三七总皂苷研究

三七总皂苷研究（共7篇）

三七总皂苷研究 篇1

三七是五加科植物三七的干燥根和根茎,功能是散瘀止血、消肿定痛,用于咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外伤出血等病症[1]。三七总皂苷( total saponins of panax notognseng,PNS) 是其主要化学成分,含有60余种单体皂苷成分,包括人参皂苷Rb1、Rg1、Rg3、Rc等[2],从20世纪40年代开始,国内外学者对PNS进行了一系列研究,揭示了其在中枢神经系统、脑血管系统、心血管系统、血液造血系统及免疫系统的作用靶点,近年来,其在肿瘤及其相关并发症的应用亦成为研究热点,现将其抗肿瘤的作用机理作一简要概述。

1抗肿瘤及其作用机制研究

肿瘤的发病机制至今仍未完全阐明,但现在研究多从信号传导、细胞凋亡、基因突变及免疫失控等机制出发。

1. 1直接抑制吴再起等[3]以胃癌细胞MKN - 28为研究对象,显示PNS对其增殖有明显的抑制作用,且呈浓度依赖性。陈鹏等[4]也发现PNS对肝癌高转移细胞HCCLM3生长有抑制作用。邹存华等[5]发现PNS阻断m TOR信号通路,降低mRNA翻译效率,抑制蛋白质翻译起始复合物形成,抑制宫颈癌Hela细胞增殖。倪晓辰等[6]发现200、400、800 mg/L的PNS对前列腺癌PC - 3细胞的抑制率分别达13. 0% 、29. 5% 和35. 9% ( P < 0. 05) 。t PNS下调PC - 3细胞增殖标志物PCNA的表达水平,该作用呈量效及时效关系。

另外,王琦侠等[7]应用MTT法检测PNS对多发性 骨髓瘤RPM18226细胞增殖的影响,发现PNS可抑制骨髓瘤RPMI8226细胞的增殖,并呈剂量依赖性,24h IC50值为( 213. 42 ± 2. 21) μg/ml; PNS与阿霉素( ADM) 联合,表现出协同效应。黄梅等[8]研究发现PNS对乳腺癌细胞有直接抑制作用,该作用具有时间和浓度依赖性; 高浓度PNS与三苯氧胺( TAM) 联合可以增强TAM对乳腺癌细胞的抑制作用,二者联合应用会使抗肿瘤作用增强。吴映雅等[9]将大鼠肝癌细胞CBRH7919与PNS共同进行 体外培养,发现PNS对CBRH7919增殖具有直接的抑制作用,并且呈浓度依赖性。

1. 2诱导细胞凋亡诱导细胞凋亡是肿瘤发病机理及治疗思路之一,特别是对于抗癌治疗的研究,激发了有效肿瘤防治策略的产生。 吴再起等[3]在培养基中加入浓度为0. 4mg/L的PNS,可诱导人胃癌细胞株MKN - 28细胞凋亡,且使细胞周期阻滞于G1期。崔玲玲等[10]通过MTT实验和集落形成实验揭示,200、400、800 μg/m L的PNS联用5、10、20 μg / m LAra - C对于白血病K562细胞的抑制增殖作用均明显高于相同剂量单用Ara - C的抑制作用,通过金氏公式判断,PNS联用Ara - C对抑制白血病K562细胞增殖有协同作用,在200、400、800 mg / m L范围内随PNS浓度增高,联合5、10、20 μg / m LAra - C抑制K562细胞增殖作用强度呈浓度依赖性。马强等[11]发现PNS对肝癌细胞具有明显的促凋亡作用,并初步探索了PNS对肝癌细胞mcl - 1L基因的表达具有抑制作用,而对Bak表达具有上调作用,mcl - 1L/Bak呈上升趋势,细胞增殖受到抑制。黄梅等[12]研究显示三苯氧胺( TAM) 及PNS单用或联用均可加速乳腺癌MCF - 7细胞凋亡,并显示出时间及浓度依赖。郑文球等[13]应用MTT法检测三七皂苷R1对HL - 60细胞生长抑制率显示75 ~ 1200 μg/ m L三七皂苷R1作用48小时可显著抑制HL - 60细胞增殖,且随着药物浓度及时间增加抑制作用增强,即呈药物浓度 - 时间依赖性。 且揭示其作用可能与上调凋亡调节基因p53的和下调survivin有关。

1. 3逆转耐药化疗药物耐药是恶性肿瘤治疗中面临的重要难题, 也是治疗失败的重要原因,有研究显示PNS在逆转一些肿瘤耐药方面起到一定作用。刘丽丽等[14]发现PNS是一种有效安全的多药耐药逆转剂,且能够部分逆转耐药乳腺癌细胞MCF - 7 /( 阿霉素) ADM的多药耐药性。王琦侠等[15]通过细胞培养、MTT实验及黏附实验显示,PNS可减低多发性骨髓瘤RPMI8226细胞与纤连蛋白( FN) 的黏附率,并能部分逆转黏附介导的骨髓瘤耐药。王艳等[16]将人参皂苷Rg3与人肺癌细胞株A549 /顺铂DDP细胞共培养发现,三七中的人参皂苷Rg3可通过上调nm23的表达抑制人肺腺癌细胞株A549 / 顺铂DDP细胞的侵袭和转移能力,还可通过上调caspase - 3的表达,减低细胞膜的流动性达到逆转耐药的作用。

1. 4调节免疫功能肿瘤免疫概念的提出已有一百余年,然而免疫抑制与肿瘤发生的相互机制仍未完全阐明,至今药物干预肿瘤免疫功能成为研究热点。汪蕾等[17]经过人参皂苷Rb1、黄芪以及两者联合预处理后人肝癌细胞系Hep G2培养上清的制备,并行实验检查发现肝癌细胞系Hep G2能分泌IL - 10,抑制NK细胞释放杀伤介质从而抑制其杀伤功能可能是肝癌细胞免疫逃逸的机制之一,而PNS中的人参皂苷Rb1和黄芪能显著逆转这种免疫抑制,提高机体的抗肿瘤免疫。此外,洪梅等[18]采用BCG2. 5 mg静脉注射致敏小鼠,第10天给于LPS7. 5 μg静脉攻击造成小鼠免疫性肝损伤模型,通过灌胃给予PNS连续10天,发现PNS能降低免疫性肝炎小鼠TGF - β1和NF - κBp65水平,从而达到调节免疫作用。

1. 5抑制血管新生肿瘤的生长和转移有赖于血管的形成,但肿瘤能否形成血管则取决于促血管生成因子( VEGF、FGF、EGF/TGF - α 等) 和抗血管生成因子( 血管抑素、内抑素等) 二者之间的平衡。研究发现,在人类乳腺癌细胞( MCF - 7) 中,人参皂苷Rg1可通过激活ERα 通路发挥其雌激素样作用从而抑制血管生成[19]。色素上皮衍生因子( pigment epithelium derived factor,PEDF) 是一种血管生成抑制剂,研究表明人参皂苷Rb1是ERβ 的选择性激动剂,Rb1能够直接作用于人类PEDF基因启动子,它能够显著增加PEDF的转录、蛋白表达和分泌。结果表明Rb1的抗血管生成作用源于PEDF的特异性,即人参皂苷Rb1通过ERβ 调节PEDF来抑制内皮细胞的管状结构形成[20]。PNS及其单体皂苷在阻断肿瘤血管生成的作用机制尚待进一步探索。

2对肿瘤治疗相关并发症的作用研究

2. 1改善骨髓抑制化学治疗是目前治疗恶性肿瘤的重要手段之一,然而多数肿瘤化疗药物在杀伤或控制肿瘤细胞的同时,对骨髓造成暂时性或永久性的损伤,用量及作用的发挥受到限制。

