安全性方面具有一定潜力。在动物血清病毒灭活过程中,不仅要保证灭活的高效率,还不能影响其理化、生物学和免疫学性质,而且病毒灭活剂的残留应无毒副作用[3]。目前在动物血清制品病毒灭活技术应用和研究方法上国内外主要集中在以下方面。
㈠加热当前国内外在灭活动物血清中病毒时,采用的常规方法是热灭活法,如干热灭活法[4],巴氏加热法(60℃,10小时)。加热法相对比较简单,并且可以在制品灌装到成品容器封口后再加热,防止制品加热灭活病毒后再次被病毒污染。因此,在病毒灭活研究和应用早期,加热法被广泛地应用于各种血液制品的病毒灭活研究中,早期获得药政当局批准文号的病毒灭活制品也均为热处理制品。
第一,干热灭活法。干热灭活法即冻干后的制剂经加热处理、干热杀灭病毒的方法。常用的干热法有60℃~80℃、10小时~72小时加热法及80℃、72小时处理法。许金波等用100℃处理Ig G 30分钟,可灭活水疱性口炎病毒8.2 Log[5]。20世纪80年代初,用60℃~80℃、10小时~72小时加热处理FⅧ冻干浓制剂和凝血酶原复合物。但现已证明这种方法不能彻底灭活HBV、HCV、HIV[6]。而80℃、72小时干热处理已被证明能有效灭活HBV、HCV、HIV[7]。干热灭活法仅适用于冻干制剂的病毒灭活。
第二,巴氏加热法。此方法的理论依据是通过对温度及作用时间的选择,使病毒结构的破坏速率远大于蛋白质结构的破坏速率。近50年的临床使用结果和近来的动物实验均证实,白蛋白在溶液状态下经60℃、10小时加热处理后,不仅能灭活HBV,也能灭活HCV和HIV。因此,巴氏加热法较广泛地应用于白蛋白的灭活,使白蛋白成为在病毒安全上最可靠的一种血液制品。
由于加热是通过热量传递使病毒蛋白变性破坏,从而杀死病毒,因此仍存在一定的缺点。周铁群等通过用巴氏加热法灭活水泡性口炎病毒(VSV)[8],证明经该法处理的样品,可能由于加热对样品中某些成分,如蛋白的影响(导致蛋白变性沉淀),使得原倍样品对检测系统细胞有不同程度的毒性,导致实验最终计算的病毒灭活效果偏低。因此,对血清加热时,高温对血清蛋白分子,特别是热不稳定的凝血因子活性的损害较大。动物血清中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)现大多采用此方法,虽然BVDV病毒在56℃时可灭活,但也不能确保完全灭活血清中的BVDV病毒。并且此方法需要10小时,较为耗时,同时对凝血因子和其他有效成分损害较大,故在大规模生产过程中应用是极不理想的。
㈡甲醛灭活法甲醛是一种有强烈刺激性的致癌物质,其既可作用于病毒含氨基的核苷酸碱基(如A,G,U),又可作用病毒壳蛋白。李元新等用0.4%的甲醛溶液37℃灭活48小时,对兔出血症、巴氏杆菌病二联灭活苗的兔出血症基础苗进行灭活,并且经抽样检测抗体水平和走访调查,表明灭活后的疫苗安全有效[9]。
但甲醛作用于病毒壳蛋白时,易使蛋白质发生交联或病毒颗粒聚集,不能再作用于壳蛋白内的核酸。这样,病原体蛋白的抗原性会遭到严重破坏,并可能有病原体存活。此外,用甲醛灭活时,所需时间长,一般需要在37℃~39℃处理24小时以上或更长时间,并且灭活的效果易受温度、p H、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响。在研究中应引起注意,残留的游离甲醛,若随疫苗注入机体后,会产生刺激性反应。
㈢亚甲蓝光化学(MB)法这种方法在欧洲国家中应用较为普遍[10]。该方法不但对经血液传播的脂包膜病毒具有灭活作用,而且对一些非脂包膜病毒如猿猴病毒40(Sim ian virus40,SV40)、腺病毒也有灭活作用[11]。
Mohr等通过PCR技术检测到该方法对人类细小病毒B19的核酸有损伤作用[12]。在我国,有学者用MB/光照方法对血浆进行病毒灭活的实验表明,MB/光照病毒灭活血浆中几乎所有的有包膜病毒都会被灭活,但对无包膜的病毒没有效果。此外,亚甲蓝光化学法在对病毒灭活的同时,也会对血浆蛋白的含量和活性有所改变[13],从而影响血浆的适用范围及应用效果。
