抗炎免疫成分

抗炎免疫成分（共7篇）

抗炎免疫成分 篇1

细菌性奶牛乳房炎主要是由大肠杆菌、链球菌及金黄色葡萄球菌等感染导致的一种多发性乳腺疾病[1,2],是奶牛最主要的疾病之一,主要用抗生素、磺胺等抗菌药治疗[3],但由于病原菌种类多且极易产生耐药性和药物残留等,导致治愈率降低、反复发病、淘汰和威胁人类健康。蒙药中含有多种具有抗炎免疫作用的药物[4],前期研究证明治疗奶牛乳房炎蒙药复方“特润舒都乐”的疗效与环丙沙星相当[4]、抗炎作用与地塞米松相当、提高免疫力的效果显著优于左旋咪唑、毒副作用小、无耐药性,但未能说明发挥作用的成分。故本试验选取“特润舒都乐”的6种抗炎免疫成分进行正交试验设计,通过测定体内抗菌保护率确定最佳正交复方,现将结果报道如下。

1 材料

1.1菌种

致病性的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌,来源于内蒙古呼和浩特市某奶牛场患有乳房炎疾病奶牛的奶样。

1. 2 试验动物

昆明系小鼠,雌雄各半,体重为( 20±2) g,许可证号为SCXK( 蒙2002 - 0001,购自内蒙古大学实验动物中心。

1. 3 主要试剂

甘露醇氯化钠营养琼脂、伊红美蓝营养琼脂、营养肉汤,购自广东环凯微生物科技有限公司; 大黄酸、大黄素、大黄酚、川楝素等对照品,购自上海雅吉生物科技有限公司。

1. 4 主要仪器

生化培养箱( 型号为HPS—250) 、超净工作台( 型号为FLC—3) ,均由内蒙古农业大学兽医学院动物生理学实验室提供。

2 方法

2. 1 奶牛乳房炎主要致病菌最低致死浓度 ( MLD)( 100% MLD) 的测定

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌 培养3代,使其达到最佳活力,再用高压高温灭菌的生理盐水分别 稀释至浓 度为1. 0×1011cfu / m L、0. 5×1011cfu / m L、1. 0×1010cfu / m L,每10只小鼠腹腔注射各浓度的每种细菌0. 3 m L,观察2 d内小鼠的死亡情况,以确定致病菌对小鼠的100% MLD。

2. 2奶牛乳房炎主要致病菌混 合菌 MLD ( 80%MLD) 的测定

由2. 1得知,小鼠腹腔 注射大肠 杆菌0. 5×1011cfu / m L、金黄色葡萄球菌0. 5×1011cfu / m L和链球菌1. 0×1011cfu / m L是使小鼠2 d内100% 死亡的最低浓度。对3种浓度的细菌进行2倍稀释,共设8个浓度梯度,取3种菌的每个平行稀释梯度各0. 1 m L,混合后腹腔注射小鼠,观察2 d内小鼠的死亡情况,以确定主要致病菌混合菌对小鼠的80%MLD。

2. 3 蒙药单一抗炎免疫成分的小鼠体内抗菌保护率的测定

将小鼠随机分成20组,每组10只,雌雄各半,连续灌服7 d,2次/d。末次给药2 h后小鼠腹腔注射80% MLD混合菌液,0. 3 m L / 只,观察2 d内小鼠的死亡情况,计算保护率。计算公式: 保护率 = ( 阴性对照组死亡数 - 试验组死亡数) /阴性对照组死亡数×100% 。分组及给药方案见表1。

mg·( kg·d)- 1

注: 阳性对照组( 环丙沙星) 的给药量为 130 mg·( kg·d)- 1,阴( H2O) 的给药量为 20 mg·( kg·d)- 1。

2. 4 蒙药抗炎免疫成分正交复方的小鼠体内保护率的测定

选取蒙药复方“特润舒都乐”中的6种抗炎免疫成分,根据L18( 37) 正交试验设计进行蒙药复方“特润舒都乐”抗炎免疫成分的筛选。将小鼠随机分成20组,每组8只,分为阴性对照组 ( H2O) 、阳性对照组( 环丙沙星) 和试验组。试验组药物的剂量与水平见表2,阴性对照组、阳性对照组给药剂量同表1,连续灌服7 d,2次/d。末次给药2 h后小鼠腹腔注射80% MLD混合菌液,0. 3 m L / 只,观察2 d内小鼠的死亡情况,计算保护率。计算公式: 保护率 = ( 阴性对照组死亡数 - 试验组死亡数) /阴性对照组死亡数×100% 。

mg·( kg·d)- 1

注: - 表示不用药; 1 水平表示低剂量,2 水平表示中剂量,3 水平。

3 结果与分析

3. 1 奶牛乳房炎主要致病菌 MLD( 100% MLD) 的测定( 结果见表 3)

由表3可知: 小鼠腹腔注射0. 5×1011cfu / m L大肠杆菌时死亡率为100% ,1. 0×1010cfu / m L时死亡率为30% ; 0. 5×1011cfu / m L金黄色葡萄球菌时死亡率为100% ,1. 0×1010cfu / m L时死亡率为40% ;1. 0×1011cfu / m L链球菌时 死亡率为100% ,0. 5×1011cfu / m L时死亡率为30% 。

3. 2奶牛乳房炎主要致病菌混 合菌 MLD ( 80%MLD) 的测定结果

当小鼠腹腔注射1. 0×108cfu / m L大肠杆菌、1. 0×108cfu / m L金黄色葡萄球菌和0. 5×109cfu / m L链球菌各0. 1 m L时,小鼠的死亡率达到80% ,即80% MLD。

3. 3 蒙药单一抗炎免疫成分的小鼠体内抗菌保护率的测定( 结果见表 4)

%

注: 阳性对照组( 环丙沙星) 的保护率为 87. 5% ,阴性对照组( H2O) 的保护率为 0。

由表4可知,各成分对小鼠的抗菌保护都高于阴性对照组,其中栀子苷、川楝素和胡黄连苷Ⅱ对小鼠的抗菌保护率都体现为: 中剂量组大于高、低剂量组;姜黄素、大黄酸和大黄素对小鼠的抗菌保护率随着剂量的增加而增大。

3. 4 蒙药抗炎免疫成分正交复方的小鼠体内保护率的测定( 结果见表 5)

由表5可知,正交各组方对小鼠的抗菌保护率均高于阴性对照组,但低于阳性对照组,其中对小鼠抗菌保护率的最优组方是A2B2C3D1E2F1G3,保护率可达到71% ,环丙沙星的保护率为86% ,即A、B和E采用中剂量,C为高剂量,D、F、G不用药。该组方为小鼠体内抗菌保护率的最佳组方。

4 讨论

蒙药是纯天然的绿色药物,含有多种生物有效成分,它为新型治疗奶牛乳房炎药物的研发提供了保证[5]。前期研究证明,由诃子、大黄等7味药组成的“特润舒都乐”制剂对牛源性大肠杆菌有一定抑菌作用,能够显著增强小鼠非特异性和特异性免疫功能,从而提高牛源性大肠杆菌感染后小鼠的存活率,故试验选取其6种抗炎免疫有效成分进行深入研究,结果表明,6种不同浓度的单一成分对感染牛源性混合菌的小鼠均有不同程度的保护作用。

注: A ~ G 分别代表栀子苷、姜黄素、大黄酸、大黄素、川楝素、胡黄连苷Ⅱ、空白。

正交试验设计是寻求最优水平组合的有效方法[6]。研究采用正交试验设计,以感染牛源性混合菌的小鼠保护率作为指标,选出一个体内抗菌保护率达71% 的抗炎免疫成分正交组方A2B2C3D1E2F1G3,低于环丙沙星的保护率( 86% ) ,但是无抗生素残留,后续将进一步研究其抗炎免疫作用,决定是否将此组方用于奶牛乳房炎的临床研究。

参考文献

[1]战永波,王纯洁,包金荣,等.蒙药对奶牛乳房炎中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用[J].黑龙江畜牧兽医,2010(2上):134-135.