上世纪90年代,陈俊等[21]实验结果表明PNS可增加正常小鼠骨髓CFU - S的增殖,直接说明三七的造血促进作用在造血干细胞阶段就出现。高润兰等[22]采用c DNA芯片技术分析PNS能诱导造血细胞的基因表达谱,从而促进人造血细胞巨核系、粒系、红系增生。陈小红等[23]通过细胞培养法显示,PNS在某种程度上能够抑制Daxx、Fas蛋白表达,而减少造血细胞的凋亡。高润兰等[24]发现PNS可通过诱导GATA - 1和GATA - 2蛋白合成增加,增高与相关基因上游调控区的启动子和( 或) 增强子结合的活性,而调控与造血细胞增殖、分化相关基因的表达。钱煦岱等[25]通过实验显示PNS对CD3+4造血干 /祖细胞不但具有显著地刺激增殖作用,而且能够产生诱导其向粒系细胞定向分化的效应。

然而,对于PNS刺激造血细胞的研究主要针对血液系统疾病 ( 白血病、再生障碍性贫血等) ,对于恶性肿瘤化疗后应用PNS制剂 ( 注射用血塞通粉针) 治疗骨髓抑制的研究尚缺。

2. 2防治肝功能损害化疗引起肝功能损害是肿瘤治疗的另一方面重要副作用。洪梅等[18]发现PNS能显著减低免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性。因此,我们可以认为PNS在防治化疗引起肝损害的临床应用方面可获得一定疗效,其在这方面的应用价值及机理有待进一步研究。

2. 3防治放射损伤放射治疗是肿瘤治疗的三大治疗手段之一,而对于食管癌、肺癌等胸部肿瘤的放疗产生的放射性肺损伤成为临床常见的问题,目前应用糖皮质激素治疗早期放射性肺损伤取得一定疗效,但其副作用限制了后期的治疗。孙晓芳等[26]等通过实验发现PNS能明显减轻博来霉素( BLM) 所致的小鼠肺泡炎及纤维化程度,可能与其抑制肺组织中Cat B的过度表达有关。因此,PNS针对放射性肺损伤的纤维化修复应有一定作用。

2. 4防治骨转移许多学者报告,至少50% 癌症病人死后尸解发现有骨转移,其中仅一半病人在临床上出现症状,骨转移尤其在乳腺癌、甲状腺癌、肺癌的发生率较高。前列腺癌、膀胱癌和部分乳腺癌和肺癌的骨转移是成骨性破坏。研究表明,PNS可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化,促进成骨细胞OPG的表达[27],还能促进大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞的增殖、分化[28]。盛华刚等[29]等研究结果显示PNS和淫羊藿苷组分配伍比例为5: 2时,可明显促进成骨细胞增殖并有明显的钙化作用。

综上所述,三七总皂苷在抗肿瘤及其治疗相关并发症方面的实验研究已揭示其作用机理,但是将其广泛应用临床抗肿瘤及相关并发症方面的研究较少,尤其对于PNS纯度较高的血栓通粉针在这方面的应用尚少。目前,研究显示,PNS在骨髓造血及相关免疫应答方面已取得喜人成绩,然而对于肿瘤放化疗引起骨髓抑制,若应用血栓通是否可以改善,有待进一步深入研究。

三七总皂苷研究 篇2

1 抑制细胞凋亡活性

1.1 抑制心肌细胞凋亡

缺血预处理 (IPC) 能够诱导产生心肌保护作用, 能够改善心肌对抗缺血 (缺氧) /再灌注 (复氧) 损伤, 并且是心肌凋亡的抑制因素。早期缺血预处理能够减少缺血/再灌注心肌细胞凋亡的数量[3]。中药及其单体的药理预适应应用在现代的心血管药理研究中起到了重要的作用。包金风等[4]通过细胞实验证实了人参皂苷Rg1、Rb1药理性预适应可明显降低肥厚细胞缺氧/复氧损伤凋亡率, 电镜超微结构显示人参皂苷Rg1、Rb1组细胞结构尚未被破坏, 细胞结构完整, 表明人参皂苷Rg1、Rb1可提高细胞的生存能力。

1.2 抑制神经系统细胞凋亡

Chen等[5]研究发现预先通过人参皂苷Rg1处理的细胞, 多巴胺 (DA) 对PC12细胞凋亡的诱导作用明显降低。Li等[6]的报道也证实人参皂苷Rg1可以降低大鼠皮质神经元凋亡。神经毒素MPTP (1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶) 的代谢产物MPP+ (1-methyl-4-phenyl-Pyridinium) 可导致神经元的变性和凋亡。方芳等[7]经实验证实人参皂苷Rgl预处理能抑制MPTP代谢产物MPP+诱导SHSY5Y细胞的凋亡。

1.3 抑制肺细胞凋亡

三七总皂苷 (PNS) 具有保护缺血/再灌注损伤 (I/R) 肺的作用, 该作用可能与其抑制c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase, JNK) 转导通路、上调Bcl-2/Bax的比值从而减少Caspase-3 (Caspase-3作为JNK的下游效应分子, 介导细胞凋亡) 依赖性的肺细胞凋亡有关[8]。

2 抗炎活性

2.1 抗心肌炎

内毒素 (Endotoxin) 可激活单核-巨噬细胞系统 (mononuclear phagocyte system) , 释放出白细胞介素 (IL-1β) 、肿瘤坏死因子 (TNF-α) 等多种炎症介质和细胞因子, 导致细胞、组织和器官的损伤与病变。吴颖等[9]发现三七皂苷R1能够保护内毒素脂多糖 (LPS) 诱导的小鼠心肌损伤, 抑制炎症反应的发生。

2.2 改善类风湿性关节炎

类风湿性关节炎 (Rheumatoid arthritis, RA) 是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病, 环瓜氨酸肽 (CCP) 是RA发病的重要靶抗原之一, 不同浓度的PNS均对CCP干预的淋巴细胞增殖有显著的抑制作用, 其中PNS高剂量组对淋巴细胞增殖的抑制作用较低剂量组更为明显[10]。PNS在RA的治疗中能起到较好的免疫抑制作用, 具有较强的抗炎活性。

2.3 防治血管炎症

辅助性T细胞17 (Th17) 是一种新发现的能分泌白介素17 (IL-17) 的T细胞亚群, 能介导炎症反应, 在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义[11]。有研究揭示, Th17是参与早期血管炎症反应的关键T细胞亚群, 三七皂苷R1可以减少炎症因子IL-17的过度释放, 从而降低血管内皮细胞的活化, 使受损内皮屏障得到修复, 保护血管内皮损伤的进一步发展, 达到防治血管炎症的效果[12]。

2.4 减轻全身炎症综合征

磷脂酶A2 (PLA2) 作为炎症的启动因子在全身炎症反应综合征中具有关键作用, 参与炎症及急性损伤的致病过程[13]。PNS能抑制PLA2, 有效拮抗各种炎症因子的产生和释放, 阻断过度的炎症反应, 使炎症病情的进展得到遏制, 从而减轻全身炎症综合征[14]。

3 抗纤维化活性

3.1 抗肝纤维化

肝纤维化是由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生, 人体中血清Ⅲ型前胶原 (PCIII) 、透明质酸 (HA) 、层粘连蛋白 (LN) 的含量增加会加重肝纤维化。Rg1和Rb1可通过降低大鼠血清中PCIII、HA、LN的含量, 实现抗纤维化作用, 进而抑制肝纤维化大鼠转氨酶的升高, 起到抗肝纤维化作用[15]。

3.2 抗肾小管间质纤维化

肾小管上皮细胞内活化蛋白-1 (activator protein-1, AP-1) 的活化可增加纤维连接蛋白 (fibronectin, FN) 的转录活性, 诱导FN的分泌, 可导致肾小管间质的纤维化和损伤。有研究表明, PNS可通过抑制AP-1的分泌, 使FN和转化生长因子 (TGF-β1) 的分泌减少, 减缓肾小管间质纤维化和损伤进程[16]。

