转移相关因子3

转移相关因子3（共3篇）

转移相关因子3 篇1

丙泊酚 (P, propofol) 作为一种新型的静脉麻醉药, 因起效快、苏醒迅速而完全、副作用小, 连续静脉输注后无蓄积作用等优点, 现已经普遍用于临床需要做手术的全身麻醉, 包括门诊的小手术、无痛人流和无痛胃肠镜检查等。丙泊酚对缺血再灌注损伤 (IRI, ischemia reperfusion injury) 的组织或器官有保护作用已经从临床和实验研究中得到证实。本实验是关于丙泊酚对大鼠脑缺血再灌注时细胞凋亡 (apoptosis) 和相关因子影响的进一步探讨。

1 材料和方法

1.1 材料

Bax兔抗鼠单克隆抗体 (SC-526) , Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体 (SC-492) , Caspase-3兔抗人多克隆抗体 (SC-7148) , 二步法免疫组织化学检测试剂 (PV-9001) , DAB显色剂 (ZLI-9018) , (TUNEL) 原位细胞凋亡检测 (ZK-8005) , 以上试剂均购于北京中杉金桥生物技术公司, 丙泊酚注射液 (西安力邦制药有限公司) 。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组

雄性Wistar大鼠78只, 体重230～250g, 鼠龄3～4个月, 由佳木斯大学实验动物中心提供。随机分为3组:对照组 (C=6) , 缺血组 (I/R=36) , 丙泊酚组 (P=36) ;缺血组和丙泊酚组又根据再灌注的时间不同分为再灌注1h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h亚组。

1.2.2 模型制备

采用大鼠四条血管阻断方法 (Pulsinelli-4VO) [1]制备大鼠全脑缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛380mg/kg腹腔注入麻醉后, 将大鼠俯卧固定, 备皮, 消毒。在枕骨下于平行脊柱沿颈背正中线切开皮肤, 皮下肌肉至第一颈椎, 找到后弓上的翼突孔, 按其解剖位置将烧灼的细针直接插入双侧翼突孔, 插入时间在1～2秒即可。并电凝烧闭椎动脉;次日用同样的麻醉方法处理大鼠后, 在颈部正中切口, 于双侧颈动脉鞘出分离双侧颈动脉, 在双侧颈动脉环绕丝线并提出颈动脉, 用临时阻断夹夹闭颈总动脉造成全脑缺血15min, 15min后松开阻断夹恢复再灌注。P组于缺血前10min腹腔注入丙泊酚110mg/kg, I/R组在缺血前10min腹腔注入等溶剂的生理盐水。C组不电凝双侧椎动脉, 不夹闭双侧颈总动脉, 其余处理与手术组相同。

1.2.3 标本制作

于再灌注时间点麻醉动物, 迅速剪开胸腔暴露心脏, 于心尖处剪一小口, 插入软管至主动脉, 丝线结扎固定, 剪开右心耳快速向心脏推注肝素化生理盐水, 冲净血液后, 以。4℃4%多聚甲醛灌流30min, 断头取脑, 由视交叉平面冠状切取约4mm组织块, 置4%多聚甲醛固定、脱水、透明、石蜡包埋, 切片机做连续冠状面切片。

1.2.4 免疫组化及TUNEL法检测

免疫组化法检测Bax, Bcl-2, Caspase-3蛋白在大鼠海马CA1区的表达情况, TUNEL法检测其细胞的凋亡数。

1.2.5 数据收集

在400倍光镜下计数CA1区细胞总数和阳性细胞数, 计算阳性率 (阳性率=阳性细胞数/总细胞数×100%) 。每张切片计数4个不重叠视野, 取平均值。

1.3 统计学处理

采用SPSS17.0软件进行统计处理, 数据均用均数±标准差表示。组间比较采用方差分析。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

