人肺腺癌A549细胞（精选6篇）
人肺腺癌A549细胞 篇1
近几十年来,肺癌的发病率和死亡率不断升高。在1998～2002年,肺癌的发病率和死亡率在我国大多数地区居恶性肿瘤的首位[1];而在2002年肺癌的新病例和死亡人数在全世界也居恶性肿瘤首位[2]。肺癌的病理分型出现腺癌比例增加的趋势。在生物体内蛋白质进行选择性降解的重要途径之一是泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin proteasome pathway,简称UPP通路),它在调节细胞凋亡过程中的作用非常重要[3,4],在研究UPP在细胞凋亡中的作用时,蛋白酶体抑制剂(MG132)的应用为我们提供了有力的手段。有研究表明,蛋白酶体抑制剂能够诱导多种人肿瘤细胞的凋亡是通过阻断泛素化通路而实现,但其具体作用机制到目前仍未被阐明[5,6]。该研究应用体外培养的人肺腺癌细胞株A549,并且给予不同浓度的MG132处理,观察其对A549细胞凋亡率的影响,以及细胞内Bcl-2和Bad蛋白表达水平的变化。探讨MG132调控A549细胞凋亡的可能机制,为进一步研究MG132诱导A549凋亡的机制和其他类型肺癌以及其他肿瘤的作用提供参考。
1 材料与方法
1.1 A549细胞和试剂
人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。新生牛血清(NBS,杭州四季青生物工程材料研究所);RPMI-1640培养基(Gibco公司);AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒(上海博蕴生物试剂有限公司);MG132、一抗Bcl-2和Bad、MTT(Sigma公司)。
1.2 细胞培养及处理
将A549细胞常规复苏后,以RPMI-1640培养液加10%NBS培养,放入37℃、5%CO2的培养箱内培养,细胞传2～3代后按照需要接种于不同培养板中,当细胞融合密度约70%时,换无血清的RPMI-1640培养液培养,MG132在给药前应用RPMI-1640培养液现配。并且进一步稀释使其在培养液中的终浓度为:0、5、10、20、40μmol/L,并设空白对照组(不做任何处理)。培养24 h,检测相关指标。
1.3 MTT比色法检测细胞存活率
细胞按照需要接种于96孔板,处理方法同“1.2”所述,将培养24 h后的每组细胞,每孔中加入MTT 20μl(PBS配制、5 g/L)。4 h后终止培养,吸弃所有液体,再加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)200μl充分溶解,静置于37℃条件下30 min。用酶标仪测定570 nm光密度(OD)值,计算细胞存活率(即每组OD值/正常对照组OD值×100%=该组的细胞存活率)。
1.4 蛋白免疫印迹(Western Blot)
将传代后细胞接种于培养瓶内,处理同方法“1.2”所述。培养24 h后收集细胞,应用胞浆蛋白抽提试剂盒提取蛋白,测蛋白后分装,保存于-80℃冰箱中备用。将等量蛋白以10%聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,半干转法至NC膜上,随后经5%脱脂奶粉封闭,室温下1 h,加入稀释的一抗Bcl-2(1∶300)和Bad(1∶300),4℃条件下过夜。第2日晨复温30 min,常规方法洗膜,NBT/BCIP显色,双蒸水洗膜终止反应。应用图像处理仪(Gene Company)扫描结果,Image J软件进行半定量分析。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率
细胞传代后接种于6孔板,处理方法同“1.2”所述。培养24 h,吸尽培养基,用胰蛋白酶(0.25%)消化细胞后收集,磷酸盐缓冲液(PBS)液洗2次,每组细胞收集为1管,每管加入凋亡试剂盒中的结合缓冲液将细胞重悬,随后将细胞转移到试管中。每管再分别加入10μl的PI和5μl的Annexin V-FITC。避光,室温放置5 min,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。
1.6 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,Sigma Plot 2000作图。计量资料采用均数±标准差表示,组间比较采用最小显著差(LSD-t)法,以P<0.05为差异有统计学意义。每组数据至少从3次独立的实验中获得。
2 结果
2.1 MG132对A549细胞成活率的影响
MTT法检测结果显示,随着MG132浓度的增加A549细胞存活率逐渐下降(表1),呈现浓度依赖性关系。并且,与正常对照组比较,除了0μmol/L组外,其余各组差异均有统计学意义(均P<0.05)。
注:与空白对照组比较,*P<0.05
2.2 MG132对A549细胞凋亡率的影响
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果显示,空白对照组A549细胞凋亡率约(4.0±1.4)%,0μmol/L组凋亡率为(4.1±1.7)%、5μmol/L组凋亡率为(12.2±2.1)%、10μmol/L组凋亡率为(26.3±2.9)%、20μmol/L组凋亡率为(33.1±3.0)%、40μmol/L组凋亡率为(54.2±4.7)%,与空白对照组比,除0μmol/L组外,其余各组差异均有统计学意义(均P<0.05)。
2.3 MG132对A549细胞中Bcl-2和Bad蛋白的影响
Western Blot结果显示,随着MG132的浓度增高A549细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐降低(图1A),除0μmol/L组外,其余各组与空白对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。而促凋亡蛋白Bad的表达在各组中无明显变化(图1B)。与空白对照组比,差异均无统计学意义(均P>0.05)。
3 讨论