3.3 抗肺纤维化

TGF-β1是肺纤维化 (pulmonary fibrosis, PF) 发生过程中的关键因子。TGF-β1可趋化炎症细胞, 诱导性地扩大生物学效应, PNS通过抑制TGF-β1的合成分泌, 使成纤维细胞合成活化减少, 减轻胶原的沉积, 从而延缓PF进程[17]。

4 对细胞游离钙的作用

4.1 维持细胞钙稳态

人参皂苷Rb1预处理对肥厚心肌细胞缺氧/复氧 (H/R) 损伤游离钙稳态的影响实验[18]显示, Rb110μmol·L-1对KCl和去甲肾上腺素 (NA) 诱发的细胞内钙荧光强度升高的幅度较H/R组 (心肌细胞H/R损伤模型) 与AngⅡ组 (血管紧张素刺激形成肥厚模型) 分别下降52.8%和82.54%, 表明Rb1对KCl、NA诱导的钙离子浓度增加具有明显抑制作用, 可以改善钙稳态失衡引起的细胞功能障碍和代谢紊乱, 能减轻钙信号异常导致的心肌钙稳态失衡, 而维护细胞钙稳态是心肌保护作用的机理之一。

4.2 阻滞钙通道

人参皂苷Rb1对缺血心室肌细胞L-型钙通道 (L-type calcium channel) 电流有明显的阻滞作用, 记录全细胞钙通道电流, 显示Rb1减弱缺血后的L-型钙通道电流的I-V曲线电流幅值, 而对L-型钙通道电流的最大激活电压和反转电位没有影响[19]。Rb1可能通过阻滞缺血心室肌细胞钙离子通道钙离子的内流, 降低胞浆内钙离子浓度, 使心肌收缩力减弱, 降低心脏做功和心肌耗氧。

5 逆转耐药、增强药物疗效

5.1 增强激素药物疗效

系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus, SLE) 是一种自身免疫性疾病, 目前, 其首选药物是糖皮质激素和免疫抑制剂。SLE患者淋巴细胞P-糖蛋白表达增高是导致激素耐药的重要因素。P-糖蛋白是药物外排泵, 其表达水平和转运功能与耐药程度呈正相关, 下调P-糖蛋白表达水平或降低其转运活性均可逆转药物耐药。PNS不仅显著降低SLE患者外周淋巴细胞P-糖蛋白表达水平, 而且能直接抑制其转运活性, 较P-糖蛋白经典抑制剂维拉帕米 (Verapamil) 更具优势。PNS对P-糖蛋白表达和转运活性的双重抑制作用是其协同激素诱导SLE患者淋巴细胞凋亡、提高激素作用效应的重要机制[20]。

5.2 增强顺铂细胞毒性

缝隙连接细胞间通讯 (gap junction intercelluar communication, GJIC) 是细胞之间的一种直接通讯方式, 缝隙连接功能 (gap junction, GJ) 的增强可增强顺铂的细胞毒性。三七皂苷R1能够不同程度地恢复或增强GJ, 并具有一定的剂量依赖性。在缝隙连接形成时, 100μmol·L-1三七皂苷R1与顺铂合用可使顺铂的细胞集落形成率降低, 表明三七皂苷可通过增强GJ增强顺铂的细胞毒性, 增强药物疗效[21]。

5.3 改善胰岛素抵抗活性

人体脂类物质摄入过多会导致脂类代谢紊乱, 游离脂肪酸生成增加, 干扰胰岛素信号转导途径, 造成胰岛素抵抗, 加剧糖尿病恶化。有研究报道, 人参皂苷Rb1可以改善2型糖尿病模型大鼠高脂血症、胰岛素抵抗和高胰岛素血症, 作用机制可能是通过降低血脂和调控内源性疏醇抗氧化剂含量[22]。

6 在血管系统和血液方面的活性

6.1 减轻肺动脉高压

三七皂苷单体R1作为三七总皂苷减轻肺动脉高压的有效成分, 可能通过降低肺动脉平滑肌细胞ERK1/2 (细胞外信号调节激酶) 通路的活性, 使低氧高二氧化碳性肺动脉收缩得到抑制, 进而起到肺血管重建和缓解肺动脉高压的作用[23]。

6.2 改善微循环

三七总皂苷具有改善微循环的作用。陈重华等[24]研究发现, R1和Rd均能使正常小鼠耳廓细静脉和细动脉的血管口径显著增大, 亦能使耳廓毛细血管开放数明显增加, 增加血流速度。表明R1和Rd对正常小鼠耳廓微循环具有促进作用。R1和Rd还能减轻NA所致小鼠耳廓毛细血管痉挛收缩的程度及相对增加毛细血管的开放数量, 亦能相对增加小鼠耳廓毛细血管血流的速度, 表明R1和Rd具有改善NA所致小鼠耳廓微循环的作用。

6.3 降低血压

葛茂庭[25]将受试者随机分为PNS治疗组和对照组, 治疗组服用常规的降血压药物, 如双氢克尿塞和依那普利;实验组使用常规的降血压药物, 同时还使用PNS治疗。实验数据显示治疗组对收缩压及舒张压影响明显高于对照组, 表明PNS具有良好的降压效果。

6.4 活血作用

陈瑞芬等[26]通过动物实验证明PNS有抑制大鼠血栓形成、抗缺血性脑损伤作用。PNS制剂还可降低甘油三酯、低胆固醇、全血粘度、低密度脂蛋白、血浆粘度、血细胞比容, 从而降低血脂[27]。

6.5 促进造血

PNS对CD34+造血干/组细胞不但有显著的刺激增殖作用, 而且能够诱导其向粒细胞定向分化的效应。钱煦岱等[28]采用免疫磁珠分离纯化系统获得高纯度的骨髓CD34+细胞, 应用多向组细胞 (CFU-Mix) 体外培养集落形成法, 观察到使用PNS25mg·L-1时, CFU-Mix产率得到提升, 说明PNS具有促进CD34+细胞增殖的效应, 间接促进造血。另外, 在PNS浓度为25.50和100 mg·L-1时, 粒系细胞表面标记CD33+和CD15+细胞百分比均比无PNS的对照组高, 该研究表明适宜浓度的PNS可诱导CD34+造血干/组细胞向粒细胞定向分化。

6.6 抗失血性休克

PNS对失血性休克恢复具有保护作用。周志勇[29]的实验结果显示, 在大鼠失血性休克模型中, 动脉血氧分压 (PaO2) 和平均动脉压 (mean artery pressure, MAP) 均有不同程度的下降, 而在PNS高剂量组则有显著的上升, 虽然没有达到空白对照组的水平, 但是已经有明显的提升, 到复苏期时, 其PaO2和MAP水平已经基本与对照组一致, 说明PNS对于失血性休克恢复期大鼠具有一定的保护作用。

7 其他活性

7.1 抗胆碱活性

乙酰胆碱 (Acetylcholine, ACh) 是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一, 可维持意识清醒, 促进学习和改善记忆。宋晓斌等[30]选用亚硝酸钠、乙醇、东莨菪碱等化学物质诱导记忆缺损模型鼠, 观察人参皂苷Rg1对学习记忆不同阶段的影响, 结果显示, 人参皂苷Rg1可以通过降低乙酰胆碱酯酶 (AchE) 活性而减少Ach降解, 从而增强胆碱能系统功能, 使模型鼠的学习记忆得以改善。

7.2 抗氧化活性

使用三七治疗阿兹海默症的研究表明[31], 三七总皂苷可提高多种体内抗氧化剂, 如谷胱甘肽还原酶 (GSH) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 (CAT) 的水平, 从而让身体整个机能具有较强的抗自由基、抗氧化作用。潘东峰等[32]研究证实, 百草枯中毒的大鼠经PNS治疗后体内丙二醛减少, SOD增多, 表明PNS具有抗脂质过氧化的作用, 同时也可以保护机体免受脂质过氧化的损伤。