见表1。

① Bcl-2组间比较:相同时间点P 和 I/R的比较:P72h VS I/R72h;P48h VS I/R48h;P24h VS I/R24h;P12h VS I/R12h;P6h VS I/R6h;P1h VS I/R1h (P<0.05) 。② Bax组间比较:相同时间点P 和 I/R的比较: P72h VS I/R72h;P48h VS I/R48h; P24h VS I/R24h;P12h VS I/R12h;P6h VS I/R6h;P1h VS I/R1h (P<0.05) 。③ Caspase-3组间比较: 相同时间点P 和 I/R的比较, P72h VS I/R72h; P48h VS I/R48h; P24h VS I/R24h;P12h VS I/R12h;P6h VS I/R6h; P1h VS I/R1h (P<0.05) 。④ TUNEL组间比较: 相同时间点P 和 I/R的比较: P72h VS I/R72h: P48h VS I/R48h; P24h VS I/R24h;P12h VS I/R12h;P6h VS I/R6h; P1h VS I/R1h (P<0.05) 。⑤ Bcl-2组内不同时间点比较:I/R1h VS I/R6h、I/R12h、I/R24h、I/R48h、I/R72h (P<0.05) 。, I/R24h VS I/R48h、I/R72h (P<0.05) ;P1h VS P6h、P12h、P24h、P48h、P72h、P<0.05, P24h VS P48h、P72h (P<0.05) 。⑥Bax组内不同时间点比较: I/R1h VS I/R6h、I/R12h、I/R24h、I/R48h、I/R72h P<0.05, I/R24h VS I/R48h、I/R72h (P<0.05) ;P1h VS P6h (P>0.05) , P1h VS P12h、P24h、P48h、P72h、 (P<0.05) , P24h VS P48h、P72h (P<0.05) 。⑦ Caspase-3组内不同时间点比较:I/R1h VS I/R6h、I/R12h、I/R24h、I/R48h、I/R72h (P<0.05) , I/R24h VS I/R48h、I/R72h P<0.05;P1h VS P6h (P>0.05) , P1h VS P12h、P24h、P48h、P72h、 (P<0.05) , P24h VS P48h、P72h (P<0.05) 。⑧TUNEL组间不同时间点比较:I/R1h VS I/R6h、I/R12h、I/R24h、I/R48h、I/R72h (P<0.05) , I/R24h VS I/R48h (P<0.05) , I/R24h VS I/R72h (P>0.05) ; P1h VS P6h (P<0.05) , P1h VS P12h、P24h、P48h、P72h、 (P<0.05) , P24h VS P48h、P72h (P<0.05) 。

3 讨论

在心肺复苏、器官移植、溶栓术、冠脉搭桥术、危重病人存在血流灌注不足时以及临床上脑外科手术麻醉和脑梗死患者不可避免引起IRI。缺血可以产生炎症前反应, 再灌注时进一步加重了组织损伤, 因此防止器官IRI是医生面临最严峻的问题。 细胞凋亡是细胞在基因的调控下主动性程序性死亡, 受促进凋亡基因和抑制凋亡基因的协调及双重调控。Bax是Bcl-2家族成员之一。当在外界因素的作用下促使Bcl-2高表达, 则Bax蛋白与Bcl-2和Bcl-XL蛋白形成异源二聚体可阻止细胞的凋亡发生;但假如Bax蛋白过度表达导致Bax和Bcl-2, Bcl-XL形成同源二聚体而促进细胞的凋亡。Caspae-3属于白介素Ib转换酶家族成员, 是细胞凋亡的执行者。Caspae酶是一种半胱氨酸蛋白激酶, 与启动凋亡和效应阶段关系密切。Caspae-3是促凋亡信号转导通路的重要效应酶, 它的出现是细胞死亡的标志, Caspae-9和Caspae-8分别启动细胞内外凋亡通路与Caspae-3直接相关。近年的研究表明在IRI中活化的Caspae-3可以裂解Bcl-2, 促使线粒体释放CytoC促使细胞凋亡。因此能抑制剂Caspae-3蛋白和Bax蛋白的表达, 同时又能促使Bcl-2蛋白表达, 改善在IRI中的作用, 减少细胞凋亡, 尽可能地保持器官的基本功能。本实验以对缺血缺氧最敏感的海马组织作为研究对象, 可看出Bcl-2蛋白的表达在I/R组和P组中都在再灌注12h时达到最高, 其数值分别是 (36.09±0.71) 和 (43.46±1.11) , 随着再灌注时间的增加, 表达逐步下降, 但Bcl-2蛋白表达在P组始终高于I/R组;Bax 、Caspae-3和TUNEL在I/R组分别在24h、48h、和48h时达到高峰, 其数值分别是 (56.13±1.26) 、 (44.52±0.90) 和 (75.45±2.83) , 以后随再灌注的时间增加表达逐渐减少, 而在P组Caspae-3和 Bax随再灌注时间的延长, 二者的表达逐步降低, 显著低于I/R组Caspae-3和 Bax蛋白表达;此外TUNEL的实验结果也进一步证明P组的大鼠海马CA1区细胞凋亡程度显著低于I/R组;Bcl-2/Bax在I/R组和P组都在关注12h最高, 其数值分别是0.80和2.30, 以后随灌注时间的延长逐渐降低, 但P组始终大于I/R组。丙泊酚作为一种新型的麻醉兼有镇静最常用的药已广泛用于临床上。近年研究其在脑保护方面的研究颇多。其保护机制是多位点相互作用的结果。比如其与维生素E化学结构相似具有抗氧化, 保护线粒体和清除自由基的特性;抑制中枢神经系统兴奋性氨基酸的释放[2];非选择性抑制一氧化氮合酶的活性, 降低神经系统一氧化氮含量;预防钙超载。抑制细胞的凋亡, 比如促进Bcl-2[3]的蛋白表达, 抑制Caspase-3 和Bax蛋白表达。 总之, 在组织器官缺血再灌注过程中应用丙泊酚麻醉药可减少细胞的凋亡, 对其有保护作用。