泛素-蛋白酶体通路[7](UPP)调控着真核生物细胞内绝大部分蛋白质的降解过程,参与细胞转录、蛋白质稳定、蛋白质降解、细胞凋亡、应激反应和受体胞吞等多种生理过程,能够通过多种途径影响细胞周期的进行,是真核细胞内重要的蛋白质质控系统。MG132[8](Z-Leu-Leu-Leu-CHO,三肽基乙醛)可以抑制UPP途径介导的蛋白质降解,是一种常用的肽醛类26S蛋白酶体抑制剂,如影响NF-κB、调节细胞内凋亡信号通路、调节细胞周期相关蛋白和凋亡调控蛋白等过程,从而抑制细胞的增殖促进细胞凋亡,是很有发展前途的抗肿瘤药物。也有研究表明:与凋亡调控相关的Bcl-2家族、caspase和凋亡抑制因子等的降解均与UPP有关[9,10]。在本研究中笔者特别关注Bcl-2家族在UPP通路中的作用,在细胞凋亡调控机制方面,Bcl-2是迄今研究最广泛而深入的凋亡调控基因之一,在细胞凋亡中起着非常重要的作用,Bcl-2能够抑制细胞凋亡,而Bad则促进细胞的凋亡,是该家族中两组作用相反的蛋白。本研究应用体外培养的A549人肺腺癌细胞,给予不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132处理一段时间后,检测细胞凋亡率的变化,同时观察对细胞中Bcl-2和Bad两种蛋白表达水平的影响,初步探讨在A549细胞凋亡中UPP通路的作用及其可能的机制。
该研究结果显示,随着MG132浓度增加A549细胞的凋亡率逐渐增加,并且细胞中Bcl-2蛋白的表达水平也逐渐降低。同时在笔者的实验中也发现,Bad蛋白的表达水平在各组中没有明显变化。因此,笔者推测,MG132可能是通过减少Bcl-2蛋白的表达诱导A549细胞凋亡,而Bad蛋白似乎不参与MG132诱导A549细胞凋亡的作用。Pigneux等[11]发现MG132能够明显地增强一种抗肿瘤药物(IDA)诱导白血病细胞的凋亡,而此作用是通过上调促凋亡蛋白Bim和Bax的表达实现。Yan等[12]观察到MG132处理的MG-63细胞内除了Caspase-8活性增加、p27聚集外,Bcl-2和Bax比值也明显增加,说明Bcl-2家族蛋白之间的比例失衡可能也是MG132诱导细胞凋亡的机制之一。Guzman等[13]发现MG132能够诱导人白血病细胞的凋亡,而对正常的白细胞几乎没有作用。MG132与目前大多数的抗肿瘤药物对细胞无选择性的杀伤作用有明显的不同,因此笔者设想,蛋白酶体抑制剂的应用为肿瘤的治疗提供了新的方向。
然而,对于MG132其抑制肿瘤的作用和机制还有很多需要回答的问题,例如其是否还影响Bcl-2家族中其他成员的表达;是否影响另外两个与凋亡相关的家族蛋白Caspase家族和凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员的表达,以及其与临床常用的抗肿瘤药物有何差异等,这些问题还有待于在以后的研究中深入探讨。
摘要：目的:研究不同浓度蛋白酶体抑制剂MG132对人肺腺癌A549细胞凋亡的作用,并且观察对细胞中Bcl-2和Bad两种凋亡相关蛋白表达的影响。方法:体外培养A549细胞分别暴露于0、5、10、20、40μmol/L的MG132,24 h后MTT法测定细胞存活率,流式细胞术(FCW)检测细胞的凋亡率,Western Blot方法测定A549细胞中Bcl-2和Bad两种蛋白的表达情况。结果:MTT法和流式细胞术检测结果显示,A549细胞的存活率和凋亡率与MG132呈浓度依赖性关系,MG132浓度越高细胞存活率越低,并且凋亡率越高。Western Blot方法测定结果显示A549细胞中Bcl-2的表达随着MG132浓度增高而逐渐减少,而Bad的表达无明显变化。结论:MG132可以诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡,实现该作用的可能机制部分是通过降低Bcl-2蛋白的表达,而Bad在这一过程中似乎没有表现出明显的作用。
关键词：肺腺癌,蛋白酶体抑制剂,A549细胞,Bcl-2,Bad
人肺腺癌A549细胞 篇2
1 资料与方法
1.1 纳入排除标准
纳入原人参二醇对人肺腺癌A549 细胞周期, 细胞存活率和细胞凋亡影响的研究, 原人参二醇的浓度不限。 排除:①联合其他化学药;②数据不完整或有错误。 对重复发表的文献仅保留最先发表的一篇。 对同一研究多次发表, 仅保留样本量最大和信息最全的一篇。
1.2 文献检索
利用“人参”、“A549”、“肺癌”、“肺腺癌”检索万方数据库、中国期刊全文数据库、维普中文科技期刊数据库, 获取有关原人参二醇对人肺腺癌A549细胞周期, 细胞存活率和细胞凋亡影响的研究, 检索实施时间为2015 年5 月, 所有检索策略均通过多次预检索后确定, 检索式根据具体数据库做相应的调整。 此外, 追查已纳入文献的参考文献, 以获取以上检索未发现的相关信息。
1.3 资料提取
提取内容主要包括:①一般资料:题目、作者姓名、发表日期和文献来源。 ②人肺腺癌A549 细胞周期, 细胞存活率和细胞凋亡情况。 ③实验的方法。 如遇分歧通过讨论或根据第3 位研究人员的意见协商处理。
1.4 统计分析
对不同浓度原人参二醇对的人肺腺癌A549 细胞周期, 细胞存活率和细胞凋亡影响采用Rev Man5.2 统计软件Meta分析, 以均数差 (MD) 为效应量, 效应量以95%CI表示。
2 结果
2.1 20 (S) -原人参二醇对A549 细胞细胞周期的影响[4,5]
由表1 可知, 在20 (S) - 原人参二醇作用24h时, 检测G0/G1 期时, 对照组分别和10μmol/m L、20μmol/m L、40μmol/m L相比, 均有统计学意 (P <0.05) ;10μmol/m L和20μmol/m L、40μmol/m L相比, 均有统计学意义 (P<0.05) ; 20μmol/m L和40μmol/m L相比, 有统计学意义 (P<0.05) 。 检测G2/M期时, 对照组分别和10μmol/m L、20μmol/m L、40μmol/m L相比, 20μmol/m L和40μmol/m L组有统计学意义 (P<0.05) ;10μmol/m L和20μmol/m L、40μmol/m L相比, 均有统计学意义 (P<0.05) ; 20μmol/m L和40μmol/m L相比, 有统计学意义 (P<0.05) 。 检测S期时, 对照组分别和10μmol/m L、20μmol/m L、40μmol/m L相比, 均有统计学意 (P<0.05) ;10μmol/m L和20μmol/m L、40μmol/m L相比, 均有统计学意义 (P<0.05) ; 20μmol/m L和40μmol/m L相比, 有统计学意义 (P<0.05) 。
2.2 20 (S) -原人参二醇对A549 细胞存活率的影响[]