7.3 光保护活性

在一定浓度范围内, 三七皂苷R1可作为一种对抗紫外 (UV) 辐射的保护剂, 减轻UVA波段及UVB波段的光损伤[33]。当皮肤被UV辐射损伤后, 细胞外被破坏的基质进行降解、沉积和清除, 并生成新的细胞, 使结缔组织进行重建。胶原作为细胞外基质中的主要成分, 在重建过程中发挥重要作用, 羟脯氨酸 (hydroxyproline) 是胶原蛋白中一种极其重要且含量稳定的氨基酸。三七皂苷R1浓度为50μg·mL-1以下时, 经UV照射的成纤维细胞 (fibroblast) 的羟脯氨酸含量及总胶原分泌量均增加;间质胶原酶 (MMP-1) 主要降解皮肤中的Ⅰ型胶原, 三七皂苷R1浓度为20μg·mL-1时, 可以抑制UV诱导的成纤维细胞MMP-1高分泌[34]。UV辐射会造成皮肤成纤维细胞的损伤, 而三七皂苷R1对其有一定的保护作用。

7.4 抑制癌细胞增殖

PNS具有诱生内源性TNF-α的作用, 抑制人肝癌细胞HepG2移植瘤增殖, 而且PNS对人肝癌细胞的增殖抑制作用与给药剂量呈现出一定的量效关系, 其作用机制可能与白细胞介素18 (IL-18) 和TNF-α的调解作用有关[35]。

7.5 抗抑郁活性

PNS具有抗抑郁样作用, 付珊等[36]使用强迫游泳实验与悬尾模型实验这两个经典实验模型对PNS进行了初步的抗抑郁活性测试, 发现10mg·kg-1剂量组与空白组相比能明显降低小鼠强迫游泳和悬尾的不动时间, 表明PNS可能具有一定的抗抑郁活性;对孤养大鼠给予氟西汀 (Fluoxetine) 和PNS后, 大鼠海马和纹状体中5-羟色胺 (5-HT) 和NA含量均显著增加, 海马组织中5-HT的代谢产物含量也明显增加;PNS还可提高抑郁大鼠脑内多巴胺 (DA) 含量, 表明其抗抑郁作用机理与增加脑内5-HT和DA的含量有关。

7.6 促进骨形成

吉光荣等[37]探讨了含PNS的条件培养基对骨髓间质干细胞 (MSCs) 体外骨潜能的影响, 通过组织学、形态学及碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 和骨钙素 (BGP) 定量分析显示, 含PNS的条件培养基培养后的MSCs表现出较强的ALP活性, 形成钙结节, 具有与成骨细胞相似的功能表现, 说明PNS可以大大提高MSCs的成骨能力。吴丽萍等[38]研究表明, PNS可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化, 促进成骨细胞骨保护素 (OPG) 的表达。

8 结语

三七总皂苷对痛风的干预 篇3

1 仪器与方法

1.1 实验仪器

电热恒温水浴箱 (上海精宏实验设备有限公司) ;CO2恒温培养箱;超净工作台 (苏州净化设备有限公司) ;Olympu显微镜;Bio-Red全自动酶标仪;NAPCO, 细胞培养箱;9SORVALL高速冷冻离心机;Gene Mate PCR循环仪;DYY-6B电泳仪;BIO-RAD Gel Doc TM XR凝胶紫外s成像系统;BD流式细胞检测仪。

1.2 方法

实验方法分为空白对照组、阳性对照组、模型组 (尿酸钠刺激组) 、三七总皂苷 (血塞通) 干预组。空白对照组 (200μL 1640培养液) 、模型组 (尿酸钠刺激组50µg·ml-1MSU溶液) 、阳性对照组 (50µg·ml-1吲哚美辛) , 三七总皂苷 (血塞通) 干预组 (2.5、5.0、10.0µg·m L-1) 。

1.3 HUVEC细胞的培养

HUVEC细胞株经支原体检测符合要求, HUVEC细胞经0.25%胰蛋白酶消化, 含10%胎牛血清的1640培养液中和, 离心后去上清液, 加含10%胎牛血清的1640培养液培养, 移入细胞培养瓶中, 在37℃5%CO2培养箱中传代培养。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

对处于对数生长期的HUVEC用0.25%的胰蛋白酶消化, 轻轻吹打, 制成细胞悬液, 调整好细胞密度为5×106/L, 接种于普通细胞培养瓶中。待细胞长满后, 再进行三七总皂苷药物干预, PBS收集细胞, 离心去上清液, 加入CD54单克隆抗体, 30min后, PBS洗涤, 应用流式细胞仪检测细胞凋亡。观察细胞凋亡的现象, 具有明显抑制细胞凋亡的作用。

1.5 统计学处理

计量资料以 (±s) 表示, 组间采用t检验, 以P<0.01为具有显著性差异。

2 痛风患者的治疗前后尿酸值变化情况

见表1。

3 结果

用MSU诱导刺激HUVEC细胞, 对ICAM-1的基因表达进行检测。空白对照组对ICAM-1的基因表达仅有少量, 模型组对ICAM-1的基因表达明显高于空白对照组P<0.01, 阳性对照组和三七总皂苷 (血塞通) 明显降低对ICAM-1的基因表达P<0.01, 具有显著性差异。三七总皂苷 (血塞通) 组2.5/µg·ml-1对MSU诱导的HUVEC致炎症模型下的ICAM-1的表达有显著抑制作用, 具有抗炎作用。

流式细胞仪染色检测细胞凋亡:将收集的细胞用PBS洗涤, 悬浮于buffer中, 取100μL的细胞悬液于试管中, 加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI, 混匀, 于室温避光30min, 在反应试管加入400μL buffer液, 双染后流式细胞仪检测细胞凋亡。双染后流式细胞仪检测可见, 在由4个象限组成的散点图上。与正常组比较, 模型组细胞凋亡率明显增加为 (9.30±1.32) %;三七总皂苷组2.5、5.0、10.0μg/ml明显抑制细胞凋亡 (6.90±1.07) %, 与模型组比较P<0.01, 具有显著性差异。

4 结论

用尿酸钠溶液刺激血管内皮细胞株可以形成急性炎症模型, 三七总皂苷 (PNS) 对以尿酸钠 (MSU) 100µg·m L-1诱导体外急性炎症模型, 对MSU诱导的HUVEC损伤致炎症模型下的ICAM-1的表达都有显著抑制作用。模型组明显高于空白组P<0.01, 三七总皂苷组2.5µg·m L-1降低MSU对HUVEC刺激的基因表达, P<0.01。三七总皂苷 (血塞通) 组2.5、5.0、10.0µg·m L-1明显抑制细胞凋亡 (6.90±1.07) %, 与模型组比较P<0.01。

临床应用血塞通治疗痛风患者疗效确切, 使用方便, 患者的依从性好, 且症状得到改善, 尿酸值治疗前后有显著性差异。通过临床治疗, 体外药效评价, 构建成分基本清楚, 作用靶点明确的中药治疗方案和体系。体内外结合评价治疗标准的方法, 体内主要是药物疗效的体现, 体外主要是药物作用机制的探讨和评价。减少中药成分复杂, 作用机理不明确的弱点, 形成成分清楚、作用目标明确、质量稳定可靠的特点, 同时又具有传统中成药相似的整体功能, 毒副作用小的特点。

摘要：目的 本文以尿酸钠100μg mL-1诱导体外急性炎症模型, 观察三七总皂苷对ICAM-1表达及内皮细胞凋亡的影响, 探讨临床用于痛风的价值。方法 采用2.5、5.0、10.0μg mL-1浓度的三七总皂苷进行预干预, 实时定量PCR检测ICAM-1的基因表达, 流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果 三七总皂苷组2.5、5.0、10.0μg mL-1明显抑制细胞凋亡 (6.90±1.07) %, 与模型组比较P<0.01;能显著抑制ICAM-1基因的表达。结论 三七总皂苷显著抑制炎症因子ICAM-1的表达及细胞凋亡。

关键词：三七总皂苷,ICAM-1,痛风

参考文献

[1]张福康, 陆再华, 杨妍华.三七总皂苷对细胞免疫炎症因子作用的研究进展[J].中国药师, 2011, 14 (9) :1349-1350.