关键词：丙泊酚,缺血再灌注损伤,细胞凋亡,Bcl-2,Bax,Caspase-3

参考文献

[1]Pulsinelli WA, JamesBA.New model of bilateral hemispheric is-chemia in the unanesthetized rat[J].Stroke, 1979, 10:267

[2]Snyder GL, Galdi S, Hendrick J P, et al.general anaesthetics selec-tively modulate glutamatergic and dopaminergic signaling via site-specific phosphorylation in vivo[J].Neuropharmacology, 2007, 53 (5) :619-630

[3]Chen J, Graham SH, Chen PH, et al.Bcl-2 is expression in neu-rons that survive focal cerebral ischemia the rat[J].Neuroreport, 1995, 26 (2) :394-396

转移相关因子3 篇2

1 资料与方法

1.1一般资料

该院收治的结肠癌合并2型糖尿病患者129例, 其中男性69例, 女性60例, 年龄在55~85岁之间, 平均69.13岁。全部患者均经病理检查被确诊为结肠癌, 均符合2型糖尿病的诊断标准。

1.2 检测方法

标本取材后立即用10%甲醛溶液固定24 h, 修正组织块, 采用常规石蜡包埋, 修整蜡块。切片厚度4μm, 连续切片5张, 烤片后备用。阻断内源性过氧化物酶活性, 进行抗原修复, 滴加封闭置于湿盒中孵育30 min, 保持温度为37℃。滴加一抗, 4℃过夜。用PBS缓冲液振荡洗涤3遍, 滴加二抗, 37℃孵育10 min。PBS缓冲液震荡洗涤三遍, 滴加链霉卵白素 (被辣根酶标记的) , 37℃孵育30 min。DAB显色3~5 min, 用苏木素轻度复染。

光镜下观察切片, 采用双盲法记录阳性细胞个数。染色程度低于30%判定为“-”, 高于30%判定为“+”。

1.3 统计方法

记录并统计患者在术前、术后1周、术后3个月及术后1年的IGF-Ⅰ水平, 进行组内对比分析, 并与对照组的正常人IGF-Ⅰ水平进行对比。对各组数据进行卡方检验, 应用SPSS19.0软件进行数据统计与分析。

2 检测结果

2.1检测结果

患者术前、术后一周、术后3个月的平均IGF-Ⅰ表达率分别为65%、45%、20%。在术后一年, 未发生淋巴结转移的患者, 平均IGFⅠ表达率为11%;发生淋巴结转移的患者, 平均IGF-Ⅰ表达率上升为60%。正常人的平均IGF-Ⅰ表达率为10%。