由2 表可知, 在20 (R) - 原人参二醇作用72h时, 检测细胞存活率, 对照组分别和1μmol/m L、10μmol/m L、50μmol/m L、100μmol/m L相比, 均有统计学意 (P <0.05) ;1μmol/m L分和10μmol/m L、50μmol/m L、100μmol/m L相比, 均有统计学意义 (P<0.05) ; 10μmol/ml分和50μmol/m L 、100μmol/m L相比, 均有统计学意义 (P <0.05) ; 50μmol/m L和100μmol/m L相比, 无统计学意义 (P>0.05) 。
2.3 20 (S) - 原人参二醇对A549 细胞凋亡率的影响[4,5]
由表3 可知, 在20 (S) - 原人参二醇作用24h时, 定量分析G0/G1 期前的亚二倍体凋亡峰 (Sub G1) 得到细胞凋亡率。 对照组分别和10μmol/m L、20μmol/m L、40μmol/m L相比, 均有统计学意 (P <0.05) ;10μmol/m L和20μmol/m L、40μmol/m L相比, 均有统计学意义 (P<0.05) ; 20μmol/m L和40μmol/m L相比, 有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
人参被人们称为“百草之王”, 是我国传统的名贵药材。 人参含有多种人参皂苷单体及人参倍半萜稀、人参酸、人参英、人参奎酮、人参宁、人参多糖、B族维生素、烟酸、胆碱、多种氨基酸以及微量元素锗等成分[7]。 其主要活性成分是人参皂苷, 人参皂苷具有抗疲劳、延缓衰老、抑制肿瘤细胞生长、调节中枢神经系统、提高机体免疫力、改善心脑血管供血不足等作用。 关于抗肿瘤作用方面研究最多的是二醇组人参皂苷, 20 (S) -人参皂苷Rg3和Rh2, 它们在抑制肿瘤血管生成、降低肿瘤微血管密度、诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤转移、对化疗药物减毒增效等方面具有较广泛的抗肿瘤功效[8,9]。 将人参皂苷Rg3 的3位上的末端葡萄糖水解掉可得到人参皂苷Rh2, 再把人参皂苷Rh2 的3 位上的最后一个葡萄糖水解掉就得到20 (S) -原人参二醇, 20 (S) -原人参二醇作为人参二醇组皂苷化学水解及人肠道菌代谢的最终产物, 有可能比人参皂苷Rg3 和人参皂苷Rh2具有更强的抗癌活性、抗癌增效减毒作用以及增强机体免疫功能的作用, 而且生物利用度可能更高[10]。 20 (S) -原人参二醇的分子式为C30H52O3。
本研究结果显示, 20 (S) - 原人参二醇以0μmol/m L、10μmol/m L、20μmol/m L、40μmol/m L和0μmol/m L、25μmol/m L、50μmol/m L、100μmol/m L的两组剂量作用于A549 细胞24h后, 实验组G0/G1 期细胞与对照组相比, 呈现浓度依赖性递增, 而G2/M期与S期细胞数目相应减少, 提示20 (S) - 原人参二醇对A549 细胞的周期调控作用主要发生于Gl期, 阻止其向G2/M期与S期发展, 即可将细胞阻滞于Gl期, 从而抑制细胞的增值。 张锐等研究结果表明20 (S) -原人参二醇对A549 细胞的杀伤作用可能由于其对A549 细胞凋亡的诱导。
20 (R) - 原人参二醇以分别以对照组以0μmol/m L、1μmol/m L、10μmol/m L、50μmol/m L、100μmol/m L作用于A549 细胞72h后, 实验组细胞存活率与对照组相比, 呈现浓度依赖性递增。
20 (S) - 原人参二醇以0μmol/m L 、10μmol/m L、20μmol/m L、40μmol/m L和0μmol/m L、25μmol/m L、50μmol/m L、100μmol/m L的两组剂量作用于A549细胞24h后, 实验组G0/G1 细胞凋亡率与对照组相比, 呈现浓度依赖性递增。 有文献报道AKT活性的下调可能是PPD诱导A549 细胞凋亡的一个关键步骤, PPD可通过抑制PI3K/AKT信号途径作用线粒体通路诱导A549 细胞凋亡。
摘要：利用Meta分析方法评价原人参二醇对人肺腺癌A549细胞的作用。meta分析结果显示:原人参二醇[20 (S) -原人参二醇或20 (R) -原人参二醇]对人肺腺癌A549细胞在阻滞细胞周期、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡不同方面有明显的作用, 且随着浓度增大, 作用随之更加明显。
关键词：原人参二醇,人肺腺癌A549细胞,细胞周期,细胞存活率,细胞凋亡
参考文献
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人肺腺癌A549细胞 篇3
关键词：澳洲茄边碱,细胞凋亡,凋亡蛋白caspase3,细胞周期
0 引言
肺癌是当今人群中发病最快,致死率最高的恶性肿瘤之一,在世界范围内的男性人群中位居肿瘤疾病发病率第一位,在女性人群中位居肿瘤疾病发病率第二位。由于其治疗手段单一,主要以化疗和手术治疗为主,且预后较差[1]。故在传统中医中,我们寻求对其有效的中药制剂进行研究。
澳洲茄边碱(solamargine,SM)提取自茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)草本植物龙葵(Solanum nigrum Linn),属甾体类生物碱中的胆甾烷衍生物[2],其对抗肿瘤活性有较好的疗效,已经证实其对前列腺癌、肝癌等具有一定的治疗作用[3,4,5]。澳洲茄边碱能有效抑制前列腺癌细胞的增殖[3],上调HepG2细胞的凋亡蛋白Caspase3活性,促进细胞凋亡,对肝癌细胞增殖有明显的抑制作用[4];能将HepG2细胞的细胞周期抑制在G2/M期,从而抑制HepG2细胞增殖、促进细胞凋亡的发生[5]。
细胞凋亡是一个复杂的级联式基因表达过程,而Caspase3蛋白是细胞凋亡过程中的核心调控蛋白[6],其活性的高低与细胞凋亡的水平直接相关,故其对抗肿瘤的作用机制也是当今研究热点。
为了研究澳洲茄边碱对肺癌的治疗作用,我们将澳洲茄边碱作用于人肺腺癌细胞A549,观察处理后细胞的生长抑制率、细胞周期变化及细胞凋亡水平,并检测凋亡蛋白Caspase3的表达水平,探索其是否同样对肺癌肿瘤的生长具有抑制作用。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