[2]张佳红, 王晋平, 王慧娟.三七总皂苷调整类风湿关节炎免疫相关内环境失衡状态的临床研究[J].中国中西医结合杂志, 2007, 27 (7) :589-592.

[3]刘桂林, 窦迎春, 刘粉叶, 等.三七总皂苷对oxLDL诱导的人脐静脉内皮细胞CD40, VCAM-1表达的影响[J].山东大学学报, 2010, 48 (10) :14-19.

69例三七总皂苷不良反应分析 篇4

关键词：三七总皂苷制剂,不良反应,回顾性分析

1 资料与方法

1.1 一般资料

在江苏省人民医院2003年1月—2008年3月上报的不良反应分析报告中检索由于使用三七总皂苷所引起的不良反应, 共69例。

1.2 方法

对患者性别、年龄、既往过敏史、家族不良反应事件、不良反应出现的时间、预后情况、对原患疾病的影响、关联性等方面进行统计和分析。

2 结果

2.1 发生不良反应的性别与年龄

在所收集的69例三七总皂苷制剂所致的不良反应中, 男14例, 女55例, 具体的性别与年龄分布情况见表1。

(n)

2.2 家族药品不良反应事件

在69例不良反应事件中, 有家族药品不良反应事件的为5例 (7.25%) ;无不良反应为37例 (53.62%) ;不详 (不代表没有) 为27例 (39.13%) 。

2.3 过敏史

69例不良反应事件中, 8例有过敏史 (包括对青霉素和一些食物过敏) , 占总数的11.59%;31例无过敏史, 占总数的44.93%;30例过敏史不详 (不代表一定没有) , 占总数的43.48%。

2.4 不良反应症状出现时间

在69例病例中, 首次用药即出现不良反应的为1例, 占1.45%, 非首次用药即出现不良反应的为64例, 占98.44%;非首次用药即出现不良反应的病例中严重不良反应为2例, 占2.89%;一般不良反应有62例, 占89.86%;另有4例无记载。在不良反应出现的时间中, 1~5天即出现不良反应的为22例, 占31.88%;6~10天出现不良反应的为7例, 占10.14%;10天以上出现不良反应的为5例, 占7.25%;另有35例不良反应出现天数不详。

2.5 不良反应对原患疾病的影响

在69例病例中, 对原患疾病无明显影响的为67例, 占97.10%;使患者病程延长的为1例, 占1.45%;使患者病情加重的为1例, 占1.45%。

2.6 不良反应关联性评价

在69例不良反应中, 关联性为可能的有37例, 占53.62%;关联性为很可能的有21例, 占30.43%;关联性为肯定的有8例, 占11.59%, 另有3例无记载。

3 讨论

3.1 不良反应与性别、年龄的关系

由表1可知, 在这69例不良反应事件中, 女性所占比例明显高于男性, 说明使用三七总皂苷制剂时, 女性比男性发生不良反应的概率高, 这与刺五加注射液[1]、参麦注射液[2]等中药注射剂不良反应的文献报道中描述的男女比例不同, 这可能与以下因素有关:生理和心理特征, 特别是女性特殊的生理周期, 以及女性的激素水平和耐受性。因此女性患者用药时, 更加需要密切观察药物的治疗效果和不良反应, 一旦发生异常, 需要及时查明原因并采取措施, 如对药物剂量进行调整或对所用药物进行更换, 以免发生不良反应。

从年龄分布的角度分析, 在60岁以上的老年人中, 不良反应的发生率比较高。这要从含三七总皂苷制剂的主要适应证和老年人自身生理特点两方面分析:首先, 60岁以上老年患者使用该药频率比较大, 因为该年龄段老年人易患各种心脑血管疾病, 经常使用三七制剂做对症治疗, 所以该年龄段老年人使用较多, 出现不良反应概率较高;其次, 老年患者对药物的敏感性和耐受性与青壮年不同, 他们对剂量的个体差异比较大, 药效阈值相应变窄, 因为老年患者大多体质较差, 且存在不同程度的脏器功能减退, 因而易使药物蓄积引起不良反应。故老年患者在用该药时应重点观察他们的反应, 尽量避免或者减少不良反应的发生。

3.2 不良反应与过敏史及家族不良反应的关系

在69例不良反应事件中, 不能排除家族不良反应事件及过敏史者所占比例相对较大, 故医师用药前应详细询问病史, 对不能排除家族不良反应事件和过敏史的病人需考虑做过敏试验或尽量避免使用。

3.3 用药与症状出现时间的关系

不良反应症状出现时间长短不一, 最少的仅为1天, 多的长达十几天, 但大部分出现在1~5天内。所以用药前5天的临床反应需加以重视, 需要连续观察, 但是这并不代表能忽视5天后的不良反应观察。

3.4 不良反应对原患疾病的影响分析

据统计数据分析, 不良反应对原患疾病的影响不大, 只有1例使病程延长, 1例使病情加重, 且没有致人死亡的病例。故只要注意预防, 细心观察患者的临床表现, 发现不良反应立即停药并进行处理, 基本上不会对患者造成很大伤害。

3.5 不良反应的关联性评价分析

69例不良反应事件的关联性评价中, “可能”和“很可能”两个结果占了近九成, “肯定”仅为一成。但“肯定”是指“再次用药不良反应再次出现”, 在临床上, 只要怀疑发生了不良反应, 医生多数会选用其他同类药物而不会再次选用该药, 故“很可能”和“可能”的结果较多。

对于三七总皂苷类制剂的不良反应应给予足够的重视, 特别是临床医生应该注意用法用量和剂型对病人造成的不同影响, 并尽量单一化给药, 根据病人的具体情况, 设计个体化给药方案。对用药的过程密切观察, 在发现不良反应后立即停药并采取措施, 防止严重的不良反应发生。

参考文献

[1]曾聪彦, 彭伟文, 吴惠妃.刺五加注射液不良反应78例文献分析[J].中国中医药信息杂志, 2004, 11 (2) :1721.

UPLC法测定三七总皂苷含量 篇5

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(美国安捷伦1290),检测器为二极管阵列检测器;色谱柱(Ultimate XB-C18柱,2.1 mm×50.0 mm,1.8μm,月旭材料科技上海有限公司);超声波清洗机(江苏昆山超声仪器有限公司);电子分析天平(日本岛津)。

三七总皂苷对照提取物(中国食品药品检定研究院,批号:110870-201002)5种皂苷类物质含量标定为:三七皂苷R1(6.9%),人参皂苷Rg1(28%),人参皂苷Re(3.8%),人参皂苷Rb1(29.7%),人参皂苷Rd(7.3%);甲醇(色谱纯,月旭科技);水为重蒸馏水。

1.2 色谱条件

色谱柱(Ultimate XB-C18柱,2.1 mm×50.0 mm,1.8μm);检测波长为203 nm;柱温25℃;流速0.6 m L/min;进样量2μL;以水为流动相A,以乙腈为流动相B,按表1中的规定进行梯度洗脱。

1.3 溶液制备

1.3.1 对照提取物溶液的制备。取三七总皂苷对照提取物适量,精密称定,加70%甲醇溶解并稀释成每1 m L含2.5 mg的溶液,即得。

1.3.2 供试品溶液的制备。取样品25 mg,精密称定,置10m L量瓶中,加70%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。