2.2 IGF-Ⅰ水平在术前、术后的变化

在术后1周, 患者的IGF-Ⅰ水平较术前有显著降低, 有显著性差异 (P<0.05) , 但仍显著高于正常对照组。术后3个月, 患者的IGF-Ⅰ水平较术前、术后1周有显著性降低 , 但仍高于正常对照组。

2.3 结肠癌合并 2 型糖尿病患者 IGF-Ⅰ表达水平与淋巴结转移的相关数据

术后1年, 对所有患者进行随访, 其中32例 (24.81%) 患者发生淋巴结转移。术后1年, 未发生淋巴结转移的97例患者, IGF-Ⅰ水平与术后3个月相比显著降低, 与正常人的IGF-Ⅰ无显著性差异;发生淋巴结转移的32例患者, IGF-Ⅰ水平显著高于同期未发生转移的结肠癌患者, IGF-Ⅰ水平较术后3个月显著升高, 均比正常人的IGF-Ⅰ高, 有统计学意义。

3 讨论

结肠癌已上升为全球第三大最常见的恶性肿瘤, 它也是世界大多数国家和地区近二三十年来死亡率和发病率上升最快的肿瘤之一。结肠癌通常起病隐匿, 病情进展较慢, 缺乏特异性的早期诊断指标, 因此在起病早期较难被发现。随着医学及分子生物学等学科的进展和检测手段的不断进步, 人类已经在分子水平、基因水平对其发病原因开始阐述, 但目前对其病因、病机的研究尚不完全清楚, 目前的研究热点在于各类体液因子和细胞因子与结肠癌发生发展的关系。多项研究表明, 多种恶性肿瘤的发生发展与体内胰岛素样生长因子 (IGF) 及其受体 (IGF-R) 的增高有关。胰岛素样生长因子有Ⅰ、Ⅱ两类, 主要合成场所是肝脏, 它们与胰岛素具有同源性。IGFⅠ的合成主要依赖生长激素, 它是促进细胞生长、具有胰岛素样代谢效应的因子, 在心血管疾病、内分泌代谢病及肿瘤等的病理生理过程中发挥重要作用。该研究表明, IGF-Ⅰ与结肠癌的淋巴转移有相关性, 虽然结肠癌合并2型糖尿病病人胰岛素样生长因子-Ⅰ表达与淋巴转移的相关性的确切机制尚不清楚, 但从该研究结果看来, 胰岛素样生长因子-Ⅰ的表达水平将可能为结肠癌的早期诊断提供依据, 可作为预测高危人群的新指标, 并存在通过改变这一指标来预防、治疗肿瘤的可能性。

参考文献

[1]张丽莎.彩色多普勒超声诊断胆囊息肉样病变的应用价值[J].中国临床医学, 2006, 13 (2) :39.

[2]程怡.彩色多普勒超声对胆囊息肉样病变的鉴别诊断价值[J].中国全科医学, 2008, 11 (8) :44.

[3]周秀芳.超声检查1124例健康人胆囊息肉发病率及分析[J].沈阳医学院学报, 2008, 10 (2) :160.

[4]孙健玮.彩色多普勒超声诊断胆囊息肉样病变的临床价值[J].西部医学, 2008, 20 (26) :378.

转移相关因子3 篇3

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

Q5000紫外光分光光度计(美国Gen-View Scientific公司);Diaphot倒置相差显微镜(日本Nikon公司);Rotor Gene 3000 PCR仪(美国Qiagen公司);高速低温离心机(美国Sigma公司);Modol680型i Mark酶标仪(美国BIO-RAD公司);CO2培养箱(美国Nuaire公司);Penicillin-Streptomycin(10000x)、Platinum SYBR q PCR Super Mix-UDG试剂盒、Trizol试剂(美国Life technologies公司);c DNA第一链合成试剂盒(美国Thermo Scientific公司);碱性磷酸酶(AKP)测试盒(南京建成生物工程研究所);磷酸氢钙(透钙磷石)(上海迈坤化工有限公司);胎牛血清(天津康源生物技术有限公司);改良型α-MEM培养液(赛默飞世尔生物化学制品有限公司);MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞(中国协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心)。