澳洲茄边碱,质量分数>98%,购自上海源叶生物公司,配制成浓度为10、20、50μmol·L-1的系列溶液;二甲基亚砜(DMSO)购自SIGMA公司;CCK-8试剂购自日本株式会社同仁(DOJINDO)化学研究所;MEM培养基购自GIBCO公司;胎牛血清购自GIBCO公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(C1063)、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(C1052)均购自碧云天生物技术研究所;Cleaved Caspase3抗体购自cellsignal公司;GAP-DH抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;HRP标记羊抗鼠二抗和HRP标记羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 主要仪器
二氧化碳培养箱(美国Thermo公司);蛋白印迹装置(美国Bio-Rad公司);酶标仪(瑞士TE-CAN公司);流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。
1.3 细胞株
人肺腺癌A549细胞来源于武汉大学基础医学院医学遗传学系。
1.4 方法
1.4.1 细胞增殖和抑制实验
用含10%胎牛血清和双抗的MEM培养基培养A549细胞,2~3天进行传代。细胞融汇度达到90%时,胰酶消化细胞为单细胞悬液,96孔板每孔接种1x104个细胞,于37℃二氧化碳培养箱中培养24h后吸去孔中的培养基,然后加入100μL含有10、20、50μmol·L-1澳洲茄边碱的MEM完全培养基,处理24、48、72h后每孔加入10μL CCK8试剂,37℃孵育30 min后检测450nm处吸光度值。按照以下公式计算各浓度处理组细胞的生长抑制率:抑制率=(A对照组-A实验组)/(A对照组-A调零组)×100%
1.4.2 Western blot检测活化的Caspase3的表达水平
细胞融汇度达到90%时,胰酶消化细胞为单细胞悬液,6孔板每孔接种5x105个细胞,于37℃二氧化碳培养箱中培养24h后吸去孔中的培养基,然后加入2mL含有10、20、50μmol·L-1澳洲茄边碱的MEM完全培养基,处理24h后收集细胞,RIPA裂解液冰上裂解30 min,4℃、12 000rpm离心15min,所得上清即为总蛋白。每孔上样20μg总蛋白检测活化的Caspase3蛋白(Cleaved Caspase3)的表达水平。
1.4.3 细胞凋亡检测
细胞融汇度达到90%时,胰酶消化细胞为单细胞悬液,6孔板中每孔接种5x105个细胞,于37℃二氧化碳培养箱中培养24h后吸去孔中的培养基,然后加入2 mL含有20μmol·L-1澳洲茄边碱的MEM完全培养基,处理24h后收集细胞,使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡测试剂盒染色,随后流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.4.4 细胞周期检测
细胞融汇度达到90%时,胰酶消化细胞为单细胞悬液,6孔板中每孔接种5x105个细胞,于37℃二氧化碳培养箱中培养24h后吸去孔中的培养基,然后加入2 mL含有20μmol·L-1澳洲茄边碱的MEM完全培养基,处理24h后收集细胞,75%乙醇固定1h,然后使用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒进行染色,流式细胞仪检测细胞周期。
2 结果与分析
2.1 澳洲茄边碱对A549细胞生长的影响
加入终浓度为10、20、50μmol·L-1的澳洲茄边碱处理A549细胞24、48、72h后,检测细胞增殖的抑制率,发现随着处理时间的增加,细胞增殖抑制率也逐渐增加;且澳洲茄边碱对A549细胞增殖的影响存在剂量效应,当药物浓度增大时,对细胞增殖的抑制作用也随之增强(图1,表1)。
2.2 澳洲茄边碱诱导A549细胞凋亡
对各浓度处理组中活化的Caspase3(cleaved Caspase3)进行检测,Western blot检测结果表明,随着加药浓度的增加,水解激活的Caspase3的表达水平逐渐增强,表明细胞的凋亡程度也逐渐增强(图2)。
注:Cleaved Caspase3:激活的Caspase3蛋白;GAPDH:内参;CK:未处理的正常A549细胞;10μmol·L-1、20μmol·L-1、50μmol·L-1表示分别使用10μmol·L-1、20μmol·L-1、50μmol·L-1澳洲茄边碱处理24h后的A549细胞Note:Cleaved Caspase3:activited Caspase3protein;GAPDH:reference gene;CK:untreated A549cells;10μmol·L-1,20μmol·L-1,50μmol·L-1indicated A549cells treated by 10μmol·L-1,20μmol·L-1,50μmol·L-1solamangine for 24hours respectively
在A549细胞中加入终浓度为20μmol·L-1的澳洲茄边碱处理24h,然后检查其凋亡情况。检测结果表明,加入20μmol·L-1澳洲茄边碱处理24h后,有25.35%的细胞处于早期凋亡状态,11.47%细胞处于晚期凋亡状态,有2.75%细胞已经死亡,凋亡和死亡细胞占比为39.57%(图3A),而在未使用澳洲茄边碱处理的A549细胞中,凋亡和死亡细胞仅为2.55%(图3B)。由此可见,澳洲茄边碱能诱导A549细胞发生凋亡。
2.3 澳洲茄边碱影响A549细胞的分裂
在A549细胞中加入终浓度为20μmol·L-1的澳洲茄边碱处理24h,然后对其进行细胞周期检测。检测结果表明,未处理的A549细胞中,84.83%的细胞处于G1期,而在处理过的细胞中,76.90%的细胞处于G1期,而且处理过的细胞中G2期的细胞比例也有所增高(图4),表明澳洲茄边碱使细胞周期阻滞在了G2/M期,影响了细胞的分裂,从而抑制细胞的增殖。
3 讨论
近年来,全球范围内的癌症病例和死亡人数都在不断增加,其中一半的新增病例都发生在亚洲,而中国的新增癌症病例高居第一位,开发有效的抗癌药物的重要意义不言而喻。