[2]BRADLEY A.Bovine mastitis:an evolving disease[J].Vet J,2001,164(2):116-128.

[3]王新,张秀英.中药治疗奶牛乳房炎的研究现状与展望[J].中国兽药杂志,2004,38(2):43-46.

[4]乌日娜.蒙药特润舒都乐对小鼠实验性乳腺炎抗炎免疫作用的影响[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2008.

[5]松林,乌云斯日古楞.试论中国蒙药的研究概况[J].中国民族医药杂志,2006,2(1):26-29.

[6]关红,李成应,李培峰,等.正交法筛选抗奶牛乳房炎主要致病菌的中药组方[J].黑龙江畜牧兽医,2010(9上):137-139.

几种中药抗炎有效成分研究进展 篇2

1 甙类

三七总皂甙 (total saponins of Panax notoginseng) 是五加科人参属植物三七的主要活性成分, 能明显抑制5-HT诱导的大鼠足肿、巴豆油所致的小鼠耳肿, 60, 120, 240mg/kg三个剂量组能显著抑制角叉菜胶 (25mg/kg) 诱导的大鼠气囊滑膜炎中的白细胞游走及蛋白质渗出。抗炎机理与其降低中性粒细胞内游离钙水平、抑制炎性细胞生成TNFα、NO, 抑制PLA2活性、减少PGE2释放, 升高cAMP抑制中性粒细胞释放氧自由基、抗脂质过氧化等作用有关[1,2] 。

柴胡皂甙 (saikosaponin) 对毛细血管通透性、炎症介质释放、白细胞游走和结缔组织增生等对许多炎症过程都有影响, 其抗炎作用与刺激肾上腺, 促进肾上腺皮质合成, 上调糖皮质激素受体mRNA的表达, 促进糖皮质激素分泌;抑制环氧酶 (COX) 、脂氧酶 (LPO) 活性, 抑制花生四烯酸代谢, 减少炎症介质释放有关[3] 。

商陆皂甙甲 (esculentoside A, ESA) 是从中国商陆根中提取的三萜皂甙, 对急性渗出性炎症、慢性肉芽组织增生性炎症及其他一些炎症模型都有显著的抑制作用。ESA体外剂量依赖性的抑制A23187刺激的小鼠巨噬细胞PAF产生, IC50为1.5mmol/L, ESA 0.1-10mmol/L显著抑制巯基乙酸盐刺激的小鼠腹腔巨噬细胞释放TNFα、IL-1、IL-6, 体内ESA连续给药7d可剂量依赖性的抑制LPS刺激的小鼠血清中TNFα、IL-1、IL-6产生, 体内ESA连续给药14d可剂量依赖性的降低Heymann 肾炎大鼠血清中的TNFα、IL-1、IL-6的含量[4,5] 。

雷公藤多甙 (polyglycosides of tripterygium wilfordii Hook. TWP) 能抑制组胺所致的小鼠皮肤毛细血管通透性的增加、大鼠实验性关节肿及棉球肉芽肿, 抑制迟发型超敏反应, 对体内NO生成、淋巴细胞增殖反应、IL-2的产生均有抑制作用, 还能降低T细胞亚群CD4/CD8比值, 显著抑制细胞免疫, 抑制免疫复合物型肾炎如兔的Masugi肾炎、牛血清蛋白性肾炎及柔红霉素性肾病的免疫复合物生成、干扰和减轻免疫复合物在肾小球上皮细胞基底部和连接处沉积, 抑制炎性细胞浸润和基底部病变, 此外其抗炎作用也与其抗氧化作用有关[6,7] 。

黄芩甙 (baicalin) 可抑制小鼠耳肿及角叉菜胶所致的大鼠足肿, 抗炎作用与其降低大鼠白细胞内Ca2+浓度, 升高cAMP, 抑制5-脂氧酶 (5-LPO) 活性, 抑制花生四烯酸代谢, 抑制LTB4和LTC4合成有关[8] 。

丹皮总甙 (total glucosidies of Mudan cortex, TGM) 系芍药科植物牡丹皮中提取的活性成分, 主要包含芍药甙、丹皮原甙、丹皮新甙等成分, TGM (25, 50mg/kg ig ) 剂量依懒性抑制角叉菜胶诱导的大鼠足肿、二甲苯诱发的小鼠耳肿;致炎前1h 灌胃 TGM ( 25~100mg/kg) 对佐剂性关节炎大鼠原发症状及继发性炎症反应均有明显抑制作用, 进一步作用机理及活性部位有待深入研究[9] 。

西红花总甙 (crocins glycosides) 25~100mg/kg明显抑制二甲苯所致的小鼠急性耳肿、醋酸诱导的小鼠腹腔毛细血管通透性增高及蛋清、角叉菜胶所致的大鼠足肿, 对非特异性免疫反应及特异性免疫反应无明显的抑制作用, 但对迟发型变态反应有明显的抑制作用[10] 。

鬼针聚炔甙 (bipinnatpolyacety lenic loside) 是从鬼针草中分离的一种新天然产物, 可抑制巴豆油诱发的小鼠耳肿、蛋清所致的足肿, 降低毛细血管通透性, 抑制棉球肉芽肿的形成[11] 。

从伞形科植物防风中分离的5-O-甲基维斯阿米醇甙 (4-O-β-D-glucosyl-5- O-methylrisammind) 和升麻甙, 各3 个剂量组 (50, 100, 150mg/kg) 能明显抑制二甲苯所致的小鼠急性耳肿, 初步研究表明有抗炎作用[12] , 但作用机制还须进一步深入研究。

2 生物碱

早期研究发现小檗碱 (berberine) 对二甲苯引起的小鼠耳肿, 乙酸、组胺诱导的小鼠皮肤血管通透性增加及角叉菜胶诱发的足肿均有明显的抑制作用, 在整体实验中小檗碱可明显抑制炎症介质如PGE2等的合成, 细胞水平研究表明, 小檗碱明显降低中性粒细胞中磷脂酶A2活性, 抑制趋化因子ZAP诱导的中性粒细胞趋化、酵母多糖诱发的多核白细胞化学发光, 抑制白细胞羟自由基及过氧化氢的产生[13] 。

粉防己碱 (tetrandrine, Tet) 是千金藤属植物粉防己的主要成分, 近年研究表明Tet抗炎作用显著, 对多种炎症模型有明确的防治作用, 抗炎机制复杂, 几乎对炎症的各个环节均有影响。Tet可抑制巨噬细胞、肥大细胞、淋巴细胞功能, 通过抑制磷脂酶A2活性, 减少花生四烯酸经环氧酶和脂氧酶途径代谢生成前列腺素类、血栓素类和白三烯类炎症介质, 明显抑制单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞产生释放IL-1、IL-5、IL-6、TNFα抑制血小板活化因子释放, 抑制组胺释放, 而且还有抗氧化损伤的作用, 其作用机制可能是通过抑制细胞内游离钙离子浓度升高, 抑制磷脂酰肌醇代谢, 干扰跨膜信号传递产生的。动物实验表明, Tet无明显毒性, 无非甾体类抗炎药物的激素样副作用, 可长期使用, 值得进一步研究与开发[14] 。

山豆根碱 (dauricine) 不但对急性炎症的毛细血管通透性增高、炎性渗出和组织水肿有抑制作用, 而且对炎症后期肉芽组织增生也有抑制作用, 其抗炎作用, 可能与兴奋垂体—肾上腺皮质系统间接发挥抗炎作用有关[15] 。