1.2 方法

1.2.1 试样制备

将医用钛块用线性切割法制成10mm×10 mm×2 mm的试件。再将试件表面依次用300#、600#、800#、1000#、1200#水磨砂纸打磨抛光后,所有试件依次采用无水乙醇、去离子水超声震荡清洗15 min后,65℃烤箱烘干,高压灭菌后备用。

1.2.2 电化学方法制备涂层

将钛片试件置于电镀槽内,以石墨棒作为阳极,电沉积液为预配制好的透钙磷石(无水氯化钙1.85 g,磷酸二氢铵1.43 g,纯水250 ml)水溶液,以氯化钠为辅助电解液,沉积时间为1 h,制备透钙磷石涂层。

1.2.3 浸提液的制备及锶的掺入

参照《GB/T16886.12-2005医疗器械生物学评价第12部分:样品制备与参照样品》的方法,无菌下将含透钙磷石涂层的纯钛试件和纯钛试件置于24孔板中,每孔加入含10%胎牛血清的α-MEM培养液2 ml为浸提介质,按试件表面积与浸提液体积比值为1.25 cm2/ml[7],37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中浸提24 h[8],经0.22μm滤膜过滤除菌于4℃保存备用。按溶质/溶液方式加入氯化锶(Sr Cl2·6H2O)配制成所需锶浓度的浸提液,一次性滤器过滤除菌,分装,4℃保存备用。

1.2.4细胞培养

收到冻存细胞后,对冻存细胞进行复苏,待细胞在培养瓶中生长至80%~90%融合时,进行传代培养[9]。

1.2.5 实验分组及处理(表1)

实验前取生长至90%融合的MC3T3-E1细胞,根据实验需求将细胞种植于相应规格的细胞培养板上,密度约为105/ml,贴壁24 h后按不同组别更换培养基,每组细胞设3个复孔。

1.2.6 细胞增殖检测(MTT试验)

①将细胞种植于96孔板,种植密度约为105/ml,每组设6个复孔,其余空白孔用灭菌水填充;②细胞贴壁后,按实验分组处理,每孔分别加入150μl相应培养基,于气温37℃、CO2含量为5%的恒温培养箱中培养72 h;③取出96孔板,在超净台内向含有细胞的孔内分别加入MTT溶液20μl,继续于细胞培养箱内培养4 h;④取出96孔板,弃去各孔内液体,分别向含有细胞的孔内加入DMSO各200μl,于摇床上震荡10 min;⑤将96孔板置于酶标仪中检测490 nm光吸收值。

1.2.7 ALP实验

将细胞种植于12孔板上,种植密度约为105/ml,每组设3个复孔。细胞贴壁后按不同分组分别培养3 d检测ALP活性。方法如下:

①从培养箱中取出12孔板,移除培养基,用灭菌PBS液1 ml/孔清洗3次;②向孔内加入0.5%胰酶-EDTA溶液500μl消化细胞制成细胞悬液;③将细胞悬液分别移入1.5 ml离心管中,于1 000 r/min转速下离心10 min,移除上层清液;④向离心管内分别加入含有0.1%Triton X-100的10 mmol/L Tris·Cl(p H7.5)溶液400μl,重悬细胞后于-20℃冰柜内静置20 min后室温解冻10 min,重复3个循环。

于1 000 r/min转速下离心10 min,吸取上清按ALP测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书检测ALP活性,另取上清使用BCA法对总蛋白含量进行测定,ALP活性与总蛋白浓度之比即为ALP比活性,单位以U/g·L计。

1.2.8 Real-time PCR实验

将细胞种植于6孔板上,种植密度约为105/ml,每组设3个复孔。细胞贴壁后按不同分组分别培养3 d或5 d,按照Invitrogen公司Trizol试剂说明书操作分别提取各孔总RNA,并按照Invitrogen公司逆转录试剂盒说明书操作将总RNA分别逆转录为c DNA,使用invitrogen公司的Platinum SYBR Green q PCR Super Mix-UDG试剂盒及RotorGene 3000型Real-time PCR仪检测b FGF和VEGF的mRNA表达水平,PCR反应程序见表2。