㈣有机溶剂/表面活性剂(S/D法)通常是将血清与溶剂1%的3-N丁酸磷酸盐和表面活性剂1%Triton X-100混合,在31℃孵育4小时,然后用萃取和层析的方法清除溶剂和表面活性剂。该法最初应用于因子Ⅷ制品,以后扩大应用于其他凝血因子制品,静脉注射免疫球蛋白和血清。
经过该方法处理血清的优点是可以灭活脂包膜病毒如HBV、HCV、H IV-1/2、HTLV-I/Ⅱ、CMV等,该血清也不会传播这些病毒无法测定的基因突变型或尚不知名的脂包膜病毒。然而,此方法对于非脂包膜病毒如HAV和微小病毒B19没有灭活作用。有研究表明,经过S/D方法处理的血浆,其中某些血浆蛋白,如纤维蛋白原和其它凝血因子的活性减少大约30%,而蛋白-C的活性减少50%[14]。因此S/D方法处理的动物血清仍具有潜在的危险[15]。
㈤β-丙内酯法β-丙内酯(BPL)是一种杂环类烷化剂,沸点155℃,常温下是无色粘稠状液体。早在1984年β-丙内酯就被选作狂犬灭活疫苗的灭活剂正式使用,可作用于病原体DNA或RNA,改变病毒核酸结构,使病毒失去传染性,从而达到灭活目的,而不直接作用于蛋白,对病毒具有很强的灭活作用,可以单独用来灭活病毒或与紫外线照射结合起来应用,具有易水解、灭活时间短(37℃下仅需2小时)等优点。原先β-丙内酯用于在制备死病毒疫苗时灭活病毒,后来转用于杀灭血液制品中的病毒。目前的研究中国内外研究倾向于β-丙内酯对各种人用疫苗的灭活。如李福安等将丙内酯应用在人用狂犬病疫苗制备中[16],陈伟等使用β-丙内酯灭活Vero细胞肾综合征出血热疫苗[17],并取得了成功。另外,β-丙内酯与紫外线照射联合应用时,也能使病毒蛋白变性,且病毒灭活作用进一步增强。如在黑猩猩中用β-PL/UV处理感染性Hbs Ag阳性血清[18],β-丙内酯和紫外线照射合用灭活非甲非乙型肝类病毒Hutchinson株等实验也取得了成功[19]。
尽管β-丙内酯法被证明可用于血液制品中的病毒灭活,但大剂量的β-丙内酯(BPL)是一种致癌物,虽然有研究表明其极易水解,在37℃水浴水解2小时后[20,21]水解为无毒性的人体脂肪代谢产物β-羟基丙酸[22],但此研究结果目前在国内外仅处于实验证实阶段,故动物血清中病毒的灭活方面至今未被广泛应用,只在欧洲一些国家被用于处理凝血因子制品。
三、讨论
在保证血源质量的前提下,灭活、去除病毒工艺是保证血液制品安全性的重要与必要手段。目前临床使用的追踪调查表明,由于灭活的效果受多种因素的影响,没有一种病毒灭活方法能保证动物血清制品绝对无传播病毒的危险。因此,仅采用一种灭活病毒工艺,不能绝对保证血液制品的安全。而在病毒灭活工艺的基础上,增加色谱、纳米膜过滤等去除病毒工艺,则病毒去除率大大提高,病毒灭活、去除效果得到明显改善。目前欧洲已明确提出,在血液制品生产过程中必须至少分别采用一种灭活和去病毒技术,以保证血液制品的安全。
兔病毒性出血症组织灭活苗的研制 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
(1) 种毒:RHD兔的肝、脾、肾由本室保存试验。
(2) 试验用兔:3~4月龄, 体重1.5~2.2kg的健康兔8只, 购于农户。
(3) 人O型血红细胞:购于吉林农业大学校医院。 (4) 微量V型血凝反应板;微型振荡器。
1.2 方法
1.2.1 病毒接种试验
取含毒兔的肝、脾、肾, 用生理盐水制成10倍乳剂 (血凝价1:28) 。冰箱中静止1h, 取上清液。观察试验兔2d, 无异常, 将6只接毒兔平均分成3组, 分别皮下注射RHDV上清液1mL、0.5mL、0.2mL。2只对照兔, 分别皮下注射1mL生理盐水。每天观察试验兔的精神、食欲等状况。
1.2.2 细菌学检验
无菌摘取死亡兔肝、脾、肾, 在血琼脂平板上划线分离培养, 37℃培养48h, 观察有无细菌生长。
1.2.3 红细胞凝集试验 (HA)
(1) 无菌取出肝、脾、肾, 置于灭菌的乳钵中。用生理盐水按1:10浓度稀释研磨成组织匀浆。反复冻融3次, 3000rpm离心20 min, 取上清液作为待检抗原。4℃保存备用。
(2) 根据薛华平微量血凝试验, 于99孔V型板上每孔加生理盐水0.025mL;从第1孔加1:10病料上清液0.025 m L;从第1孔开始倍比稀释至第11孔, 最后0.025mL弃去。第12孔是生理盐水对照。每孔加1%人O型红细胞0.025 m L, 立即放在微量混合器上振荡1 min, 置4℃冰箱感作30 min。