苦豆碱 (aloperine) 对各种致炎剂引起的急性炎症、Ⅲ、Ⅳ型变态反应及佐剂型关节炎均有显著的抑制作用, 其抗炎抗变态反应的作用不是依赖于垂体-肾上腺皮质系统, 而是通过抑制白细胞游走、稳定溶酶体膜、清除自由基、抑制前列腺素、组胺及淋巴因子等炎症介质的合成和释放有关[16] 。

3 黄酮类

淫羊霍总黄酮 (total flavonoids of Epimedium, TFE) 200、400mg/kg可显著抑制巴豆油所致小鼠耳肿和醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加, TFE 70、140mg/kg对角叉菜胶所致的大鼠足肿有明显的抑制作用, TFE 140、280mg/kg显著抑制巴豆油所致大鼠肉芽组织增生, 减少渗出液量, 抑制慢性炎症发生。抗炎机制可能与其抑制炎症局部组织PGE合成、释放, 提高过氧化氢酶活性, 抗脂质过氧化有关, 而与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴无关[17] 。

大豆异黄酮主要包括染料木素 (genistein) 、大豆黄素 (daidzein) 和黄豆黄素 (glycitein) , 大多以β-葡萄糖苷形式存在, 是大豆中的主要活性成分。几千年前的中国文献就记载了大豆有治肠炎的作用, 现代研究表明, 这种作用与染料木素有关。染料木素已证明是酪胺酸激酶的抑制剂, 它可降低NOS的mRNA的表达、抑制NO合成;此外还能抑制IL-1、TNFα、VEGF的含量[18] 。

桑色素 (morin) 对急性炎症作用显著, 25mg/kg连续给药4周可促进鼠结肠炎组织修复, 恢复髓过氧化物酶活性, 抑制NOS活性, 降低结肠炎组织中LTB-4、IL-1的水平, 提高结肠组织氧化应激能力[19] 。

从黄芩根中分离的汉黄芩素 (wogonin) 的抗炎作用与其抑制炎症组织中COX-2活性、抑制PGE2 的合成有关。芦丁 (rutin) 和陈皮甙 (hesperidin) 对急、慢性炎症作用显著, 而芦丁在慢性炎症模型中抗炎作用尤为突出[20] 。

4 萜类

熊果酸 (ursolic acid) 属五环三萜类化合物, 广泛存在于中药和其他植物中。对多种致炎剂如TPA、角叉菜胶、D-苯丙炔酸乙酯 (EPP) 、 放线菌D和放线菌诱发的多种实验性水肿有明显的抑制作用。另有报道大鼠每天ip 12.5mg/kg共7d, 有糖皮质激素样的作用, 并可延缓植入羊毛球的发炎过程。其抗炎机制可归结为以下几个方面[21,22] :1) 抑制肥大细胞释放组胺。2) 抑制脂氧酶和环氧酶活性, 减轻花生四烯酸级联反应中某些炎症因子的产生。3) 抑制风湿性疾病中弹性蛋白酶的活性。4) 抑制补体活化 (可能是抑制经典补体途径中的C3转化酶) 。

甘草酸 (glycyrrhizic acid, GA) 是甘草中最重要的有效成分之一, 对各种急慢性炎症模型均有明显抑制作用。其抗炎机理与其抑制磷脂酶A2活性, 抑制PEGs、白三烯等炎症介质的产生, 增强巨噬细胞合成NO, 以及促进酪氨酸蛋白激酶CK-II催化的磷脂化反应等作用有着密切的关系[23,24,25] , 进一步揭示甘草酸与磷脂化反应调控之间的关系, 对于揭示甘草酸的抗炎机理意义更大。

扁蒴藤素是从卫矛科粉背南蛇藤中提取的醌甲基三萜类的单体化合物, 体内实验证实扁蒴藤素具有显著的抗炎作用, 抗炎作用与其抑制白细胞游走、蛋白质渗出及抑制NAG释放, 降低 NO含量, 抑制MDA生成, 增强SOD及CAT活性有关[26] 。

5 展望

抗炎免疫成分 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

红毛五加由中山大学药学院杨得坡教授鉴定为红毛五加[Acanthopanax giraldii Harms.]的茎皮,RPMI1640干粉(Gibco公司)HEPES(Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青公司),DMSO(广州化学试剂厂),脂多糖(Sigma公司),PGE2放免试剂盒(苏州大学医学院血栓室),EDTA(上海生工公司),胰蛋白酶(上海生工公司),MTT(上海生工公司),柱色谱用硅胶(100-200目),实验中所用甲醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、乙醇等试剂均为分析纯,RAW264.7细胞株(中山大学实验动物中心细胞库)。

1.2 试验方法

1.2.1 化学成分的提取与分离

红毛五加茎皮干燥品3kg,粉碎成粗粉,加10倍量95%乙醇室温浸泡48h,滤取提取液;残渣再用8倍量的95%乙醇室温浸泡48h,滤取提取液。合并两次提取液,低温(40℃)减压回收溶剂至300mL,真空40℃干燥至无醇味,得浸膏。取浸膏80g,加1000mL的蒸馏水溶解,依次用石油醚,乙酸乙酯,正丁醇各萃取5次,低温(40℃)减压回收溶剂,真空40℃干燥得石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分、水相部分,称重。

1.2.2 M TT法检测红毛五加三个萃取部分以及水相部分对细胞株RAW264.7的活性的影响

实验分组:正常对照组(细胞培养液)、溶剂组(终浓度为含1‰DMSO培养基)、各萃取部分及水相部分(终浓度分别是200mg/L、150mg/L、l00mg/L、50mg/L)。

取对数生长期的RAW264.7细胞,用0.25%的胰酶消化,吹打成为均匀的单细胞悬液,计数细胞,用培养基稀释成7.5×103 cell/mL接种于96孔板中,每孔200μL,37℃,5%CO2培养箱培养24h。弃除培养液,用PBS洗涤3次,每孔加入180μL培养基,随即按照试验分组加入20μL试验药物,对照组加入20μL培养基,溶剂组加入20μL含DMSO的培养基。每组6孔,连续孵育20h,在实验结束前4h,每孔加入MTT(5mg/mL)20μL,继续孵育至实验结束,吸弃上清,每孔加入100μL DMSO充分溶解细胞沉淀,振荡15min,在1h内用酶标仪在490nm处测定吸光度(OD值),重复试验6次。

1.2.3 红毛五加三个萃取部分及水相部分对巨噬细胞样细胞RAW264.7产生PGE2的作用

试验分组:正常对照组(细胞培养液)、溶剂组(终浓度为含1‰DMSO培养基)、LPS刺激组、LPS+药物组40mg/L、LPS+药物组10mg/L。(药物分别为:石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分、水相部分),每组6孔。

试验步骤:取对数生长期的RAW264.7细胞,用0.25%的胰酶消化,吹打成为均匀的单细胞悬液,计数细胞,用培养基稀释成5×105cell/mL接种于24孔板中,每孔1mL,37℃,5%CO2培养24h。吸弃培养液,PBS洗涤三次。对照组加入1mL培养基,除对照组外各孔加入890μL培养基,10μL LPS,100μL药物,37℃,5%CO2孵育24h。培养结束后吸取上清入1mLEP管中,4℃,3000r/min离心3min,-20℃冻存至测定,重复试验3次。

测定:放射性免疫法(RIA)测定PGE2的含量,PGE2的抑制率按照下列公式计算:

抑制率IR=(CLPS-C药物)/(CLPS-C对照)×100%。

1.3 统计学分析

数据以均数±标准差(χ—±s)表示,抑制率以百分率表示,采用SPSS11.0软件对数据进行两独立样本资料t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法测定三个萃取部分以及水相部分对RAW264.7细胞活性的影响