我国的中草药资源十分丰富,自古以来就在疾病的预防、治疗以及提高人体免疫力方面发挥着重要作用。近年来的研究表明,很多中药的提取物都具有相当的抗肿瘤活性[7,8]。澳洲茄边碱提取自我国的一味传统中草药———龙葵,已有研究表明,龙葵制剂及澳洲茄边碱在肝癌、前列腺癌、肠癌等多种癌症中具有抗肿瘤疗效[9,10,11,12],澳洲茄边碱作为龙葵提取物的主要成分之一,主要通过抑制细胞分裂和促进细胞凋亡的方式来抑制癌细胞的生长和增殖。本研究以人肺腺癌A549细胞为研究对象,探索了澳洲茄边碱的作用浓度、抗肿瘤途径及作用机制,发现10、20、50μmol·L-1的澳洲茄边碱可有效抑制A549细胞的增殖,作用24h后三者对细胞增殖的抑制率即可达到22.80%、36.40%、51.10%,对细胞增殖生长的抑制十分明显;作用72h后三者对细胞增殖的抑制率分别达到65.7%、87.10%和94.20%,表明其能在较长的一段时间抑制细胞的增殖生长。本研究中,使用20μmol·L-1的澳洲茄边碱即可将细胞周期阻滞于G2/M期,有效抑制A549细胞分裂,同时触发A549细胞的凋亡,从而抑制A549肺癌细胞的增殖;且随着药物处理浓度的增加,细胞增殖抑制率和Caspase3的活化水平也随之增加,表明澳洲茄边碱对A549增殖的抑制存在剂量效应。本研究结果显示,澳洲茄边碱能有效抑制A549细胞的增殖、通过促进Caspase3的水解活化从而促进细胞凋亡,其有望在肺癌的临床防治中发挥重要的作用。
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人肺腺癌A549细胞 篇4
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 细胞株
人非小细胞肺癌A549细胞株(传代细胞)由郑州大学公共卫生学院劳动卫生教研室惠赠,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中于37℃,5%二氧化碳条件下培养。
1.1.2 主要试剂
注射用奥沙利铂(江苏恒瑞医药股份有限公司)、RPMI-1640培养基(北京索莱宝公司)、胰酶(上海碧云天生物技术有限公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、四甲基偶氮唑盐(MTT)(Biosharp公司)、PI(sigma公司)、柱式Trizol总RNA抽提试剂盒及引物合成(上海生工生物工程有限公司)、第一链试剂盒及2×Taq Green PCR Master Mix(Fermentas公司)。鼠抗人Survivin多克隆抗体、兔抗人Cyclin D1多克隆抗体(上海生工生物工程有限公司)。
1.2 仪器与设备
二氧化碳培养箱(美国热电Scientific公司)、TC512 TECHNE PCR扩增仪、倒置显微镜(日本Olympus公司)、台式低速及高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、6孔及96孔培养板(美国Coming公司)、流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)、UVP凝胶电泳拍摄及分析系统(美国UVP公司)、核酸蛋白定量检测仪(德国GE公司)等。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞增殖抑制实验
采用MTT检测法。取对数生长期A549细胞,0.25%胰蛋白酶消化,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液制备成浓度为6×104～8×104/m L的单细胞悬液接种于96孔平底板,每孔200μL。实验设阴性对照组、空白对照组和5个实验组。37℃、5%二氧化碳、饱和湿度下培养箱培养24 h,待细胞贴壁后,弃去原培养基,每孔加180μL完全培养基。实验组每孔中加入用培养基配制的奥沙利铂20μL,使其终浓度分别为125.00、62.50、31.25、15.63和7.81μg/m L。空白对照组加入等量细胞液不加药物加等体积的完全培养基,阴性对照组无细胞加等体积培养基用以调零。每组设5个平行孔,于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下分别培养24、48和72 h。取出后每孔加20μL 5 mg/m L的MTT溶液,继续培养4 h后弃去孔内培养液,每孔加入100μL DMSO溶液振荡10 min,自动酶标仪上以492 nm波长测定各孔OD值。按下列公式计算奥沙利铂对A549细胞的抑制率:抑制率(fa)=(1-实验组平均OD值/阴性对照组平均OD值)×100%。取各组平均值,绘制增殖抑制曲线。
1.3.2 流式细胞仪检测A549细胞周期
采用PI单染法。取对数生长期A549细胞,以1×105～2×105/m L的浓度接种于6孔板,每孔1 800μL,37℃、5%二氧化碳条件下培养箱培养24 h,每孔加奥沙利铂200μL,使其终浓度分别为125.00、62.50、31.25、15.62和7.81μg/m L,空白对照组加入等体积的完全培养基,分别培养24、48和72 h后,胰酶消化,PBS清洗2次,1 000 r/min离心5 min,弃上清,预冷的70%冷乙醇固定,4℃过夜。1 000 r/min离心10 min弃酒精,PBS洗2次,每管加入750μL PI染液(PI 50μg/m L,RNase 100μg/m L),室温避光染色30 min,流式细胞仪检测。
1.3.3 Hoechst 33342荧光染色观察细胞
细胞处理方式同1.3.2方法,药物作用48 h后,PBS清洗2次,胰酶消化,2%胎牛血清培养基终止,吹打成单细胞悬液,加Hoechst 33342至终浓度5μg/m L,37℃避光孵育30 min,离心去底色,2%胎牛血清培养基重悬,荧光显微镜下观察。
1.3.4 半定量RT-PCR检测Survivin和Cyclin D1基因m RNA表达
柱式Trizol法分别提取各组药物作用48 h后6孔板里各孔细胞的总m RNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳测定RNA完整性,核酸蛋白定量检测仪测定RNA浓度和纯度。按Fermentas第一链合成及2×Taq Green PCR MasterMix的试剂盒说明书进行逆转录和PCR扩增。PCR总反应体积25μL,反应条件:95℃3 min,95℃30 s,56.6℃(Survivin)58.6℃(Cyclin D1)30 s,72℃50 s(Survivin)40 s(Cyclin D1),33个循环,72℃8 min。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳,DNA markerⅠ片段600 bp,UVP凝胶图像分析仪分析扫描各条带,并对凝胶条带灰度信号强度半定量分析。以人β-actin基因作为内参照,用Survivin/β-actin及Cyclin D1/β-actin的比值作为Survivin、Cyclin D1的相对表达强度。Premier primer 6设计引物,引物序列:Survivin上游引物为5'-AGTCTGGCGTAAGATGATGGA T-3',下游引物为5'-GTGCATTTTCAGTTGTTTCTGC-3',扩增产物347 bp;Cyclin D1上游引物为5'-TGC CAGGATGATAAGTTCCTTT-3',下游引物为5'-ATC AAAGGCAGAAGGTTTGTGT-3',扩增产物316 bp;β-actin上游引物为5'-TGACGTGGACATCCGCAA AG-3',下游引物为5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAG G-3',扩增产物205 bp。