1.4 色谱分析

取供试品溶液和对照提取物溶液各2μL,按照色谱条件进行测试。

1.5 线性关系考察

分别称取三七总皂苷对照品适量,用70%甲醇溶解并稀释制成每1 m L含0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、7.50、20.00 mg的溶液,按照色谱条件,分别精密吸取各浓度对照品溶液2μL,自动进样器进样,测定峰面积,以各色谱峰峰面积(Y)对其浓度(X)进行线性回归。

1.6 精密度考察

吸取对照品溶液2μL,按照色谱条件,自动进样器连续进样6次,进行精密度考察[10]。

1.7 稳定性考察

参照色谱条件,取制备的供试品溶液,在室温条件下放置,分别在0、1、2、4、8、12、24、36 h进样测定,记录每针样品中5种皂苷类成分的峰面积。

1.8 重复性考察

取样品6份,按照上述方法制备供试品溶液,再根据色谱条件进样测试5种皂苷类成分的含量。

1.9 加标回收率考察

取三七总皂苷样品6份,每份12.5 mg,精密称定,置10m L量瓶中,分为3组,同时加入对照品,第1组分别加800μL,第2组分别加1 000μL,第3组分别加1 200μL,70%甲醇溶解并稀释至刻度,同供试品溶液的制备方法处理,按照色谱条件进样测定,分别计算回收率。

1.1 0 样品测定

取3个不同批次的三七总皂苷提取物,采用本方法与药典的方法进行测定,比较含量结果。

2 结果与分析

2.1 色谱分析结果

色谱分析图谱如图1。结果表明,此条件下三七总皂苷成分与其他成分分离度良好。

2.2 线性关系考察结果

以各色谱峰峰面积(Y)对其浓度(X)进行线性回归结果见表2。结果表明,三七总皂苷的5种皂苷类成分在本试验范围内,浓度与峰面积呈良好的线性关系。

注:1-三七皂苷R1;2-人参皂苷Rg1;3-人参皂苷Re;4-人参皂苷Rb1;5-人参皂苷Rd

2.3 精密度考察结果

三七总皂苷的5种皂苷成分峰面积的RSD(n=6)分别为1.02%、0.39%、0.98%、0.35%、0.79%,表明精密度良好。

2.4 稳定性考察结果

根据每针样品中5种皂苷类成分的峰面积,其RSD(n=8)分别为0.93%、0.82%、0.77%、0.68%、0.91%。结果表明,供试品溶液中三七总皂苷成分在36 h内较为稳定。

2.5 重复性考察结果

5种皂苷类成分含量的RSD值(n=6)分别为0.38%、0.35%、0.61%、0.54%、0.42%,表明该方法重复性良好。

2.6 加标回收率考察结果

5种皂苷类成分的平均回收率分别为98.18%、99.43%、97.26%、98.54%、99.02%,RSD(n=6)分别为1.03%、0.64%、0.98%、1.37%、0.78%。

2.7 样品测定

3 个不同批次的三七总皂苷提取物采用2种方法测定的含量比较结果见表3。

3 结论与讨论

关于检测波长,《中国药典》2015版规定检测波长为203 nm,通过文献及实际操作过程发现,203 nm波长时各色谱峰分离较好,响应值也较高,故仍然采用203 nm波长测定;在柱温的选择上,柱温是影响色谱峰分离度的一个重要因素,笔者在试验过程中,主要考察25、27、29、31℃等常规柱温范围,发现该色谱条件下都能满足规定的分离度要求,故规定该方法的柱温为25℃。色谱柱的选择上,主要考察了规格基本相同的Waters ACQUITY UPLC BEH ShieldR P 18柱、安捷伦zorbax rrhd eclipse XDB-C18柱、月旭Ultimate XB-C18柱和Ultimate Polar-RP柱,发现这几种柱子都可应用于该方法测定。本方法与药典方法所测结果基本一致,且分析时间大为缩短,峰形好,洗脱溶剂消耗小,方法准确,重现性好。

摘要：〔目的〕建立超高效液相色谱法测定三七总皂苷提取物中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的含量。〔方法〕采用Ultimate XB-C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8μm);以水(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱(0~4min,19%B;4~8 min,19%~35%B;8~10 min,35%~95%B;10~11 min,95%B):检测波长为203 nm,柱温25℃,流速0.6 m L/min,进样量2μL。结果:三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd分别在0.006 9~0.552 0、0.028 0~2.240 0、0.003 8~0.304 0、0.297 0~2.376 0、0.007 3~0.584 0mg/m L范围内呈良好的线性关系。平均回收率分别为98.18%、99.43%、97.26%、98.54%、99.02%。RSD分别为1.03%、0.64%、0.98%、1.37%、0.78%。〔结论 〕该方法分析时间短,洗脱溶剂消耗小,方法准确,重现性好,可用于三七总皂苷提取物的质量控制。

关键词：UPLC法,三七总皂苷,提取物,含量

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典[S].1部.北京:中国医药科技出版社,2015:11.

[2]顾萍,张勇,高飞,等.三七总皂甙对大鼠脑出血模型中神经细胞凋亡、Bcl-2表达的影响[J].中国临床医学,2006,3(4):527-529.

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[4]郭长杰,伍杰雄,李若馨.PNS对痴呆模型大鼠大脑皮质神经递质含量的影响[J].中国临床医学杂志,2004,13(3):150-152.

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[6]付次双,金建生,谢纪青.三七总皂苷对大鼠慢性缺血性肾损伤的影响[J].中国新药与临床杂志,2010,29(2):104-105.

[7]杨钦河,胡四平,张玉佩,等.三七总皂甙对脂肪变性L02肝细胞TG水平及SREBP-1 cm RNA表达的影响[J].山东医药,2010,50(7):48-49.

[8]孙晓芳,杨长福,黄春芳,等.PNS对肺纤维化小鼠肺组织胶原影响的实验研究[J].中医药学报,2010,38(5):14-16.

[9]国家药典委员会.中国药典[S].1部.北京:中国医药科技出版社,2015:393-394.

三七总皂苷研究 篇6

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

异丙肾上腺素购自上海禾丰制药有限公司,三七总皂苷购自云南植物药物有限公司,羟脯氨酸测试盒购自南京建成生物工程研究所,Trizol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司,RT-PCR试剂盒为日本TOYOBO公司,DEPC购自上海生工公司。

1.2 仪器与设备

电子天平:德国Sartorius公司;纯水器:美国Millipore公司;光学显微镜:日本Olympus公司;722紫外分光光度计:上海第三器械厂;高速冷冻离心机:德国Eppendorf公司;温度梯度PCR扩增仪:德国Eppendorf公司;UVP凝胶自动成像系统:美国Bio-Rad公司;水平琼脂糖凝胶电泳仪:美国Bio-Rad公司

1.3 试验方法

1.3.1 动物分组

昆明种小鼠30只,随机分为5组(对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组),每组6只。

1.3.2 动物模型制作

模型组及各剂量组均背部皮下持续注射异丙肾上腺素,剂量采用首剂40mg/kg,第2天20 mg/kg,第3天10 mg/kg,第4天5mg/kg,并以此剂量维持10 d,自由进食,给水,对照组小鼠相同部位注射相同体积的生理盐水。于造模第2天各剂量组分别给予50、100和150 mg/(kg·d)三七总皂苷持续灌胃,对照组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,与异丙肾上腺素注射相隔2 h以上。小鼠均在同一条件下笼养,保持室内空气清洁,常规饮水及照明,标准颗粒饲料喂养,造模2周。

1.3.3 左心室重量指数检测

2周后,小鼠禁食12h称重(BW),处死,摘取心脏,精密天平称全心重量(HW),去除大血管、心房、心外膜脂肪组织,用预冷的生理盐水冲洗干净,沿室间隔剪去右室游离壁,剩余部分用滤纸吸干水分后称左心室重量(包括室间隔)(LVW),计算全心重量/体重(HW/BW)即心重指数、左心室重量/体重(LVW/BW)即左心室重量指数(LVI)。以左心室重量指数表示心肌肥厚程度。将左室切成的小块心肌组织置于中性福尔马林固定液中固定,另外取部分左室组织放入冻存管,标号后立即置于超低温冰箱。