石油醚萃取部分中正常细胞组的OD值为(0.484±0.016),溶剂组的OD值(0.486±0.023),溶剂组与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05),而200mg/L剂量组、150mg/L组、100mg/L组、50mg/L组分别为(0.343±0.055)、(0.455±0.031)、(0.456±0.023)、(0.469±0.027)。石油醚萃取部分中200mg/L组、150mg/L组、100mg/L组、50mg/L组细胞活性与正常对照组相比有统计学意义(P<0.05);150mg/L与正常对照组相比无统计学意义(P>0.05)。同样的乙酸乙酯萃取部分,正丁醇萃取部分,水相部分100mg/L以下均不抑制细胞活性,见表1~4。

2.2 三个萃取部分及水相部分对RAW264.7细胞产生PGE2的作用

RAW264.7细胞在LPS刺激下产生的PGE2为(9.18±1.27)pg/m L,对照组为(1.08±0.57)pg/mL,与刺激组相比,有统计学意义(P<0.01),增加倍数约为9倍。而溶剂组的PGE2为(9.05±0.87)pg/mL,与LPS刺激组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。石油醚萃取部分在40mg/L以及10mg/L药物剂量组对LPS刺激RAW264.7细胞产生PGE2为(8.85±1.85)pg/m L、(9.80±2.03)pg/m L,与刺激组相比,均无统计学意义(P>0.05),见表5。乙酸乙酯萃取部分在40mg/L以及10mg/L药物剂量组对LPS刺激RAW264.7细胞产生PGE2为(9.70±3.59)pg/mL、(10.43±4.28)pg/mL,与刺激组相比,无统计学意义(P>0.05),见表6。正丁醇萃取部分的40mg/L以及10mg/L药物剂量对LPS刺激RAW264.7细胞产生PGE2为(7.26±0.95)pg/m L、(7.43±0.82)pg/mL,与刺激组相比,差异有统计学意义(P<0.05),抑制率分别为23.7%、21.6%,见表7。水相部分的40mg/L以及10mg/L药物剂量对LPS刺激RAW264.7细胞产生PGE2为(7.18±1.46)pg/mL、(10.34±5.44)pg/mL。40mg/L剂量组与刺激组相比,差异有统计学意义(P<0.05),抑制率为24.7%,见表8。

注:溶剂为含1‰DMSO的培养基vs正常对照,**P<0.01,*P<0.05

注:溶剂为含1‰DMSO的培养基vs正常对照,**P<0.01

溶剂为含1‰DMSO的培养基vs正常对照,**P<0.01

注:溶剂为含1‰DMSO的培养基vs正常对照,**P<0.01

3 讨论

红毛五加所用药材为其茎皮,与其他所有中药一样,红毛五加所含成分多而复杂,其中苷类、多糖为其主要成分,苷类可能为其主要的抗炎有效成分。参考文献以及前期的试验预试验,所以本试验选用95%乙醇提取,不同极性的溶剂萃取,以及用硅胶柱分离的传统的方法。

注:溶剂为含1‰DMSO的培养基,药物为石油醚萃取部分,vs LPS刺激组,**P<0.01

注:溶剂为含1‰DMSO的培养基,药物为乙酸乙酯萃取部分,vs LPS刺激组,**P<0.01

注:溶剂为含1‰DMSO的培养基,药物为正丁醇萃取部分,vs LPS刺激组,*P<0.05,**P<0.01

注:溶剂为含1‰DMSO的培养基,药物为水相部分,vs LPS刺激组,*P<0.05,**P<0.01

细胞水平反映的是药物对细胞的整体作用,通常用来筛选可以影响细胞功能的样品,与分子水平相比,细胞筛选可以得到更多的信息,与动物水平筛选相比,可以节约成本。因此本研究以在细胞水平上筛选红毛五加抗炎有效成分。

炎症反应是机体的一种保护性反应,但是过度的炎症反应会危害机体的正常生理功能,导致各种疾病的发生。炎性反应又是一种复杂的病理过程,在炎症部位有多种炎性介质的存在,而且一种炎性介质的释放,不仅可对本身的释放起正负反馈作用,还可以激活其他介质系统,由此产生一系列的连锁反应,从而导致炎症的进一步发展。其中类脂质介质是重要的炎症介质,它是膜磷脂经由花生四烯酸的代谢产物。花生四烯酸属不饱和脂肪酸,为哺乳动物组织中细胞内膜磷脂的构成成分。当各种致炎因素和免疫原刺激组织细胞时,细胞膜发生紊乱,膜磷脂酶A2被激活,其水解细胞内膜磷脂从而释放出游离的花生四烯酸[10]。经COX代谢后的产物为前列腺素(prostaglandins,PGs),血烷酸(TXA2,TXB2)和前列环素(prostycyclin,PGI2)等,它们与炎症的发生和发展有着密切关系[11],PGE2是巨噬细胞产生的一种非蛋白非多肽的脂肪酸代谢产物。PGE2能扩张毛细血管前微动脉;通过兴奋血管壁PG受体,激活腺苷酸环化酶,使平滑肌细胞内cAMP增加而舒展血管;PGE2还能抑制交感神经释放缩血管的去甲肾上腺素而扩展血管。PGE2能增高微静脉,毛细血管后微静脉的通透性以及刺激组胺释放而增加血管通透性。PGE2产生痛觉过敏和致痛的作用。PGE2能增加单核细胞,中性粒细胞的趋化反应,PGE2还是已知的最强致热物质之一[12]。

在巨噬细胞中PGE2的改变可以反应COX活性或COX表达的改变,所以本试验建立以巨噬细胞样细胞RAW264.7为目标细胞的以PGE2的改变为指标的体外筛选模型逐步从红毛五加提取物中筛选抗炎的有效成分。

抗炎免疫成分 篇4

1实验材料

1.1试剂和仪器

醋酸泼尼松由三九同达药业有限公司生产; 2, 4二硝基氯苯 (DNCB) 由上海试剂厂生产, 氢化可的松由扬州制药厂提供;角叉菜胶为Sigma产品。751型紫外分光光度计;DL-50型超级恒温器, TDL-5型低速台式离心机;TG328A型电子分析天平; RE-52型旋转蒸发器。

1.2实验动物

大鼠70只, 体重 (126.2±21.7) g, 昆明种小鼠120只, 体重 (19.1±2.1) g, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供, 常规饲养。

1.3板党提取物的制备

板党由恩施州中药材生产GAP (质量管理规范) 示范基地提供。板党醇提液:板党粗粉经乙醇回流提取3次后制成1g/mL醇提取液。板党水提液:板党水煎煮3次后, 过滤浓缩成1g/mL溶液。

2实验方法

2.1小鼠耳肿胀抑制实验[2]

将40只昆明种小鼠随机分为4组, 给药组分别ip水提液1.5g/kg和3.5g/kg, 阳性药组ip氢化可的松2.0mg/kg, 对照组ip等量生理盐水。给药40min后, 将每只小鼠右耳内外双侧均匀涂巴豆油致炎液0.05mL, 左耳作对照, 1h后处死并剪下双耳, 打孔器 (6mm) 取耳片, 分别精密称重, 计算抑制率。

2.2角叉菜胶致大鼠足肿胀实验 (参考文献[2,3] )

大鼠30只, 随机分成3组, 给药组分别ip醇提液1.5g/kg和3.5g/kg, 对照组ip等量生理盐水。40min后, 将1%角叉菜胶溶液0.15mL注入右后肢脚掌皮下, 用足容积测量器测量大鼠右后肢踝关节以下容积并记录致炎前后容积。

2.3大鼠棉球肉芽肿实验 (参考文献[2,4] )

大鼠40只, 随机分为4组, 乙醚浅麻, 手术第2天醇提液组和水提液组分别ip 0.5g/kg、 1.5g/kg, 阳性药组ip氢化可的松2.0mg/kg, 对照组ip等量生理盐水, 1次/d, 连用4天, 第5天处死大鼠, 将无菌棉球及肉芽组织取出, 置于60℃烤箱内进行干燥, 然后精密称重, 对肉芽组织重量及抑制率进行计算。