1.3.5 Western-blotting检测Survivin和Cyclin D1蛋白表达
裂解奥沙利铂作用48 h后各浓度组细胞提取总蛋白,分光光度计测定蛋白浓度,取50μg蛋白分别经SDS-PAGE电泳分离,Western blotting检测Survivin和Cyclin D1的蛋白表达。鼠抗人Survivin多克隆抗体(浓度1∶800),兔抗人Cyclin D1多克隆抗体(浓度1∶300)。通过Gel-Proanalyzer 4软件读取目的条带OD积分扫描值,以各组β-actin条带的扫描值为标准,观察各组Survivin、Cyclin D1的相对蛋白表达量。
1.4 统计学方法
所有实验数据采用SPSS 17.0软件分析,计量资料以均数±标准差表示。多样本均数比较,经方差齐性检验后,采用单因素方差分析(F检验)或Kruskal-Wallis检验,并进一步做多重比较(LSD检验),检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 MTT法测定奥沙利铂对A549细胞增殖抑制率
MTT结果显示,奥沙利铂对肺癌A549细胞的生长有明显抑制作用,且随药物浓度增高和作用时间延长而增强,呈现明显的剂量-时间依赖性。其中72 h组中空白对照组的抑制率较高,可能与细胞生长的接触抑制导致自身凋亡有关(见表1及图1)。
2.2 流式细胞仪检测细胞周期分布
FCM检测结果显示,奥沙利铂能够改变A549细胞周期的分布,主要将其阻滞在S期和G2/M期,且S期比例随药物浓度增加而升高,G2期变化无明显的剂量依赖性,但整体有增加的趋势。随着作用时间的延长(>72 h),中、高浓度的奥沙利铂(31.25、62.50和125.00μg/m L)可以诱导A549细胞发生凋亡。各浓度组作用于A549细胞24 h后,G1期比例略减(F=47.86,P<0.05),G2/M期比例增加(F=130.46,P<0.05),S期比例明显增加(F=67.53,P<0.05);作用48 h后,G1期比例明显减少(F=198.11,P<0.05),G2/M期比例明显增加(F=66.98,P<0.05),S期比例明显增加(F=237.25,P<0.05);作用72 h后,G1期比例略减(F=31.13,P<0.05),G2/M期比例随剂量增高有减少趋势但仍比对照组高(F=14.41,P<0.05),S期比例明显增加(χ2=29.191,P<0.05),其中31.25、62.50和125.00μg/m L作用72 h后出现凋亡峰(见表2、图2～4)。
2.3 Hoechst33342染色后细胞形态
如图5所示,对照组细胞镜下可见完整均一的淡蓝色细胞质,形态完好;药物作用组细胞形态不规则,可见部分细胞核物质边集,有高亮蓝色荧光的凋亡小体及核碎片。
2.4 RT-PCR检测奥沙利铂对Survivin和Cyclin1基因mRNA表达的影响
经UVP凝胶图像扫描分析系统分析,由Survivin和Cyclin D1条带与内参β-actin条带的灰度值比值可知,奥沙利铂作用48 h后,A549细胞的Survivin和Cyclin D1表达与对照组相比均下降,并且随奥沙利铂浓度增加其抑制作用越明显(见表3及图6)。
2.5 Western-blotting检测Survivin和Cyclin D1蛋白表达
结果显示,与对照组相比,一定浓度的奥沙利铂能抑制Survivin和Cyclin D1蛋白的表达(P<0.05),有统计学意义(见表4及图7)。
3 讨论
凋亡抑制基因Survivin于1997年由耶鲁大学的AMBROSINI等[4]用效应细胞蛋白酶体21(effector cell protease receptor 21,EPR21)cDNA从人类基因库中分选出来。l AP家族(inhibtor of apoptosis family of proteins,IAPs)是一类在结构上具有同源性的细胞凋亡抑制蛋白,它们在许多生物、动物组织中存在,包括病毒、真核生物和哺乳动物等,具有抑制细胞凋亡的功能,与肿瘤的关系甚为密切[5]。Survivin作为IAP(凋亡抑制蛋白)家族的新成员,其结构较独特,含有1个N末端的杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(baculovims IAP repeat,BIR),羧基末端没有环指结构,而是α——螺旋。IAP家族成员均可在成人正常终末分化组织中表达,而Survivin基因只在绝大多数癌组织中表达,在大部分正常组织中不表达,属差异蛋白,这个特点使其可能成为肿瘤治疗的理想靶点[6]。研究显示Survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子且参与肿瘤的发生、发展过程,与诊断、预后密切相关。与IAP家族其他成员不同的是Survivin不仅可以抑制细胞凋亡并且以严格的细胞周期调控方式在有丝分裂中表达,在调节细胞有丝分裂过程中起到重要作用如微管的聚合、卵裂沟的形成及胞质的分裂等[7]。在体外将Hela细胞阻断在G1期、S期和G2/M期,检测细胞内源性Surivin m RNA的表达,发现在G1期检测不到,在S期增加6～7倍,在G2/M期表达上调40倍[8]。
Cyclin D1是典型的G1期细胞周期蛋白,主要通过对抑癌基因蛋白pRb的调控实现促进细胞通过G1/S检查点。Cyclin D1可结合并激活Cdk 4,使pRb蛋白高度磷酸化与E2F分离,E2F便可促进相关基因的转录,从而推动细胞由G1期进入S期,促进细胞的增殖[9]。细胞周期的阻滞常发生于G1/S期与G2/M期,尤其G1末期限制调控点“R”的阻滞[10],Cyclin D1过表达是导致G1/S期检测点缺陷主要原因,此检测点功能缺陷可能会导致遗传基因突变和染色体结构异常的细胞获得增殖,从而导致肿瘤发生。研究显示Cyclin D1也是一个与NSCLC有密切关系的癌基因,并在多种肿瘤中都被证明是反应预后的重要指标。