实验所需引物之序列来源于Liu[10]、Caprara[11]和Kashiwagi[8]等研究中的相应引物,序列见表3。

1.3 统计学处理

使用Excel建立数据库,应用SPSS 17.0进行统计学分析,实验结果以±s表示,采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成骨细胞增殖结果

将不同浓度的含锶的浸提液作用于细胞培养3 d后各实验组490 nm光吸收值结果见表4。各处理组细胞活性均高于Control组,但仅有Br+Sr-M组和Br+Sr-H组细胞活性较Control组差异有统计学意义(P<0.05);各Sr处理组与Brushite组相比,490 nm光吸收值差异均无统计学意义。

注:①与对照组比较,①P<0.05

2.2 细胞ALP比活性检测结果

ALP染色结果如图1所示,MC3T3-E1细胞胞质内ALP颗粒被染成红棕色。

各处理组ALP比活性均高于Control组,且差异有统计学意义(P<0.05)。Br+Sr-M组和Br+Sr-H组细胞较Brushite组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。Br+Sr-M组和Br+Sr-H组细胞ALP比活性较Br+Sr-L组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。Br+Sr-M组细胞ALP比活性较Br+Sr-H组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)(表5)。

2.3 成骨相关基因表达的检测结果

使用Rotor-Gene 6.0软件对Real-time PCR结果进行处理,利用ΔΔCT法计算出各目的因子表达水平的相对值。VEGF及b FGF的mRNA相对表达量结果如表6和表7所示。

MC3T3-E1成骨细胞在各浸提液中培养3 d后,Brushite组b FGF因子的mRNA表达水平与Control组无显著差异;而Br+Sr-L组、Br+Sr-M组和Br+Sr-H组b FGF的mRNA表达水平较Control组显著增高(P<0.05),较Brushite组显著增高(P<0.05);Br+Sr-L组b FGF的mRNA表达水平较Br+Sr-M组显著降低(P<0.05),较Br+Sr-H组显著增高(P<0.05);其余各组间b FGF的mRNA表达水平无显著差异。

MC3T3-E1成骨细胞在各浸提液中培养3 d后,Brushite组、Br+Sr-L组、Br+Sr-M组和Br+Sr-H组VEGF的mRNA表达水平与Control组无显著差异,其余各组间VEGF的mRNA表达水平无显著差异。

MC3T3-E1成骨细胞在各浸提液中培养5 d后,Brushite组、Br+Sr-M组和Br+Sr-H组的b FGF的mRNA表达量均明显高于Control组(P<0.05)、Br+Sr-H组P<0.05);Br+Sr-M组和Br+Sr-H组的b FGF的mRNA表达量明显高于Brushite组(P<0.05),并明显高于Br+Sr-L组(P<0.05);Br+Sr-H组的b FGF的mRNA表达水平显著高于Br+Sr-M组(P<0.05);其余各组间b FGF的mRNA表达水平无明显差异。

A:对照组;B:透钙磷石组;C:透钙磷石+锶0.1%组;D:透钙磷石+锶0.5%组;E:透钙磷石+锶1%组(×100)A:Control group;B:Brushite group;C:Br+Sr-L group;D:Br+Sr-M group;E:Br+Sr-H group(×100)

注:①与对照组比较,P<0.05;②与Brushite组比较,P<0.05;③与Br+Sr-L组比较,P<0.05;④与Br+Sr-M组比较,P<0.05

注:①与对照组比较,P<0.05;②与Brushite组比较,P<0.05;③与Br+Sr-L组比较,P<0.05

注:①与对照组比较,P<0.05;②与Brushite组比较,P<0.05;③与Br+Sr-L组比较,P<0.05;④与Br+Sr-M组比较,P<0.05

MC3T3-E1成骨细胞在各浸提液中培养5 d后,Br+Sr-L组、Br+Sr-M组和Br+Sr-H组的VEGF的mRNA表达量均明显高于Control组(P<0.05),并显著高于Brushite组(P<0.05);Br+Sr-M组和Br+Sr-H组的VEGF的mRNA表达量明显高于Br+Sr-L组(P<0.05);而Br+Sr-H组的VEGF的mRNA表达水平显著低于Br+Sr-M组(P<0.05);其余各组间VEGF的mRNA表达水平无明显差异。