2.4小鼠碳粒廓清实验[5]

将40只昆明种小鼠, 随机分成4组, 给药组ig水提液20g/kg和40g/kg, 阳性药组ig醋酸泼尼松15mg/kg, 对照组ig等体积的生理盐水, 连用4天, 在最后一次给药1h后, 鼠尾iv印度墨水15mL/㎏, 分别在1min、6min时从小鼠眼静脉丛处吸取血液25μL, 用2.5mL 0.1%Na2CO3溶液进行溶解, 于650nm测定吸光度。采血后将小鼠立刻处死, 摘取其肝、脾脏, 称湿重, 按公式计算廓清指数K值和吞噬指数α值。

2.5DNCB致小鼠迟发型超敏反应实验[5]

将昆明种小鼠40只随机分成4组, 给药组ig水提液20g/㎏和40g/㎏, 阳性药组ig醋酸泼尼松15mg/kg, 对照组ig等体积的生理盐水, 颈背部sc7%DNCB丙酮溶液25μL致敏。不间断给药8天后, 用同一溶液45μL涂于右耳廓两面进行攻击, 将左耳廓用作对照, 24h后, 将其双耳剪下, 用6mm打孔器取耳片, 精确称重, 记录差值作为迟发型超敏反应的强度, 计算抑制率。

2.6数据分析

采用SPSS11.0分析软件处理实验数据。

3实验结果

(1) 板党水提液对巴豆油致小鼠耳肿胀的影响 (表1) 。

注:*p<0.05; **p<0.01。

(2) 板党醇提液对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响 (表2) 。

(3) 板党提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响 (表3) 。

(4) 板党水提液对小鼠碳粒廓清功能的影响 (表4) 。

注:*p<0.05;**p<0.01。

注:*p<0.05;**p<0.01。

注:*p<0.05;**p<0.01。

(5) 板党水提液对DNCB致小鼠迟发型超敏反应的影响 (表5) 。

4讨论

炎症是机体组织受损伤时所发生的一系列保护性应答, 以局部血管为中心, 典型特征是红、肿、热、痛和功能障碍, 可参与清除异物和修补组织等。实验表明板党有较强的抗炎和免疫调节作用, 其抑制作用随剂量的增加而增强, 还能够显著抑制异物所致大鼠炎症的肉芽增生。板党水提液可提高小鼠碳粒廓清K值及α值, 表明能增强单核巨噬细胞的吞噬功能, 能明显抑制2, 4二硝基氯苯引起的小鼠迟发型超敏反应, 这可能与抑制了T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞有关。富硒板党抗炎和免疫调节作用是否与根中含硒量也有一定的关系, 还有待于进一步深入研究。

注:*p<0.05;**p<0.01。

摘要：目的:探讨恩施地区板桥党参的抗炎和免疫作用。方法:抗炎实验采用巴豆油致小鼠耳廓肿胀等常规抗炎模型;免疫实验采用对小鼠体内碳粒廓清功能影响等方法。结果:板党提取物可明显抑制巴豆油致小鼠耳廊肿胀及角叉菜胶引起的大鼠足跖肿胀, 能显著抑制大鼠棉球肉芽肿的增重及2, 4二硝基氯苯 (DNCB) 致小鼠迟发型超敏反应 (DTH) , 增强吞噬功能。结论:板党有明显的抗炎和免疫调节作用。

关键词：板党,抗炎作用,免疫功能

参考文献

[1]肖本见, 陈国栋, 兰宗平.富硒板党地上部分对小鼠益智和低氧/复氧损伤的保护作用的研究[J].中药材, 2005, 28 (8) :688-690.

[2]H GERHARD VOGEL编, 杜冠华译.药理学实验指南—新药发现和药理学评价[M].北京:科学出版社, 2001:535, 536, 544, 583.

[3]徐叔云, 卞如濂, 陈修, 等.药理实验方法[M].第1版.北京:人民卫生出版社, 1982:934-934, 945-945.

[4]Li Y K.Methologyin Pharmacological Study on Chinese Ma-teria Medica[M].Shanghai:Shanghai Science ang TechnologyPress, 1991:155.

抗炎免疫成分 篇5

1 材料

1.1 动物

KM小鼠, 体重 (20±2) g, ♀♂各半;SD大鼠, 体重 (200±20) g, ♀♂各半;购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。

1.2 药物及试剂

抗感利咽喷雾剂由武汉市三医院中药制剂中心提供 (每毫升含生药0.64克) , 批号:050615。磷酸可待因片:青海制药厂生产, 批号:051022。地塞米松片:湖北迪晨药业有限公司产品, 批号:050311。左旋咪唑片:陕西博华制药有限责任公司产品, 批号:051008。息斯敏片:西安杨森制药有限公司产品, 批号:050610。

2方法及结果

2.1 镇咳作用[1]

取小鼠40只, 按性别体重随机分为4组, 每组10只, 即空白组, 抗感利咽喷雾剂高剂量组、抗感利咽喷雾剂低剂量组和磷酸可待因组。抗感利咽喷雾剂高、低剂量组予抗感利咽喷雾剂6.4、3.2g/kg灌胃给药;磷酸可待因组灌胃给可待因片混悬液0.2g/kg, 空白组灌胃等量蒸馏水, 每日1次, 连续3天。末次给药1小时后, 将小鼠逐只放入玻璃钟罩内, 超声波雾化器恒压喷入氨水气雾10秒, 记录从喷雾开始至小鼠第1次咳嗽时间 (咳嗽潜伏期) 和2分钟内的咳嗽次数。数据经t检验处理, 结果见表1。

2.2 抗炎作用

2.2.1 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀度的影响[1]

取小鼠40只, 按性别体重随机分为4组, 每组10只, 分别为空白对照组、抗感利咽喷雾剂高剂量组、抗感利咽喷雾剂低剂量组和地塞米松组。抗感利咽喷雾剂高、低剂量组予抗感利咽喷雾剂6.4、3.2g/kg灌胃, 地塞米松组给予地塞米松混悬液0.5g/kg灌胃, 空白组灌胃等量蒸馏水, 每日1次, 连续3天。末次给药1小时后, 小鼠右耳涂以二甲苯0.05ml, 左耳不涂作自身空白对照。涂抹二甲苯30分钟后, 将小鼠颈椎脱臼处死, 用内径6mm的打孔器打下左、右双耳相应部位的圆耳片, 迅速在精密扭力天平上称重, 右耳圆片重量减去左耳圆片重量之差为肿胀度, 比较各组的肿胀度。数据经t检验处理, 结果见表2。

与空白组比较*P<0.05, **P<0.01

与空白组比较*P<0.05, **P<0.01 (下同)

2.2.2 对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性亢进的作用[1]

取小鼠40只, 分组、给药及剂量同2.2.1。末次给药1小时后, 小鼠尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水 (0.1ml/10g) 后, 立即于小鼠腹腔注射0.6%醋酸0.2ml, 20分钟后, 断头放血处死小鼠, 剪开腹腔, 用5ml生理盐水冲洗腹腔3次, 收集洗涤液, 离心 (1000r/min) 5分钟, 取上清液在721型分光光度计590nm处测定吸收度 (OD值) 。数据经t检验处理, 结果见表3。

与空白组比较*P<0.05, **P<0.01

2.2.3 对大鼠蛋清性足趾肿胀的作用[1]