1.3.4 心肌组织形态学观察

将每个标本做两张切片,分别进行HE染色,具体过程由学院病理科协助完成。

1.3.5 心肌胶原含量测定

严格按照所购羟脯氨酸试剂盒进行,应用下列公式计算标本羟脯氨酸含量:羟脯氨酸含量(μg/mg湿重)

1.3.6 RT-PCR测心肌MMP-2和MMP-9mR-NA的表达水平

分组同上,收集心肌细胞,按TRIzol提取总RNA,引物根据oligo6.0软件设计,由上海英骏生物公司设计合成。MMP-2扩增产物长度307 bp,其上游引物为:5'-CACACCAGGTGAAGGAT GTG-3',下游引物为:5'-GCCCTCCTAAGCCAGTCT CT-3';MMP-9扩增产物长度293 bp,其上游引物为:5'-GAAGGCAAACCCTGTGTGTT-3',下游引物为:5'-CCAATTGGGAGTCAAGGAGA-3';mice GAP-DH扩增产物长度660 b,其上游引物为:5'-CTG-CACCACCAACTGCTT-3',下游引物为:5'-GTCTGG GATGGAAATTGT-3'。按RT-PCR试剂盒说明书操作,MMP-2的参数为94℃3 min,94℃30 s,57℃30 s,72℃1 min,72℃5 min,32cycles,MMP-9的PCR反应参数为:94℃3 min,94℃30 s,58℃30s,72℃1 min,72℃5 min,32cycles。内参GAPDH的参数为94℃3 min,94℃30 s,57℃30 s,72℃1min,72℃5 min,32cycles。依据扩增长度配制1.5%琼脂糖凝胶(50 mL),微波炉加热前加入核酸凝胶染色剂Gel Red 5μL(即稀释至1:10 000),冷却后制胶,取5μL PCR产物加1.0μL上样缓冲液(0.25%溴酚蓝,40%蔗糖),稳压电泳80 V约40min。凝胶在UVP凝胶成像系统中扫描观察结果、拍照,采用图像分析软件Band Scan5.0分析电泳条带的光密度值,计算出MMP-2和MMP-9分别与内参的光密度积分值比值作为MMP-2和MMP-9 mR-NA的相对表达量。

1.4 统计学分析

所有数据使用SPSS13.0统计软件进行统计描述,计量资料用均数±标准差表示,多个样本均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANO-VA),根据方差齐性检验(Homogeneity-of-Variance),当总体方差齐同时选择LSD法;当方差不齐时,选择Tamhane's T2法,检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 心肌结构光镜下的改变

病理学检查显示:400×显微镜下观察,对照组心肌细胞排列整齐,未见细胞肥大现象;模型组与对照组相比,心肌细胞明显肥大,细胞间距增宽,胞浆丰富、着色深,胞核浓染、增大,治疗组心肌细胞肥大都有减轻,以高剂量组最明显,见图1~5。

2.2 左心室肥厚指数的变化

以不同浓度的三七总皂苷作用于各组小鼠,结果发现:与对照组相比,模型组小鼠HW/BW、LVI的值增加,明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.05);与模型组相比,各治疗组小鼠HW/BW、LVI的值较模型组有下降趋势,见表1,中、高剂量组心室肥厚指数明显下降,具有显著性(P<0.05)。

注:1)与对照组相比,差别有显著性,P<0.01;2)与模型组相比,差别有显著性,P<0.05;3)与模型组相比,差别有显著性,P<0.01

2.3 心肌胶原含量的变化

与对照组小鼠比较,模型组小鼠左心室心肌细胞中羟脯氨酸(Hyp)含量明显升高(P<0.01);与模型组比较,中、高剂量组小鼠Hyp含量均显著降低(P<0.05或P<0.01),而低剂量组小鼠Hyp含量虽有下降趋势,但无显著性(P>0.05),见表2。

注:1)与对照组相比,差别有显著性,P<0.01;2)与模型组相比,差别有显著性,P<0.05;3)与模型组相比,差别有显著性,P<0.01

2.4 MMP-2和MMP-9表达水平的变化

与对照组相比,模型组MMP-2 mRNA显著增加(P<0.01)。各治疗组MMP-2 mRNA均有降低,但低剂量组与模型组相比无显著性,中、高剂量组较模型组明显降低(P<0.01)。

MMP-9 mRNA的表达水平,见表3,图6,模型组与对照组相比差异也有显著性,中、高剂量组与模型组相比差异有显著性,与高剂量组比较,差异有显著性(P<0.01)。

注:1)与对照组相比,差别有显著性,P<0.05;2)与对照组相比,差别有显著性,P<0.01;3)与模型组相比,差别有显著性,P<0.05;4)与模型组相比,差别有显著性,P<0.01

A:不同剂量三七总皂苷对MMP-2 mRNA表达的影响;B:不同剂量三七总皂苷对MMP-9 mRNA表达的影响;M:DNA marker;A~B:依次为对照组,模型组,低剂量组,中剂量组,高剂量组

3 讨论

正常心脏是由心肌细胞(cardiac myocyte)及周围的心脏间质组成,心脏间质主要包括细胞外基质(extracellular matrix,ECM)及其脉管系统,其中ECM围绕在心肌细胞周围,保持心脏结构与功能的完整性,主要由胶原构成。心肌肥厚(myocardial hypertrophy)过程包括了心肌细胞的肥大和心肌间质的纤维化,以往对于心肌肥厚的研究多是集中在研究心肌细胞功能改变对心室功能的影响,目前,越来越多的研究表明心肌细胞外基质的改变对心室功能产生很大的影响。心肌肥厚细胞外基质重塑即心肌胶原纤维化的发生发展过程,是原始刺激因素造成心肌组织中非心肌成分的不呈比例增生而导致的,常伴有心肌胶原成分的比例增加[2]。羟脯氨酸(Hyp)是机体胶原蛋白的主要成分之一,在正常胶原蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量,其他蛋白中均不存在,测定心肌Hyp的含量,可反映心肌胶原蛋白的含量,从而判断心肌间质细胞增殖和纤维组织增生的程度。本试验通过碱水解法测定Hyp含量,其原理是Hyp在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲酸作用呈现紫红色,根据其呈色的深浅可推算出其含量。因此,羟脯氨酸含量可作为衡量其胶原组织代谢和判断纤维化程度的重要指标。

异丙肾上腺素诱导心肌肥厚模型是经典的动物心肌肥厚模型之一。本试验参照文献建立小鼠心肌肥厚模型[3],造模14 d后通过病理学观察,模型组心肌细胞明显肥大,心重指数和左心室肥厚指数均较对照组明显增加,具有统计学意义,表明小鼠心肌肥厚的动物模型成功建立;左心室胶原含量的明显增高表明了心肌肥厚小鼠出现了心肌细胞之间胶原的沉积,心肌胶原在心肌间质的普遍沉积提示异丙肾上腺素所致心肌肥厚模型也伴有心肌胶原网络的重塑,即心肌细胞外基质重构。而三七总皂苷中、高剂量组与模型组相比,差别也均有统计学意义,表现出三七总皂苷对异丙肾上腺素致心肌成纤维细胞增生及胶原蛋白增加具有一定的抑制作用。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组锌离子(Zn2+)依赖的内肽酶家族,主要参与特异降解细胞外基质(ECM),并为基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitorsof metalloproteinases,TIMPs)及细胞因子所调控。MMP-2和MMP-9统称明胶酶,它们可降解变性的胶原、明胶,主要由心肌细胞、成纤维细胞合成。MMP-2又称明胶酶A,能降解I、Ⅱ、Ⅲ型胶原[4],MMP-9又称明胶酶B,主要降解明胶和I、Ⅱ型胶原及基质膜成分。MMP-2和MMP-9可在肥厚左室心肌中表达增加已经被证实,MMP-2和MMP-9的表达水平间接反映了左心室肥厚的程度[5]。研究推断,MMP-2可以通过促进心肌细胞肥大和间质胶原纤维变形而导致心肌重塑[6]。MMP-9的缺失可以减轻压力负荷所致的心肌ECM重塑[7]和左室重构[8],MMP-9可以对基底膜成分过度降解而影响心肌细胞的空间组合和排列[9]。已有文献报道,异丙肾上腺素所致心肌肥厚中存在MMP-2、MMP-9活性增强[10],在本试验中研究表明心肌肥厚小鼠的心肌中MMP-2、MMP-9表达水平增高,结果与文献报道一致。