奥沙利铂作为第3代铂类细胞周期非特异性药物,具有更强的细胞毒作用可诱发DNA损伤引起肿瘤细胞凋亡,且其肾毒性和血液毒性不明显[11]。体外研究表明奥沙利铂对多种肿瘤细胞如肺腺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞等均有诱导凋亡的作用。本研究中MTT结果显示奥沙利铂可以明显抑制A549细胞的增殖,且呈现出一定的剂量时间依赖性。奥沙利铂主要以DNA为作用靶点,以烷化形式在DNA内形成链内和链间交,诱导DNA单链断裂,从而抑制DNA的合成及复制,影响细胞周期重分布。其研究中FCM结果显示,较低浓度的奥沙利铂(7.81μg/m L)作用24、48和72 h均可诱导A549细胞阻滞于G2/M期但无明显的S期变化;中浓度奥沙利铂(31.25μg/m L)作用24 h仅阻滞A549细胞于S期,作用48和72 h后均可诱导A549细胞阻滞于G2/M期;高浓度奥沙利铂(62.5和125μg/m L)作用24 h后明显阻滞A549细胞于S期,作用48和72 h后出现细胞阻滞于G2/M期并在72 h后出现明显凋亡峰。可见奥沙利铂对A549细胞周期分布的影响受到剂量和时间的双重影响,阻滞A549细胞于G2/M期和S期;此外,采用Hoechst 33342染色验证细胞凋亡的镜下形态学变化。本研究中PCR、Western-blotting结果显示,经不同剂量奥沙利铂作用48 h后,A549细胞Surivin和Cyclin D1基因在转录水平、翻译水平的表达均受到一定程度的抑制,并呈现出一定剂量依赖的趋势。
综上所述,奥沙利铂对肺腺癌具有明显的体外增殖抑制作用并可改变A549细胞的周期分布诱导其凋亡,此过程中伴随Surivin和Cyclin D1基因的表达下调,提示奥沙利铂可能通过下调Surivin和Cyclin D1基因的表达,改变A549细胞周期分布并诱导凋亡发生。两基因在肿瘤细胞从G1期过度增殖到G2/M期凋亡缺陷的整个过程中均发挥重要作用,而Surivin和Cyclin D1是否可能存在协同促进肿瘤细胞恶性进展的效应及其更进一步的相互作用机制研究将有助于阐明肿瘤的发病机制,同时为其诊断治疗提供分子学基础。
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人肺腺癌A549细胞 篇5
1 材料与方法
1.1 实验仪器与材料
北虫草 (由沈阳虫林密宝食品科技有限公司提供) 、肺腺癌细胞A549 (购自博士德生物)
DMEM;胎牛血清;二甲基亚砜 (DMSO) 胰蛋白酶, MTT (均来自于博士德生物) 超纯水、96孔板 (Fisher) 高压蒸汽灭菌锅、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、酶标仪、电磁炉。
1.2 北虫草水提物的制备
取北虫草粉碎, 100目过滤, 取北虫草粉末5g, 加入200m L超纯水, 电磁炉700W提取30min, 4000r/min离心两次, 取上清液定容至100m L, 制得终浓度为30mg/m L的北虫草提取液, 经0.22μm无菌滤器过滤除菌, 备用。使用前用DMEM基本培养基稀释成实验所需的浓度。
(注:P<0.05表示具有显著性差异;P<0.01表示具有极显著性差异)
1.3 肺腺癌细胞A549的培养及生长观察
将A549细胞置于含10%胎牛血清的DMEM基本培养基, 在37℃、5%CO2培养箱中进行传代培养, 用0.25%的胰酶细胞消化液进行消化传代, 且3天传代1次, 并观察细胞的生长状况。实验所用的细胞均为对数生长期细胞。
1.4 MTT法检测A549细胞的抑制率
在96孔板的每孔中, 加入200μL含1×104个细胞的细胞悬液, 待其贴壁后加入不同质量浓度的北虫草提取液 (3mg/m L、2 mg/m L、1 mg/m L、0.5 mg/m L、0.25 mg/m L) 分别作用于细胞, 每组三个重复, 置于CO2培养箱中培养24h后去上清液, 每孔加入2mg/m L的MTT 20μL于培养箱内避光反应4小时, 然后加入150μLDMSO, 用酶标仪在490nm处测定OD值, 计算细胞抑制率。实验设置阴性对照组和空白对照组。
1.5 统计分析
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量数据均以 表示, 组间比较采用单因素方差分析法, P<0.05表示具有显著性差异, P<0.01, 表示具有极显著性差异, 数据具有统计学意义
2 结果与分析
2.1 A549细胞形态观察:如图1所示
2.2 A549细胞抑制率
从图2中可以看出, 北虫草提取液对肺癌细胞株A549存在抑制作用, 随着北虫草提取物浓度的增加, 肺癌细胞A549的形态发生明显的变化, 出现皱缩、膜泡甚至破裂等现象, 经吉姆萨染色发现细胞出现凋亡小体, 北虫草提取液对肺癌细胞A549的作用为凋亡。
从表1中可以得出:随着北虫草提取物浓度的增加, 对肺癌细胞A549的抑制率随之增加, 且存在显著地剂量依赖。当北虫草提取物浓度为3mg/m L时, 抑制率达到最大为74.14±4.49。浓度为0.25mg/m L和0.5mg/m L两组之间无显著性差异 (P>0.05) , 但与其他三组之间存在显著性差异, 其中当北虫草提取物浓度为1mg/m L时, 与其他四组之间存在极显著性差异 (P<0.01) 。
3 讨论
MTT法简单易操作, 本实验采用MTT法反映出北虫草提取物对体外培养的肺癌细胞株A549具有明显的抑制作用, 为临床治疗肺癌提供了有力的依据。同时本文采用了市售北虫草为研究对象, 为大众消费北虫草提供了科学保障。目前对于北虫草抗癌的研究较多, 其中颜晶晶、孟泽彬等人对北冬虫夏草的提取物抗癌做了研究[4,5,6], 李灿、卢丽丽、张丽艳对虫草各组分的体外抗肿瘤效果进行了深入研究[7,8]李万芳、杜秀菊等人对不同提取方法所获得的虫草各组分进行深入探讨[9,10]。以前期的研究为基础我们还将对该虫草提取液对肺癌细胞A549进行时效的研究, 同时进行更精细的研究, 为北虫草临床治疗肺癌提供进一步的理论支撑。
摘要：本文采用MTT法进行北虫草水提取物对肺腺癌细胞A549体外抑制的研究。结果表明:北虫草水提取物可抑制肺腺癌细胞A549的生长, 细胞形态发生明显变化。随着北虫草水提物浓度的增加, 抑制率显著增大, 呈明显的剂量依赖。当北虫草水提物浓度为3mg/m L时, 抑制率最大为74.14%±4.49 (P<0.05) , 为北虫草临床治疗肺癌提供理论依据。.