取大鼠40只, 按性别体重随机分为4组, 每组10只, 分别为空白组、抗感利咽喷雾剂高剂量组、抗感利咽喷雾剂低剂量组、地塞米松组。抗感利咽喷雾剂高、低剂量组予抗感利咽喷雾剂3.2、1.6g/kg灌胃, 地塞米松组予地塞米松混悬液0.5g/kg, 空白组灌胃等量蒸馏水。每日给药1次, 共3次。末次给药1小时后, 从大鼠右后掌向踝关节方向进针, 皮下注射10%鸡蛋清液0.1ml致炎, 排水法测定致炎后1、2、3、4、5、6小时大鼠右后足踝关节以下足爪的容积, 计算肿胀度, 数据进行t检验处理, 结果见表4。

与空白组比较*P<0.05, **P<0.01

2.3 对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响[1] (小鼠血清炭粒廓清指数测定)

取小鼠40只, 随机分为4组, 每组10只, 空白组、抗感利咽喷雾剂高剂量组、抗感利咽喷雾剂低剂量组、左旋咪唑组。抗感利咽喷雾剂高、低剂量组予抗感利咽喷雾剂6.4、3.2g/kg灌胃, 左旋咪唑组予左旋咪唑混悬液0.05g/kg, 空白组灌胃等量蒸馏水, 各组每日灌胃给药1次, 连续3天。末次给药1小时后, 小鼠尾静脉注射印度墨汁 (0.1ml/10g) , 分别在2、5分钟时从小鼠眼眶用尖嘴吸管取血0.025ml, 立即注入装有2ml 0.1%Na2CO3的试管中, 摇匀, 在721型分光光度计600nm处测定吸收度 (OD值) , 比较各组小鼠单位时间内血清中碳粒指数K值。K= (LogOD1-LogOD2) / (t2-t1) 。实验数据进行t检验处理, 结果见表5。

与空白组比较*P<0.05, **P<0.01

3 讨论

抗感利咽喷雾剂属中药复方制剂, 是在传统验方银翘散基础上加减调整而成。方中金银花、连翘、贯众、鱼腥草清热解毒、辛凉透邪;牛蒡子、射干清咽利喉、消肿止痛。现代药理研究表明, 上述诸药具有明显抗炎、抗病毒、抑菌、解热等作用[2,3,4,5]。

本实验结果表明抗感利咽喷雾剂高、低剂量均能显著延长氨水致小鼠咳嗽的潜伏期和减少咳嗽次数, 具有镇咳作用。耳廓肿胀、腹腔注射醋酸实验显示, 本制剂高低剂量均能显著减轻化学物质刺激导致的炎性渗出和腹腔毛细血管通透性亢进, 明显抑制组织水肿;足跖肿胀实验显示本制剂高低剂量均有显著的抗炎消肿作用。通过小鼠血清炭粒廓清试验显示本制剂能显著提高正常小鼠巨噬细胞吞噬功能, 提示该药能增强机体的非特异性免疫, 具有提高机体免疫功能的作用。

参考文献

[1]陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社, 1996:168.

[2]孙延波.金银花对口腔病原性微生物体外抑菌试验的研究.中国中药杂志, 1996, 21 (4) :242.

[3]洪佳漩, 高雅文, 汪柏尧, 等.鲜鱼草提取物抗菌作用的实验研究.中国中医药科技, 2007, 14 (6) :418.

[4]胡克杰, 徐凯建, 王跃红, 等.连翘酯甙体外抗病毒作用的实验研究.中国中医药科技, 2001, 8 (2) :89.

抗炎免疫成分 篇6

1 三七的抗炎作用

始载三七的《本草纲目》中记载,“甘,微苦,温,无毒。止血,散血,定痛。金刃箭伤,跌扑杖疮,血出不止者,嚼烂涂,或为末掺之,其血即止。亦主吐血,衄血,下血,血痢,崩中,经水不止,产后恶血不下,血运,血痛,赤目疖肿处,咬蛇伤诸病”。根据这些记载,可以认为三七除具有止血作用,还具有抗炎作用,尤其是对炎症伴有血肿的急性期病症疗效确切。

三七对多种原因引起的血管通透性的增加有明显的抑制作用。王一菱等[1]的研究认为三七总皂甙通过抑制肥大细胞释放组织胺等活性物质,抗渗出,改变炎症早期的血管通透性而具抗炎作用。李淑惠等[2]发现三七叶皂甙剂量依赖性抑制角叉菜胶诱导大鼠气囊滑膜炎灌洗液中磷脂酶A2(PLA2)活性,降低灌洗液中前列环素E2(PGE2)含量,并同时降低灌洗液中白细胞数及蛋白含量,认为其具有良好的抗炎活性。陈剑鸿等[3]研究了三七总皂苷对内毒素损伤血管内皮细胞的炎症的抗炎作用,发现内毒素加三七总皂苷组与内毒素组相比,各指标均较内毒素组有不同程度降低,认为其具有抗炎作用。刘文娥等[4]建立恒河猴子宫内膜炎模型,探讨复方三七成分对恒河猴子宫内膜炎症所致异常出血,子宫内膜超微结构的影响。治疗组以复方三七成分灌胃治疗,模型组及空白对照组给予等量生理盐水,3个疗程后,在预测下一次月经来潮前1 d切取3组猴的子宫内膜,固定后置电镜下观察。结果电镜下空白组子宫内膜为正常分泌晚期图像;模型组间质内可见大量炎性细胞浸润,螺旋动脉扩张,内皮细胞线粒体广泛空泡样变;治疗组间质细胞有少量炎性细胞,螺旋动脉部分内皮细胞线粒体有空泡样变。认为复方三七成分可以促进螺旋动脉内皮细胞和平滑肌细胞的修复从而达到抗炎止血的作用。炎症因素可以明显促进泡沫细胞的生成,贾乙等[5]通过研究发现三七皂苷可通过其抗炎活性干预这一过程。在传统泡沫细胞形成模型基础上添加炎症刺激因素及三七皂苷,三七皂苷可以明显减少由炎症因素引起的脂质沉积的增加。

2 三七的免疫调节作用

2.1 三七的免疫增强作用

清代赵学敏《本草纲目拾遗》中说“三七补血第一”,认为三七有较强的补益功效。民间也多有以三七滋补的习惯。提示三七有一定的免疫增强的作用。

张文琦等[6]用纯化的三七根皂甙及叶皂甙给小鼠灌胃,连续7 d后,观察其对红细胞免疫功能的影响。结果表明三七皂甙能升高红细胞补体C3b受体花结率,提示其能增强机体红细胞免疫功能。周小玲等[7]研究发现三七能明显提高肺泡巨噬细胞及外周血中性粒细胞的吞噬率,降低外周血白细胞移行抑制指数,表明三七能提高大鼠的特异性和非特异性细胞免疫功能。孙云等[8]给D-半乳糖衰老模型小鼠连续灌服复方三七口服液,发现复方三七口服液能增加D-半乳糖实验性衰老模型小鼠脏器指数,加快碳粒廓清速率,增强淋巴细胞转化能力,明显提高血清超氧化物歧化酶水平并降低脂质过氧化物含量,提示复方三七口服液可增强免疫和抗氧化功能从而能延缓衰老。赵鹏等[9]以三七皂甙粉给小鼠连续灌胃后,显示三七皂甙能明显刺激小鼠的脾淋巴细胞增值、转化作用,促进小鼠迟发型变态反应作用,提高小鼠抗体生成细胞数,提高小鼠的血清溶血素水平,促进小鼠单核-巨噬细胞吞噬作用,增强小鼠的单核-腹腔巨噬细胞吞噬能力,提高小鼠NK细胞活性,说明三七皂甙具有增强免疫力作用。江源等[10]采用环磷酰胺皮下注射制作小鼠免疫低下模型,应用三七皂苷Rg1进行预防与治疗,观察其对免疫低下小鼠模型外周血白细胞总数、淋巴细胞百分率、脾指数、胸腺指数及刀豆球蛋白A(ConA)诱导的脾细胞增殖能力的影响,结果发现采用三七皂苷Rg1治疗或预先采用三七皂苷Rg1注射均可明显增强小鼠的免疫能力,对环磷酰胺有一定的拮抗作用。肖幸丰等[11]采用血清药理学方法观察脂多糖诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖、白细胞介素(IL)-2分泌,结果三七总皂苷含药血清能明显促进小鼠脾淋巴细胞增殖,表明对小鼠免疫系统具有一定的选择性调节作用,主要增强T细胞功能。