3 讨论

3.1 透钙磷石对成骨细胞的影响

Brushite组与Control组的b FGF的mRNA表达水平在培养早期(第3天)无明显差异,但Brushite组的b FGF的mRNA表达水平在第5天时则显著高于对照组。这一现象提示在成骨活动的早期b FGF对成骨细胞的功能并不起主要作用,而在培养后期(第5天)时b FGF的mRNA表达水平的增加使成骨细胞可以通过旁分泌或自分泌等形式刺激表达其他成骨促进因子,以增强成骨细胞的成骨活动。Hagmann在对离体培养的人类间充质干细胞进行研究时发现b FGF可以促进DMEM低糖培养基中培养的MSC像软骨细胞定向分化[12]。Teplyuk等[5]研究发现核转录因子Runx2能够增强b FGF受体的表达,而b FGF的表达则会抑制Runx2的某些下游因子的表达,二者形成负反馈调节系统从而促进前成骨细胞的增殖并调控其成骨活动。由于本次试验未对细胞Runx2等其他细胞因子的表达水平进行检测,因此尚不能证明Brushite对b FGF的mRNA表达的促进作用是否与这一机制有关,因此还需要对此进行深入研究。

3.2 掺锶透钙磷石对MC3T3-E1细胞成骨指标的影响

实验结果显示Sr对MC3T3-E1细胞活性、成骨指标、因子表达等方面有不同程度的影响。过高的Sr浓度可能会对MC3T3-E1细胞的成骨作用产生不良影响,因此Sr对成骨细胞促进成骨的作用仅在一个较小的范围(低于1%)内有效,超出这一范围的Sr浓度将可能抑制成骨细胞的活性。

3.3 掺锶透钙磷石对MC3T3-E1细胞因子的影响

本研究发现提示低浓度的Sr对成骨细胞b FGF的mRNA表达水平的影响随时间变化幅度不大,其原因可能如前文中提出的假设,即Sr可能随着细胞成骨活动而被摄取进而分泌形成细胞基质,从而使低浓度的Sr在此活动下被耗竭。而对于1%含Sr量的DCPD浸提液培养的细胞,与Sr浓度为0.5%的DCPD浸提液培养的细胞相比,其b FGF的mRNA表达水平的增长幅度原超过后者,在第5天时Br+Sr-H组b FGF的mRNA表达水平已经明显超过Br+Sr-M组,这一结果呈现与对应的细胞ALP活性相反的趋势。对于这一问题,Teplyuk等的研究提供了一些线索。因此这一结果也支持了笔者前文中对于高浓度Sr离子会抑制成骨细胞进行成骨活动的观点,而高浓度Sr的这一结果可能正是通过诱导b FGF的mRNA高表达进而抑制ALP活性这一机制发挥作用的。但是,适量的b FGF mRNA的表达可以诱导成骨细胞的生长发育,Caverzasio等[12]对雷奈酸锶(SrRn)诱导成骨细胞生长的机制进行研究,发现这一现象可以被FGF通路抑制剂所阻断。因此,本实验结果表明Sr可能通过影响b FGF的mRNA表达发挥诱导成骨细胞生长的作用。

本次实验结果发现在浸提液培养第3天的各组细胞中VEGF的mRNA表达水平,虽然在含Sr各组中略有增高但未达到显著性差异,而在第5天时却均显著高于对照组及Brushite组。与b FGF的mRNA在各组的表达形式相比,VEGF的mRNA表达结果同样受到不同Sr浓度的影响,即Sr对成骨细胞VEGF的mRNA表达水平的促进作用存在一个最适浓度(0.5%)。Liu等[13]在对大鼠成骨肉瘤细胞系ROS17/2.8细胞进行研究时发现适量的Sr掺入磷酸钙中可以诱导其VEGF及b FGF的mRNA表达水平上调。可以看出Sr对成骨细胞的活性的影响与细胞VEGF和b FGF mRNA的表达水平调控有关,并且呈现出明显的剂量相关性。