关键词：北虫草,MTT法,肺腺癌细胞,抑制率
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人肺腺癌A549细胞 篇6
1 材料与方法
1.1 细胞株
人肺腺癌细胞株A549(ATCC)购于中国医学科学院肿瘤研究所,用含10%的胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640培养液加100 U/mL青霉素和100μg/m L链霉素,于37℃、5%CO2的孵箱中孵育。
1.2 试剂与仪器
注射用顺铂(冻干型)为齐鲁制药产品;jetPRIME转染试剂购于PolyPlus-transfection公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自DOJINDO公司;TRI Reagent购自Sigma公司;反转录试剂盒购于Promega公司;荧光PCR试剂购于TaKaRa公司;Bcl-2、GAPDH抗体购于Santa Cruz公司。siRNA由上海吉玛公司合成(Negative Control RNA序列为:5'-UUCUCC-GAACGUGUCACGUTT-3',5'-ACGUGACACGUUCGGA-GAATT-3'。Bcl2-siRNA序列[8]为:5'-UGUGGAUGACU-GAGUACCUGAdTdT-3',5'-UCAGGUACUCAGUCAUCCA-CAdTdT-3');其余试剂均为进口分装或国产分析纯。Mx3000p荧光实时定量PCR仪由Stratagene生产;MS酶标仪由芬兰Labsystems生产。
1.3 转染
取对数生长期细胞接种于6孔板,每孔1.0×105个细胞,接种16 h后采用jetPRIME转染试剂,按说明书进行转染。每孔转染双链RNA终浓度为20 nM。转染24 h后换为正常培养液。实验分为阴性对照组(转染Negative Control RNA)和试验组(转染Bcl2-RNA)。
1.4 Real time RT-PCR
总RNA的提取采用TRI Reagent法,按照说明书进行。RNA提取后逆转录为cDNA,按说明书操作。以GAPDH为内参照扩增Bcl2基因。GAPDH上游引物:5'-TCAGTGGTG GACCTGACCTG-3',下游引物:5'-TGCTGTAGCCAAATTCG TTG-3'。Bcl-2上游引物:5'-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3',下游引物:5'-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT-3'。用2-ΔΔCt方法处理实时定量数据,计算Bcl-2 mRNA的表达差异。实验重复3次,取平均值。
1.5 CCK-8 assay
细胞转染32 h后,接种于96孔板,每孔2.0×103个细胞,接种16 h后换为新鲜配置的含不同浓度顺铂的培养液(0、0.5、1、2、3μg/mL),每个浓度5个复孔。药物作用48 h后,换为新鲜配置的含10%CCK-8液的培养液100μL,置孵箱继续培养,1 h后用多功能酶标仪于450 nm波长下检测每孔吸光度值(A)。按公式计算每个浓度的顺铂对细胞生长的抑制率(IR):IR(%)=(1-Ai/A0)×100%(注:Ai为各浓度顺铂组的平均吸光值,A0为不加顺铂组的平均吸光值),并计算顺铂对阴性对照组和实验组中A549细胞的半数抑制浓度(IC50)。实验重复3次,取平均值。
1.6 Western Blot analysis
用RIPA裂解液收集转染后细胞,BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后,利用10%的SDS-PAGE胶进行分离等量蛋白,然后转膜、封闭,加入1∶1 000稀释的兔抗人Bcl-2单克隆抗体,以及1∶5 000稀释的二抗。最后加入发光试剂,曝光、显影。以GAPDH为内参照。
1.7 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行处理数据,计量资料采用均数±标准差()表示,两组独立样本采用t检验,计数资料采用百分率表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Bcl-2 mRNA及蛋白在A549细胞中转染siBcl-2后的差异表达
在A549细胞中转染双链RNA 48 h后,实验组同阴性对照组相比,Bcl-2 mRNA表达水平降低了93.2%(P=0.037)(图1),其蛋白表达也明显降低(图2),几乎达到“敲出”该基因的效果。
2.2 A549细胞转染siBcl-2后对顺铂的敏感性增强
根据CCK-8结果显示,顺铂对两组A549细胞的增殖均有抑制作用(图3)。转染Negative Control后顺铂对A549细胞的IC50值为(2.68±0.37)μg/mL,转染Bcl2-siRNA后的IC50值为(0.81±0.24)μg/mL,转染Bcl2-siRNA后A549细胞对顺铂的敏感性提高了69.8%(P=0.024)(图4)。
3 讨论
顺铂是一种经典的肿瘤化疗药物,该药疗效具有剂量依赖性,但是随着给药量的增加,其对机体的毒副作用也相应增加,这就使得顺铂的使用具有一定的限制性[9]。顺铂的毒副作用包括骨髓、肾、耳、胃肠道毒性及过敏反应等[10,11,12,13,14]。在临床应用中,严重的肾毒性是限制治疗的常见因素[10],其肾毒性具有剂量限制性,主要损伤近曲小管,较少累及远曲小管和肾小球[11],可以引起肾小管的萎缩及肾脏纤维化[10]。其耳毒性表现为顺铂治疗过程中可出现累及性、不可逆的听力受损[12,13],顺铂导致的过敏反应,随着用药疗程和剂量的增加而随之增加,严重者甚至可出现生命危险[14]。探索一种能提高肿瘤对化疗药物顺铂敏感性的方法显得至关重要。
本研究以人肺腺癌细胞A549为模型,将Bcl2-siRNA转染进入细胞,使得A549细胞中Bcl-2 mRNA表达水平降低了93.2%,而且Bcl-2蛋白表达量也明显降低。本研究进一步通过CCK-8法测得细胞在转染Bcl2-siRNA后,对顺铂的敏感性提高了69.8%,IC50值由(2.68±0.37)μg/mL下降至(0.81±0.24)μg/mL。据此,可以相信将此方法应用于临床,将极大地降低顺铂的治疗剂量,从而能够将顺铂的毒副反应控制在较低水平。
Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,B细胞淋巴瘤/白血病)基因,是1984年从B细胞滤泡性淋巴瘤中分离出来的一种原癌基因。该基因定位于染色体18q1.3上,大小约230 kb,编码26×103 kDa大小的蛋白。Bcl-2基因在肿瘤的发生发展中起重要的作用[15]。其表达水平与多种肿瘤对化疗药物敏感性有关[16]。Bcl-2蛋白过度表达时,可以抑制活性氧对细胞诱发的凋亡,也可以拮抗细胞内因还原型谷胱甘肽含量的下降所诱发的凋亡[17],同时它还能影响细胞内钙内流而抑制凋亡[18]。Bcl-2基因低表达的卵巢癌对化疗反应良好[19]。人肺腺癌细胞对紫杉醇的敏感性也与Bcl-2基因的表达有关[20]。