2.2 三七的免疫抑制作用

免疫系统的过度激活尤其是自身免疫的发生会导致多系统的损伤。三七可以通过抑制相应器官组织中炎性因子的含量抑制免疫反应对靶器官的损伤。

王勇等[12]研究提示烫伤后可致机体免疫紊乱,伤后早期巨噬细胞分泌过多的肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-1,体外运用三七总皂苷可抑制核因子(NF-κB)活性,干预NF-κB信号通路,降低TNF-α mRNA,从而控制烫伤后炎症反应。张林波等[13]建立帕金森病大鼠模型,采用三七皂甙Rg1纹状体内注射,检测处理后大鼠的神经行为、纹状体内炎性因子含量变化及脾细胞增殖反应。结果显示三七皂甙Rg1可明显减少模型大鼠的神经旋转行为,降低纹状体损毁侧TNF-α、IL-1β和IL-6含量,同时对脾细胞有增殖效应。结果表明三七皂甙Rg1可调整机体的免疫功能,降低免疫炎性反应对多巴胺能神经元的损伤。刘雅等[14]观察兔食饵性动脉粥样硬化(AS)形成过程中血清中IL-6、C-反应蛋白(CRP)、循环免疫复合物(CIC)水平的变化和三七总皂苷对这些免疫因子及动脉粥样斑块面积大小的影响。结果显示,AS模型组IL-6、CRP及CIC水平明显高于正常对照组;三七总皂苷组各时相点IL-6、CRP及 CIC水平显著低于AS模型组,主动脉斑块面积也较AS组明显降低;IL-6、CRP和CIC水平均与AS斑块面积呈显著正相关性。结果表明三七总皂苷可以通过抗炎和免疫抑制的途径发挥抗AS的作用。丁青等[15]研究了三七在子宫内膜细胞炎症过程中对NF-κBp65表达和活性变化及其TNF-α、IL-1β含量变化的影响。结果发现子宫内膜细胞炎症过程中细胞核内出现NF-κBp65的高水平表达,TNF-α、IL-1β的含量随炎症发展而逐渐上升,三七复合有效成分能有效降低炎症因子TNF-α、IL-1β的含量,降低NF-κBp65的转录及蛋白表达量,抑制NF-κBp65的核因子DNA结合活性。姚茹冰等[16,17]研究提示三七总皂苷可能通过抑制佐剂性关节炎大鼠血清和腹腔巨噬细胞分泌的炎症细胞因子TNF-α、IL-1β,对关节炎发挥治疗作用,并且与地塞米松相比,无抑制大鼠生长发育和减轻大鼠体质量的作用。

3 小 结

抗炎免疫成分 篇7

在本研究中,用分子蒸馏对超临界流体萃法取制备的当归挥发油进行进一步分馏,应用气质联用色 谱 ( gas chromatography-mass spectroscopy, GC-MS) 分析所得馏分的化学组成,用LPS诱导的RAW264. 7细胞模型评价各馏分的抗炎作用,用PLSR分析各馏分中的化学成分与抗炎药效的相关性。本研究为当归及其他中药挥发油的进一步开发利用及中药挥发油质量控制提供了有价值的资料。

1材料

1.1材料与试剂

当归饮片购自北京本草方源药业有限公司,经北京中医药大学中药学院中药鉴定系刘春生教授鉴定为伞形科植物当归的干燥根。提取前将当归饮片粉碎成粗粉。

脂多糖,二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide,DMSO) 购自Sigma-Aldrich公司; 磷酸盐缓冲液( PBS) 、青霉素—链霉素溶液、MTT试剂购自北京索来宝公司; NO试剂盒购自江苏碧云天生物科技研究所; DMEM培养基、色谱级乙酸乙酯购自Fisher公司。

1.2仪器与设备

HA220-50-01超临界流体萃取仪 ( 江苏南通华安超临界萃取有限公司) ,BSA224S分析天平( 赛多利斯科学仪器有限公司) ,VLK-70分子蒸馏设备 ( 德国瑞达有限公司) ,Thermo Finnigan 2000 Trace DSQ气相色谱-质谱仪器( 美国Thermo公司) ,Multiskan GO多功能酶标仪( 美国Thermo公司) 。

2实验方法

2.1超临界流体萃取及分子蒸馏

根据实验室前期已确定的最佳提取工艺对当归进行超临界流体萃取,以CO2为萃取溶剂。提取的工作条件如下: 工作压力: 30 MPa,工作温度: 50℃ ,提取时间: 2小时,CO2的流量: 25 L/h; 分离器 Ⅰ的工作压力: 8 MPa,温度: 50℃ ; 分离器Ⅱ的压力为提取系统尾部的压力,工作温度: 35℃。

用分子蒸馏设备对所得挥发油进行分馏,工作条件如下: 刮刀的转速: 300 rpm/min,分子蒸馏过程真空度: 0. 35 mbar,滴速: 每秒1 ~ 2滴。本研究中, 通过改变温度来获得不同的馏分。将所得到的馏分保存在 - 20℃冰箱中用于进一步的研究。

2.2总提取物与各馏分的GC-MS分析

将各馏分适当稀释后,用无水硫酸钠脱水,然后用GC-MS进行分析,GC-MS条件: 柱子型号: 安捷伦DB-5 MS( 0. 25 mm × 30 m,0. 25 μm) ,进样口温度: 230 ℃,升温程序: 80 ℃ 以3 ℃ /min升温至167 ℃ ,保持2. 5 min; 以2 ℃ / min升至202 ℃ ,以4 ℃ / min升至280 ℃ ,保持15分钟,载气为高纯氦气,流速: 1 m L/min,进样量: 1 μL,溶剂延迟: 4分钟。离子源温度: 230 ℃,电离源: EI,电子能量: 70 ev; 传输线温度: 250 ℃ ; 四级杆温度: 150 ℃ ,扫描质量范围: 35 ~ 550 amu。

2.3抗炎能力的测定—馏分对LPS诱导的RAW264.7释放NO的抑制作用

2. 3. 1 RAW264. 7细胞培养及传代小鼠单核巨噬细胞系细胞RAW264. 7细胞购自国家实验细胞资源共享平台。细胞用含有10% 胎牛血清,1% 青霉素—链霉素溶液的DMEM培养基,培养环境为37℃ 、5% CO2,当细胞生长密度达到70% ~ 80% 的时候进行传代,1 ~ 2天换液1次,2 ~ 3隔天传代。

2. 3. 2MTT测定各馏分对RAW264 . 7生长的影响将处于 对数生长 期的RAW264. 7细胞,按1 × 104/ 孔的密度接种于96孔板中,置于37 ℃ 、 5 % CO2的环境中培养24小时,然后分别加入不同浓度的含药 培养基,使药物的 最终浓度 分别为100 μg / m L、50 μg / m L、25 μg / m L、12 . 5 μg / m L、 6 . 25 μg / m L、3. 13 μg / m L、1 . 56 μg / m L,同时设置空白对照组与调零孔。继续培养24小时后,加入5 mg / m L的MTT 20 μL,置于细胞培养箱中孵育4小时,吸出上清液后,每孔加入150 μL DMSO,放置于摇床上摇10分钟,用酶标仪测定其在450 nm处的吸光度。