三七总皂苷研究 篇7

1 资料与方法

1.1 纳入标准

血脂异常患者诊断标准参照2007年中国成人血脂异常防治指南制定联合委员会制定的《中国成人血脂异常防治指南》。[3]

1.2 排除标准

不符合纳入标准者;伴有严重并发症;合并患有严重循环系统、呼吸系统、消化系统等疾病;合并有恶性肿瘤、感染、外科手术、视网膜病变、外伤等影响内皮祖细胞疾病;药物过敏及过敏体质者;依从性差, 不配合治疗者。

1.3 一般资料

选取2012年1月—2014年1月我院收治的64例血脂异常患者作为研究对象, 按住院时间随机分为治疗组与对照组各32例。其中治疗组男18例, 女14例, 年龄41~71岁, 平均年龄 (55±9) 岁, 病程11个月至3年;对照组男15例, 女17例, 年龄42~69岁, 平均年龄 (53±7) 岁, 病程1~4年。两组患者的性别、年龄、病程等资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.4 方法

1.4.1 药物与材料

血栓通注射液 (0.25g, 广西梧州制药 (集团) 股份有限公司, 批号13110714) , DiI-ac-LDL (Molecular probe公司) , PBS、Hanks液、ECSG、M199、胰酶、胎牛血清 (均购自GIBCO公司) , FITC-AC133及PE-VEGFR-2 (Bender systemTM) , PE-CD34 (Caltag Laboratories) , MTT (华美生物工程公司) , VIII因子免疫组化相关抗原试剂盒 (武汉博士德生物工程公司) , VEGF (Peprotech EC公司) , 纤维连接蛋白 (Roche公司) 。

1.4.2 治疗方法

对照组予以常规治疗, 治疗组在对照组基础上给予血栓通注射液450mg, 溶于5%葡萄糖注射液或0.9%生理盐水静脉滴注, 1次/d, 疗程为10天。疗程结束分别抽取两组患者空腹全血20mL, 对血中EPCs进行培养并分析。

1.4.3 EPCs培养

纤维连接蛋白预先包被24孔培养皿, 取全血20mL分离单个核细胞。方法:采用密度梯度离心法, 以5×106个/mL种于培养皿, 将1mL含链霉素 (100U/mL) 、青霉素 (100U/mL) 及胎牛血清 (20%) 的M199加入每个培养皿, 置培养箱中培养, 培养环境为饱和湿度、5%CO2和37℃。3天后添加培养液, 洗去未贴壁细胞, 继续培养待用[4]。

1.4.4 EPCs鉴定

吸取0.25%的胰酶适量消化培养后的EPCs, 并制成单个细胞悬液 (1×106个/mL) , 加入10μL (1mg/mL) 荧光标记的AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin或CD34, 采用流式细胞仪分析细胞中AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin、CD34的表达水平。以2.4μg/mL终浓度加入培养皿DiI-ac-LDL避光与细胞孵育4h, 荧光显微镜下观察洗去培养液后的细胞荧光指标;以同批培养细胞作为空白对照组, 但不加DiI-ac-LDL, 验证培养细胞吞噬DiI-ac-LDL能力, 采用GSC7901 (胃癌细胞株) 予阴性对照。检测免疫组化法培养细胞Ⅷ因子相关抗原的, 采用GSC7901予阴性对照[5]。

1.4.5 EPCs数量检测

取各组1/10分离的单个核细胞, 制成单个细胞悬液 (1×106个/mL) , 加入荧光标记的AC133、CD34各10μL (1mg/mL) , 通过流式细胞仪分析细胞AC133、CD34的表达, 运用Quest软件分析计算双阳性细胞。

1.5 统计学方法

实验数据采用SPSS 11.5软件进行统计学分析, 所有数据均经正态分布检验, 自身比较采用配对样本T检验, 计量资料采用t检验, 计数资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EPCs鉴定

洗去碎片及未贴壁细胞, 培养3天后, 可见典型细胞集落:向外扩散, 外周为纺锤形细胞, 层层叠叠;中间为大量圆形细胞, 略高于培养平面, 呈白色半透明, 见图1。流式细胞仪分析显示6天后细胞AC133、VEGFR-2、VE-Cadherin和CD34表达。荧光显微镜检:多数细胞随培养时间延长可吞噬DiI-ac-LDL, 激发灰色荧光, 见图2;阴性对照和空白对照均无荧光。免疫组化示培养2天后Ⅷ因子相关抗原为阳性, 呈棕色胞浆, 阴性对照和空白对照均不显棕色。

2.2 血栓通注射液对全血EPCs数量的影响

与对照组相比, 血栓通注射液能够增加EPCs数量, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。

(±s, 个/mL)

注:与对照组比较, *P<0.05。

3 讨论

血脂异常患者血清中ox-LDL过高可诱导内皮细胞的氧化损伤甚至凋亡, 从而导致内皮功能障碍。因此血脂异常为冠心病、脑血管意外、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的重要致病因素。相关研究报道[6], 损伤内皮的再内皮化可有效减少新内膜厚度和平滑肌细胞增殖, 而再内皮化过程需EPCs的参与。

EPCs作为内皮细胞的同一谱系, 其功能和数量同样受到血脂异常的影响, 主要作用机制为:ox-LDL影响EPCs的动员及分化;ox-LDL参与EPCs的凋亡过程;ox-LDL直接损伤EPCs。提示通过治疗手段提高血脂异常患者外周血中EPCs数量, 能有效降低血脂异常患者发生冠心病、脑血管意外、动脉粥样硬化等并发症概率。

血栓通注射液为传统中药材三七经提取工艺精制而成的中成药注射液, 主要成分为三七总皂苷。现代药理研究表明血栓通注射液作用机制可能通过减少骨髓基质细胞RANKL表达, 增加OPG表达[7]。实验研究证明, 三七总皂苷可显著提高血脂异常患者外周血中EPCs数量, 从细胞水平上为三七总皂苷作用心脑血管途径提供了新的理论依据, 具有极大意义。

参考文献

[1]季亢挺, 张怀勤, 李海鹰, 等.高胆固醇血症患者外周血内皮细胞的变化及丹参的保护作用[J].中华中医药学刊, 2007, 25 (6) :1173-1175.

[2]陈剑梅, 郭洁文.三七总皂苷对心脑血管作用的药理研究新进展[J].今日药学, 2011, 21 (7) :389-392.

[3]中国成人血脂异常防治指南制订联合委员会.中国成人血脂异常防治指南[J].中华心血管病杂志, 2007, 35 (5) :390-419.

[4]季亢挺, 张怀勤, 唐积肥, 等, 丹参对高胆固醇血症患者内皮祖细胞数量及功能的影响[J].中国中药杂志, 2007, 32 (12) :1214-1217.

[5]WERNER N, JUNK S, LAUFS U, et al.Intravenous transfusion of endothelial progenitor cells reduces neointima formation after vascular injury[J].Circulation Res, 2003, 93 (2) :e17.

[6]GRIESE D P, EHSAN A, MELO L G, et al.Isolation and transplan-tation of autologous crculating endothelial cells into denuded vessels and prosthetic grafts:implications for cellbased vascular therapy[J].Circulation, 2003, 108 (21) :2710.