1.2.4 灭活
将10%的含毒组织乳剂加入0.5%甲醛溶液, 使其最后浓度为0.25%, 边滴加边振荡, 然后置37℃恒温箱中灭活24h, 在灭活过程中每6h充分振荡1次, 震荡时间为5 min。
1.2.5 无菌检验
无菌抽取2mL灭活的组织液, 分别接种于血平皿、熟肉基及肉汤培养基, 37℃培养48h, 观察有无细菌生长。
1.2.6 红细胞凝集抑制试验 (HI)
根据薛华平微量血凝试验, 于微量血凝反应板的第1~11孔, 每孔加生理盐水0.025m L, 第12孔加0.05mL;再向第1孔加入已知兔瘟阳性血清0.025 m L, 并倍比稀释至第10孔;自1~11孔各加4U血凝价的被检抗原0.025mL, 在微型混和器上振荡1min。置37℃温箱30min, 其间摇振2~3次。然后每孔加1%O型红细胞0.025mL, 在混合器上振荡1min, 置4℃冰箱感作30 min观察结果。以血凝抑制的最高稀释度为判定终点。
1.2.7 安全检验
疫苗经无菌检查合格后分装, 然后抽样做安全试验。取2只健康兔肌肉或皮下接种疫苗5mL, 观察5d, 检验有无不良反应。
1.2.8 效力检验
取敏感兔5只, 其中2只试验兔各肌肉注射RHD灭活苗1mL, 另3只对照兔各肌肉注射1mL生理盐水。10d后5只兔均皮下注射1mL RHDV。
2 结果
2.1 细菌学检验结果
病毒接种死亡兔的肝、脾、肾于血琼脂平板划线培养均不见可疑菌落生长。
2.2 HA试验结果
6只接毒兔的接种剂量不同, HA结果明显不同。试验证明接种1mL为最适剂量。因为1mL中的RHDV含量可以使兔体内的含毒量达到最高 (见表1) 。
2.3 无菌试验
灭活疫苗在血平皿、熟肉基及肉汤培养基上均未见可疑菌落生长。
2.4 HI试验、疫苗安全、效果检验结果
接种1mL RHD组织灭活苗后10d即可产生免疫力, 疫苗发挥了其免疫原性, 对RHDV产生了保护作用, 保护率为100% (见表2) 。
3 讨论
该病在我国大规模发生并流行, 所造成的损失极为惨重。RHD所到之处兔群的死亡率高达90%~100%。而且本病发病极快, 最急性型几乎没有任何症状兔就突然死亡。目前, 对RHDV尚没有确实有效的治疗药物, 只有通过定期接种RHD组织灭活苗预防该病。RHDV尚没有合适的细胞可以传代, 所以不能够制作活疫苗。唯有制作组织灭活疫苗才能达到对RHDV的免疫效果。
RHDV的血凝试验在37℃, 室温和4℃条件下感作, 经多次试验证明, 4℃条件下感作效果最好。其所需时间短, 效价高, 是RHDV血凝试验首选条件。可见RHDV的血凝试验对温度具有严格的选择性。
RHDV与人的O、A、AB、B血型新鲜红细胞具有较强的凝集作用, 对鸡、鸭、鹅的红细胞只有轻微的凝集作用, 而对牛、马、羊、猪、兔、鼠的红细胞则无凝集作用。而RHDV对人的O型红细胞最为敏感。分析原因是由于人的O型血红细胞内含有凝集RHDV的特异性受体, 而RHDV含有凝集人O型血红细胞的血凝素。其它动物的红细胞中凝集RHDV的特异性受体含量较少或没有。
由于实验兔在引进时可能已经感染了RHDV, 或感染其它疾病, 或不适应新的环境, 注射生理盐水的2只对照兔也与接毒兔一同死亡。剖检变化与RHD兔的剖检变化完全一致。分析原因, 除了上述原由外, 也可能是对照兔与接毒兔在同一个实验室内饲养, 对照兔通过接毒兔的排泄物感染了RHDV。4号接毒兔在接种RHDV后并没有死亡。此兔在人为猝死后剖检并无兔瘟剖检变化, 可能在引进之前已经接种了RHDV疫苗, 也可能该兔体内产生抗体而耐过。
摘要：本文报告了兔病毒性出血症 (又称兔瘟) 组织灭活苗的研制程序与测试结果。本疫苗是用人工感染兔的肝、脾、肾的10%组织匀浆中加入0.5%甲醛溶液37℃灭活24h而制成的。本疫苗安全性可靠, 免疫原性良好。兔肌肉注射1mL, 10d产生免疫力, 近期保护率为100%。
关键词：兔瘟,灭活苗
参考文献
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