2 . 3 . 3馏分对NO释放的影响将处于对数生长期的RAW264. 7细胞,按照1 × 104/ 孔的密度接种于96孔板中,于37℃ 、5% CO2环境中培养24小时,然后分别加入含药培养基,使其最终浓度为12 . 5 μg / m L,继续培养1小时后,加入LPS进行诱导,LPS的终浓度是10 μg /m L,对照组加入等量的PBS,继续培养24小时后,吸取细胞上清液进行离心,用Griss试剂法测定每组细胞的上清液中的NO,按照试剂盒上的操作步骤进行测定,通过计算NO抑制率评价馏分的抗炎作用。

2.4统计学处理

采用SPSS 20. 0进行统计分析,结果以均数 ± 标准差(  ± s) 表示,经检验数据符合正态分布,方差齐,采用单因素方差分析,多组间两两比较采用LSD检验,检验水平 α = 0. 05,双侧检验,P < 0. 05时有显著性差异。用SIMCA-P 11. 5偏最小二乘法回归( partial least squares regression,PLSR) 分析馏分中化学成分与抗炎作用的相关性。

3结果

3.1超临界流体萃取及分子蒸馏

本研究用超临界流体萃取法制得了棕色澄明的当归挥发油,得率为1. 4% ,其中当归挥发油中主要有效成分藁本内酯的相对含量为65. 98% 。

当归挥发油进行分子蒸馏后得到6个不同的馏分,在100℃ 下分离得到了馏分1,然后将残渣进一步分离,在110℃时,得到馏分2,并将所得的残渣按照上述方法进一步分离,在120℃、130℃、140℃、 150℃ 下分别获得了馏分3、馏分4、馏分5、馏分6。 馏分1到馏分6从浅黄色变化到橙黄色,颜色逐渐加深,黏度增大。

3.2当归挥发油分子蒸馏后所得馏分的GC-MS分析

通过与NIST 2. 0质谱图库提供的标准图谱进行比较,并查阅参考文献,确定各馏分中的化学成分。

采用面积归一化法确定馏分中各化学成分的相对含量。本研究为研究各馏分中化学成分与其抗炎作用的相关性,为简化分析只对各馏分中相对含量大于1% 的化学成分进行分析。GC-MS分析结果如表1所示。

GC-MS的结果显示,藁本内酯是各馏分中相对含量最高的成分,各馏分中藁本内酯从低到高依次为: 馏分6( 32. 77% ) < 馏分5( 48. 63% ) < 馏分1 ( 62. 46% ) < 馏分2( 72. 27% ) < 馏分4( 75. 28% ) < 馏分3( 79. 97% ) 。

3.3抗炎作用

3. 3. 1各馏分对RAW264 . 7细胞生长的影响如表2所示,MTT结果显示各馏分的药物浓度在12. 5 μg / m L、6. 25 μg / m L、3. 13 μg / m L、1. 56 μg / m L时对细胞的正常生长无影响,细胞生存率与空白对照组相比,无显著性差异,P >0. 05。

3. 3. 2各馏分的抗炎作用本研究考察了各馏分药物浓度在12. 5 μg/m L、6. 25 μg/m L、3. 13 μg/m L、 1. 56 μg / m L时对LPS诱导的RAW264 . 7细胞NO释放的影响,结果显示 当药物浓 度分别为6 . 25 μg / m L、3 . 13 μg / m L、1 . 56 μg / m L能够抑制LPS诱导的RAW264 . 7细胞NO的释放,但无统计学差异( P > 0. 05) 。因此本研究选用各馏分浓度为12. 5 μg /m L ( P < 0. 05 ) 时对LPS诱导的RAW264 . 7细胞释放NO的影响作为抗炎作用评价指标。结果如表3所示。

抗炎结果显示在所得的6个馏分中馏分4的抗炎能力最强,而馏分1和馏分5的能力相对较弱。如表2所示,各馏分的抗炎能力与馏分中藁本内酯的含量不成剂量依赖,馏分中其他成分对馏分抗炎作用的贡献是值得关注的。

3.4偏最小二乘法回归分析

为了研究馏分中化学成分( 相对含量 > 1% ) 与其抗炎作用的相关性,本研究采用SIMCA-P 11. 5偏最小二乘法回归分析,分析馏分中化学成分与抗炎作用的相关性。将各馏分中含量 > 1% 的化学成分的相对含量作为自变量,其抑制NO释放的百分比作为因变量进行回归分析。

PLSR分析结果显示馏分中的化学成分十九烷: 2,2-二甲基-1-苯基-1-丙醇、Z-藁本内酯、E-藁本内酯、十六烷、阿魏酸、十三酸、亚油酸、油酸、5, 8 ,11 -十七碳三炔酸甲酯与馏分抗炎作用呈正相关; ( - ) -柠檬烯、6-丁基-1,4-环庚二烯、β-柏木烯、顺-11,14,17-二十碳三烯酸甲酯、1-石竹烯、红没药醇、桉油烯醇、1-( 2,4-二甲基苯基) -1-丙酮、 丁烯基苯酞、十五烷、2,6,10,14-四甲基十五烷、 2 ,6 ,11 -三甲基十二烷、十八烷、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸、3-羟基甲基烯-2- 樟脑、( Z) -氧代环十七碳-8-烯-2-酮、Ethyl 9,9-diformylnona-2,4,6,8-tetraenoate、己二酸-1-( 2-乙基己基) 酯与馏分的抗炎药效呈负相关,结果如表4所示。

在偏最小二乘法中,自变量在解释因变量重要程度的大小时可以用投影变量重要性指标值来评价,其值越大说明自变量对因变量解释的重要程度越大。

馏分中,各化学成分的变量重要性值如表5所示,当变量重要性值大于1时说明自变量能对因变量做一个更好的解释,各化学成分中变量重要性值大于1的化学成分有十三酸、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、β-柏木烯、顺-11,14,17-二十碳三烯酸甲酯、红没药醇、桉油烯醇、1-石竹烯、十九烷、亚油酸、十五烷、2,6,11-三甲基十二烷、十八烷、 E-藁本内酯、阿魏酸、油酸。结果如表5所示。

注: “ - ”表示在该馏分中未检出。

注: 与空白对照组( 99. 99 ± 4. 21) 比较,aP < 0. 05、bP < 0. 01。

偏最小二乘法的一个重要用途是用于预测建模,以各样本点在Y的原始数据为观测值,以回归方程的拟合值y'为预测值,绘制观测值和预测值的散点图,如下图所示,所有的样本点均排列在途中对角线附近,有关化学成分与药效之间的预测模型的拟合结果: y = 1* x + 2. 935e - 0. 07,R2= 0. 997, 其预测结果是令人满意的,结果如图1所示。

4讨论

超临界流体萃取法是一种快速、清洁的提取技术,是中药挥发油常用的提取手段之一。分子蒸馏,也称为短程蒸馏,是一种快速、高效、无污染的分离和浓缩技术,是分离和纯化的天然产物的常用的方法,特别适用于高沸点、高黏度且热敏性物质分离,被广泛地用于中草药挥发油和其它精油的分离[4,5,6]。

偏最小二乘法是结合了主成分提取和相关性分析的综合建模方法,被称为第二代回归技术,通过成分提取,以主成分分析过程通过协方差矩阵筛选出变异信息贡献程度最大的综合性成分,再通过这些选出来的综合成分建立回归模型[7]。

本研究用分子蒸馏的方法对当归挥发油蒸馏后得到了6个馏分,GC-MS分析结果显示藁本内酯仍是各馏分的主要成分但有较大差异,抗炎实验结果表明不同馏分的抗炎作用不同( P < 0. 05) ,且与馏分中藁本内酯的含量没有依赖性,PLSR结果抗炎药效与化学成分存在较好的线性,说明模型建立是合理的, PLSR结果显示除藁本内酯外,当归超临界提取物中与藁本内酯的共存成分对其抗炎活性也起到了重要的作用。本实验为当归及其他中草药挥发油的进一步研究开发和利用提供了有价值的资料。